Ген ліпоксигенази-1 ячменю, спосіб відбору ячменю, матеріали для солодових алкогольних напоїв і спосіб отримання солодових алкогольних напоїв

Є ще 23 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Мутантний ген ліпоксигенази-1 ячменю, в якому гуанін у донорному сайті сплайсингу (5'-GT-3') 5-го інтрона гена ліпоксигенази-1 ячменю мутований в іншу основу.

2. Мутантний ген ліпоксигенази-1 ячменю за п. 1, в якому інша основа є аденіном.

3. Спосіб відбору ячменю, позбавленого ліпогенази-1 ячменю, що включає стадію розпізнавання ячменю, позбавленого ліпоксигенази-1 ячменю, за допомогою визначення, є або не є гуанін в донорному сайті сплайсингу 5-го інтрона гена ліпоксигенази ячменю мутованим в іншу основу.

4. Спосіб відбору ячменю, позбавленого ліпогенази-1 ячменю, за п. 3, в якому інша основа є аденіном.

5. Спосіб відбору ячменю, позбавленого ліпогенази-1 ячменю, за п. 3 або 4, що включає

стадію екстракції геномної ДНК, в якій геномну ДНК екстрагують з проби ячменю,

стадію ампліфікації ДНК, в якій ДНК-фрагмент, що містить донорний сайт сплайсингу 5-го інтрона гена ліпоксигенази-1 ячменю, ампліфікують з екстрагованої геномної ДНК, і

стадію детектування ДНК-фрагмента, в якій ДНК-фрагмент, що містить донорний сайт сплайсингу 5-го інтрона гена ліпоксигенази-1 ячменю, ампліфікований на стадії ампліфікації ДНК-фрагмента, розщеплюють рестриктазою, детектують ДНК-фрагмент, що має вказану кількість основ, і розпізнають ячмінь, позбавлений ліпоксигенази-1 ячменю, за допомогою визначення, є або не є гуанін в донорному сайті сплайсингу 5-го інтрона гена ліпоксигенази ячменю мутованим в іншу основу.

6. Спосіб відбору ячменю, позбавленого ліпогенази-1 ячменю, за п. 5, в якому рестриктазою, що використовується на стадії детектування ДНК-фрагмента, є AfaI і/або RsaI, які упізнають нуклеотидну послідовність 5'-GTAC-3'.

7. Матеріал для солодових алкогольних напоїв, де цей матеріал вибраний з групи, що складається з насіння, солоду, екстракту солоду, продукту розщеплення ячменю або обробленого ячменю, отриманого з ячменю, який має мутантний ген ліпоксигенази-1 ячменю за п. 1 або 2.

8. Матеріал для солодових алкогольних напоїв, де цей матеріал вибраний з групи, що складається з насіння, солоду, екстракту солоду, продукту розщеплення ячменю або обробленого ячменю, отриманого з ячменю, відібраного з використанням способу відбору за будь-яким з пп. 3-6.

9. Спосіб отримання солодових алкогольних напоїв, що характеризується  використанням матеріалу для солодових алкогольних напоїв за п. 7 або 8.

10. Нуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну послідовність від положення 1 до положення 1554, представлену в SEQ ID NO:10.

11. Нуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:11.

12. Нуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну послідовність з 10-60 суміжних основ, у тому числі основу 3178, в нуклеотидній послідовності, представленій в SEQ ID NO:11.

13. Спосіб детектування присутності активності LOX-1 в ячмені, що включає стадію виділення геномної ДНК з проби ячменю і стадію детектування основи 3178 нуклеотидної послідовності, представленої в SEQ ID NO:11, причому присутність цієї основи є показником присутності активності LOX-1 в ячмені.

