Рідка стабалізована композиція інтерферону без hsa

1. Стабілізована рідка фармацевтична композиція без HSA, що містить інтерферон-бета (IFNбета), яка являє собою розчин, що містить буфер, поверхнево-активну речовину, якою є полоксамер 188, ізотонічний агент, бактеріостатичний препарат, яким є бензиловий спирт, і антиоксидант, яким є метіонін. 2. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що згаданим інтерфероном-бета є людський рекомбінантний IFN-бета. 3. Композиція за будь-яким із попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що згаданий буфер є присутнім у кількості, достатній для підтримання рН даної композиції у межах визначеного діапазону рН плюс/мінус 0,5 одиниці, причому визначений діапазон рН становить від приблизно 3,0 до приблизно 5,0. 4. Композиція за попереднім пунктом, яка відрізняється тим, що рН має значення 3,5±0,2. 5. Композиція за попереднім пунктом, яка відрізняється тим, що рН має значення 4,5±0,2. 6. Композиція за будь-яким із попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що концентрація буфера становить від 5 мМ до 500 мМ. 7. Композиція за будь-яким із попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що концентрація буфера становить 10 мМ. 8. Композиція за будь-яким із попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що згаданим буфером є 2 (19) 1 3 94032 4 кількості поверхнево-активної речовини, якою є полоксамер 188, антиоксиданта, яким є метіонін, і ізотонічного агента до забуференого розчину з подальшим доданням інтерферону-бета (IFNбета). 22. Контейнер, герметично закритий за стерильних умов і придатний до зберігання перед застосуванням, який містить рідку фармацевтичну компози цію за будь-яким із пп. 1-20. 23. Контейнер за п. 22, який являє собою заздалегідь заповнений шприц для введення однієї дози. 24. Контейнер за п. 22, який являє собою флакон. 25. Контейнер за п. 22, який являє собою капсулу для автоматичного інжектора. 26. Контейнер за п. 23 або п. 24, призначений для введення однієї або декількох доз. Цей винахід у цілому стосується фармацевтичних композицій, що містять інтерферон (IFN), зокрема, стабілізованих композицій бетаінтерферону, вільних від людського сироваткового альбуміну (HSA) як додаткового фармацевтичного наповнювача. Інтерферони є цитокінами, тобто розчинними білками, що передають інформаційні повідомлення між клітинами і відіграють суттєву роль у імунній системі завдяки тому, що допомагають знищувати мікроорганізми, які викликають інфекцію, і заліковують будь-яке наслідкове пошкодження. Природні інтерферони секретуються інфікованими клітинами, і вперше вони були ідентифіковані у 1957 році. Їхня назва виникла унаслідок того, що вони "втручаються (interfere)" у процес реплікації та продукування вірусів. Інтерферони демонструють як антивірусну, так і антипроліферативну активність. На основі біохімічних та імунологічних властивостей, природні людські інтерферони розподіляються на три головні класи: альфа-інтерферон (лейкоцитарний), бета-інтерферон (фібробластний) та гаммаінтерферон (імунний). Альфа-інтерферон на цей час є схваленим у Сполучених Штатах та інших країнах для лікування лейкозу ворсистих клітин, гострокінцевих кондилом, саркоми Капоші (рак, який звичайно уражує хворих, що страждають на синдром набутого імунодефіциту (СНІД)) та хронічного гепатиту ні А ні В. Окрім того, інтерферони є глікопротеїнами, що продукуються організмом у відповідь на вірусну інфекцію. Вони пригнічують розмноження вірусів у захищених клітинах. Складаючись з білка більш низької молекулярної маси, інтерферони є найвищою мірою неспецифічні за своєю дією, тобто IFN, індукований одним вірусом, є ефективним проти широкого діапазону інших вірусів. Вони, однак, є видоспецифічними, тобто IFN, продукований одним видом, буде стимулювати антивірусну активність у клітинах лише того самого або близькоспорідненого виду. Інтерферони були першою групою цитокінів, які почали застосовуватись завдяки своїм потенційним протипухлинним та антивірусним активностям. Три головні інтерферони позначаються як IFN , IFN-  та IFN-  . Ці головні види інтерферонів початково були класифіковані за клітинами їх походження (лейкоцит, фібробласт або Т-клітина). Очевидним стало, однак, що однією клітиною може продукуватись декілька типів. З цієї причини лейкоцитарний IFN зараз називають IFN-  , фіб робластний IFN називають IFN-  , а інтерферон, що продукується Т-клітинами, називають IFN-  . Існує також IFN четвертого типу, а саме лімфобластний інтерферон, що продукується лінією клітин "Namalwa" (яку одержали з лімфоми Бьоркіта), яка, як видається, продукує суміш як лейкоцитарного, так і фібробластного інтерферонів. Одиниця інтерферону (U) або Міжнародна одиниця інтерферону (IU) є показником активності IFN, що визначається як кількість, необхідна для захисту 50 % клітин проти вірусного пошкодження. Аналізом, що може застосовуватись для визначення біологічної активності, є аналіз пригнічення цитопатичного ефекту. Опис цього аналізу наведено у літературних джерелах (Рубінштейн (Rubinstein) та інші, 1981; Фаміллетті П.К. (Familletti Р.С.) та інші, 1981). За цим антивірусним аналізом, приблизно 1 Од/мл відповідає кількості інтерферону, яка пригнічує репродукцію вірусу на 50 %. Одиниці визначають за Міжнародним стандартом людського бета-інтерферону, який надається Національним інститутом здоров'я (США) (Пестка С. (Pestka S.), 1986). Інтерферон кожного класу включає декілька різних типів. Кожен з IFN-  і IFN-  є продуктом одного гена. Білки, що класифікуються як альфаінтерферони, є найбільш різноманітною групою, що включає приблизно 15 типів. В хромосомі 9 є кластер генів для IFN-  , що включає щонайменше 23 члени, 15 з яких є активними і транскрибуються. Зрілі альфа-інтерферони не гліколізуються. Усі альфа- і бета-інтерферони мають однакову довжину (165 амінокислот або 166 амінокислот) і схожі біологічні активності. Гамма-інтерферони мають 146 амінокислот у довжину і меншою мірою походять на класи  та  . Лише гаммаінтерферони можуть активувати макрофаги або індукувати визрівання Т-клітин-кілерів. Ці терапевтичні засоби нових типів подеколи називають модуляторами біологічних реакцій (BRM), оскільки вони впливають на реакцію організму на пухлину, впливаючи на розпізнавання через імуномодуляцію. Людський фібробластний інтерферон (IFN-  ) має антивірусну активність і може також стимулювати природні клітини-кілери проти пухлинних клітин. Він являє собою поліпептид із приблизною масою 20000 Да, що індукується вірусами і двонитковими РНК. Повну амінокислотну послідовність цього білка визначили (Дерінк (Derynk) та інші, 1980) за нуклеотидною послідовністю гена для 5 фібробластного інтерферону, клонованого методами рекомбінантних ДНК. Його довжина становить 166 амінокислот. Шепард (Shepard) та інші (1981) описали мутацію на основі 842 (Cys  Tyr у положенні 141), що ліквідує його антивірусну активність, і варіантний клон із делецією нуклеотидів 1119-1121. Марк (Mark) та інші (1984) ввели штучну мутацію шляхом заміни основи 469 (Т) на (А), унаслідок чого у положенні 17 відбулась амінокислотна заміна Cys  Ser. Повідомлялось, що одержаний IFN є таким самим активним, як і "нативний" IFN-  і стійким впродовж довготривалого зберігання (70°С). Ребіф (Rebif®) (фірма Serono - рекомбінатний людський бета-інтерферон), найостанніша розробка у галузі інтерферонотерапії розсіяного склерозу (MS), являє собою інтерферон (IFN)-бета-la, що продукується клітинними лініями ссавців. Рекомендованою міжнародною непатентованою назвою (INN) для нього є "Інтерферон-бета-1а". Як і з усіма фармацевтичними засобами на основі білків, однією з головних перепон, яку необхідно подолати у разі застосування бетаінтерферону як терапевтичного засобу, є втрата фармацевтичної придатності, що може бути наслідком його нестійкості у фармацевтичних композиціях. Фізичними нестійкостями, що загрожують активності та ефективності поліпептиду у фармацевтичних композиціях, є денатурація і утворення розчинних і нерозчинних агрегатів, у той час як хімічними нестійкостями є гідроліз, утворення імідів, окиснення, рацемізація і деамідування. Відомо, що деякі з цих змін ведуть до втрати або зниження фармацевтичної активності білка, що становить інтерес. У інших випадках точні наслідки цих змін є невідомими, однак одержані продукти розкладу все ще розглядаються як фармацевтично неприйнятні унаслідок потенційних або небажаних побічних ефектів. Стабілізація поліпептидів у фармацевтичних композиціях залишається ділянкою, на якій головну роль відіграє метод спроб та помилок (оглядові статті Ванг (Wang) (1999), Int. J. Pharm., 185:129188; Ванг (Wang), Хансон (Hanson) (1988), /. Parenteral Sci. Tech., 42:S3-S26). Наповнювачами, які