Спосіб одержання білково-полісахаридного комплексу гіполіпідемічної дії

Спосіб одержання білково-полісахаридного комплексу гіполіпідемічної дії шляхом екстракції сировини водою з наступним упарюванням одержаного екстракту, осадженням спиртом етиловим, відокремленням та сушкою осаду, який відрізняється тим, що як сировину використовують гриб Pleurotus ostreatus, екстракцію проводять принаймні тричі у співвідношенні сировина : екстрагент 1:15-16 протягом 60 хвилин при температурі 5060°С та постійному перемішуванні, екстракт упарюють до 1/30 від попереднього об'єму, осаджують трикратною кількістю спирту етилового 96%. Винахід відноситься до фармації та медицини, а саме до способів одержання біологічно активних речовин з природної сировини, зокрема до способів одержання білково-полісахаридного комплексу гіполіпідемічної дії з гриба Pleurotus ostreatus. Проблема створення нових засобів гіполіпідемічиої дії є актуальною. На даний час існують лише синтетичні препарати подібної спрямованості дії, які викликають суттєві побічні реакції і мають певні протипоказання у окремих категорій хворих. Створення природних засобів гіполіпідемічної дії, які є більш споріднені організму людини і мають м'яку дію вирішує питання фармакотерапії в геронтології і педіатрії. Відомим є спосіб отримання БАР білкової природи рослинного походження - ферменту уреази з насіння кавуна звичайного (Citrollus vulgaris L.). [Промышленная технология лекарств: (Учебник. В 2-х т. Том 2 / В.И. Чуешов, М.Ю. Чернов, Л.М. Хохлова и др.). Под ред. проф. В.И. Чуешова. - X.: МТК - Книга; Издательство НФАУ, 2002. - С.274276.]. Подрібнене насіння екстрагують сумішшю розчинів натрію хлориду і натрію гідрокарбонату (рН 7,9-8,1) протягом двох годин при температурі 22±2°С. Далі екстракт піддають центрифугуванню в два етапи. Після цього екстракт охолоджують до -10°С. Виділення уреази з екстракту здійснюють шляхом обробки його насиченим розчином амонію сульфату в буферному розчині (рН 7,0) при періодичному перемішуванні. Суспензію осаду білка відстоюють протягом 6 годин, далі центрифугують протягом 20 хвилин. Осад суп утнього білка відкидають, а надосадову рідину знов піддають висолюванню амонію сулыЬатом. Суспензію відстоюють протягом 12 годин, центрифугують. Отриманий осад розчиняють в очищеній воді і охолоджують до +10°С. Далі проводять фракційне осадження ферменту етанолом у співвідношенні 1:2, центрифугують протягом 15 хвилин. Осад розчиняють в очищеній воді і суша ть сублімацією з оптимальним режимом температур від -40°С до +30°С. Тривалість заморожування - висушування 2-3 години, досушування - 8-10 годин. До недоліків відомого способу можна віднести складний та тривалий процес отримання і низький вихід кінцевого продукту. В якості прототипу заявленного способу обраний спосіб одержання комплексу полісахаридів протиалергічної дії з листя смородини чорної [Патент 24032, Україна, МПК6 А61К35/78, 3.95125519, заявл. 28.12.95, опубл. 31.08.98, Бюл. №4.], що (19) UA (11) 83530 (13) C2 (21) a200608048 (22) 17.07.2006 (46) 25.07.2008, Бюл.№ 14, 2008 р. (72) КУЧЕРЕНКО НАТАЛІЯ ВАСИЛІВНА, U A, ДЕМ'ЯНЕНКО ВІКТОР ГРИГОРОВИЧ, UA, СТОЛЄТОВ ЮРІЙ ВІТАЛІЙОВИЧ, UA (73) НАЦІОН АЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA (56) Промышленная технология лекарств: (Учебник. В 2-х т. Том 2 / В.И. Чуешов, М.Ю. Чернов, Л.М. Хо хлова и др.). Под ред. проф. В.И. Чуешова. - X.: МТК - Книга; Издательство НФАУ, 2002. С.274-276. UA 24032 C1, 31.08.1998. RU 2097989 C1, 10.12.1997. RU 2189395 C2, 20.09.2002. 3 83530 передбачає екстракцію сировини гарячою водою при 90°С у співвідношенні сировина: екстрагент 1:5-6. Екстракцію проводять протягом 3 годин при перемішуванні при постійній підтримці температури 90°С, причому одну й ту ж порцію сировини піддають екстракції тричі. Одержані екстракти об'єднують та упарюють до 1/7 попереднього об'єму. Осадження біологічно активного комплексу проводять чотирикратною кількістю спирту етилового 92-95% і залишають на добу для повного осадження. Осад відділяють, промивають етиловим спиртом, сушать і подрібнюють. Вихід готового продукту становить 13-14% від повітряно-сухої сировини. Зазначений спосіб дозволяє одержати засіб з конкретним