Текст

1. Мутантний ген ліпоксигенази-1 ячменю, в якому гуанін у донорному сайті сплайсингу (5'-GT3') 5-го інтрона гена ліпоксигенази-1 ячменю мутований в іншу основу. 2. Мутантний ген ліпоксигенази-1 ячменю за п. 1, в якому інша основа є аденіном. 3. Спосіб відбору ячменю, позбавленого ліпогенази-1 ячменю, що включає стадію розпізнавання ячменю, позбавленого ліпоксигенази-1 ячменю, за допомогою визначення, є або не є гуанін в донор 2 (19) 1 3 85183 4 10. Нуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну 13. Спосіб детектування присутності активності послідовність від положення 1 до положення 1554, LOX-1 в ячмені, що включає стадію виділення гепредставлену в SEQ ID NO:10. номної ДНК з проби ячменю і стадію детектування 11. Нуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну основи 3178 нуклеотидної послідовності, предстапослідовність, представлену в SEQ ID NO:11. вленої в SEQ ID NO:11, причому присутність цієї 12. Нуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну основи є показником присутності активності LOX-1 послідовність з 10-60 суміжних основ, у тому числі в ячмені. основу 3178, в нуклеотидній послідовності, представленій в SEQ ID NO:11. Даний винахід відноситься до гена ліпоксигенази-1 ячменю, способу відбору ячменю, матеріалів для солодових алкогольних напоїв і способу отримання солодових алкогольних напоїв. Ліпоксигеназа-1 ячменю (далі "LOX-1") є ферментом, присутнім у солоді, який окисляє лінолеву кислоту, що утворюється солодом, до 9гідропероксіоктадекадієнової кислоти під час затирання солоду для отримання солодових алкогольних напоїв [Kobayashi, N et al., J. Ferment. Bioeng., 76, 371-375, 1993]. Далі, 9гідропероксіоктадекадієнова кислота перетворюється в тригідроксіоктадеценову кислоту (THOD) пероксигеназа-подібною активністю [Kuroda, H., et al., J. Biosci. Bioeng., 93, 73-77, 2002]. Відомо, що THOD зменшує піностійкість пива, додає терпкий смак і погіршує однорідність смаку пива [Kobayashi, N., J. Am. Soc. Brew. Chem. 60: 37-41, 2002; і Kaneda, H. et al., J. Biosci. Bioeng., 92, 221226, 2001], призводячи до більш низької якості солодових алкогольних напоїв. Крім того, 9гідропероксіоктадекадієнова кислота перетворюється в транс-2-ноненаль, який є речовиною, відповідальною за неприємний присмак картону у витриманих солодових алкогольних напоях [Yasui, Journal of the Brewing Society of Japan, 96:94-99 (2001)]. Як стратегія інгібування утворення транс-2ноненалю для поліпшення стабільності смаку солодових алкогольних напоїв буч запропонований спосіб отримання солодових алкогольних напоїв з використанням солоду з низькою активністю LOX-1 [Drost, J. Am. Soc. Brew. Chem. 48:124-131 (1990)]. Douma et al. індукували мутацію в ячмені мутагенною (хімічної) обробкою для створення індукованої мутованої лінії, що виявляє на 9% більш низьку активність LOX-1 у порівнянні з контролями, і намагалися отримувати солодові алкогольні напої з використанням такого ячменю [WO 02/053721]. Однак навіть при використанні такого ячменю зменшена концентрація транс-2-ноненалю у отриманих солодових алкогольних напоїв є недостатньою, і стабільність смаку не є досить поліпшеною. Крім того, абсолютно невизначені результати отримували відносно зменшення THOD або поліпшення піностійкості. Даний винахід був виконаний у світлі вищезгаданих проблем рівня техніки, і його метою є забезпечення гена LOX-1 ячменю, який є застосовним для отримання солодових алкогольних напоїв, що виявляють поліпшену стабільність смаку та стій кість піни, без маніпуляцій генами, способу відбору LOX-1-недостатнього ячменю, матеріалів для солодових алкогольних напоїв, що о тримуються з ячменю, отриманого за допомогою цього способу відбору, та способу отримання солодових алкогольних напоїв з використанням цих матеріалів для солодових алкогольних напоїв. Внаслідок дуже ретельного дослідження, що проводиться для досягнення вищеописаної мети, автори даного винаходу завершили цей винахід виявленням природного різновиду ячменю, який повністю позбавлений активності LOX-1, та ідентифікацією нового мутантного гена LOX-1 з цього різновиду ячменю. Конкретно, мутантний ген LOX-1 даного винаходу характеризується тим, що гуанін у донорному сайті сплайсинга (5'-GT-3') 5-го інтрона відомого гена LOX-1 ячменю мутований в іншу основа. Переважно, цією іншою основою є аденін. Спосіб відбору ячменю, позбавленого LOX-1 ячменю, відповідно до даного винаходу характеризується розпізнаванням ячменю, позбавленого LOX-1 ячменю, за допомогою визначення, є чи не є гуанін в донорномуу сайті сплайсинга 5-го інтрона гена LOX-1 мутованим в іншу основу. Переважно, цією іншою основою є аденін. Спосіб відбору ячменю, позбавленого LOX-1 ячменю, характеризується також включенням стадії екстракції геномної ДНК, в якій геномну ДНК екстрагують з проби ячменю; стадії ампліфікації ДНК-фрагмента, в якій ДНК-фрагмент, що містить донорний сайт сплайсинга 5-го інтрона гена LOX1, ампліфікують з екстрагованої геномної ДНК; і стадії детектування ДНК-фрагмента, в якій ДНКфрагмент, що містить донорний сайт сплайсинга 5-го інтрона гена LOX-1, ампліфікований у стадії ампліфікації ДНК-фрагмента, розщеплюють рестрикційним ферментом (рестриктазою), детектують ДНК-фрагмент, що має вказану кількість основ, і ячмінь, позбавлений LOX-1 ячменю, розпізнають за допомогою визначення, є чи не є гуанін у донорному сайті сплайсинга мутованим в іншу основу. Рестрикційним ферментом, що використовується у стадії детектування цього ДНК-фрагмента, є переважно Afal і/або Rsal, які впізнають нуклеотидну послідовність 5'-GTAC-3'. Згідно з даним винаходом, сорт ячменю, що має ознаку недостатності активності LOX-1, розпізнають на основі присутності або відсутності мутації гуаніну в донорному сайті сплайсинга 5-го інтрона гена LOX-1. 5 85183 6 У результаті, можна легко розпізнати різновид Далі, даний винахід забезпечує нуклеїнову киячменю, позбавлений активності LOX-1, за допослоту, що містить нуклеотидну послідовність з 10могою аналізу на генетичному рівні, без прямого 60 суміжних основ, в тому числі основу 3178, у вимірювання активності LOX-1. На активність фенуклеотидній послідовності, представленій в SEQ рменту впливають індивідуальні стадії росту, сеID NO:11. Основа 3178 є поліморфізмом єдиного редовище та інші фактори, і, отже, її важко точно нуклеотиду, який є G у випадку аутентичного LOXвиміряти, але даний спосіб дозволяє розпізнати 1 і А у випадку мутантного LOX-1. За допомогою різновид ячменю з відмінною активністю LOX-1 детектування присутності або відсутності нуклеїспособом, відмінним від вимірювання активності нової кислоти, що включає в себе цей поліморфферменту, і, отже, незалежно від факторів навконий сайт, у пробі ячменю, можна дізнатися, має чи лишнього середовища та інших факторів. Крім не має цей ячмінь ознаку недостатності активності того, у той час як активність ферменту не може LOX-1. бути виміряна, поки насіння не дозріє, скринінг Крім того, даний винахід забезпечує спосіб деДНК може ідентифікувати присутність або відсуттектування присутності активності LOX-1 в ячмені, ність ознаки відсутності цієї активності на ранній що включає стадію виділення геномної ДНК з простадії росту, так як його проводять перед цвітінби ячменю та стадію детектування основи 3178 ням, та, отже, є е фективним для безперервного нуклеотидної послідовності, представленої в SEQ зворотного схрещування. ID NO:11, причому присутність цієї основи є показМатеріал для солодових алкогольних напоїв ником присутності активності LOX-1 в ячмені. Згідданого винаходу характеризується тим, що він є но з цим способом, можна дізнатися, має чи не насінням, солодом, екстрактом солоду, продуктом має випробуваний ячмінь ознаку недостатності розщеплення ячменю або обробленим ячменем, активності LOX-1. отриманими з ячменю, що має мутантний ген LOXНасіння, солод, екстракт солоду, продукт роз1 відповідно до даного винаходу. щеплення ячменю або оброблений ячмінь, отриМатеріал для солодових алкогольних напоїв мані з ячменю, позбавленого активності LOX-1, даного винаходу характеризується також тим, що виявленого за допомогою цього способу, можуть він є насінням, солодом, екстрактом солоду, пробути використані як сировинний матеріал для дуктом розщеплення ячменю або обробленим отримання солодових алкогольних напоїв для ячменем, отриманими з ячменю, відібраного з виотримання солодових алкогольних напоїв з поліпкористанням способу відбору позбавленого LOX-1 шеною стабільністю смаку та стійкістю піни. ячменю відповідно до даного винаходу. Фіг.1 є діаграмою, що показує результати акСпосіб отримання солодових алкогольних нативності LOX-1 у тесті пошук у 1. поїв даного винаходу характеризується викорисФіг.2 є діаграмою, що показує результати інгітанням матеріалу для солодових алкогольних набуючої LOX-1 активності у тесті верифікації 1. поїв відповідно до даного винаходу. Фіг.3 є парою зображень електрофорезу, що Згідно з даним винаходом, можна отримувати показують результати Вестерн-аналізу білка LOXсолодові алкогольні напої з поліпшеною стабільні1 насіння ячменю в тесті верифікації 2. Зображенстю смаку та стійкістю піни, оскільки LOX-1 не приня А показує результати Вестерн-аналізу після сутній у цьому матеріалі, і, отже, не відбувається електрофорезу в ПААГ, а В показує результати легкого утворення 9-гідропероксіоктадекадієнової Вестерн-аналізу після ізоелектрофокусування кислоти з лінолевої кислоти і, отже, не відбуваєть(IEF). ся також легкого утворення THOD і транс-2Фіг.4 є зображенням електрофорезу, що поканоненалю в цьому способі отримання солодових зує результати аналізу ОТ-ПЛР РНК насіння ячмеалкогольних напоїв. ню в тесті верифікації 3. Крім того, даний винахід забезпечує нуклеїноФіг.5 є діаграмою, що показує структур у донову кислоту, що містить нуклеотидну послідовність рного сайта сплайсинга 5-го інтрона гена LOX-1 у від положення 1 до положення 1554, представлену тесті верифікації 4. в SEQ ID NO:10. Ця нуклеотидна послідовність Фіг.6 є парою зображень електрофорезу, що представляє кодуючу ділянку гена, що кодує мутапоказують результати аналізу сплайсинга мутантнтний білок LOX-1, позбавлений ліпоксигеназної ного гена LOX-1 у тесті верифікації 5. Зображення активності білка LOX-1. За допомогою детектуванА є зображенням електрофорезу ампліфікованих ня присутності або відсутності цієї нуклеїнової кифрагментів, що містять 3-ий - 5-ий інтрон, а В є слоти в пробі ячменю можна дізнатися, має чи не зображенням електрофорезу ти х самих фрагменмає цей ячмінь ознаку недостатності активності тів, що і в А, після розщеплення Stul. LOX-1. Фіг.7 є зображенням електрофорезу, що покаДалі, даний винахід забезпечує нуклеїнову кизує індуковані експресією білки в E. соlі в тесті веслоту, що містить нуклеотидну послідовність, рифікації 7 і 8. представлену в SEQ ID NO:11. Ця нуклеотидна Фіг.8 є діаграмою, що показує активність індупослідовність представляє геномну послідовність кованою експресією LOX-1 в E. соlі в тесті верифігена, що кодує мутантний білок LOX-1, позбавлекації 1. ний ліпоксигеназної активності білка LOX-1. За Фіг.9 є зображенням електрофорезу, що покадопомогою детектування присутності або відсутзує поліморфізм ДНК у 2-ому дочірньому поколінні ності цієї нуклеїнової кислоти в пробі ячменю можгібриду для Kendall x SBOU2 у тесті верифікації 9. на дізнатися, має чи не має цей ячмінь ознаку неФіг.10 є таблицею, що підсумовує поліморфізм достатності активності LOX-1. ДНК у гібридному 2-ому дочірньому поколінні й 7 85183 8 активність LOX-1 в 3-ому дочірньому поколінні бути використані, включають у себе електрофорез гібриду для Kendall x SBOU2 у тесті верифікації 9. в агарозному гелі та електрофорез в поліакрилаФіг.11 є зображенням електрофорезу, що помідному гелі. Коли мутація ДНК, що підлягає детеказує результати аналізу основного сорту/лінії ячктуванню, заснована на присутності ампліфікації меню з використанням Afal-способу в прикладі 1. або ефективності ампліфікації, замість електроФіг.12 є зображенням електрофорезу, що пофорезу може бути використана кількісна ПЛР, наказує результати аналізу LOX-1-недостатнього приклад, спосіб TAQMAN. ячменю з використанням Afal-способу в прикладі Спосіб відбору LOX-1-недостатнього ячменю 2. даного винаходу характеризується включенням, Фіг.13 є парою діаграм, що показують резульпереважно, стадії екстракції геномної ДНК, в якій тати активності LOX-1 LOX-1-недостатнього насінгеномну ДНК екстрагують з проби ячменю; стадії ня ячменю в прикладі 2. Діаграмма А показує реампліфікації ДНК-фрагмента, в якій ДНКзультати за часу реакції ферменту 5 хвилин, а фрагмент, що містить донорний сайт сплайсинга діаграма В показує результати за часу реакції 90 5-го інтрона гена LOX-1, ампліфікують з екстрагохвилин. ваної геномної ДНК; і стадії детектування ДНКФіг.14 є таблицею, що показує результати фрагмента, в якій ДНК-фрагмент, що містить доаналізу солоду насіння з популяції LOX+F4 і LOXнорний сайт сплайсинга 5-го інтрона гена LOX-1, F4 в прикладі 5. ампліфікований у стадії ампліфікації ДНКФіг.15 є точковою діаграмою, що показує конфрагмента, розщеплюють рестрикційним ферменцентрації транс-2-ноненалю і потенціали ноненатом (рестриктазою), детектують ДНК-фрагмент, лю для сусла в прикладі 5. що має вказану кількість основ, і позбавлений Даний винахід буде тепер пояснений більш LOX-1 ячменю ячмінь розпізнають за допомогою детально. визначення, є чи не є гуанін у донорному сайті Спочатку будуть дані пояснення з приводу мусплайсинга мутованим в іншу основу. тантного гена LOX-1. Спочатку буде пояснена стадія екстракції геМутантний ген LOX-1 даного винаходу є новим номної ДНК. геном, виявленим авторами даного винаходу, і він Немає особливих обмежень відносно способу характеризується тим, що 60-а основа G відомого екстракції геномної ДНК, і може бути використаний гена LOX-1 ячменю (SEQ ID NO:1) замінена на A будь-який широко відомий спосіб. Конкретно, екст(SEQ ID NO:2). Оскільки основи 60-61 SEQ ID NO:1 ракцію можна провести, наприклад, способом складають донорний сайт сплайсинга (5'-GT-3'), ця СТАВ [Murray et al., 1980, Nucleic Acids Res. заміна основи дає аберацію у сплайсинга LOX-1, 8:4321-4325] або способом з бромідом етидію так що активний LOX-1 не може бути експресова[Varadarajan and Prakash 1991, Plant Mol. Biol. Rep. ний. 9:6-12]. Тканина, що використовується для екстраНуклеотидна послідовність ділянки 5-го інтрокції геномної ДНК, не обмежується насінням ячмена відомого гена LOX-1 наведена у вигляді SEQ ID ню, але може бути також листям, стеблом, корінNO:1 у списку послідовностей, а нуклеотидна поням або т.