додають до поліпептидних фармацевтичних композицій для підвищення їх стійкості, є буфери, цукри, поверхнево-активні речовини, амінокислоти, поліетиленгліколі і полімери, однак стабілізувальні ефекти цих хімічних домішок різняться у залежності від білка. У сучасних композиціях на основі IFN-  HSA (людський сироватковий альбумін) застосовують як засіб, що підвищує розчинність IFN-  . Застосування HSA, однак, має певні вади. HSA є продуктом людської крові і повинен, таким чином, відбиратись у людей. Незважаючи на заходи, що вживаються для зменшення ризику, застосування продуктів людської крові, наприклад, HSA, тягне за собою потенційне введення людських вірусів, наприклад ВІЛ або вірусу гепатиту С. Унаслідок цього існує необхідність у додатко 94032 6 вих фармацевтичних композиціях на основі IFN-  , що містять фізіологічно сумісні стабілізатори, які поліпшують розчинність цього білка і стабілізують білок проти утворення агрегатів, збільшуючи тим самим його фармацевтичну придатність. Цей винахід спрямовано на стабілізовані фармацевтичні композиції, що містять інтерферон (IFN), і способи їх одержання. Ці композиції одержують без людського сироваткового альбуміну (HSA), і вони, таким чином, є вільними від цього фармацевтичного наповнювача. Такі композиції у цьому описі називають фармацевтичними композиціями IFN без HSA ("вільними від HSA"), і вони містять інтерферон (IFN) або його ізоформу, мутеїн, гібридний білок, функціональну похідну, активну фракцію або сіль, де згадана композиція являє собою розчин, що містить буфер, поверхневоактивну речовину, ізотонічний агент і антиоксидант. За варіантом здійснення цього винаходу, згадана композиція містить також бактеріостатичний препарат. Термін "інтерферон" або "IFN", що застосовується у цьому описі, означає будь-яку молекулу, що у літературі визначається як така, і включає, наприклад, інтерферони будь-яких типів, згадані у вищенаведеному розділі "Передумови створення винаходу". Вищенаведене визначення включає, зокрема, IFN-  , IFN-  і IFN-  . IFN-  за цим винаходом є інтерфероном, якому віддають перевагу. Придатний за цим винаходом IFN-  є комерційно доступним, наприклад, як Rebif® (фірма Serono), Avonex® (фірма Biogen) або Betaferon® (фірма Schering). Перевагу за цим винаходом віддають застосуванню інтерферонів людського походження. Термін "інтерферон", що застосовується у цьому описі, означає його ізоформу, мутеїн, гібридний білок, функціональну похідну, активну фракцію або сіль. Термін "бета-інтерферон (IFN-бета або IFN )", що застосовується у цьому описі, означає фібробластний інтерферон, зокрема, людського походження, який одержують шляхом виділення з біологічних рідин або за допомогою методів рекомбінантних ДНК із прокаріотних або еукаріотних клітин-хазяїв, а також його солі, функціональні похідні, варіанти, аналоги і активні фрагменти. За варіантом, якому віддають перевагу, IFN-бета означає інтерферон-бета-1а. Термін "мутеїни", що застосовується у цьому описі, означає аналоги IFN, у яких один або декілька амінокислотних залишків природного IFN замінені різними амінокислотними залишками чи видалені, або один чи декілька амінокислотних залишків додані до природної послідовності IFN без значної зміни активності одержаних продуктів, порівняно з IFN дикого типу. Ці мутеїни одержують відомими методами синтезу та/або сайтспрямованого мутагенезу чи будь-яким іншим відомим придатним способом. До мутеїнів, яким віддають перевагу, належать, наприклад, мутеїни, описані Шепард (Shepard) та іншими (1981) або Марк (Mark) та іншими (1984). Амінокислотна послідовність будь-якого з та 7 94032 ких мутеїнів, за варіантом, якому віддають перевагу, достатньою мірою повторює амінокислотну послідовність IFN, завдяки чому активність мутеїну є по суті подібною або навіть кращою за активність IFN. Біологічна функція інтерферону є добре відомою фахівцю у цій галузі. Встановлені біологічні стандарти, які є доступними, наприклад, від Національного інституту біологічних стандартів та контролю (http://immunology.org/links/NIBSC). Описані біологічні аналізи для визначення активності IFN. Аналіз IFN може, наприклад, здійснюватись за описом, наведеним Рубінштейн (Rubinstein) та іншими, 1981. Так, за допомогою стандартних експериментальних методів можна визначити, чи є активність будь-якого даного мутеїну по суті подібною або навіть кращою за активність IFN. Мутеїни IFN, які можуть застосовуватись за цим винаходом, або нуклеїнові кислоти, що їх кодують, включають кінцевий набір, по суті, відповідних послідовностей, як замінних пептидів або полінуклеотидів, які можуть бути поточним чином одержані пересічним фахівцем у цій галузі без зайвого експериментування, виходячи з інструкцій та настанов, наведених у цьому описі. Змінами для мутеїнів, яким віддають перевагу за цим винаходом, є зміни, відомі як "консерватив 8 ні" заміни. Консервативні амінокислотні заміни поліпептидів або білків за цим винаходом можуть включати синонімічні амінокислоти у межах групи, які мають достатньо подібні фізико-хімічні властивості, завдяки чому заміни між членами групи збережуть біологічну функцію цієї молекули. Зрозуміло, що у вищезазначених послідовностях можуть також здійснюватись інсерції або делеції без зміни функції згаданих послідовностей, зокрема, якщо інсерції або делеції залучають лише декілька амінокислот, наприклад менше тридцяти, за варіантом, якому віддають перевагу, менше десяти, і не видаляють або зміщують амінокислоти, що є критичними для функціональної конформації, наприклад, цистеїнові залишки. Білки та мутеїни, одержані шляхом таких делецій та/або інсерцій, входять до сфери дії цього винаходу. За варіантом, якому віддають перевагу, синонимічними амінокислотними групами є групи, зазначені у Таблиці І. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, синонимічними амінокислотними групами є групи, зазначені у Таблиці II; і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, синонимічними амінокислотними групами є групи, зазначені у Таблиці III. Таблиця І Групи синонімічних амінокислот, яким віддають перевагу Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Туr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gin, Lys, Glu, His Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Gly, Thr, Pro, Ala Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gln, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp 9 94032 10 Таблиця II Групи синонімічних амінокислот, яким віддають більшу перевагу Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser His, Lys, Arg Leu, Ilе, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Таблиця III Групи синонімічних амінокислот, яким віддають найбільшу перевагу Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly lle Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Прикладами здійснення амінокислотних замін у білках, що можуть застосовуватись для одержання мутеїнів IFN для застосування у цьому винаході, є стадії будь-яких відомих методів, наприклад, наведені у патентах США № 4,959,314, № Синонімічна група Ser Arg Leu, Ile, Met Pro Thr Ala Val Gly Ile, Met, Leu Phe Tyr Cys, Ser His Gln Asn Lys Asp Glu Met, Ile, Leu Met 4,588,585 і № 4,737,462, які були видані на ім'я Марк (Mark) та інші; № 5,116,943, який був виданий на ім'я Котс (Koths) та інші; № 4,965,195, який був виданий на ім'я Неймен (Namen) та інші; № 4,879,111, який був виданий на ім'я Чонг (Chong) 11 та інші; і № 5,017,691, який був виданий на ім'я Лі (Lee) та інші; та білки із заміною лізину, наведені у патенті США № 4,904,584 (Шоу (Shaw) та інші). Конкретні мутеїни IFN-бета були описані, наприклад, Марк (Mark) та іншими, 1984. Термін "гібридний білок" означає поліпептид, що містить IFN або його мутеїн, злитий з іншим білком, який, наприклад, має тривалий час перебування у рідинах у тілі людини. IFN може, таким чином, зливатись з іншим білком, поліпептидом тощо, наприклад імуноглобуліном або його фрагментом. Словосполучення "функціональні похідні", що застосовується у цьому описі, означає похідні IFN та їхні мутеїни і гібридні білки, які можна одержати з функціональних груп, що існують у вигляді бічних ланцюгів на залишках, або N- чи С-кінцевих груп, способами, відомими у цій галузі, і які включають до цього винаходу доти, доки вони залишаються фармацевтично прийнятними, тобто, доки вони не знищують активності білка, яка є по суті подібною до активності IFN, і не наділяють токсичними властивостями композиції, що їх містять. До цих похідних можуть належати, наприклад, бічні ланцюги поліетиленгліколю, які можуть маскувати імунодомінантні сайти і подовжувати тривалість перебування IFN у рідинах у тілі людини. До інших похідних належать аліфатичні складні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, одержані