видом фармакологічної активності протиалергійної. Недоліками способу можна вважати відносну тривалість процесу екстракції та підвищені витрати спирту при осадженні біологічно активного комплексу. Крім того, проведення екстракції при температурі 90°С за відомим способом не дозволяє отримувати речовини білкової природи з ферментативною активністю, які є термолабільними. Завданням винаходу є створення нового способу одержання білково-полісахаридного комплексу гіполіпідемічної дії шляхом екстракції гриба Pleurotus ostreatus водою при заданих параметрах способу, в результаті чого одержують біологічно активну субстанцію білкової природи з ферментативною гіполіпідемічною активністю, яка може бути використана як активна діюча речовина у складі 4 лікарських засобів, виконаних у різних лікарських формах. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі одержання білковополісахаридного комплексу гіполіпідемічної дії шляхом екстракції сировини водою з наступним упарюванням одержаного екстракту, осадженням спиртом етиловим, відокремленням та сушкою осаду, згідно з винаходом, передбачено, що в якості сировини використовують гриб Pleurotus ostreatus, екстракцію проводять у співвідношенні сировина: - екстрагент 1:15-16 протягом 60 хвилин при температурі 50-60°С, екстракт упарюють до 1/30 попереднього об'єму і осаджують трикратною кількістю спирту етилового. Вибір екстрагенту та параметрів заявленого способу здійснено експериментальним шляхом з урахуванням ступеню біологічної активності одержаного комплексу, його ефективності, доступності та нешкідливості екстрагенту, практичного відтворення способу у промислових умовах. Біологічно активні сполуки гриба Pleurotus ostreatus білкової та полісахаридної природи належать до гідрофільних або розчинних у воді. Експериментальне встановлено, що використання в якості екстрагента води 50-60°С при одержанні білково-полісахаридного комплексу забезпечує найбільш повну екстракцію біологічно активних речовин. Результати досліду з вибору оптимального екстрагенту за кількісним виходом екстрактивних речовин з сировини наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Вибір виду екстрагента Екстрагент Кількісний вихід екстрактивних речовин,% вода 50-60°С 20% етанол 40% етанол 69,542 60,512 52,456 Аналіз даних свідчить, що максимально ефективна екстракція досягається при використанні у якості екстрагенту води 50-60°С. При таких умовах виключається руйнування термолабільних екстрактивних речовин. Експериментальним шляхом доведено, що співвідношення сировина-екстрагент 1:15-16 є найбільш оптимальним для заявленого способу. Менша кількість екстрагенту не дозволяє ефективно провести екстракцію і створює складності технологічного характеру при обробці великої кількості сировини. Збільшення кількості екстрагенту недоцільно, бо повна екстракція досягається заявленою його кількістю. В ході експериментів було визначено, що оптимальним часом процесу екстракції для заявленого способу є 60 хвилин. Для вичерпного вилучення БАР з сировини бажано одну й ту ж порцію сировини піддавати екстракції принаймні тричі. Експериментальним шляхом визначено оптимальний об'єм упареного екстракту (до 1/30 попереднього об'єму), а відтак непрямим чином - його концентрація та необхідна трикратна кількість спирту етилового для осадження комплексу БАР. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Висушений подрібнений гриб Pleurotus ostreatus завантажують у реактор і заливають водою 50-60°С у співвідношенні сировина: екстрагент 1:15-16. Екстракцію проводять протягом 60 хвилин при перемішуванні при підтриманні постійної температури 50-60°С. Для максимального вилучення БАР з сировини кожну порцію сировини піддають екстракції тричі. Одержані екстракти об'єднують і упарюють на вакуум-випарному апараті до 1/30 попереднього об'єму. До упареного екстракту додають спирт етиловий 96% у співвідношенні екстракт: спирт 1:3, що призводить до осадження комплексу БАР. Надосадову рідину видаляють при фільтрації під вакуумом. Одержаний осад піддають вакуумній сушці при температурі 50-60°С протягом 7 годин. Вихід готового продукту складає 44-45% від повітряно-сухої сировини. В результаті здійснення заявленого способу одержують водорозчинний білковополісахарндний комплекс - порошок світлокоричневого кольору зі специфічним запахом, со 5 83530 лонувато-кислий на смак, гігроскопічний, дуже добре розчинний у воді, практично нерозчинний в ефірі і хлороформі. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1. 100,0г подрібненої висушеної маси гриба Plewotus ostreatus заливали водою 50°С у співвідношенні сировина-екстрагент 1:15 і екстрагували на водяній бані при температурі 50°С протягом 60 хвилин. Витяг злили. Операцію повторили 3 рази. Отриманий сумарний водний екстракт (3,23 л) упарили під вакуумом при температурі 50°С до загального об'єму 100мл. До упареного екстракту додали спирт етиловий 96% у співвідношенні 1:3. Відділили надосадову рідину за допомогою вакууму. Отриманий осад висушили у вакуум-сушильній шафі при температурі 50°С протягом 7 годнії. Вихід водорозчинного білковополісахаридпого комплексу склав 44,04%. Приклад 2. Гілоліпідемічну дію водорозчинного білково-полісахаридного комплексу, одержаного за заявленим способом, вивчали на моделі експериментальної гіперліпідемії- Дослідження проводили на білих щурах лінії Вістар. Всі тварини були згруповані у 3 групи: 1 група -контроль-патологія (тварини з експериментальною гіперліпідемією), 2 6 група - тварини, ліковані ловастатином в дозі 1,5мг/кг (ОД50 у щурів), 3 група -тварини, ліковані засобом, отриманим за заявленим способом, в дозі 1,0г/кг. Експериментальну гіперліпідемію у щурів викликали введенням холестерину в дозі 0,5г/кг і 30% насичених жирів, а також 5000 МО вітаміну Д на протязі 3-х тижнів. Холестерин у вказаній дозі вводили тваринам внутрішньошлунково у вигляді суспензії на соняшниковій олії. В якості насиченого жиру використовували свинячий жир, який щури отримували одночасно із кормом як і вітамін Д. Препаратом порівняння був обраний Ловастатин-КМП (ВАТ "Київ медпрепарат"). Критеріями оцінки тіполіпідемічної дії досліджуваного засобу було визначення у сироватці крові щурів: загального холестерину (ЗХС), холестерину ліпопротеїнів низької щільності (ХС ЛПНЩ) - атерогенннй фактор, та холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ХС ЛПВЩ) -антиатерогенний фактор. Результати вивчення гіполіпідемічної активності засобу, отриманого за заявленим способом, та Ловастатину-КМГГ в умовах експериментальної гіперліпідемії у щурів наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Вивчення гіполіпідемічної дії білково-поліеахаридного комплексу, одержаного з гриба Pleurotus ostreatus за заявленим способом Група тварин Контроль-патологія Засіб, отриманий за заявленим способом Ловастатин-КМП Рівень ЗХС,% 100 61,7 45,3 Дані таблиці 2 свідчать, що засіб, отриманий за заявленим способом, сприяв зниженню рівню загального холестерину сироватки крові щурів на 38,3%, холестерину ліпопротеїнів низької щільності - на 51,1%, та підвищува в рівень холестерину ліпопротеїнів високої щільності на 33%. Таким чином, можна зробити висновок, що водорозчинний білково-полісахаридний комплекс з гриба Pleurotus ostreatus, одержаний у відповідності з заявленим способом, виявляє виражену гіполіпідемічну активність: зменшує рівень атерогенних факторів (ЗХС, ХС ЛІТНЩ), та підвищує рівень антиатерогенного фактора (ХС ЛПВЩ). За своєю гшоліпідемічною активністю засіб незначно поступається гіполіпідемічній дії референс - препарату Ловастатину-КМП за зниженням атерогенннх фак Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін Рівень ХС ЛПНЩ,% 100 48,9 40,0 Рівень ХС ЛПВЩ,% 100 133,0 131,0 торів, проте не поступається йому за підвищенням антиатерогенного фактору. В результаті здійснення заявленого способу одержують біологічно активну субстанцію з вираженою гіполіпідемічної активністю, яка є перспективною для використання в якості лікарської субстанції для створення лікарських препаратів. Заявлений спосіб дає змогу одночасно отримати два класи біологічно активних речовин у складі одного комплексу і має високий вихід цільового продукту. Спосіб передбачає використання поширеної в Україні доступної сировини і може бути здійснений в умовах хіміко-фармацевтичних підприємств з використанням стандартного обладнання. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601