п. Наприклад, листя може бути слідовність частини мутантного гена LOX-1 даного використане для відбору з партії індивідуумів у винаходу, що відповідає ділянці 5-го інтрона гена генераціях зворотного схрещування. LOX-1, наведена в списку послідовностей у вигляТепер буде пояснена стадія ампліфікації ДНКді SEQ ID NO:2. фрагмента. Тепер буде пояснений спосіб відбору LOX-1Немає особливих обмежень відносно способу недостатнього ячменю відповідно до даного винаампліфікації ДНК-фрагмента, і, наприклад, може ходу. бути використаний спосіб ПЛР (полімеразної ланСпосіб відбору LOX-1-недостатнього ячменю цюгової реакції). Праймери, що використовуються відповідно до даного винаходу характеризується для способу ПЛР, не обмежені конкретно в їх н укрозпізнаванням ячменю, позбавленого LOX-1 ячлеотидних послідовностях, поки вони представлеменю, на основі того, є чи не є гуанін у донорному ні ділянкою, що дозволяє ампліфікувати ДНКсайті сплайсинга 5-го інтрона гена LOX-1 мутовафрагмент, що містить донорний сайт сплайсинга ним в іншу основу. 5-го інтрона гена LOX-1, і, конкретно, вони є переСпособом відбору LOX-1-недостатнього ячмеважно 10-60 суміжними основами і, більш переваню, що використовує ви щезазначену мутацію осжно, 15-30 суміжними основами гена LOX-1. Занови, може бути, наприклад, спосіб з використанзвичай нуклеотидна послідовність праймера буде ням праймера, що містить вищезазначений сайт переважно мати GC-вміст 40-60%. Переважно тамутації на 3'-кінці послідовності праймера або всекож, щоб відмінність у величинах Tm двох прайредині послідовності праймера, для ампліфікації мерів, які використовуються для способу ПЛР, ДНК, детектування мутації основи на основі присубула така, що дорівнює нулю або була дуже матності ампліфікації або ефективності ампліфікації і лою. Ці праймери переважно не утворюють втовідбору LOX-1-недостатнього ячменю, або спосіб ринну структур у один з одним. ампліфікації ДНК-фрагмента, що містить вищезаТепер буде пояснена стадія детектування значений сайт мутації, і відбору LOX-1ДНК-фрагмента. недостатнього ячменю. Мутантний ген LOX-1 відповідно до даного виНемає конкретних обмежень відносно способу находу має нуклеотидну послідовність, відмінну детектування мутації нуклеотидної послідовності, від відомого LOX-1, як пояснено вище, і, отже, при доки даний спосіб дозволяє детектувати ДНКвикористанні рестриктази, яка впізнає або розщефрагменти, але відповідні способи, які повинні плює цю відмінну частину, для розщеплення про 9 85183 10 дукту ампліфікації, відмінність у розмірах отримаТепер буде пояснене отримання солодових них ДНК-фрагментів буде очевидною. Немає осоалкогольних напоїв. бливих обмежень у відношенні рестриктази, що Спосіб отримання солодових алкогольних навикористовується для даного винаходу, поки вона поїв даного винаходу характеризується викорисвпізнає або розщеплює відмінну частину, але петанням матеріалу для солодових алкогольних нареважними є рестриктази Afal і/або Rsal, які, як поїв відповідно до даного винаходу. вже було продемонстровано, виявляють таку акСпочатку буде пояснена стадія отримання сотивність. лоду, що характеризується використанням LOX-1Іншими словами, оскільки мутантний ген LOXнедостатнього ячменю, і цей спосіб не є особливо 1 даного винаходу має гуанін в донорному сайті обмеженим і може бути будь-яким широко відомим сплайсинга, мутований в іншу основу, він не місспособом. Більш конкретно, наприклад, замочутить сайта розщеплення для рестриктаз Afal і Rsal вання до міри замочування 40-45% супроводжу(5'-GTAC-3': нуклеотидів 60-63 5-го інтрона), який ється пророщуванням при 10-20°C протягом 3-6 присутній у відомому гені LOX-1. У результаті, його днів і пічним сушінням для отримання солоду. патерн розщеплення, при розщепленні продукту Тепер буде пояснена стадія затирання. ампліфікації гена, що містить цей сайт розщепСтадія затирання відповідно до даного виналення, рестриктазами Afal і/або Rsal, буде відрізходу є стадією отримання сусла затиранням винятися від патерна розщеплення відомого гена щезазначеного солоду. Більш конкретно, вона LOX-1, що дозволяє ідентифікувати мутантний ген складається з чотирьох стадій. LOX-1. Першою стадією є стадія затирання, в якій маДНК-фрагмент, що має вказану кількість остеріал, що містить солод, змішують з водою, отринов, не обмежується в кількості основ, поки він є ману суміш нагрівають для затирання солоду й ДНК-фрагментом, в якому присутність відмінної отримують сусло з цукрованого солоду. частини призводить до відмінності в розмірі ДНКСолод, що використовується для цієї стадії, фрагмента, що отримується розщепленням продупереважно отримують додаванням води і повітря кту ампліфікації рестриктазою. до ячменю для пророщування з подальшим сушінДетектування на цій стадії особливо не обменям для видалення зародків. Цей солод є джережується, поки воно є способом, що робить можлилом необхідних ферментів для отримання сусла, а вим детектування ДНК-фрагмента, що розщеплютакож основним джерелом крохмалю як матеріала ється рестриктазою, і, конкретно, детектування для затирання. Висушений пічним сушінням проможе виконуватися, наприклад, електрофорезом в рощений солод використовують також для надаагарозному гелі або електрофорезом в поліакривання характерного смаку і кольору солодовому ламідному гелі. алкогольному напою. Крім такого солоду, можуть Тепер буде пояснений матеріал для солодобути додані домішки, такі як LOX-1-недостатній вих алкогольних напоїв даного винаходу. ячмінь за даним винаходом і/або звичайний ячМатеріал для солодових алкогольних напоїв мінь, кукурудзяний крохмаль, кукурудзяні крупи, даного винаходу характеризується тим, що він є рис, сахариди або т.п. насінням, солодом, екстрактом солоду, продуктом У стадії отримання сусла, описаній вище, пророзщеплення ячменю або обробленим ячменем, дукт розщеплення ячменю або оброблений ячмінь, отриманими з ячменю, що має мутантний ген LOXотриманий з LOX-1-недостатнього ячменю даного 1 відповідно до даного винаходу, і тим, що він є винаходу і/або звичайного ячменю, змішують із насінням, солодом, екстрактом солоду, продуктом заторною водою і додають, якщо необхідно, вищерозщеплення ячменю або обробленим ячменем, зазначені домішки для отримання сусла. отриманими з ячменю, відібраними способом відСолод перемішують після додавання заторної бору LOX-1-недостатнього ячменю відповідно до води. При додаванні домішок вони можуть бути даного винаходу. також змішані в цей момент. Сахариди можуть Солодовий екстракт є екстрактом з солоду, і як додаватися перед кип'ятінням, описаним нижче. приклади може бути згаданий екстракт цукрових Немає особливих обмежень відносно заторної компонентів або білкових компонентів з солоду. води, і може бути використана вода, яка придатна Продукт розщеплення ячменю є продуктом роздля отримуваних солодових алкогольних напоїв. щеплення ячменю ферментами або т.п., і він Затирання проводять по суті при загальноприйнявключає в себе ячмінний затор і т.п. Обробленим тих умовах. Після фільтрування солодового затоячменем називають дроблений ячмінь, що викориру, отриманого таким чином, додають матеріали, стовується як домішка для солодових алкогольних які надають аромат або гіркоту, такий як хміль або напоїв. трави, і суміш кип'ятять і потім охолоджують з Оскільки матеріал для солодових алкогольних отриманням охолодженого сусла. напоїв за даним винаходом не містить LOX-1, не Другою стадією є стадія додавання дріжджів відбувається легкого утворення 9до охолодженого сусла для ферментації з метою гідропероксіоктадекадієнової кислоти з лінолевої отримання проміжних продуктів солодового алкокислоти і, отже, не відбувається легкого утворення гольного напою. THOD і транс-2-ноненалю під час цього способу Дріжджі, що використовуються в цій стадії, отримання солодових алкогольних напоїв; таким можуть бути будь-якими пивними дріжджами для чином, можна отримувати солодові алкогольні спиртового бродіння, які метаболізують цукор у напої з поліпшеною стабільністю смаку і піностійкісуслі, отриманому затиранням солоду, з утворенстью. ням спирту та газоподібного діоксиду вуглецю, і, конкретно, можуть бути згадані, наприклад, 11 85183 12 Saccharomyces cerevisiae та Saccharomyces слідовність, представлену в SEQ ID NO:11. SEQ ID uvarum. NO:11 представляє геномну послідовність для Зброджування виконують охолоджуванням сумутантного LOX-1 у сорті SDOU2 ячменю, позбавсла, отриманого в стадії затирання, і додаванням леного активності LOX-1. Тобто мутантний ген до нього дріжджів. Умови зброджування можуть LOX-1 даного винаходу характеризується тим, що бути по суті такими самими, що й умови для загавін представлений послідовністю SEQ ID NO:11. льноприйнятої ферментації, і, наприклад, темпеОснова, що відповідає положенню 3178, є G в ауратура зброджування буде зазвичай не вищою тентичному гені LOX-1, тоді як основа 3178 є му15°С і переважно 8-10°C, тоді як період зброджутованим в А в мутантному гені LOX-1. Ця основа є вання складає переважно 8-10 днів. також першою основою 5-го інтрона аутентичного Третьою стадією є стадія витримування, в якій гена LOX-1, і послідовність GT у вигляді послідовпроміжні продукти солодового алкогольного наності основ 3178-3179 відповідає донорному сайту пою, отриманого в стадії зброджування, витримусплайсинга (Фіг.5). Однак у мутантном гені LOX-1 ють. послідовність основ 3178-3179, що відповідає доУ цій стадії зброджуваний розчин, який завернорному сайту сплайсинга, є AT, і, отже, відбувашив спиртове бродіння, переносять у герметизоється аберація сплайсинга, яка запобігає сплайсиваний чан і витримують. Це повторне зброджуваннга. Крім того, послідовність основ 3176-3178 є ня по суті є таким самим, що і зброджування при TGA, яка є стоп-кодоном, і, отже, у цій точці трансзвичайних умовах, і, наприклад, температура виляція закінчується. тримування дорівнює переважно 0-2°C і час виОскільки мутантний білок LOX-1, що експресутримування дорівнює приблизно 20-90 днів. Виється мутантним геном LOX-1, має тільки частину, тримування збродженого розчину робить відповідну 5-ому екзону, він позбавлений амінокиможливими проходження повторного бродіння і слотних залишків на С-кінцевій стороні від 5-го дозрівання екстракту, що залишився. екзона аутентичного білка LOX-1. Молекулярна Четвертою стадією є стадія фільтрування, в маса аутентичного білка LOX-1 дорівнює 95кД, якій проміжні продукти солодового алкогольного тоді як молекулярна маса мутантного білка LOX-1 напою, отриманого на стадії витримування, фільтдорівнює 57кД. Мутантний білок LOX-1 позбавлерують з отриманням солодового алкогольного наний ліпоксигеназної активності, і це корелює з віпою. домим фактом, що домен, який відповідає ділянці Умови фільтрування є по суті такими самими, екзона біля 5-го інтрона в аутентичному білку LOXщо і загальноприйняті умови, і, наприклад, фільт1, є активним центром LOX рослин [Shibata and руючим матеріалом, що використовується, можуть Axelrod (1995) J. Lipid Mediators and Cell Signaling бути діатомова земля, полівінілпіролідон (PVPP), 12:213-218]. сілікагель, порошок целюлози або т.