шляхом реакції з аміаком або з первинними чи вторинними амінами, N-ацильні похідні вільних аміногруп залишків амінокислот, які були одержані з ацильними складовими (наприклад, алканоїльними або карбоциклічними ароїльними групами), або О-ацильні похідні вільних гідроксильних груп (наприклад, вільних гідроксильних груп серильних або треонільних залишків), які були одержані з ацильними складовими. Під "активними фракціями" IFN або мутеїнів і гібридних білків у цьому винаході розуміються будь-які фрагменти або попередники поліпептидного ланцюга білкової молекули самостійно або разом із пов'язаними молекулами або залишками, зв'язаними з ними, наприклад залишки цукру чи фосфату або агрегати білкової молекули чи залишки цукру самі по собі, за умови, що згадана фракція не має значно зниженої активності, порівняно з відповідним IFN. Термін "солі" у цьому описі означає як солі карбоксильних груп, так і солі аміногруп білків, опис яких було наведено вище, або їхніх аналогів, одержані шляхом додання кислоти. Солі карбоксильної групи можна одержати засобами, відомими у цій галузі, і до них належать неорганічні солі, наприклад, солі натрію, кальцію, амонію, заліза або цинку тощо, і солі, одержані за допомогою органічних основ, наприклад солі, одержані з амінами, наприклад, триетаноламіном, аргініном або лізином, піперидином, прокаїном тощо. До солей, одержаних доданням кислоти, належать, наприклад, солі, одержані з мінеральними кислотами, наприклад хлористоводневою кислотою або сірчаною кислотою, і солі, одержані органічними кислотами, наприклад оцтовою кислотою або щавлевою кислотою. Звичайно, будь-які з таких солей повинні 94032 12 зберігати біологічну активність білків (IFN) за цим винаходом, тобто здатність до зв'язування відповідного рецептора і ініціювання передачі сигналу рецептором. За цим винаходом, застосуванню рекомбінантного людського IFN-бета і сполук за цим винаходом віддають особливу додаткову перевагу. Нещодавно було наведено опис варіанта інтерферону особливого: роду. Так звані "консенсусні інтерферони" є штучними варіантами IFN (патент США № 6,013,253). За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, сполуки за цим винаходом застосовують у комбінації з консенсусним інтерфероном. Словосполучення "людський консенсусний інтерферон (IFN-con)", що застосовується у цьому описі, означає штучний поліпептид, який переважно включає ті амінокислотні залишки, що є спільними для субпопуляції IFN-альфа, репрезентативної для більшості послідовностей підтипу природного людського лейкоцитарного інтерферону, і який включає, у одному або декількох із тих положень, де немає амінокислоти, спільної для всіх підтипів, амінокислоту, яка переважно зустрічається у цьому положенні і у жодному разі не включає будь-якого амінокислотного залишку, який не існує у цьому положенні у принаймні одного природного підтипу. IFN-con включає (однак ними не обмежується) амінокислотні послідовності, позначені як IFN-con1, IFN-con2 і IFN- con3, які розкривають у патентах США № 4,695,623, № 4,897,471 і № 5,541,293. Послідовності ДНК, що кодують IFN-con, можна одержати, як описано у вищезгаданих патентах або за допомогою інших стандартних методів. За додатковим варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, гібридний білок включає злиття з Ig. Злиття може бути прямим або здійснюватись через короткий лінкерний пептид, довжина якого може не перевищувати 1-3 амінокислоти або який може бути довшим, наприклад, він може складатись з 13 амінокислотних залишків. Згаданий лінкер може бути, наприклад, трипептидом із послідовністю E-F-M (Glu-Phe-Met) або являти собою лінкерну послідовність із 13 амінокислот (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-GlyGln-Phe-Met), введену між послідовністю IFN і послідовністю імуноглобуліну. Одержаний гібридний білок може мати поліпшені властивості, наприклад триваліший час перебування у рідинах у тілі людини (період напіввиведення), підвищену питому активність, підвищений рівень експресії або полегшення процесу очищення згаданого гібридного білка. За додатковим варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, IFN зливається з константною ділянкою молекули Ig. За варіантом, якому віддають перевагу, він зливається з ділянками важкого ланцюга, наприклад, доменами СН2 і СН3 людського IgG1. Інші ізоформи молекул Ig є також придатними для одержання гібридних білків за цим винаходом, наприклад ізоформи ІgG2, IgG3 або IgG4 чи інших класів Ig, наприклад, IgM або IgA. Гібридні білки можуть бути мономерними або мультимерними, гетеро- або гомомультимерними. 13 За додатковим варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, функціональні похідні включають щонайменше одну складову, приєднану до однієї або декількох функціональних груп, що зустрічаються у вигляді одного або декількох бічних ланцюгів на амінокислотних залишках. За варіантом, якому віддають перевагу, згаданою складовою є поліетилен (PEG). Поліетиленгліколізація може здійснюватись відомими способами, наприклад способами, опис яких наведено, наприклад, у WO 99/55377. Кількість, введена індивіду у вигляді одноразової дози або багаторазових доз, буде змінюватись у залежності від ряду факторів, у тому числі, фармакокінетичних властивостей, шляху введення, стану і характеристик хворого (стать, вік, маса тіла, стан здоров'я, розміри), ступеня розвитку симптомів, одночасно здійснюваного лікування, частоти лікування і бажаного ефекту. Стандартні дози людського IFN-бета коливаються у межах від 80000 МОд/кг на добу до 200000 МОд/кг на добу або від 6 млн. МОд (мільйонів Міжнародних одиниць) до 12 млн. МОд на хворого на добу чи від 22 мкг на хворого до 44 мкг на хворого. За цим винаходом IFN, за варіантом, якому віддають перевагу, може вводитись у дозі від приблизно 1 мкг до 50 мкг, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від приблизно 10 мкг до 30 мкг або від приблизно 10 мкг до 20 мкг на хворого на добу. Введення активних інгредієнтів за цим винаходом може здійснюватись внутрішньовенним, внутрішньом'язовим або підшкірним шляхом. Шляхом введення IFN, якому віддають перевагу, є підшкірний шлях. IFN може вводитись щоденно, через день або рідше. За варіантом, якому віддають перевагу, IFN вводять один раз, двічі або тричі на тиждень. Шляхом введення, якому віддають перевагу, є підшкірне введення, наприклад, тричі на тиждень. Додатковим шляхом введення, якому віддають перевагу, є внутрішньом'язове введення, яке може здійснюватись, наприклад, один раз на тиждень. За варіантом, якому віддають перевагу, від 22 мкг до 44 мкг або від 6 млн. МОд до 12 млн. МОд IFN-бета вводять тричі на тиждень шляхом підшкірної ін'єкції. IFN-бета може вводитись підшкірно у дозі від 25 мкг до 30 мкг або від 8 млн. МОд до 9,6 млн. МОд через день. 30 мкг або 6 млн. МОд IFN-бета можуть додатково вводитись внутрішньом'язово один раз на тиждень. Термін "стійкість" означає фізичну, хімічну і структурну стійкість композицій інтерферону за цим винаходом (зі збереженням біологічної активності). Нестійкість білкової композиції може спричинюватись хімічним розкладом або агрегацією білкових молекул з утворенням полімерів вищого порядку, дегліколізацією, модифікацією гліколізації, окисненням або будь-якою іншою структурною модифікацією, що знижує щонайменше одну біологічну активність поліпептиду інтерферону, включеного до цього винаходу. "Стійким" розчином або композицією є такий розчин або така композиція, де ступінь розкладу, 94032 14 модифікації, агрегації, втрати біологічної активності тощо білків цього розчину або композиції є прийнятно контрольованим і з часом не підвищується до неприйнятного рівня. За варіантом, якому віддають перевагу, композиція зберігає вказану активність інтерферону впродовж періоду часу тривалістю від 12 міс до 24 міс щонайменше на рівні або приблизно на рівні 60 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше на рівні або приблизно на рівні 70 %, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше на рівні або приблизно на рівні 80 %. Стабілізовані композиції IFN без HSA за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, мають строк зберігання щонайменше приблизно 6 міс, 12 міс, 18 міс, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 20 міс, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 22 міс., за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше приблизно 24 міс при температурі зберігання 2-8 °С. Способи контролювання стійкості фармацевтичних: композицій IFN без HSA за цим винаходом є доступними у цій галузі техніки, з включенням тих способів, опис яких наведено у прикладах, що розкриваються у цьому описі. Так, утворення агрегатів IFN під час зберігання