п., і темпераТаким чином, якщо ячмінь, що має мутантний тура може бути 0±1°С. ген LOX-1, використовується як сировинний матеЦя процедура дає солодовий алкогольний наріал для отримання солодових алкогольних напопій. Потім відфільтрований солодовий алкогольїв, білок LOX-1 не буде присутнім у цьому сироний напій вміщують в чан, розливають в бочки, винному матеріалі, і, отже, утворення 9розливають в пляшки або в консервні банки для гідропероксіоктадекадієнової кислоти з лінолевої транспортування на ринок, або відразу ж, або піскислоти під час цього способу отримання солодоля стерильного фільтрування чи теплової обробки. вих алкогольних напоїв буде зменшене, так що в Частка солоду, що використовується для результаті може бути досягнуте інгібування утвоотримання ячмінного алкогольного напою, особрення THOD і транс-2-ноненалю з метою отриманливо не обмежується, і алкогольний напій може ня солодових алкогольних напоїв з поліпшеними бути будь-яким напоєм, що отримується з використабільністю смаку і стійкістю піни. Таким чином, станням солоду як початкового матеріалу. Конкренуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну потно можуть бути згадані, наприклад, пиво та ігрисслідовність, представлену в SEQ ID NO:11, відпотий солодовий напій. Безалкогольне пиво і відно до даного винаходу, є у високій мірі корисбезалкогольний ігристий солодовий напій також ною для отримання солодових алкогольних напоїв вважаються солодовими алкогольними напоями, з поліпшеними стабільністю смаку і стійкістю піни. оскільки спосіб отримання, що використовується, є Нуклеїнова кислота даного винаходу забезпесхожим зі способом отримання таких солодових чує н уклеїнову кислоту, що містить нуклеотидну алкогольних напоїв, як пиво. послідовність з 10-60 суміжних основ, у тому числі Оскільки матеріал за даним винаходом не місоснову 3178, в нуклеотидній послідовності, предтить LOX-1, не відбувається легкого утворення 9ставленій в SEQ ID NO:11. Ця нуклеїнова кислота гідропероксіоктадекадієнової кислоти з лінолевої може бути використана як зонд для розрізнення кислоти і, отже, інгібується утворення THOD і між аутентичною і мутантною формами гена LOX-1 транс-2-ноненалю під час способу отримання соячменю. Тобто, оскільки основа 3178 аутентичного лодових алкогольних напоїв, і, отже, можна отригена LOX-1 є G, отримане помилкове спарювання мувати солодові алкогольні напої з поліпшеною може бути використане для розрізнення аутентичстабільністю смаку і стійкістю піни. ної та мутантної форм на основі відмінності в гібТепер будуть пояснені нуклеїнова кислота і ридизації. Наприклад, за допомогою утворення спосіб детектування присутності активності LOX-1 гібридів між цими нуклеїновими кислотами і нуклев ячмені відповідно до даного винаходу. їновою кислотою гена LOX-1, поступового збільНуклеїнова кислота даного винаходу характешення температури і вимірювання температури ризується тим, що вона містить нуклеотидну поплавлення гібридів можна легко розрізняти аутен 13 85183 14 тичний ген LOX-1 і мутантний ген LOX-1, оскільки них основ, у тому числі основ 3178-3181, як зонд їх температури плавлення будуть розрізнятися. Ця для гібридизації з обробленою рестриктазами нукнуклеїнова кислота може бути також використана леїновою кислотою можна розрізнити форму гена для розрізнення форм гена LOX-1 (аутентичLOX-1 і, о тже, зробити можливим пізнавання іденної/мутантної форм) з використанням способів, тичності основи 3178. відомих фахівцям з кваліфікацією в даній галузі. З Якщо внаслідок розпізнавання основи 3178 таточки зору специфічності, ця нуклеїнова кислота, ким чином виявляється, що ця основа є G, то мопереважно, містить нуклеотидну послідовність з жна зробити висновок, що ячмінь, який тестується, 20-50 суміжних основ, у тому числі основу 3178, і, має активність LOX-1 і не придатний як сировинпереважно, вона включає в себе основи 3178ний матеріал для солодових алкогольних напоїв з 3181. Ця нуклеїнова кислота може бути також міполіпшеними стабільністю смаку і стійкістю піни. З чена флуоресцентною речовиною, радіоактивним іншого боку, якщо цією основою є А, то можна ізотопом або т.п. зробити висновок, що ячмінь, який тестується, не Спосіб детектування присутності активності має активності LOX-1 і, отже, придатний як сироLOX-1 в ячмені відповідно до даного винаходу винний матеріал для солодових алкогольних напопередбачає стадію виділення геномної ДНК з проїв з поліпшеними стабільністю смаку і стійкістю би ячменю і стадію детектування основи 3178 нукпіни. леотидної послідовності, представленої в SEQ ID Нуклеїнова кислота даного винаходу характеNO:11, причому присутність цієї основи є показниризується також тим, що вона містить нуклеотидну ком присутності активності LOX-1 в ячмені. Згідно послідовність від положення 1 до положення 1554, з цим способом, можна дізнатися, має чи не має представлену в SEQ ID NO:10. SEQ ID NO:10 ячмінь, що тестується, ознаку недостатності актипредставляє кДНК-послідовність мутантного LOXвності LOX-1. 1, що експресується сортом ячменю SBOU2, поПроба ячменю не обмежується насінням ячзбавленого активності LOX-1. Нуклеотидна посліменю, і вона може бути листям, стеблом, корінням довність від положення 1 до положення 1554 ячменю або т.п. Нуклеїнова кислота може бути представляє кодуючу ділянку. Як пояснено вище, виділена широко відомими способами і, напримутантний білок LOX-1, що кодується цією кДНК, клад, може бути використаний спосіб СТАВ або не має амінокислотних залишків на С-кінцевому спосіб з використанням броміду етидію. боці від 5-го екзона аутентичного білка LOX-1, його Детектування основи 3178 нуклеїнової послімолекулярна маса дорівнює 57кДа і він позбавледовності, представленої SEQ ID NO:11, може виний ліпоксигеназної активності. конуватися за допомогою способу, відомого фахіТаким чином, ячмінь, що експресує цю нуклеївцям з кваліфікацією в даній галузі. Наприклад, нову кислоту, може бути використаний як сироякщо необхідно, нуклеїнова кислота, що містить винний матеріал для отримання солодових алкооснову 3178 нуклеотидної послідовності, предстагольних напоїв з метою отримання солодових вленої SEQ ID NO:11, може бути ампліфікована за алкогольних напоїв з поліпшеними стабільністю способом ампліфікації нуклеїнових кислот, таким смаку і стійкістю піни, як згадувалося вище. як ПЛР. Ідентичність основи в положенні 3178 виПриклади діленої нуклеїнової кислоти або ампліфікованого Тепер даний винахід буде пояснений більш фрагмента нуклеїнової кислоти можна розрізняти, детально за допомогою наступних прикладів, з наприклад, за допомогою нуклеїнової кислоти, що розумінням того, що ці приклади ніяким чином не є містить нуклеотидну послідовність, представлену такими, що обмежують даний винахід. SEQ ID NO:11, причому ця нуклеїнова кислота Тест пошук у 1 (пошук на LOX-1-недостатній містить послідовність з 10-60 суміжних основ, у ячмінь за допомогою вимірювання активності фетому числі основу 3178, як описано вище. рменту LOX-1) Однак спосіб детектування основи 3178 з виАктивність ферменту LOX-1 вимірювали за користанням відмінності в основах 3178-3181 гена способом, описаним нижче, а пошук на LOX-1LOX-1 є більш зручним і ефективним. Сайт основ недостатній ячмінь проводили з ресурсів генів яч3178-3181 є сайтом розщеплення рестриктаз меню. Afal/Rsal в аутентичному гені LOX-1, але внаслідок Спочатку розчин неочищеного ферменту ексттого, що основа 3178 є А у мутантному гені LOX-1, рагували з насіння ячменю за наступному спосовона не утворює сайта розщеплення для рестрикбом. Одну зрілу насінину ячменю подрібнювали таз Afal/Rsal (Фіг.5). Іншими словами, при обробці молотком і використовували 500мкл буфер у для виділеної нуклеїнової кислоти або ампліфікованоекстракції (0,1M натрій-ацетатний буфер (рН 5,5)) го фрагмента нуклеїнової кислоти рестриктазами для екстракції зі струшуванням при 4°С протягом Afal/Rsal нуклеїнова кислота аутентичного LOX-1 30 хвилин. Отриманий екстракт центрифугували буде розщеплюватися, тоді як нуклеїнова кислота протягом 10 хвилин при 15000об/хв. і потім супермутантного LOX-1 не буде розщеплюватися. Елекнатант використовували як розчин неочищеного трофоретичний аналіз обробленої рестриктазами ферменту. проби нуклеїнової кислоти буде робити можливим Потім, 5мкл розчину субстрату (40мМ лінолева розрізнення форми гена LOX-1 (а утентичної або кислота, 1,0% (маса/об'єм) водний розчин Твіна мутантної) на основі відмінності в картинах елект20) і 85мкл буфер у для екстракції додавали до рофорезу, так що може бути розрізнена ідентич10мкл розчину неочищеного ферменту і змішували ність основи в положенні 3178. Крім того, за допоразом і потім реакцію проводили при 24°C протямогою використання нуклеїнової кислоти, що гом 5 хвилин. Реакцію зупиняли додаванням і змімістить нуклеотидну послідовність з 10-60 суміжшуванням 100мкл стоп-розчину (80мМ 2,6-ди-трет 15 85183 16 бутил-п-крезол, розчин в метанолі). Після відстоюантитіла (1000-разовому розведення/TTBS) протявання реакційної суміші при -20°C протягом 30 гом 30 хвилин. Мембрану промивали TTBS тричі хвилин її центрифугували при 3000об/хв. протягом протягом 5 хвилин кожного разу, після чого прово20 хвилин і супернатант використовували в настудили реакцію протягом 30 хвилин з розчином міпній реакції з розвитком забарвлення. Частину ченого лужною фосфатазою козячого антитіла 200мкл утворюючого колір розчину (4мМ 2,6-дипроти кролячого IgG (Santa Cruz Biotechnology, трет-бутил-п-крезол, 25мМ сірчана кислота, розчин в TTBS при 1000-разовому розведенні). 0,25мМ гексагідрат сульфату амонію/заліза(ll), Після промивання цієї мембрани TTBS протягом 5 100мМ ксиленоловий оранжевий, 90% водний мехвилин´2 і потім АР9,5 (10мМ Трис-НСІ (рН 9,5), танол) додавали до 20мкл отриманого суперната0,1M хлорид натрію, 5мМ хлорид магнію) протягом нта і після відстоювання протягом 30 хвилин вимі5 хвилин´1, проводили реакцію з розчином субрювали оптичну густину при 550нм. Як негативний страту лужної фосфатази (1мг/мл нітросинього контроль реакцію проводили таким самим чином з тетразолію, 0,5мг/мл BCIP, розчину в АР9,5) для використанням розчину неочищеного ферменту, розвитку забарвлення. У результаті отримували обробленого нагріванням при 100°C протягом 5 темну смугу з молекулярною масою близько 95кДа хвилин для інактивації LOX-1, тоді як позитивний з контрольним сортом (Kendall), в той час як дві контроль використовували насіння Kendall, сорти дуже слабкі смуги детектували в ділянках молекуячменю. лярної маси близько 95кДа і близько 57кДа у виЯк показано на Фіг.1, пошук ресурсів генів не падку насіння сорту SBOU2 (Фіг.3А). виявив значущої активності LOX-1 в насінні сорту Потім пробу цього екстракту піддавали ізоелеSBOU2. Оскільки SBOU2 є місцевим сортом, він є ктричному фокусуванню (IEF, рІ 3-9) з використаншвидше спонтанним мутантом, ніж штучно мутаням PhastSystem (Amersham Pharmacia) і піддавагенізованою лінією. ли Вестерн-аналізу, як описано вище. Внаслідок Тест верифікації 1 (підтвердження відсутності аналізу з використанням SBOU2 детектували смуінгібуючої LOX-1 активності в розчинах неочищегу в положенні pI LOX-2, але ясна смуга не була ного ферменту SBOU2) присутньою в положенні pl LOX-1 (Фіг.3В). Це пеРозчини неочищеного ферменту SBOU2 виредбачає, що смуга приблизно 95кД, що виявляпробовували на присутність або відсутність інгібується у випадку екстрагованого з насіння SBOU2 ючої LOX-1 активності. білка, була білком LOX-2. Розчини неочищеного ферменту SBOU2 Ці результати підтвердили, що насіння SBOU2 (10мкл, 20мкл, 50мкл) додавали до розчину нефактично не експресує аутентичний білок LOX-1. очищеного ферменту, що виявляє активність LOXТест верифікації 3 (аналіз РНК LOX-1 насіння 1 (позитивний контроль: PC), і досліджували зміни SBOU2) активності LOX-1. Активність LOX-1 не змінювалаОТ-ПЛР проводили з використанням як матся при додаванні розчину неочищеного ферменту риці тотальної РНК, екстрагованої з приблизно 4SBOU2, і, отже, інгібуюча LOX-1 активність не витижневого дозріваючого насіння SBOU2 і 3являлася розчинами неочищеного ферменту денного насіння, яке пророщують. Реакцію провоSBOU2 (Фіг.2). Це дозволяє передбачити, що придили з використанням комерційно доступних начина недостатності активності LOX-1 в SBOU2 не борів (Roche Diagnostics, Perkin Elmer) відповідно була зумовлена інгібуючою активність LOX речодо керівництва наборів. Праймерами були 5'виною. GGAGAGGAGGCC AAGAAC AAGATG-S' (SEQ ID Тест верифікації 2 (підтвердження рівня ексNO:3) і 5'-GGTTGCCGATGGCTTAGAT-3' (SEQ ID пресії білка LOX-1 в насінні SBOU2) NO:4), сконструйовані на основі опублікованої поАнтитіло анти-LOX-1 використовували для вислідовності (DNA Databank: Accession No. L35931). значення, експресується чи не експресується білок Після інкубації при 94°С протягом 2 хвилин провоLOX-1 в насінні SBOU2. дили ПЛР з реакцією при 94°С, 1хв., 60°C, 2 хв. і Спочатку отримували антитіло анти-LOX-1. Бі72°С, 4хв., що повторяється 31 раз, з подальшою лок LOX-1, що використовується як антиген, отриреакцією подовження при 72°C, 7хв. мували очищенням білка LOX-1, що експресується При електрофорезі ампліфікованої ДНК ампE. соlі [Kuroda et al. (2002) J. Bioscience and лификацію смуги приблизно 2,5т.п.о. детектували Bioengineering 93:73-77]. Цей очищений білок видля РНК з дозріваючого і проростаючого насіння, користовували для імунізації кроликів для отриніж трохи більш низьку кількість, ніж у контролі мання антитіла проти LOX-1. Це антитіло впізнає (сорті Kendall) (Фіг.4). Це показало, що ген LOX-1 як LOX-1, так і LOX-2. був належно транскрибований. Потім проводили Вестерн-блотинг наступним Оскільки вищезазначені результати для насінчином для випробування експресії білка LOX-1 в ня SBOU2 показали, що (1) активність LOX-1 не насінні SBOU2. Частина 3мкг загального розчиннобула детектована, (2) була присутньою тільки него білка, екстрагованого з SBOU2 з використанням значна кількість антигенного білка, що реагує з 0,1M натрій-ацетатного буфера (рН 5,5), фракціоантитілом LOX-1, (3) детектували присутність білка нували електрофорезом в ДСНз молекулярною масою приблизно 57кДа і (4) при поліакриламідному гелі (електрофорезом в ДСНдетектуванні мРНК LOX-1, був зроблений висноПААГ) і потім блотували на мембрану PVDF вок, що механізмом недостатності активності LOX(Millipore). Цю мембрану промивали TTBS (20мМ 1 в SBOU2 була аберація після транскрипції. Трис-НСІ (рН 7,5), 0,15M хлорид натрію, 0,05% Тест верифікації 4 (структурний аналіз інтро(м/об.) Твін 20, 0,05% (м/об.) азид натрію) і потім нних ділянок гена LOX-1 SBOU2) використовували в реакції з розчином LOX-1 17 85183 18 Для аналізу структури ділянок інтронів і екзоці результати ОТ-ПЛР були результатами для екснів гена LOX-1 виділяли геномну ДНК ділянки, що пресованої РНК. містить все ці екзони. Тотальну ДНК з SBOU2 виПотім, для дослідження того, в яких інтронах користовували як матрицю. Праймери (5'відбулася аберація сплайсинга (3-му інтроні CACGTCGCCGTCCGATCCATC-3') (SEQ ID NO:5), (106п.о.), 4-му інтроні (132п.о.) або 5-му інтроні 5'-GGTTCCGATGGCTTAGAT-3') (SEQ ID NO:4)) (79п.о.)), цей ампліфікований фрагмент розщепконструювали на основі відомої послідовності лювали в сайті рестриктази Stul, присутньому в [DNA Databank: Accession Nos. U83904, L35931]. ділянці екзона між 4-им інтроном (132п.о.) і 5-им ПЛР проводили з реакцією при 94°С, 1хв., 65°С, інтроном. У результаті ДНК-фрагмент, що містить 2хв. і 72°С, 3хв., що повторюється 31 раз, з пода5-ий інтрон, мав рухливість, приблизно еквіваленльшою реакцією подовження при 72°С, 7хв. Отритну р ухливості одного з фрагментів ампліфікації з маний ДНК-фрагмент клонували в pCR2.1 геномної ДНК, і, отже, явно сталася аберація в (pGLXABAL1) для застосування як матриці для сплайсинга 5-го інтрона, яка або запобігала сплайструктурного аналізу. Стр уктурний аналіз провосинга, або зміщувала сайт сплайсинга до 3'дили з використанням АВІ-секвенатора, а реакцію сторони (Фіг.6В). Тобто, очевидно, що стоп-кодон, секвенування проводили за способом термінації з новоутворений, як показано на Фіг.5, зупиняв барвником. Повна структура показана в SEQ ID трансляцію білка LOX-1 SBOU2 в цьому кодоні, NO:11 у списку послідовностей. приводячи до втрати активності LOX-1. SEQ ID NO:1 списку послідовностей показує Тест верифікації 6 (структурний аналіз кДНК структур у ділянки повідомленої нуклеотидної поLOX-1 SBOU2) слідовності гена LOX-1 (WO 02053721), що містить Для з'ясування структури LOX-1, отриманої з 5-ий інтрон. Донорним сайтом сплайсинга є нуклеSBOU2, кДНК виділяли тим самим способом, який отидна послідовність 5'-GT-3' у положеннях 60-61. описаний вище. Ампліфикацію проводили з викоНуклеотидна послідовність відповідної ділянки ристанням праймера, що містить сайт BamHI і SBOU2, визначена з результатів аналізу, знахостартовий кодон (5'диться в списку послідовностей у вигляді SEQ ID GGATCCATGCTGCTGGGAGGGCTG-3' (SEQ ID NO:2. У випадку SBOU2 ясно, що гуанін у полоNO:8), і праймера, сконструйованого для включенженні 60 в донорному сайті сплайсинга мутований ня сайта HindIII і стоп-кодона (5'в аденін. AAGCTTTTAGATGGAGATGCTGTTG-3') (SEQ ID Заміна 60-ї основи SEQ ID NO:2 аденіном NO:9). Ампліфікований фрагмент клонували у векутворить новий стоп-кодон (нуклеотидна послідотор рТ7 Blue T (Novagen) (pBDC1) і потім забезпевність 5'-TGA-3' в положеннях 58-60 SEQ ID NO:2), чували структурний аналіз. Результати структурі, отже, передбачувано трансляція білка LOX-1 ного аналізу давали нуклеотидну послідовність закінчується в цій точці, якщо цей сайт сплайсинга кДНК, показану у вигляді SEQ ID NO:10. Цей кДНКніколи не змінюється в напрямку ліворуч відносно клон явно включає в себе всю ділянку 5-го інтрона 5'-кінця (Фіг.5). (основи 1554-1632 SEQ ID NO:10). Відомо, що ділянка екзона поблизу 5-го інтроТест верифікації 7 (трансформація E. соlі та на є активним центром LOX рослин [Shibata and індукована експресія) Axelrod (1995), J. Lipid Mediators and Cell Signaling Для експресії LOX-1, що походить з сорту 12:213-228], і вважається, що ви щезазначена абеSteptoe, який зберігає LOX-1 дикого типу, отримарація сплайсинга впливає великий чином на актину з Steptoe кДНК виділяли також вищеописаним вність ферменту LOX-1. способом і клонували в E. соlі (pSDC1), окремо від Тест верифікації 5 (аналіз сплайсинга в 5-ому SBOU2. BamHI-HindIII-фрагмент вирізали з кожноінтроні) ОТ-ПЛР-аналіз проводили для підтверго з клонів pSDC1 і pBDC1 і кожний з отриманих дження, що аберація сплайсинга, дійсно, мала фрагментів інсертували в сайті BamHI-Hindlll ексмісце в 5-ому інтроні. пресуючого вектора E. соlі pQE80L (Qiagen) з Тотальну РНК екстрагували з проростаючих отриманням експресуючих векторів E. coli (pSQE1 сортів SBOU2 і Kendall і для отримання матричної з інсерцією кДНК Steptoe) і pBQE1 (з інсерцією ДНК використовували комерційно доступний набір кДНК SBOU2)). Ці вектори використовували для (Roche Diagnostics) для синтезу ДНК. ПЛР провотрансформації E. coli JM109 і потім індукували дили з використанням двох різних праймерів (5'експресію за допомогою IPTG відповідно до інCCATCACGC AGGGC ATCCTG-3' (SEQ ID NO:6), 5'струкції Qiagen. У результаті індукувалася експреGCGTTGATGAGCGTCTGCCG-3' (SEQ ID NO:7)), сія смуги приблизно 95кДа в pSQE1/JM109, тоді як сконструйованих для отримання ампліфікованого експресія смуги приблизно 57кДа індукувалася з фрагмента, що містить 3-ий інтрон (106п.о.), 4-ий pBQE1/JM109 (Фіг.7). Клітини E. coli руйн ували інтрон (132п.о.) і 5-ий інтрон (79п.о.) у послідовнообробкою ультразвуком і аналізували активність сті геномної ДНК. ПЛР проводили з реакцією при LOX екстрактів неочищених ферментів. У резуль94°С, 1хв., 65°C, 2хв. і 72°C, 3хв., що повторюєтьтаті була виявлена висока активність LOX з ся 31 раз, з подальшою реакцією подовження при pSQE1/JM109, тоді як активність LOX не була ви72°С, 7хв. Електрофорез в агарозному гелі ампліявлена з pBQE1/JM109 (Фіг.8). Ці результати цілфікованих ДНК-фрагментів показав, що ампліфікоком узгодилися з результатами аналізу активності ваний фрагмент SBOU2 був приблизно на 80п.о. LOX-1 і білка LOX-1 для рослин SBCU2, що свідбільше, ніж ампліфікований фрагмент Kendall чить про те, що недостатність LOX-1 SBOU2 може (Фіг.6А). Фрагмент приблизно 1,2т.п.о. ампліфікубути відтворена в E. coli. вали з геномної ДНК SBOU2, що передбачає, що Тест верифікації 8 (тест обміну інсерцій та експресії) 19 85183 20 Потім PstI-StuI-фрагмент, що містить мутацію Внаслідок випробування поліморфізму поков донорному сайті сплайсинга 5-го інтрона pBQE1 ління F2 за способом Afal і вимірювання активності (сайт Stul знаходиться в основах 1502-1507 SEQ LOX насіння F3 розщеплення ознаки дефектного ID NO:10, а сайт Pstl знаходиться в основах 2048LOX-1 SBOU2 точно співпадало з розщепленням 2053 SEQ ID NO:10), піддавали взаємному обміну поліморфізму за способом Afal. Таким чином, ці з PstI-StuI-фрагментом pSQE1 дикого типу серії генетичних аналізів ясно показали, що дефе(pSQE1+BPS, pBQE1+SPS) і експресію індукували ктний ген LOX-1 SBOU2 знаходиться в генному в E. coli, як описано вище. У результаті з локусі LOXA. pSQE1+BPS/JM109, що має фрагмент, який похоЦі результати показали також, що застосувандить з pBQE1 Pstl-StuI, що містить мутацію в доня способу Afal як приклад способу відбору ячменорному сайті сплайсинга 5-го інтрона, вбудованю з використанням мутації ДНК дозволяє провесний в pSQE1, була індукована експресія білка ти відбір LOX-1-недостатніх ліній потомства на приблизно 57кДа (Фіг.7) і активність LOX-1 буларанній стадії росту, що усуває необхідність очікувтрачена (Фіг.8), подібно pBQE1/JM109. Навпаки, з вання до часу дозрівання насіння. pBQE1+SPS/JM109, що має фрагмент, який похоПриклад 1 дить з pSQE1 Pstl-StuI, вбудований в pBQE1, була (Дослідження поліморфізму Afal інших сортів індукована експресія білка приблизно 95кДа (Фіг.7) ячменю) і була відновлена активність LOX (Фіг.8), що схоже Звичайні сорти/лінії ячменю використовували з pSQE1/JM109. Нуклеотидна послідовність PstIдля дослідження поліморфізму Afal Загалом викоStuI-фрагмента pBQE1 була точно ідентичною ристали 32 сорти/лінії: Mikamo Golden, Golden гену LOX-1 дикого типу, за винятком донорного Melon, Haruna Nijo, Myogi Nijo, Sakitama Nijo, сайта сплайсинга 5-го інтрона (G замінений на А в Wasedori Nijo, Agurimochi, Harupin Nijo, Ryofu, основі 1554 SEQ ID NO:10). Ці результати ясно Hokuiku 33, Hokuiku 35, Prior, Schooner, Sloop, Lofty продемонстрували, що присутність або відсутність Nijo, Franklin, Betzes, Harrington, Manley, B1251, мутації в донорному сайті сплайсинга 5-го інтрона CDC Kendall, CDC Stratus, CDC Copeland, Hanna, SBOU2 визначає, чи присутня активність LOX-1. Merit, AC Metcalfe, TR145, Chariot, Stirling, Proctor, Тест верифікації 9 (картування та відбір гібриKoral та Heartland. В результаті дослідження полідного сорту ячменю з використанням мутації 5-го морфізму за способом Afal було визначено, що інтрона) перевірені сорти не були сортами типу SBOU2, У сполученій нуклеотидній послідовності LOXале, замість цього, розщеплювалися в сайті рест1, послідовність, що містить донорний сайт сплайриктази Afal, що містить донорний сайт сплайсинга синга 5-го інтрона (нуклеотиди 60-63 SEQ ID NO:1: 5-го інтрона (нуклеотиди 60-63 SEQ ID NO:1: 5'GTAC-3'), може бути відщеплена рестриктазою 5'GTAC-3') (Фіг.11). Це показало, що ці життєздатні Afal (або Rsal), яка впізнає послідовність GTAC. лінії не мають мутації ДНК в сайті Afal (нуклеотиДефектний ген LOX-1 був картований з викорисдах 60-63 SEQ ID NO:1: 5'GTAC-3'), і, отже, спосіб танням того факту, що в послідовності цієї ділянки Afal може бути ефективно використаний для відв лінії SBOU2 присутня мутація (нуклеотиди 60-63 бору дефектних генів LOX-1 серед ліній потомстSEQ ID NO:2: 5'-АТАС-3'), яка запобігає розщепва. ленню рестриктазами Afal і/або Rsal (Фіг.5). ЕкстПриклад 2 рагували ДНК з листя 144 індивідуумів 2-го дочір(Пошук у ресурса х генів) нього покоління гібридів (F2) схрещування між Всесвітньо відомі ресурси генів ячменю (місKendall і лінією SBOU2 і проводили ПЛР з викорисцевого сорту), що зберігаються в Okayama танням двох різних праймерів (5'University, досліджували з використанням способу CCATCACGC AGGGC ATCCTG-3' (SEQ ID NO:6), 5'Afal. У результаті були виявлені п'ять нових ліній GCGTTGATGAGCGTCTGCCG-3' (SEQ ID NO:7)), (SBOU1, SBOU3, SBOU4, SBOU5 і SBOU6, що сконструйованих таким чином, що ампліфікований зберігаються в Okayama University), які не розщепфрагмент повинен містити сайт Afal. ПЛР проволялися в сайті рестрикатази Afal, що містить донодили з реакцією при 94°C, 1хв., 65°С, 2хв. і 72°С, рний сайт сплайсинга 5-го інтрона (нуклеотиди 603хв., що повторюється 31 раз, з подальшою реак63 SEQ ID NO:1: 5'GTAC-3')(Фіг.l2). цією подовження при 72°С, 7хв. Кожний з ампліфіАктивність LOX-1 насіння цих ліній вимірювали кованих фрагментів розщеплювали Afal і аналізуза способом, описаним у тесті 1 пошук у. Вимірювали електрофорезом в 2,5% агарозному гелі вання активності для SBOU5 і SBOU6 проводили (далі ця процедура буде називатися "способом реакцією протягом 5 хвилин (Фіг.13A), тоді як виміAfal"). У результаті можна було легко виконувати рювання активності для SBOU1, SBOU3 і SBOU4 розрізнення між SBOU2, Kendall і гетеротипами проводили з подовженим часом реакції 90 хвилин (Фіг.9). Крім випробування поліморфізму за спосодля точної ідентифікації активності (Фіг.13В). У бом Afal, поліморфізм у кожному сорті випробовурезультаті в жодній з цих ліній не була виявлена вали також з використанням маркера ДНК значуща активність (Фіг.13). (JBC970) поблизу генного локусу LOXA хромосоми Це ясно продемонструвало, що SBOU2, а та4Н ячменю, що несе ген LOX-1 (Фіг.10). кож SBOU1, SBOU3, SBOU4, SBOU5 і SBOU6 Зріле насіння кожного з індивідуумів F2 вико(LOX-1-недостатній ячмінь типу SBOU2) були лініристали для випробування активності LOX-1 наями ячменю, позбавленими LOX-1. Оскільки всі ці сіння. Для ліній, що не виявляють активності LOX, лінії є місцевими сортами (створеними поліпшуюактивність вимірювали з використанням декількох чим відбором), а не штучно мутагенізованими ліні(4-7) насінин (Фіг.10). ями, вони представляють спонтанні мутанти гена LOX-1. 21 85183 22 Вищеописані результати показали, що спосіб Спочатку вимірювали кількість транс-2Afal, як приклад способу відбору ячменю з викориноненалю в конгресному суслі за наступним спостанням мутації ДНК, є способом, що робить можсобом. Пробу сусла 8мл вміщували у флакон, доливим не тільки відбір ліній потомства LOX-1давали 3г NaCl і флакон закривали кришкою. Понедостатньогоячменю, але також ефективний тім у верхній простір цього флакона вставляли відбір LOX-1-недостатнього ячменю з генних реполідиметилсилоксанове волокно SPME (Supelco, сурсів ячменю. Inc.) і флакон інкубували при 40°C протягом 15 Приклад 3 хвилин. (Вирощування ячменю для випробування ваПотім це волокно вставляли в інжекційний ріння напоїв) отвір приладу для газової хроматографії/масСорт ячменю Taishomugi схрещували з SBOU2 спектрометрії, обладнаного колонкою J&W DB-1 як і отримане перше дочірнє покоління (F1) самозакапілярною колонкою (30м´0,25мм, товщина плівпилювали для отримання покоління F2. Ознаку ки: 1мкм). Як газ-носій використовували гелій недостатності LOX-1 підтверджували за допомо(1мл/хв) і умови печі були 60°С-225°С (5°C за хвигою способу вимірювання активності ферменту лину), у режимі відбору іонів (m/z: 70). Кількісне LOX-1, описаного в тесті пошуку 1 і за допомогою визначення виконували стандартним способом з способу Afal, описаного в тесті верифікації 9 вище, використанням транс-2-ноненалю (Sigma) як стані групу LOX-1-недостатніх ліній і групу LOX-1дартної проби. зберігаючих ліній забезпечували у вигляді популяУ результаті, концентрації транс-2-ноненалю цій для розмноження насіння, як описано нижче. конгресних сусел, що отримуються з використанРозмноження насіння проводили для кожної ням LOX-F4 і LOX+F4, були 0,36млд.ч. (мільярдних лінії (популяції) з використанням одноманітної дічасток) і 3,85млд.