рідкої фармацевтичної композиції за цим винаходом може легко визначатись шляхом вимірювання зміни кількості розчинного IFN у розчині з часом. Кількість розчинного поліпептиду у розчині може легко піддаватись кількісному визначенню за допомогою ряду аналітичних аналізів, адаптованих для виявлення IFN. Такі аналізи включають, наприклад, високоефективну рідинну хроматографію з оберненою фазою (RP-HPLC) і УФ-абсорбційну спектроскопію, як описано у наведених нижче Прикладах. Визначення у рідких композиціях як розчинних, так і нерозчинних агрегатів під час зберігання може здійснюватись, наприклад, за допомогою аналітичного ультрацентрифугування, як вказується у Прикладах, наведених нижче, для розрізнення тієї частини розчинного поліпептиду, що є присутньою у вигляді розчинних агрегатів, і тієї частини, що є присутньою у неагрегованій, біологічно активній молекулярній формі. Словосполучення "багатодозове застосування" включає застосування одного флакона, ампули або капсули композиції інтерферону для більше ніж однієї ін'єкції, наприклад для 2, 3, 4, 5, 6 або більше ін'єкцій. Ін'єкції, за варіантом, якому віддають перевагу, здійснюють впродовж періоду часу, який щонайменше дорівнює або приблизно дорівнює 12 год., 24 год., 48 год. тощо, за варіантом, якому віддають перевагу, впродовж періоду часу, який дорівнює або приблизно дорівнює 12 дням. Ін'єкції можуть відокремлюватись у часі, наприклад, часовим періодом тривалістю 6 год, 12 год., 24 год., 48 год. або 72 год. Термін "буфер" або "фізіологічно прийнятний буфер" означає розчини сполук, які, як відомо, є безпечними для фармацевтичного або ветеринарного застосування у композиціях і які мають ефект підтримування або регулювання рівня рН композиції у діапазоні рН, бажаному для згаданої компо 15 зиції. Прийнятними буферами для регулювання рівня рН у межах від помірно кислого рН до помірно основного рН є (але ними не обмежуються) такі сполуки, як фосфат, ацетат, цитрат, аргінін, трис і гістидин. "Трис" означає 2-аміно-2-гідроксиметил1,3-пропандіол і будь-яку його фармацевтично прийнятну сіль. Буферами, яким віддають перевагу, є ацетатні буфери з фізіологічним розчином або прийнятна сіль. "Ізотонічний агент" являє собою сполуку, що є фізіологічно прийнятною і яка наділяє композицію прийнятною ізотонічністю для запобігання результуючій течії води через клітинні мембрани, що контактують зі згаданою композицією. З цією метою, як правило, застосовуються такі сполуки як гліцерин із відомими концентраціями. Іншими придатними ізотонічними агентами є (але ними не обмежуються) амінокислоти або білки (наприклад, гліцин або альбумін), солі (наприклад, хлорид натрію) і цукри (наприклад, декстроза, маніт, цукроза і лактоза). За варіантом, якому віддають перевагу, ізотонічним агентом є маніт. Термін "антиоксидант" означає сполуку, що запобігає взаємодії кисню або вільних радикалів кисню з іншими речовинами. Антиоксиданти входять до ряду наповнювачів, які, як правило, додають до фармацевтичних систем для підвищення фізичної та хімічної стійкості. Антиоксиданти додають для зниження до мінімального рівня або уповільнення процесів окиснення, що відбуваються з деякими лікарськими засобами або наповнювачами у разі піддання дії кисню або у присутності вільних радикалів. Ці процеси часто можуть каталізуватись світлом, температурою, воднем (у разі підвищення концентрації), присутністю металевих мікроелементів або пероксидів. Як антиоксиданти у лікарських засобах часто застосовуються сульфіти, бісульфіти, тіосечовина, метіонін, солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA), бутилований гідрокситолуол (ВНТ) і бутилований гідроксіанізол (ВНА). Було встановлено, що натрійEDTA підсилює активність антиоксидантів завдяки утворенню хелатних сполук з іонами металів, які інакше каталізували б реакцію окиснення. Антиоксидантом, якому віддають найбільшу перевагу, є метіонін. Термін "бактеріостатичний препарат" означає сполуку або композиції, що додаються до лікарської форми для відіграння ролі антибактеріального агента. Консервована композиція за цим винаходом, що містить інтерферон, за варіантом, якому віддають перевагу, задовольняє передбачуваним законом інструктивним рекомендаціям щодо ефективності консерванта, який повинен бути комерційно життєздатним універсальним продуктом. Прикладами бактеріостатичних препаратів є фенол, m-крезол, р-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловий спирт, алкілпарабен (метил, етил, пропіл, бутил тощо), бензалконію хлорид, бензетонію хлорид, натрію дигідроацетат і тимеросал; За варіантом, якому віддають перевагу, бактеріостатичним препаратом є бензиловий спирт. Термін "поверхнево-активна речовина" означає розчинну сполуку, що знижує поверхневий натяг рідин або знижує міжфазний натяг між двома 94032 16 рідинами або рідиною і твердим тілом, де поверхневий натяг являє собою силу, що діє на поверхню рідини із намаганням звести до мінімуму площу поверхні. Поверхнево-активні речовини подеколи застосовують у фармацевтичних композиціях, у тому числі для спрямованої доставки лікарських засобів і поліпептидів низької молекулярної маси для модифікування абсорбції лікарського засобу або його спрямованої доставки до цільових тканин. Добре відомими поверхнево-активними речовинами є полісорбати (похідні поліоксіетилену; твін), а також плюронік (Pluronic). За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, було встановлено, що завдяки об'єднанню інтерферону з поверхневоактивною речовиною, вибраною з групи, що включає плюронік F77 (Pluronic® F77), плюронік F87, плюронік F88 і плюронік F68 (Pluronic® F68), за варіантом, якому віддають особливу перевагу, з плюроник F68 (фірма BASF, плюронік F68 є також відомим під назвою полоксамер 188 (Poloxamer 188)), одержують стійкі композиції, які зводять до мінімального рівня втрату активного компонента, що спричинюється адсорбцією на поверхнях флакона та/або засобу для спрямованої доставки (наприклад, шприца, насоса, катетера тощо). Було встановлено також, що завдяки об'єднанню інтерферону з поверхнево-активною речовиною, вибраною з групи, що включає плюронік F77 (Pluronic® F77),плюронік F87, плюронік F88 і плюронік F68 (Pluronic® F68), за варіантом, якому віддають особливу перевагу, з плюронік F68 (фірма BASF, плюронік F68 є також відомим під назвою полоксамер 188 (Poloxamer 188)), одержують стійку композицію, що є більш стійкою до окиснення і утворення білкових агрегатів. Поверхнево-активні речовини типу плюронік є блокспівполімерами етиленоксиду (ЕО) і пропіленоксиду (РО). Блок пропіленоксиду (РО) знаходиться між двома блоками етиленоксиду (ЕО). CH3 HO (CH2CH2O)x -(CH2CHO)y -(CH2CH2O)x - H EO PO EO Поверхнево-активні речовини типу плюронік синтезують двостадійним способом: 1. Гідрофобну речовину бажаної молекулярної маси одержують шляхом контрольованого додання пропіленоксиду до двох гідроксильних груп пропіленгліколю; і 2. Етиленоксид додають для того, щоб гідрофобна речовина опинилась між гідрофільними групами. У разі плюронік F77 (Pluronic® F77) відсотковий вміст поліоксіетилену (гідрофільна речовина) становить 70 %, а молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілену) досягає приблизно 2306 Да. У разі плюронік F87 відсотковий вміст поліоксіетилену (гідрофільна речовина) становить 70 %, а молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілену) досягає приблизно 2644 Да. 17 У разі плюронік F88 відсотковий вміст поліоксіетилену (гідрофільна речовина) становить 80 %, а молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілену) досягає приблизно 2644 Да. У разі плюронік F68 відсотковий вміст поліоксіетилену (гідрофільна речовина) становить 80, а молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілену) досягає приблизно 1967 Да. Нижче наведені типові властивості плюронік F77: - середня молекулярна маса: 6600; - точка плавлення/плинності: 48 °С; - фізична форма при температурі 20 °С: тверде тіло; - в'язкість (за Брукфілдом): 480 сП (0,48 Па.с) [рідини при температурі 25 °С, пасти при температурі 60 °С і тверді речовини при температурі 77 °С]; - поверхневий натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25 °С: 0,1 % концентрація: 47,0 (0,047); 0,01 % концентрація: 49,3 (0,0493); 0,001 % концентрація: 52,8 (0,0528); - міжфазний натяг, дин/см (Н/м) при температурі 2 °С порівняно з вазеліновим маслом: 0,1 % концентрація: 17,7 (0,0177); 0,01 % концентрація: 20,8 (0,0208); 0,01 % концентрація: 25,5 (0,0255); - змочування (за Дрейвсом), у секундах при температурі 25 °С: 1,0 % концентрація: >360; 0,1 % концентрація: >360; - висота піни: (за методикою фірми Ross Miles), 0,1 %, мм при температурі 50 °С: 100; (за методикою фірми Ross Miles), 0,1 %, мм при температурі 26 °С: 47; (за результатами динамічних випробувань), 0,1 %, мм при 400 мл/хв.: >600; - температура помутніння у водному розчині, °С: 1,0 % концентрація: >100; 10 % концентрація: >100; - HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 25. Нижче наведені типові властивості плюронік F87: - середня молекулярна маса: 7700; - точка плавлення/плинності: 49 °С; - фізична форма при температурі 20 °С: тверде тіло; - в'язкість (за Брукфілдом): 700 сП (0,7 Па.