ч. (мільярдних часток), відповідлянки або оранжереї, доки не отримували насіння но. Таким чином, було показано, що утворення F4. При визначенні активності ферменту LOX-1 сусла з використанням солоду відповідно до данонасіння F4 було виявлено, що відповідні ознаки го винаходу робить можливим таке інгібування активності LOX-1 індивідуумів F2 зберігалися, що утворення транс-2-ноненалю, як 1/10 або менше свідчить про те, що ознака недостатності LOX-1 звичайного сусла. стабільно передається потомству. Потенціал ноненалю конгресного сусла виміНасіння F4 використовували для наступного рювали наступним способом. Спочатку конгресне випробування отримання солоду і випробування сусло кип'ятили протягом 2 годин за способом отримання солодових алкогольних напоїв. Drost et al. [Drost, B.W. van den Berg, R., Freijee, Приклад 4 F.J.M., van der Velde, E.G., and Hollemans, M., J. (Отримання солоду для випробування варіння Am. Soc. Brew. Chem., 48, 124-131, 1990]. Потім напоїв) кількість транс-2-ноненалю в пробі вимірювали за Отримували популяцію F4 LOX-1способом вимірювання транс-2-ноненалю, описанедостатнього ячменю (LOX-F4), що містить насінним вище, і розраховували потенціал ноненалю ня ячменю, яке не має активності LOX-1, і популяконгресного сусла. цію F4, що зберігає активність LOX, (LOX+F4), з У результаті потенціали ноненалю конгресних насіння ячменю з LOX-1, причому обидві популяції сусел, що використовують LOX-F4 і LOX+F4, були походили зі схрещування Taishomugi ´ SBOU2, і 2,74млд.ч. (мільярдних часток) і 11,9млд.ч. (мільявикористовували їх для отримання солоду. рдних часток), відповідно. Оскільки потенціал ноОтримання солоду проводили з використанненалю відомий як показник старіння продукту ням Automatic Micromalting System (Phoenix [Drost, B.W., et al., J. Am. Soc. Brew. Chem., 48, Systems) в умовах з температурою замочування 124-131, 1990; Ueda et al. (2001) EBC-proceedings 16°С протягом загалом 82 годин (цикл 5год. водя55:p3 28th Congress], солод, отриманий з ячменю не замочування/7год. сухий стан), пророщування відповідно до даного винаходу, може бути викорипри 15°С протягом 139 годин і пічного сушіння станий для варіння солодових алкогольних напоїв протягом 29 годин (55°C протягом 13,5 годин, 65°С для значного поліпшення стабільності смаку солопротягом 8 годин, 75°C протягом 3,5 годин, 83°C дових алкогольних напоїв. протягом 4 годин). Концентрації транс-2-ноненалю і потенціали Приклад 5 ноненалю в конгресних сусла х, отриманих з вико(Аналіз солоду і конгресного сусла) ристанням LOX-F4, показані на Фіг.15 у порівнянні Солод аналізували відповідно до стандартного з концентраціями і потенціалами транс-2способу EBC [European Brewery Convention ed., ноненалю, отриманими з використанням комерAnalytica EBC (4 th Ed.), 1987]. У результаті, не виційно доступного солоду. Як видно з результатів, являли значущої відмінності в результатах аналізу показаних на Фіг.15, сусла даного винаходу виявсолоду між солодами, що використовують LOX-F4 ляли величини, які не були такими, що досягаютьі LOX+F4, що свідчить про те, що вони можуть ся зі звичайним ячменем. бути використані для варіння солодових алкогольЦі результати показали, що використання ячних напоїв з метою порівняння присутності або меню відповідно до даного винаходу дозволяє відсутності активності LOX-1 (Фіг.14). отримувати солод з поліпшеним рівнем якості, щоПотім, 50г цього солоду використовували для не виявляється зі звичайними продуктами. отримання сусла відповідно до стандартного конКонцентрації THOD конгресних сусел вимірюгресного способу [European Brewery Convention вали, використовуючи метод високоефективної ed., Analytica EBC (4th Ed.), 1987] та аналізували рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (BPXокислення ліпідів в конгресному суслі. MC). Умови BPX були наступними. Швидкість 23 85183 24 струму рухомої фази була 0,3мл/хв, з використанПеред кип'ятінням відфільтроване сусло зміням змішаного розчину 0,5% оцтової кислоти (Розшували з 5кг крохмального сиропу (75% сахаричину А) і ацетонітрилу (розчину В) як рухомої фадів). До сусла додавали 13г гранул хмелю (87,0 BU зи, з лінійним градієнтом розчин А:розчин В=35:65 (одиниць гіркоти) (EBC)). Після кип'ятіння протягом (0хв.) - розчин А:розчин В=5:95 (30хв.). Використо70 хвилин переварене сусло охолоджували до вували колонку Waters Asymmetry column (No. 10°C. Вміст екстракту охолоджених сусел доводили додаванням води до 11,6-11,8%. 106005; C18, 3,5mkm: 2,1´150мл), температура колонки була 50°C, і використовували систему Отримані сусла аналізували відповідно до стандартних способів EBC [European Brewery Model 1100 HPLC (Hewlett-Packard) для відділення Convention ed., Analytica EBC (4th Ed.), 1987]. Репроби 5мкл сусла або солодових алкогольних назультати аналізу показані в таблиці 1. Як видно з поїв. Аналіз маси виконували з використанням таблиці 1, не було виявлено чіткої відмінності між Waters ZQ, з моніторингом маси 329 в негативному режимі електророзпилюючої (ES) іонізації. ПочатLOX-F4 і LOX+F4 відносно цих показників. ковим стандартним розчином THOD була проба Таблиця 1 екстракту пива [Kobayashi, N., et al., J. Biosci. Bioeng., 90, 69-73, 2000]. У результаті, концентрації THOD конгресних Сорт LOX+F4 LOX-F4 сусел, що використовують LOX-F4 і LOX+F4, були Питома вага (відносна щільність) 1,0475 1,0467 6,5млд.ч. (мільярдних часток) і 14,7млд.ч. (мільярЕкстракт (%) 11,78 11,60 дних часток), відповідно, що демонструє можлиДійсний неферментований екст3,45 3,38 вість інгібування концентрації THOD сусла до ½ ракт (%) або до більш низької концентрації при отриманні Дійсне зброджування (%) 70,7 70,9 сусла з використанням солоду відповідно до даноУявний неферментований екст1,54 1,52 го винаходу. ракт (%) Як згадувалося вище, THOD утворюється пеМежа уявного зброджування (%) 86,9 86,9 ретворенням з лінолевої кислоти під дією LOX-1 рН 5,88 5,93 солоду і пероксигеназної активності солоду на Колір (°EBC) 2,1 2,1 стадії затирання, але оскільки, як вважають, актиBU (одиниці гіркоти) 31,2 27,3 вність пероксигенази солоду є стадією для утвоЗагальний азот (мг/100мл) 24 22 рення THOD, що обмежує швидкість [Kuroda, H., et Поліфенол (мг/л) 44 48 al., J. Biosci. Bioeng., 93, 73-77, 2002], не було ясFAN (мг/л) 46 51 но, до якої міри зменшена активність LOX-1 інгібує утворення THOD. Однак результати в прикладах, 2. Отримання солодового алкогольного напою забезпечених в даному описі, показали, що вико(Happoshu, алкогольного напою з низьким вмістом ристання солоду, отриманого з насіння ячменю солоду) без активності LOX-1, зменшує концентрацію Сусло, отримане вище в 1, переносили в стеTHOD в суслі. Оскільки THOD присутній до кінцерилізований парою циліндрично-конічний чан на вого продукту, не метаболізуючись дріжджами 30л і потім додавали дріжджі до початкової конце[Kobayashi, N., et al., J. Inst. Brew., 106, 107-110, нтрації 30 мільйонів клітин на мл для головного 2000], використання солоду, отриманого з ячменю (власне) бродіння при 13°С. Коли вміст екстракту в відповідно до даного винаходу, може явно призворідині, що зброджується, падав до 2,5%, її перенодити до отримання солодових алкогольних напоїв сили в новий подібний чан для стадії витримуванз хорошими якістю смаку і стійкістю піни. ня. Стадію витримування проводили при 13°C Приклад 6 протягом перших 6 днів і потім при 0°C протягом 2 (Випробування варіння солодових алкогольтижнів після цього. них напоїв) Після завершення стадії витримування збро1. Отримання та аналіз сусла джувану рідину подавали в апарат фільтрування і Солод LOX-F4 і солод LOX+F4, отриманий у розливу пива. Солодовий алкогольний напій фільприкладі 4 вище, затирали з використанням затотрували і розливали в пляшки. рного апарату 50-літрового масштабу відповідно 3. Аналіз солодового алкогольного напою до стандартних способів затирання для Happoshu, Солодовий алкогольний напій, отриманий виалкогольного напою з низьким вмістом солоду ще в 2, аналізували таким чином. (вміст солоду: 24%). Умови затирання були настуАналіз відповідно до стандартного способу пними. EBC показує, що не було виявлено значущої відЗатирали 1,5кг кожного солоду окремо з 15л мінності між LOX-F4 і LOX+F4 відносно параметрів заторної води відповідно до схеми 50°С протягом загального аналізу, інших, ніж параметри окислен20хв., 65°C протягом 30хв. і 75°C протягом 3хв. ня ліпідів (таблиця 2). Після затирання проводили фільтрування пивного сусла з використанням фільтрувального чана. Отримували 35л відфільтрованих сусел. 25 85183 Таблиця 2 Сорт LOX+F4 LOX-F4 Питома вага (відносна щільність) 1,00562 1,00565 Початковий екстракт сусла (%) 11,82 11,56 Дійсний екстракт (%) 3,43 3,38 Дійсне зброджування (%) 71,0 70,7 Уявний екстракт (%) 1,44 1,45 Уявне зброджування (%) 87,8 87,4 Спирт (об.%) 5,5 5,35 Спирт (мас.%) 4,33 4,21 рН 3,51 3,28 Тиск газу (20°C) кг/см 2,35 2,55 Колір (0EBC) 1,5 1,7 Загальний азот (мг/100мл) 16 19 BU 11,6 9,5 Поліфенол (мг/л) 45 43 FAN (мг/л) 10 12 Стійкість піни солодового алкогольного напою, отриманого вище в 2, аналізували наступним способом. Аналіз стійкості піни проводили за способом NIBEM. При аналізі стійкості піни з використанням тестера піностійкості Haffmans (таблиця 3) ячмінь LOX-F4 мав явно більш високу стійкість піни, причому величина NIBEM була на 21 бал вище, ніж у випадку ячменю LOX+F4. Також, як і результат вимірювання концентрації THOD за способом, описаним у прикладі 5 вище, виявилося зменшення вмісту THOD LOX-F4 до менше, ніж половини вмісту THOD LOX+F4 (таблиця 3). Ці результати ясно показали, що спосіб отримання солодових алкогольних напоїв даного винаходу дозволяють отримувати солодовий алкогольний напій зі зниженим вмістом THOD і поліпшеним збереженням піни. Таблиця 3 Сорт NIBEM THOD (мг/л) LOX+F4 239 3,6 LOX-F4 260 1,7 Потім солодовий алкогольний напій, отриманий вище в 2, піддавали наступному сенсорному аналізу, що виконується 13 членами комісії з оцінки якості харчових продуктів. Спочатку солодові алкогольні напої LOX-F4 і LOX+F4 зберігали при 37°С протягом одного тижня. Потім їх наливали в чашки при звичайній температурі споживання напоїв і забезпечували сенсорний аналіз членами комісії з оцінки якості харчових продуктів для оцінки нестандартного смаку і загальної несвіжості по шкалі 0-4 (причому більш високий показник представляє прогресуюче старіння) (таблиці 4А, В). У результаті 10 з 13 членів комісії дали більш низькі бали LOX-F4 відносно нестандартного смаку, і, отже, LOX-F4 виявляв більш низький бал (середнє), ніж LOX+F4. Було визначено, що ця відмінність відповідно до парного t-критерію є значущою при 5% ймовірності (таблиця 4A). 26 Відносно загальної несвіжості, 11 з 13 членів комісії дали більш низькі бали LOX-F4, і, отже, LOX-F4 виявляв більш низький бал (середнє), ніж LOX+F4. Було визначено, що ця відмінність відповідно до парного t-критерію є значущою при 5% ймовірності (таблиця 4В). Описані вище сенсорний аналіз і статистичний аналіз показали, що LOX-F4 мав менші нестандартний смак і загальну несвіжість, ніж LOX+F4. Таблиця 4А Нестандартний смак Член комісії 1 Член комісії 2 Член комісії 3 Член комісії 4 Член комісії 5 Член комісії 6 Член комісії 7 Член комісії 8 Член комісії 9 Член комісії 10 Член комісії 11 Член комісії 12 Член комісії 13 Середнє LOX+F4 3 1 3 2,5 2 2,5 2,5 2,5 1 2,5 2 2,5 2 2,2 LOX-F4 2 2 2 2,5 2 2 1,5 1 0,5 2 1,5 2 1,5 1,7 Таблиця 4B Загальна несвіжість, смак Член комісії 1 Член комісії 2 Член комісії 3 Член комісії 4 Член комісії 5 Член комісії 6 Член комісії 7 Член комісії 8 Член комісії 9 Член комісії 10 Член комісії 11 Член комісії 12 Член комісії 13 Середнє LOX+F4 2,5 1 3 3 2,5 2,5 2,5 2,5 1 2,5 2 2,5 2 2,3 LOX-F4 2 2 2 2,5 2 2 1,5 1,5 0,5 2 1,5 2,5 1,5 1,8 Внаслідок вимірювання вмісту транс-2ноненалю солодового алкогольного напою, отриманого вище в 2, LOX-F4 мав більш низький вміст транс-2-ноненалю до і після зберігання при 37°С протягом одного тижня. Вміст транс-2-ноненалю LOX-F4 зменшувався до приблизно 1/3 у порівнянні з вмістом транс-2-ноненалю LOX+F4 після зберігання (таблиця 5). Таблиця 5 Концентрація транс-2ноненалю Перед зберіганням Після зберігання (Одиниці: млд.ч.) LOX+F4 LOX-F4 0,02 0,35 0,01 0,12 27 85183 Ці результати сенсорного аналізу і результати аналізу вмісту транс-2-ноненалю в солодових алкогольних напоях показали, що спосіб отримання солодових алкогольних напоїв даного винаходу дозволяє отримувати солодові алкогольні напої з поліпшеною стабільністю смаку. Нарешті, «тіло» (екстрактивність) та однорідність солодового алкогольного напою, отриманого вище в 2, аналізували сенсорним аналізом і з використанням ліпідної мембрани як датчика. Спочатку сенсорний аналіз проводився 13 висококваліфікованими членами комісії для порівняння якості смаку. Солодові алкогольні напої LOX-F4 і LOX+F4 були забезпечені для сенсорного аналізу, а "тіло" (екстрактивність) й однорідність оцінювали за шкалою 0-4 (причому більш високі бали означають більш наповнене "тіло" і кращу однорідність) (таблиця 6). Відносно "тіла" не було виявлено значущої відмінності (рівень ймовірності 5%) між LOX-F4 і LOX+F4 (таблиця 6A). Що стосується однорідності, 8 з 13 членів комісії дали більш високі бали LOX-F4 (таблиця 6В). LOX-F4 мав більш високий бал (середнє), ніж LOX+F4, і було визначено, що відмінність відповідно до парного t-критерію була значущою при 5% рівні ймовірності. Ці результати показали, що варіння солодових алкогольних напоїв з використанням LOX-F4 може поліпшува ти однорідність без впливу на "тіло" (екстрактивність) напою. Таблиця 6А Тіло Член комісії 1 Член комісії 2 Член комісії 3 Член комісії 4 Член комісії 5 Член комісії 6 Член комісії 7 Член комісії 8 Член комісії 9 Член комісії 10 Член комісії 11 Член комісії 12 Член комісії 13 Середнє LOX+F4 2 3 3 3,5 3 2 2 3 3 2,5 3 2 2 2,6 LOX-F4 1 2 2,5 3,5 3 2 2 2 2 2,5 2 3 3 2,3 Таблиця 6В Однорідність Член комісії 1 Член комісії 2 Член комісії 3 Член комісії 4 Член комісії 5 Член комісії 6 Член комісії 7 Член комісії 8 Член комісії 9 Член комісії 10 LOX+F4 1 1 1,5 3 1 2 2 1,5 1 1,5 LOX-F4 2 3 3 3 1 2 3 3 2 2 Член комісії 11 Член комісії 12 Член комісії 13 Середнє 28 2 3 3 1,8 3 2 2 2,4 «Тіло» й однорідність оцінювали також з використанням ліпідної мембрани як датчика відповідно до способу Kaneda et al. [Kaneda, H. et al., J. Biosci. Bioeng., 92, 221-226,2001] (таблиця 7). «Тіло» оцінювали на основі адсорбції на ліпідну мембрану, і результати не показали значущої статистичної відмінності (при 5% рівні ймовірності) між адсорбцією з LOX-F4 і LOX+F4 (таблиця 7A). Однорідність оцінювали на основі тривалості адсорбції на ліпідну мембрану (з більш високою тривалістю адсорбції, що показує гіршу однорідність), і LOX-F4 виявляв залишок приблизно ¼ у порівнянні з LOX+F4 зі значущою відмінністю при рівні ймовірності 1% (таблиця 7В). Таблиця 7А Тіло LOX+F4 LOX-F4 Адсорбція 189 187 Cт. відхилення 4 3 (Одиниці: Гц) (Немає значущої відмінності при рівні ймовірності 5%) Таблиця 7В Однорідність LOX+F4 LOX-F4 Залишок 12 3 Cт. відхилення 3 3 (Одиниці: Гц) (Значуща відмінність при рівні ймовірності 1%) Досі не була виявлена кореляція між активністю LOX-1 і рівнями утворення THOD ячменю в стадіях затирання [Kobayashi, N. et al., (2000), J. Biosci. Bioeng. 