с) [рідини при температурі 25 °С, пасти при температурі 60 °С і тверді речовини при температурі 77 °С]; - поверхневий натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25 °С: 0,1 % концентрація: 44,0 (0,044); 0,01 % концентрація: 47,0 (0,047); 0,001 % концентрація: 50,2 (0,0502); - міжфазний натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25 °С порівняно з вазеліновим маслом: 0,1 % концентрація: 17,4 (0,0174); 0,01 % концентрація: 20,3 (0,0203); 0,01 % концентрація: 23,3 (0,0233); - змочування (за Дрейвсом), у секундах при 94032 18 температурі 25 °С: 1,0 % концентрація: >360; 0,1 % концентрація: >360; - висота піни: (за методикою фірми Ross Miles), 0,1 %, мм при температурі 50 °С: 80; (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 26 °С: 37; (за результатами динамічних випробувань), 0,1 %, мм при 400 мл/хв: >600; - температура помутніння у водному розчині, °С: 1,0 % концентрація: >100; 10 % концентрація: >100; - HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 24. Нижче наведені типові властивості плюронік F88: - середня молекулярна маса: 11400; - точка плавлення/плинності: 54 °С; - фізична форма при температурі 20 °С: тверде тіло; - в'язкість (за Брукфілдом): 2300 сП (2,3 Па.с) [рідини при температурі 25 °С, пасти при температурі 60 °С і тверді речовини при температурі 77 °С]; - поверхневий натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25 °С: 0,1 % концентрація: 48,5 (0,0485); 0,01 % концентрація: 52,6 (0,0526); 0,001 % концентрація: 55,7 (0,0557); - міжфазний натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25 °С порівняно з вазеліновим маслом: 0,1 % концентрація: 20,5 (0,0205); 0,01 % концентрація: 23,3 (0,0233); 0,01 % концентрація: 27,0 (0,027); - змочування (за Дрейвсом), у секундах при температурі 25 °С: 1,0 % концентрація: >360; 0,1 % концентрація: >360; - висота піни: (за методикою фірми Ross Miles), 0,1 %, мм при температурі 50 °С:80; (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 26 °С: 37; (за результатами динамічних випробувань), 0,1 %, мм при 400 мл/хв: >600; - температура помутніння у водному розчині, °С: 1,0 % концентрація: >100; 10 % концентрація: > 100; - HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 28. Нижче наведені типові властивості плюронік F68: - середня молекулярна маса: 8400; - точка плавлення/плинності: 52 °С; - фізична форма при температурі 20 °С: тверде тіло; - в'язкість (за Брукфілдом): 1000 сП (1,0 Па.с) [рідини при температурі 25 °С, пасти при температурі 60 °С і тверді речовини при температурі 77 °С]; - поверхневий натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25 °С: 0,1 % концентрація: 50,3 (0,0503); 0,01 % концентрація: 51,2 (0,0512); 19 0,001 % концентрація: 53,6 (0,0536); - міжфазний натяг, дин/см (Н/м) при температурі 2 °С порівняно з вазеліновим маслом: 0,1 % концентрація: 19,8 (0,0198); 0,01 % концентрація: 24,0 (0,024); 0,01 % концентрація: 26,0 (0,026); - змочування (за Дрейвсом), у секундах при температурі 25 °С: 1,0 % концентрація: >360; 0,1 % концентрація: >360; - висота піни: (за методикою фірми Ross Miles), 0,1 %, мм при температурі 50 °С: 35; (за методикою фірми Ross Miles), 0,1 %, мм при температурі 26 °С: 40; (за результатами динамічних випробувань), 0,1 %, мм при - 400 мл/хв: >600; - температура помутніння у водному розчині, °С: 1,0 % концентрація: >100; 10 % концентрація >100; - HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 29. У композиціях за цим винаходом можуть також застосовуватись інші полімери, що мають властивості, подібні до наведених вище. Поверхневоактивною речовиною, якій віддають перевагу, є плюронік F68 і поверхнево-активні речовини, що мають подібні властивості. Плюронік, зокрема плюронік F68, є присутнім у композиції, за варіантом, якому віддають перевагу, у концентрації, яка є достатньою для підтримування стійкості інтерферону впродовж необхідного періоду зберігання (наприклад, від 12 місяців до 24 місяців), а також у концентрації, яка є достатньою для запобігання втратам білка унаслідок адсорбції на поверхнях, наприклад, флакона, ампули, капсули або шприца. За варіантом, якому віддають перевагу, концентрація плюронік, зокрема плюронік F68, у рідких композиціях становить від або приблизно від 0,01 мг/мл до або приблизно до 10 мг/мл, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від або приблизно від 0,05 мг/мл до або приблизно до 5 мг/мл, за варіантом, якому віддають значно більшу перевагу, від або приблизно від 0,1 мг/мл до або приблизно до 2 мг/мл, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, вона дорівнює або приблизно дорівнює 1 мг/мл. Концентрація IFN-бета у композиції, за варіантом, якому віддають перевагу, становить від або приблизно від 10 мкг/мл до або приблизно до 800 мкг/мл, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від або приблизно від 20 мкг/мл до або приблизно до 500 мкг/мл, за варіантом, якому віддають значно більшу перевагу, від або приблизно від 30 мкг/мл до або приблизно до 300 мкг/мл, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, вона дорівнює або приблизно дорівнює 22 мкг/мл, 44 мкг/мл, 88 мкг/мл або 264 мкг/мл. рН композицій за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, знаходиться у межах приблизно від 3,0 до або приблизно до 5,0, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, рН дорівнює або приблизно дорівнює 3,7 або 4,7. Буфером, якому віддають перевагу, є ацетат, протиі 94032 20 онами, яким віддають перевагу, є іони натрію або калію. Ацетатно-сольові буфери є добре відомими у цій галузі. Концентрації буфера у загальному об'ємі розчину можуть змінюватись і дорівнювати або приблизно дорівнювати 5 мМ, 9,5 мМ, 10 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ і 500 мМ. За варіантом, якому віддають перевагу, концентрація буфера дорівнює або приблизно дорівнює 10 мМ. За варіантом, якому віддають особливу перевагу, концентрація буфера становить 10 мМ у ацетатних іонах при рН 3,5±0,2 або 4,5±0,2. У композиції за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, антиоксидант, наприклад, метіонін, є присутнім у концентрації від або приблизно від 0,01 мг/мл до або приблизно до 5,0 мг/мл, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від або приблизно від 0,05 мг/мл до або приблизно до 0,3 мг/мл, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, вона дорівнює або приблизно дорівнює 0,1 мг/мл. Концентрація ізотонічного агента (наприклад, маніту) у рідких композиціях, за варіантом, якому віддають перевагу, становить від або приблизно від 0,5 мг/мл до або приблизно до 500 мг/мл, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від або приблизно від 1 мг/мл до або приблизно до 250 мг/мл, за варіантом, якому віддають значно більшу перевагу, від або приблизно від 10 мг/мл до або приблизно до 100 мг/мл, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, вона дорівнює або приблизно дорівнює 55 мг/мл. Цей винахід включає рідкі композиції. Розчинником, якому віддають перевагу, є вода для ін'єкцій. Рідкі композиції можуть бути однодозовими або багатодозовими. Згадані рідкі композиції інтерферону за цим винаходом, які є призначеними для багатодозового застосування, за варіантом, якому віддають перевагу, містять бактеріостатичний препарат, наприклад, фенол, m-крезол, nкрезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловий спирт, алкілпарабен (метил, етил, пропіл, бутил тощо), бензалконію хлорид, бензетонію хлорид, натрію дигідроацетат і тимеросал. Особливу перевагу віддають фенолу, бензиловому спирту і mкрезолу, більшу перевагу віддають бензиловому спирту. Згаданий бактеріостатичний препарат застосовують у кількості, яка забезпечує концентрацію, що є ефективною для підтримання згаданої композиції по суті вільною від бактерій (придатною для ін'єкцій) впродовж періоду введення багатодозових ін'єкцій тривалістю від або приблизно від 12 год. або 24 год. до або приблизно до 12 днів, за варіантом, якому віддають перевагу, від або приблизно від 6 днів до або приблизно до 12 днів. Концентрація бактеріостатичного препарату, за варіантом, якому віддають перевагу, становить від або приблизно від 0,1 % (маса бактеріостатичного препарату/маса розчинника) до або приблизно до 2,0 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від або приблизно від 0,2 % до або приблизно до 1,0 %. У разі бензилового спирту, особливу перевагу віддають концентраціям 0,2 % або 0,3 %. Однак застосування консерванта, наприклад, бензилового спирту, не обмежується багатодозовими 21 композиціями, але він може додаватись також до однодозових композицій. Кількість інтерферону у композиціях за цим винаходом забезпечує після відновлення одержання концентрацій від приблизно 1,0 мкг/мл до приблизно 50 мг/мл, хоча придатними є більш низькі і більш високі концентрації, що залежить від передбачуваного носія для спрямованої доставки, наприклад, розчинні композиції будуть відрізнятись від композицій, призначених для доставки за допомогою черезшкірного пластиру, легеневим, трансмукозним шляхами або за допомогою осмотичного чи мікронасоса. Концентрація інтерферону, за варіантом, якому віддають перевагу, становить від або приблизно від 5,0 мкг/мл до або приблизно до 2 мг/мл, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від або приблизно від 10 мкг/мл до або приблизно до 1 мг/мл, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, від або приблизно від 30 мкг/мл до або приблизно до 100 мкг/мл, За варіантом, якому віддають перевагу, активність інтерферону у композиціях за цим винаходом під час фасування зберігається щонайменше на рівні або приблизно на рівні 60 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше на рівні або приблизно на рівні 70 %, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше на рівні або приблизно на рівні 80 % впродовж 24 міс. За додатковим варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує спосіб виготовлення рідкої фармацевтичної композиції, як описувалось вище. За ще одним варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує спосіб виготовлення фасованої фармацевтичної композиції, що включає фасування розчину, що містить активний інгредієнт і наповнювачі, як описувалось вище. За ще одним варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує готовий виріб для людського фармацевтичного застосування; що включає флакон, який містить фармацевтичні композиції, як; описувалось вище, і письмовий матеріал, у якому вказується, що такий розчин може зберігатись після першого застосування впродовж періоду часу, що дорівнює або приблизно дорівнює двадцяти чотирьом годинам або більше. За варіантом, якому віддають перевагу, письмовий матеріал вказує, що такий розчин може зберігатись впродовж періоду часу, що дорівнює або приблизно дорівнює 12 дням. Після першого застосування багатодозової композиції, вона може зберігатись і застосовуватись щонайменше впродовж або приблизно впродовж 24 год., за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше впродовж або приблизно впродовж 4 днів, 5 днів або 6 днів, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, впродовж періоду часу тривалістю до 12 днів. Після першого застосування композицію, за варіантом, якому віддають перевагу, зберігають при температурі нижче кімнатної (тобто нижче або приблизно нижче 25 °С), за варіантом, якому віддають більшу перевагу, нижче або приблизно нижче 10 °С, за варіан 94032 22 том, якому віддають більшу перевагу, нижче або приблизно нижче 2-8 °С, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, нижче або приблизно нижче 4-6 °С Композиції за цим винаходом можна одержати способом, який включає додання визначеної кількості наповнювачів до забуференого розчину, з подальшим доданням інтерферону. Після цього одержаний розчин фасують у флакони, ампули або капсули. Пересічним фахівцем у цій галузі можуть бути визначені варіанти цього процесу. Наприклад, порядок, у якому додаються компоненти, чи застосовуються додаткові додатки, температура і рН, при яких одержують композицію, усе це є факторами, які можуть оптимізуватись відносно концентрації та застосованих засобів введення. У разі композицій для багатодозового застосування, бактеріостатичний препарат може додаватись до розчину, що містить активний інгредієнт (інтерферон) або, за альтернативним варіантом, він може зберігатись у окремому флаконі або капсулі з подальшим змішуванням з розчином, що містить активний інгредієнт, у момент застосування. Композиції, за цим винаходом можуть вводитись за допомогою визнаних засобів. Прикладами таких одноампульних систем є автоматичні ін'єктори або шприци-ін'єктори для спрямованої доставки розчину, наприклад, Rebiject®: Продукти, що заявляються у пунктах формули цього винаходу, включають пакувальний матеріал. Пакувальний матеріал, окрім інформації, яка вимагається органами державного регулювання, забезпечує умови, за яких згаданий продукт може застосовуватись. Пакувальний матеріал за цим винаходом, у разі продукту, розфасованого у двох флаконах (вологий/сухий), надає хворому, у разі необхідності, інструкції щодо одержання розчину і застосування такого готового розчину впродовж періоду часу тривалістю двадцять чотири години або більше. У разі розфасованого до одного флакона розчинного продукту, етикетка вказує, що такий розчин може застосовуватись впродовж періоду часу тривалістю двадцять чотири години або більше. Продукти, що заявляються у пунктах формули цього винаходу, є придатними для фармацевтичного застосування для людини. Стійкі консервовані композиції можуть надаватись хворим у вигляді прозорих розчинів. Згаданий розчин може призначатись для одноразового застосування або може застосовуватись декілька разів, і його може вистачити для одного або декількох циклів лікування хворого і, таким чином, цей розчин надає можливість застосування більш зручної схеми лікування, аніж та, що є доступною на цей час. Інтерферон у формі стійких або консервованих композицій або розчинів, опис яких наведено, може вводитись хворому за цим винаходом різноманітними способами спрямованої доставки, у тому числі шляхом підшкірної або внутрішньом'язової ін'єкції; черезшкірним, легеневим, трансмукозним шляхом, шляхом імплантації, за допомогою осмотичного насоса, капсули, мікронасоса, перораль 23 ним шляхом або іншими засобами, які визначаються досвідченим фахівцем як добре відомі у цій галузі. Термін "флакон" означає, у широкому значенні, резервуар, придатний для утримування інтерферону у твердій або рідкій формі у фасованому стерильному стані. Прикладами флакона, за цим описом, є ампули, капсули, витяжні прозорі упаковки або інший подібний резервуар, придатний для спрямованої доставки інтерферону хворому за допомогою шприца, насоса (у тому числі осмотичного), катетера, черезшкірного пластиру, легеневого або трансмукозного спрею. Флакони, придатні для фасування продуктів для парентерального, легеневого, трансмукозного або черезшкірного введення, є добре відомими і загальновизнаними у цій галузі. Термін "лікування" у контексті цього винаходу означає будь-який сприятливий ефект на розвиток хвороби, у тому числі послаблення, зменшення, зниження або полегшення патологічного розвитку після початку хвороби. Фармацевтичні композиції за цим винаходом, що містять IFN або ізоформу, мутеїн, гібридний білок, функціональну похідну, активну фракцію або сіль, є придатними для діагностування, запобігання або лікування (місцевого або системного) клінічних показань, що реагують на лікування цим поліпептидом. Такі клінічні показання включають, наприклад, розлади або хвороби центральної нервової системи (ЦНС), головного мозку та/або спинного мозку, у тому числі, розсіяний склероз; автоімунні захворювання, у тому числі, ревматоїдний артрит, псоріаз, хворобу Крона; і рак, у тому числі рак молочної залози, передміхурової залози, сечового міхура, нирок і товстої кишки. До цього опису шляхом посилання у повному обсязі включені усі посилання, наведені у цьому описі, у тому числі журнальні статті або реферати, опубліковані або неопубліковані американські або іноземні заявки на патенти, видані американські або іноземні патенти або будь-які інші посилання, у тому числі усі дані, таблиці, фігури і текст, подані у наведених посиланнях. Окрім того, до цього опису у повному обсязі включено шляхом посилання повний зміст посилань, які наводяться у наведених у цьому описі посиланнях. Посилання на стадії відомих способів, стадії традиційних способів, відомі способи або традиційні способи у жодному разі не є визнанням того, що будь-який аспект, опис або варіант здійснення цього винаходу розкривається, описується або пропонується у відповідній галузі. Наведений далі опис конкретних варіантів здійснення цього винаходу з такою повнотою розкриє загальну природу винаходу, що інші зможуть, вживши знань у межах цієї галузі (з включенням змісту посилань, що згадувались у цьому описі), легко модифікувати та/або адаптувати для різних варіантів застосування такі конкретні варіанти здійснення без зайвого