90:69-73], і було неясно, до якої міри утворення THOD зменшується інгібуванням LOX-1 ячменю. Крім того, у попередньому рівні техніки було неможливо передбачити, чи може однорідність посилюватися внаслідок такого інгібування LOX-1 ячменю. Однак результати сенсорного аналізу та аналіз «тіла» й однорідності продукту з використанням ліпідної мембрани як датчика в прикладах, наведених у даному описі, показали вперше, що ячмінь, який містить заявлений тут ген, може бути використаний для збільшення однорідності продукту без впливу на «тіло» продукту. Приклад 7 (Випробування варіння солодових алкогольних напоїв з використанням обробленого ячменю) 1. Отримання та аналіз сусла З використанням обробленого ячменю LOX-F5 і LOX+F5, наступних поколінь ліній, отриманих у прикладі 3 вище, додаткове затирання проводили з використанням заторного апарату в масштабі 50л відповідно до стандартних способів затирання для Happoshu, солодового алкогольного напою з низьким вмістом солоду (вміст солоду: 24%, вміст 29 85183 30 обробленого ячменю: 76%). Умови затирання були загального аналізу, інших, ніж параметри окисленнаступними. ня ліпідів (таблиця 9). 1,2кг комерційно доступного солоду для варіння і 3,8кг кожного обробленого ячменю затирали з Таблиця 9 20л заторної води відповідно до схеми: 50°C протягом 30хв., 65°C протягом 60хв. і 75°C протягом Сорт LOX+F5 LOX-F5 3хв. (додавали ферменти, такі як a-амілаза та bПитома вага (відносна щільність) 1,00307 1,00338 глюканаза, внаслідок високого вмісту обробленого Початковий екстракт сусла 7,77 7,60 ячменю). Після затирання проводили фільтруванДійсний екстракт (%) 2,11 2,14 ня сусла з використанням фильтрувального чана. Дійсне зброджування (%) 73,7 72,7 Отримували 40л відфільтрованих сусел. Уявний екстракт (%) 0,79 0,87 В отримані відфільтровані сусла додавали 53г Уявне зброджування (%) 89,9 88,6 гранул хмелю (одиниці гіркоти: 25,6 BU (EBC)). Спирт (об.%) 3,62 3,49 Після кип'ятіння протягом 80 хвилин переварене Спирт (мас.%) 2,86 2,75 сусло охолоджували до 10°C. Вміст екстракту охорН 4,58 4,59 лоджених сусел доводили додаванням води до Тиск газу (20°C), кг/см 2,29 2,38 7,5-7,6%. Колір (°EBC) 4,0 4,2 Отримані сусла аналізували відповідно до Загальний азот (мг/100мл) 28 27 стандартних способів EBC. Величини аналізу поBU (одиниці гіркоти) 16,8 15,3 казані в таблиці 8. Як видно в таблиці 8, не було виявлено чіткої відмінності між LOX-F5 і LOX+F5 Поліфенол (мг/л) 111 91 відносно цих показників. FAN (мг/л) 16 16 Таблиця 8 Сорт LOX+F5 LOX-F5 Питома вага ( відносна щіль1,0303 1,0296 ність) Екстракт (%) 7,63 7,46 Дійсний неферментований екст2,00 2,06 ракт (%) Дійсне зброджування (%) 73,8 72,4 Уявний неферментований екст0,67 0,71 ракт (%) Межа уявного зброджування (%) 91,2 90,5 PH 5,69 5,71 Колір (°EBC) 5,7 6,5 BU (одиниці гіркоти) 31,7 30,9 Загальний азот (мг/100мл) 45 47 Поліфенол (мг/л) 159 137 FAN (мг/л) 72 72 2. Отриманнясолодового алкогольного напою (Happoshu, алкогольного напою з низьким вмістом солоду) Сусло, отримане вище в 1, переносили в стерилізований парою циліндрично-конічний чан на 30л і потім додавали дріжджі до початкової концентрації 30 мільйонів клітин на мл для головного (власне) бродіння при 15°С. Коли вміст екстракту в зброджуваній рідині падав до 1,3%, її переносили в новий подібний чан для стадії витримування. Стадію витримування проводили при 13°C протягом перших 5 днів і потім при 0°C протягом 2 тижнів після цього. Після завершення стадії витримування зброджувану рідину подавали в апарат фільтрування та розливу пива. Солодовий алкогольний напій фільтрували і розливали в пляшки. 3. Аналіз солодового алкогольного напою Солодовий алкогольний напій, отриманий вище в 2, аналізували таким чином. Аналіз відповідно до стандартного способу EBC показує, що не було виявлено значущої відмінності між LOX-F5 і LOX+F5 відносно параметрів Стійкість піни солодового алкогольного напою, отриманого вище в 2, аналізували наступним способом. Аналіз стійкості піни проводили за способом NIBEM. При аналізі стійкості піни з використанням тестера піностійкості Haffmans (таблиця 10) ячмінь LOX-F5 мав явно більш високу стійкість піни, причому величина NIBEM була на 17 балів ви ще, ніж у випадку ячменю LOX+F5. Також, як і результат вимірювання концентрації THOD за способом, описаним у прикладі 5 вище, виявлялося зменшення вмісту THOD солодового алкогольного напою LOX-F5 до менше, ніж половини вмісту THOD LOX+F5. Ці результати ясно показали, що спосіб отримання солодових алкогольних напоїв даного винаходу дозволяє отримувати солодовий алкогольний напій зі зниженим вмістом THOD і поліпшеним збереженням піни. Таблиця 10 Сорт NIBEM THOD (відношення площ піків) LOX+F5 LOX-F5 279 296 728 237 Ці величини THOD показують відносні величини, де площі піків внутрішнього стандарту дорівнюють 100. Потім солодовий алкогольний напій, отриманий вище в 2, піддавали наступному сенсорному аналізу, що виконується 13 членами комісії з оцінки якості харчових продуктів. Конкретний спосіб цього сенсорного аналізу є таким самим, як описаний у прикладі 6. У результаті 11 з 13 членів комісії дали більш низькі бали LOX-F5 відносно нестандартного смаку, і, отже, LOX-F 5 виявляв більш низький бал (середнє), ніж LOX+F5. Було визначено, що ця відмінність відповідно до парного t-критерію є значущою при 5% імовірності (таблиця 11А). Відносно загальної несвіжості, 12 з 13 членів комісії дали більш низькі бали LOX-F5, і, отже, 31 85183 32 LOX-F5 виявляв більш низький бал (середнє), ніж Приклад 8 LOX+F5. Було визначено, що ця відмінність відпо(Випробування варіння солодових алкогольвідно до парного t-критерію є значущою при 5% них напоїв) ймовірності (таблиця 11В). 1. Отримання й аналіз сусла Описані вище сенсорний аналіз і статистичний Солод LOX-F4 і LOX+F4, отриманий за спосоаналіз показали, що LOX-F5 мав менші нестандарбом, описаним у прикладі 4, затирали з використний смак і загальну несвіжість, ніж LOX+F5. танням заторного апарату 50-літрового масштабу відповідно до стандартних способів затирання для Таблиця 11A пива (вміст солоду: 71%). Умови затирання були наступними. 5,0кг кожного випробуваного солоду, вказаноНестандартний смак LOX+F5 LOX-F5 го вище, і 2,0кг домішки (кукурудзяного крохмалю, Член комісії 1 2 1,5 кукурудзяної крупи та дробленого рису) затирали з Член комісії 2 3 2 23л заторної води відповідно до схеми: 50°C проЧлен комісії 3 3 2 тягом 20хв., 65°C протягом 40хв. і 75°C протягом Член комісії 4 2 1,5 3хв. Після затирання проводили фільтрування Член комісії 5 3 2 пивного сусла з використанням фільтрувального Член комісії 6 2 1 чана. Отримували 40л відфільтрованих сусел. Член комісії 7 2,5 3 До отриманих відфільтрованих сусел додаваЧлен комісії 8 2 1 ли 40г гранул хмелю (44,9 BU (одиниць гіркоти) Член комісії 9 2,5 2 (EBC)). Після кип'ятіння протягом 90 хвилин переЧлен комісії 10 2 1 варене сусло охолоджували до 10°C. Вміст екстЧлен комісії 11 3 2 ракту охолоджених сусел доводили додаванням Член комісії 12 2,5 1,5 води до 10,8-11,1%. Член комісії 13 2 3 Отримані сусла аналізували відповідно до стандартних способів EBC. Результати аналізу Середнє 2,4 1,8 показані в таблиці 13. Як видно з таблиці 13, не було виявлено чіткої відмінності між LOX-F4 і Таблиця 11В LOX+F4 відносно цих показників. Загальна несвіжість, смак LOX+F5 LOX-F5 Таблиця 13 Член комісії 1 2 1,5 Член комісії 2 3 1 Сорт LOX+F4 LOX-F4 Член комісії 3 3,5 1,5 Питома вага (відносна щільність) 1,0444 1,0433 Член комісії 4 2 1,5 Екстракт (%) 11,05 10,79 Член комісії 5 3 2 Дійсний неферментований екстЧлен комісії 6 2 1 3,05 3,05 ракт (%) Член комісії 7 2,5 3 Дійсне зброджування (%) 72,4 71,7 Член комісії 8 2 1 Уявний неферментований екстЧлен комісії 9 3 2 1,251,31 ракт (%) Член комісії 10 2 1 Межа уявного зброджування (%) 88,7 87,9 Член комісії 11 3 2 PH 5,71 5,68 Член комісії 12 2,5 1,5 Колір (°EBC) 6,3 6,5 Член комісії 13 3 1,5 BU (одиниці гіркоти) 38,0 38,2 Середнє 2,6 1,6 Загальний азот (мг/100мл) 77 78 Поліфенол (мг/л) 150 147 Внаслідок вимірювання вмісту транс-2FAN (мг/л) 153 148 ноненалю солодового алкогольного напою, отриманого вище в 2, до і після зберігання при 37°С протягом одного тижня LOX-F5 мав схожий вміст транс-2-ноненалю в порівнянні з LOX+F5 перед зберіганням. Вміст транс-2-ноненалю LOX-F5 зменшувався до приблизно ½ у порівнянні із вмістом транс-2-ноненалю LOX+F5 після зберігання (таблиця 12). Таблиця 12 Концентрація транс-2-ноненалю LOX+F5 LOX-F5 Перед зберіганням 0,06 0,06 Після зберігання 0,16 0,09 Одиниця: (млд. ч.) 2. Отримання солодового алкогольного напою (пива) Сусло, отримане вище в 1, переносили в стерилізований парою циліндрично-конічний чан на 30л і потім додавали дріжджі до початкової концентрації 15 мільйонів клітин на мл для головного (власне) бродіння при 10,5°C. Коли вміст екстракту в зброджуваній рідині падав до 2,5%, її переносили в новий подібний чан для стадії витримування. Стадію витримування проводили при 8°С протягом перших 8 днів і потім при 0°C протягом подальших 2 тижнів. Після завершення стадії витримування зброджувану рідину подавали в апарат фільтрування і розливу пива. Солодовий алкогольний напій фільтрували і розливали в пляшки. 3. Аналіз солодового алкогольного напою 33 85183 Стійкість піни солодового алкогольного напою, отриманого вище в 2, аналізували наступним способом. Аналіз стійкості піни проводили за способом NIBEM. При аналізі стійкості піни з викорисНестандартний смак танням тестера піностійкості Haffmans (таблиця Член комісії 1 14) ячмінь LOX-F4 показав явно більш високу стійЧлен комісії 2 кість піни, причому величина NIBEM була на 30 Член комісії 3 балів вище, ніж у випадку ячменю LOX+F4. Член комісії 4 Також, як і результат вимірювання концентраЧлен комісії 5 ції THOD за способом, описаним у прикладі 5 виЧлен комісії 6 ще, виявлялося зменшення вмісту THOD у солоЧлен комісії 7 довому алкогольному напої LOX-F4 до менше, ніж Член комісії 8 половини вмісту THOD LOX+F4. Член комісії 9 Ці результати ясно показали, що спосіб отриЧлен комісії 10 мання солодових алкогольних напоїв даного винаЧлен комісії 11 ходу дозволяє отримувати солодовий алкогольний Член комісії 12 напій зі зниженим вмістом THOD і поліпшеним Член комісії 13 збереженням піни. Середнє Таблиця 14 Сорт NIBEM THOD (відношення площ піків) LOX+F4 LOX-F4 273 303 499 221 Величини THOD показані у вигляді відносних величин, де площі піків внутрішнього стандарту дорівнюють 100. Потім солодовий алкогольний напій, отриманий вище в 2, піддавали наступному сенсорному аналізу, що виконується 13 членами комісії з оцінки якості харчових продуктів. Конкретний спосіб цього сенсорного аналізу є таким самим, як описаний у прикладі 6. У результаті 11 з 13 членів комісії дали більш низькі бали LOX-F4 відносно нестандартного смаку, і, отже, LOX-F4 виявляв більш низький бал (середнє), ніж LOX+F4. Було визначено, що ця відмінність відповідно до парного t-критерію є значущою при 5% ймовірності (таблиця 15A). Відносно загальної несвіжості, 12 з 13 членів комісії дали більш низькі бали LOX-F4, і, отже, LOX-F4 виявляв більш низький бал (середнє), ніж LOX+F4. Було визначено, що ця відмінність відповідно до парного t-критерію є значущою при 5% ймовірності (таблиця 15В). Описані вище сенсорний аналіз і статистичний аналіз показали, що LOX-F4 мав менші нестандартний смак і загальну несвіжість, ніж LOX+F4. 34 Таблиця 15А LOX+F4 2,5 3 3,5 2,5 1,5 3 2,5 3 2 2 3 1,5 2 2,5 LOX-P4 2 3,5 2 2 1 1 3 2 1,5 1 1,5 1 1 1,7 Таблиця 15В Загальна несвіжість, смак Член комісії 1 Член комісії 2 Член комісії 3 Член комісії 4 Член комісії 5 Член комісії 6 Член комісії 7 Член комісії 8 Член комісії 9 Член комісії 10 Член комісії 11 Член комісії 12 Член комісії 13 Середнє LOX+F4 3 3 3 2,5 1,5 3 3 3 2 2 3 1,5 2 2,5 LOX-F4 2 3,5 1,5 2 1 1 2,5 2 1 1 1 1 1 1,6 Ці результати сенсорного аналізу і результати аналізу вмісту транс-2-ноненалю в солодових алкогольних напоях показали, що спосіб отримання солодових алкогольних напоїв даного винаходу дозволяє отримувати солодові алкогольні напої з поліпшеною стабільністю смаку. Може бути забезпечене наступне: мутантний ген, який є застосовним для отримання солодових алкогольних напоїв, що виявляють поліпшені стабільність смаку і стійкість піни, без маніпулювання генами, спосіб відбору LOX-1-недостатнього ячменю, матеріали для солодових алкогольних напоїв, що походять з ячменю, отриманого цим способом відбору, і спосіб отримання солодових алкогольних напоїв з використанням цих матеріалів для солодових алкогольних напоїв. 35 85183 36 37 85183 38 39 85183 40 41 85183 42 43 85183 44 45 85183 46 47 85183 48 49 85183 50 51 85183 52 53 85183 54 55 85183 56 57 85183 58 59 85183 60