експериментування і без відхилення від загальної концепції цього винаходу. Таким чином, вважається, що усі подібні адаптації та модифікації входять до діапазону еквівалентів розкритих варіантів здійснення, виходячи з розк 94032 24 риття та методичних вказівок, наведених у описі. Слід розуміти, що фразеологія або термінологія, вжита у цьому описі, призначена для опису, а не для обмеження, завдяки чому термінологія або фразеологія цього опису повинна тлумачитись досвідченим фахівцем у світлі розкриття та методичних вказівок, наведених у цьому описі, у поєднанні зі знаннями пересічного фахівця у цій галузі. ОПИС ФІГУР На Фіг. 1 вказано відсоток окиснених форм, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з різними концентраціями бензилового спирту після зберігання при температурі 40 °С. На Фіг. 2 вказано відсоток окиснених форм, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з різними концентраціями бензилового спирту після зберігання при температурі 25 °С. На Фіг. 3 вказано відсоток окиснених форм, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з різними концентраціями бензилового спирту після зберігання при температурі 2-8 °С. На Фіг. 4 вказано відсоток загального об'єму агрегатів, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з різними концентраціями бензилового спирту після зберігання при температурі 40 °С. На Фіг. 5 вказано відсоток загального об'єму агрегатів, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з різними концентраціями бензилового спирту після зберігання при температурі 25 °С. На Фіг. 6 вказано відсоток загального об'єму агрегатів, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з різними концентраціями бензилового спирту після зберігання при температурі 2-8 °С. На Фіг. 7 вказано відсоток окиснених форм, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з різними бактеріостатичними препаратами після зберігання при температурі 25 °С. На Фіг. 8 вказано відсоток окиснених форм, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з різними бактеріостатичними препаратами після зберігання при температурі 2-8 °С. На Фіг. 9 вказано відсоток загального об'єму агрегатів, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з різними бактеріостатичними препаратами. На Фіг. 10 вказано відсоток окиснених форм, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з EDTA після зберігання при температурі 25 °С. На Фіг. 11 вказано відсоток загального об'єму агрегатів, присутніх у багатодозових композиціях інтерферону бета-1а з EDTA після зберігання при температурі 25 °С. На Фіг. 12 показано ефективність 0,012% Lметіоніну як антиоксиданта (при температурі 2-8 °С). На Фіг. 13 показано ефективність 0,012 % Lметіоніну як антиоксиданта (при температурі 25±2 °С). Приклади Приклад 1 - Рідка однодозова композиція інтерферону бета-1а без HSA у попередньо заповне 25 94032 них шприцах 1.1 Попередні дослідження сумісності Попередні експерименти здійснювали для перевірки захисного ефекту, що демонструється деякими наповнювачами, наприклад антиоксидантом і поверхнево-активними речовинами, оскільки очікувалось, що видалення людського сироваткового альбуміну (HSA) з існуючого продукту може вплинути на згаданий продукт із точки зору окиснення, утворення агрегатів і адсорбції на поверхнях. Інтерферон бета-1а вводили до складу композиції з концентраціями 44 мкг/мл і 88 мкг/мл у натрійацетатному буфері, що містив 54,6 мг/мл маніту у комбінації з декількома наповнювачами, наприклад, 0,4 % HSA, 0,012 % L-метіоніну, твін 20 (0,005 %, 0,007 %, 0,01 %), полоксамер 188 (0,05 %, 0,1 %, 0,5 %). Різні комбінації піддавали дії стресових умов (зберігання при температурі 40 °С або інтенсивне перемішування) і перевіряли на ступінь окиснення (RP-HPLC) і утворення агрегатів (SE-HPLC (гель-хроматографія)). 26 Таблиці DEP-1 і DEP-2 підсумовують рівні окиснення і утворення агрегатів після 2 тижнів зберігання при температурі 40 °С. Наслідком комбінування інтерферону бета-1а з обома випробуваними поверхнево-активними речовинами (твін 20 і полоксамер 188) виявилось підвищення рівня окиснення, який, для кожного типу поверхнево-активної речовини, є залежним від концентрації (Таблиця DEP-1, комбінації № 4-6 і № 7-9); при 0,5 % рівні полоксамеру 188 (який згадується також як плюронік F-68 або F-68) лікарська речовина повністю розкладається (Таблиця DEP1, № 9). Підвищений рівень розкладання спостерігається у разі твін 20, як очікувалось, унаслідок окиснювальних різновидів (наприклад, пероксидів), що можуть бути присутніми, як залишки після синтезу. Обидві поверхнево-активні речовини при різних перевірених концентраціях не впливають на рівень утворення агрегатів при зберіганні при температурі 40 °С (Таблиця DEP-2). Таблиця DEP-1 Окиснені форми (%) за даними RP-HPLC після зберігання при температурі 40 °С №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 № 10 № 11 IFN 44 мкг IFN 44 мкг + 0,4 % HSА (існуючий продукт) IFN 44 мкг + 0,012 % L-Met IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг + 0,012 % L-Met + 0,007% Твін-20 IFN 44 мкг + 0,012 % L-Met + 0,1 F-68 Т=0 3,0 2,4 3,9 3,5 3,4 3,5 3,5 3,3 3,6 3,5 3,5 2 тижні 6,5 5,5 6,2 6,0 7,0 8,7 6,9 8,0 n.m. 6,9 7,6 n.m. = не визначалось унаслідок повного розкладу Таблиця DEP-2 Загальний об'єм агрегатів (%) за даними SE-HPLC після зберігання при температурі 40 °С №1 №4 №5 №6 №7 №8 №9 IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг IFN 44 мкг Таблиця DEP-3 показує, що обидві поверхнево-активні речовини, твін 20 і полоксамер 188 (F68), застосовані з критичною концентрацією міце Т=0 2,6 2,4 2,8 2,6 2,5 2,5 2,6 2 тижні 2,8 2,1 2,0 2,0 2,9 2,5 2,9 лоутворення (CMC), допомагають запобігти агрегуванню, що індукується інтенсивним перемішуванням впродовж 5 хв. 27 94032 28 Таблиця DEP-3 Загальний об'єм агрегатів (%) за даними SE-HPLC після 5 хв. інтенсивного перемішування Т=0 №1 №3 № 10 № 11 IFN 44 мкг IFN 44 мкг + 0,012 % L-Met IFN 44 мкг + 0,012 % L-Met + 0,007% Твін-20 IFN 44 мкг + 0,012 % L-Met + 0,1 F-68 1.1.1 Фізико-хімічні характеристики Фізико-хімічними характеристиками, які, як відомо, є критичними для якості лікарського продукту, є ступінь окиснення і вміст димерів/агрегатів. Ці характеристики розглядались при проведенні досліджень на сумісність, підсумованих вище. 1.2 Наповнювачі 1.2.1 10 мМ натрійацетатний буфер, рН 3,5 10 мМ натрійацетатний буфер (рН 3,5), що містить 54,6 мг/мл маніту як ізотонічний агент, стабілізує продукт, як було показано під час проведення попередньої розробки існуючого ринкового продукту (Rebif®) і як описано у ЕР 759775. 1.2.2 Полоксамер 188 Полоксамер 188 (або плюронік F-68) включають до складу композиції у об'ємі 0,1 % (критична концентрація міцелоутворення) для запобігання адсорбції лікарської речовини на поверхні контейнерів під час процесу виробництва; більш високі концентрації можуть негативно вплинути на стійкість продукту (підвищений ступінь окиснення); більш низькі концентрації можуть бути менш ефективними при обмеженні ступеня адсорбції. 1,6 1,4 1,4 1,3 Інтенсивне перемішування впродовж 5 хв. 2,5 2,4 1,3 1,3 Ефективність полоксамеру 188 щодо запобігання адсорбції лікарської речовини під час процесу виробництва була продемонстрована таким дослідженням: розчини, що містили 44 мкг/мл інтерферону бета-1а, об'єднували з поверхневоактивною речовиною (твін 20, полоксамер 188, HSA) з 3 різними концентраціями, імітуючи процес виробництва; зразки відбирали на різних стадіях (змішування, асептична фільтрація, заповнення) і випробували засобами кількісної RP-HPLC. Відбирали такі зразки: - перед фільтрацією (BF) - після першої фільтрації (AF1) - після другої фільтрації (AF2) - після заповнення (готовий продукт у Т=0) Результати наведені у Таблиці DEP-4 у вигляді відношення рівень відновлення (%)/вихідне значення (тобто змішаний розчин перед фільтрацією): полоксамер 188 є ефективнішим за твін 20, і має таку саму ефективність, що і HSA відносно запобігання адсорбції лікарської речовини під час виготовлення. Таблиця DEP-4 Процент відновлення інтерферону бета-1а під час виготовлення AF1 AF2 Т=0 Без HSA/без поверхневоактивної речовини 97,8 94,5 93,8 HSA 97,5 97,3 96,9 0,003 % твін 20 98,2 96,3 95,8 Полоксамер 188 різного ступеня чистоти, одержаний від різних постачальників, досліджували на вміст продуктів окиснення у разі прискорених умов випробування (2 тижні при температурі 40 °С) для визначення якості продукту для застосування: ви 0,007 % твін 20 97,7 96,6 95,7 0,02 % твін 20 99,1 97,6 96,3 0,05 % F- 0,1 % 68 F-68 98,3 98,6 97,0 98,4 96,5 97,0 0,2 % F68 98,9 98,3 98,0 брали полоксамер 188 від фірми BASF, оскільки він мав більш низький рівень окиснення і постачається як реактив фармацевтичної чистоти. Результати підсумовані у Таблиці DEP-5: Таблиця DEP-5 Процент окиснених форм, виявлений у композиціях, що містять 0,1 % полоксамеру 188 (різна якість, від різних постачальників) Постачальник Якість Т=0 BASF Fluka Sigma Фармацевтична чистота Для газової хроматографії Для біохімічних досліджень 2,6 1 тиждень при температурі 40 °С 3,8 3,2 2 тижні при температурі 40 °С 3,2 4,7 4,4 29 94032 30 метіоніну; більш високі концентрації (0,05 %, 0,1 %) L-метіоніну показують порівнянний ефект відносно стійкості. Продукти окиснення, виявлені при зберіганні при температурі 40 °С, наведені у Таблиці DEP-6. 