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Gene of barley lipoxygenase-1, materials for malt alcoholic beverages and the process for preparation of malt alcoholic beverages

Автори англійською

Hirota Naohiko, Kaneko Takafumi, Kuroda Khisao, Kaneda Hirotaka, Takoi Kiyoshi, Takeda Kazuyosi

Назва патенту російською

Ген липоксигеназы-1 ячменя, способ отбора ячменя, материалы для солодовых алкогольных напитков и способ получения солодовых алкогольных напитков

Автори російською

Хирота Наохико, Канеко Такафуми, Курода Хисао, Канеда Хиротака, Такой Киеси, Такеда Казуэси

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/53, C12C 1/00, C12Q 1/68, C12N 9/08

Мітки: отримання, матеріали, ячменю, солодових, ген, напоїв, відбору, ліпоксигенази-1, спосіб, алкогольних

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/31-85183-gen-lipoksigenazi-1-yachmenyu-sposib-vidboru-yachmenyu-materiali-dlya-solodovikh-alkogolnikh-napov-i-sposib-otrimannya-solodovikh-alkogolnikh-napov.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Ген ліпоксигенази-1 ячменю, спосіб відбору ячменю, матеріали для солодових алкогольних напоїв і спосіб отримання солодових алкогольних напоїв</a>

Подібні патенти