1.2.3 L-метіонін L-метіонін (L-Met) включають до складу композиції у об'ємі 0,012 % для обмеження окиснення. Ефективність цієї концентрації показують шляхом порівняння з композицією, що не містить L Таблиця DEP-6 % окиснених форм у композиціях інтерферону бета-1а, що містять різні рівні L-метіоніну (L-Met) 1 тиждень при температурі 40 °С 3,8 2,9 3,0 2,6 T=0 IFN  -1a 44 мкг 2,8 IFN  -1a 44 мкг + 0,012 % L-Met IFN  -1a 44 мкг + 0,05 % L-Met IFN  -1a 44 мкг + 0,1 % L-Met Під час розробки композиції, ефективність Lметіоніну, як антиоксиданта, була підтверджена даними 3 місяців випробувань стійкості при температурі 2-8 °С і 25±2 ºС, які були одержані з композиціями, що містили L-метіонін у комбінації з поверхнево-активними речовинами: L-метіонін є ефективним як антиоксидант при рівні 0,012 % і може гарантувати стійкість, порівнянну зі стійкістю, що спостерігається у існуючого продукту (див. Фіг. 12 і Фіг. 13). 1.3 Лікарський продукт 1.3.1 Розробка композицій Розробка нової композиції інтерферону бета1а без HAS була зосереджена на підтвердженні результатів попередніх досліджень (ефективність 3-4 тижні при температурі 40 °С 7,6 5,3 5,1 5,0 L-метіоніну як антиоксиданта, включення полоксамеру 188 для запобігання втратам під час виготовлення) у кінцевому контейнері. Одержали розчини інтерферону бета-1а (44 мкг/мл і 88 мкг/мл), що містили 54,6 мг/мл маніту у 10 мМ натрійацетатному буфері (рН 3,5), і до їх складу ввели такі наповнювачі: - Твін 20 (0,003 %, 0,007 %, 0,02 %) - Полоксамер 188 (0,05 %, 0,1 %, 0,2 %) - L-метіонін (0 %, 0,012 %) - HSA (0,4 %, існуюча композиція, що позначається як "ref") Склад композицій, що піддавались випробуванням, наведено у Таблиці DEP-7. Таблиця DEP-7 Склад композицій, що містять інтерферон бета-1а Композиція IFN-  -1a (мкг) Маніт (мг) IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7(ref) IFN-8 IFN-9 IFN-10 IFN-11 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 88 54,6 54,6 54,6 54,6 54,6 54,6 54,6 54,6 54,6 54,6 54,6 Твін 20 Полоксамер 188 (мг) (мг) 0,03 0,07 0,2 0,2 0,5 1 2 2 1 Методика виготовлення композицій наведена нижче: 90 мл кожної композиції виготовляли за асептичних умов шляхом змішування необхідної кількості наповнювачів, розчинених у воді для ін'єкцій (WFI) з лікарською речовиною (інтерферон бета1а); після цього композиції фільтрували через 0,22 мкм мембрану (фільтрували двічі через два мембранні фільтри), і 0,5 мл кожного розчину залива HSA (мг) 4 Lметіонін (мг) 0,12 0,12 0,12 10 мМ ацетатний буфер (рН 3,5) Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл Достатня кількість до 1 мл ли до 1 мл скляних шприців Нуpаk. Розмір партії становив приблизно 180 шприців. Після цього композиції зберігали при температурі 2-8 °С, 25±2 °С і 40±2 °С з подальшим випробуванням стійкості тривалістю до 12 тижнів (до 6 тижнів у разі зразків, що зберігались при температурі 40±2 °С). Під час розробки вдавались до таких аналітичних тестів та методів (докладніше щодо цих ана 31 94032 лізів дивись Приклад 2): - біологічна активність (біологічний аналіз цитопатичного ефекту (СРЕ)); - аналіз (RP-HPLC); - продукти окиснення (RP-HPLC); - димери/агрегати (SE-HPLC і SDS-PAGE (еле 32 ктрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію)); - рН (потенціометричний метод); - осмотичний тиск (кріоскопічне вимірювання). Результати та їх оцінка підсумовані у Таблицях DEP-8-DEP-17. Таблиця DEP-8 Біоідентичність (млн. МОд/мл) IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 Час 0 11,7 11,5 11,3 11,8 12,1 IFN-6 IFN-7 IFN-8 IFN-9 IFN-10 12,1 12,1 11,2 11,2 12,0 IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7 IFN-8 IFN-9 IFN-10 Час 0 11,7 11,5 11,3 11,8 12,1 12,1 12,1 11,2 11,2 12,0 IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7 IFN-8 IFN-9 IFN-10 Час 0 11,7 11,5 11,3 11,8 12,1 12,1 12,1 11,2 11,2 12,0 2-8 °С 4 тижні 12,4 12,1 10,0 11,8 12,3 2-8 °C 12,2 12,4 11,4 12,4 13,0 25 °C 2 тижні 11,2 11,8 10,7 10,8 12,3 12,9 11,2 11,1 11,0 11,7 40 °C 2 тижні 9,4 10,0 7,8 10,9 12,1 11,6 11,0 11,0 10,1 12,3 Криві, обчислені шляхом лінійного регресійного аналізу і підсумовані у Таблиці DEP-9, показують зниження біологічної активності усіх композицій, що містять твін 20 (№ 1, № 2, № 3, № 9) і які зберігались при температурі 40 °С; зниження біо 8 тижнів 11,6 11,9 9,9 12,4 12,6 12 тижнів 11,0 11,1 9,7 11,1 11,6 11,4 12,6 11,5 12,7 12,4 10,7 11,1 10,8 11,9 11,6 4 тижні 11,5 11,3 10,6 11,8 12,5 12,0 12,7 11,5 12,1 11,8 8 тижнів 11,0 11,1 10,4 12,2 12,0 11,5 12,8 11,6 11,5 12,5 4 тижні 9,4 9,7 7,2 11,4 13,1 12,7 12,2 11,6 9,1 12,0 6 тижнів 9,6 9,6 6,0 13,0 12,1 11,4 12,0 12,0 7,1 11,0 12 тижнів 10,7 10,7 8,9 11,6 10,9 10,5 11,3 10,9 10,9 11,6 логічної активності спостерігалось також у композицій № 3 і № 6 (найвища концентрація поверхнево-активних речовин) після зберігання при температурі 25 °С і 2-8 °С. 33 94032 34 Таблиця DEP-9 Лінійний регресійний аналіз біоідентичності (нахил кривих у млн. МОд/мл х тиждень) 2-8 °С 25 °С 40 °С IFN-1 -0,07 -0,08 -0,32 IFN-2 -0,04 -0,08 -0,29 IFN-3 -0,12 -0,17 -0,83 IFN-4 -0,04 0,03 0,20 IFN-5 -0,03 -0,10 0,05 IFN-6 -0,13 -0,17 -0,05 IFN-7 -0,06 -0,02 0,06 IFN-8 -0,03 -0,01 0,16 IFN-9 0,06 -0,02 -0,67 IFN-10 -0,06 0,00 -0,17 Таблиця DEP-10 Аналіз (мкг/шприц) засобами RP-HPLC 2-8 °С IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7 IFN-8 IFN-9 IFN-10 IFN-11 Час 0 23,4 22,9 22,4 22,9 23,6 23,1 23,0 21,2 23,0 22,8 45,6 4 тижні 21,5 21,4 20,8 22,4 23,3 21,4 22,8 20,0 21,7 22,6 43,9 IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7 IFN-8 IFN-9 IFN-10 IFN-11 Час 0 23,4 22,9 22,4 22,9 23,6 23,1 23,0 21,2 23,0 22,8 45,6 2 тижні 20,5 21,2 19,9 21,5 23,4 22,6 23,1 20,8 20,5 22,2 45,2 IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7 IFN-8 IFN-9 IFN-10 IFN-11 Час 0 23,4 22,9 22,4 22,9 23,6 23,1 23,0 21,2 23,0 22,8 45,6 8 тижнів 22,8 22,2 20,8 23,1 21,7 22,9 23,4 23,5 21,6 22,7 44,3 2 тижні 18,8 18,5 15,1 20,1 21,8 20,7 20,6 19,6 16,8 20,5 43,4 12 тижнів 21,2 21,1 20,2 21,2 22,2 21,2 22,0 20,0 22,1 23,2 44,7 4 тижні 20,7 19,8 19,1 22,2 23,0 20,7 22,9 19,8 20,2 22,6 44,6 8 тижнів 20,7 20,8 17,6 22,5 23,6 22,0 23,2 20,8 18,2 22,0 43,4 4 тижні 17,8 16,2 11,2 19,8 21,0 18,8 18,8 18,3 12,7 19,8 41,5 6 тижнів 16,6 15,4 10,4 18,7 19,6 18,7 16,7 18,1 13,1 19,9 40,1 25 °С 12 тижнів 20,1 19,7 16,6 21,1 21,4 20,5 22,6 19,7 18,6 22,3 44,8 40 °С Криві, обчислені шляхом лінійного регресійного аналізу і підсумовані у Таблиці DEP-11, показують більш високу втрату вмісту білка для компози цій, що містять твін 20 (№ 1, 2, 3, 9) і які зберігались при температурі 40 °С; така сама тенденція спостерігається при температурі 25 °С, а також у 35 94032 разі композицій № 5 і № 6. Значне зменшення вмісту білка відбувається при температурі 2-8 °С у 36 композицій № 1, № 2, № 3 (з твін 20), № 4, № 5 (з полоксамером 188) і № 9 (з твін 20 і L-метіоніном). Таблиця DEP-11 Лінійний регресійний аналіз даних аналізу засобами RP-HPLC (нахил кривих у мкг/шприц х тиждень) 2-8 °С 25 °С 40 °С IFN-1 -0,13 -0,19 -1,10 IFN-2 -0,11 -0,20 -1,20 IFN-3 -0,16 -0,44 -2,00 IFN-4 -0,11 -0,09 -0,64 IFN-5 -0,14 -0,15 -0,64 IFN-6 -0,11 -0,18 -0,76 IFN-7 -0,06 -0,03 -1,00 IFN-8 0,00 -0,09 -0,53 IFN-9 -0,07 -0,34 -1,70 IFN-10 0,03 -0,04 -0,47 IFN-11 -0,06 -0,10 -0,92 Таблиця DEP-12 Процент окиснених форм за даними RP-HPLC 2-8 °С IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7 IFN-8 IFN-9 IFN-10 IFN-11 Час 0 2,8 2,5 2,7 2,6 2,8 2,5 1,5 2,8 3,3 3,0 2,6 4 тижні 2,8 2,9 3,0 2,6 2,8 3,1 1,5 2,9 3,4 3,2 2,9 IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7 IFN-8 IFN-9 IFN-10 IFN-11 Час 0 2,8 2,5 2,7 2,6 2,8 2,5 1,5 2,8 3,3 3,0 2,6 2 тижні 3,0 3,0 3,5 3,0 3,0 3,0 1,7 3,1 3,4 3,0 2,8 IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7 IFN-8 IFN-9 IFN-10 IFN-11 Час 0 2,8 2,5 2,7 2,6 2,8 2,5 1,5 2,8 3,3 3,0 2,6 2 тижні 6,0 3,7 8,8 4,1 3,7 4,9 2,8 3,8 5,7 3,6 3,2 8 тижнів 3,3 3,4 4,2 3,6 3,6 4,5 1,7 3,2 3,4 3,0 2,9 12 тижнів 3,4 3,4 4,5 3,2 3,2 4,4 1,3 3,1 3,6 3,0 2,9 4 тижні 3,1 3,1 3,9 3,1 3,1 3,2 1,9 2,9 3,5 3,2 3,1 8 тижнів 4,2 3,4 6,7 4,7 4,4 5,3 2,0 4,1 3,9 3,3 3,2 4 тижні 8,3 8,7 12,3 6,7 7,2 7,6 3,9 7,6 8,6 9,3 5,3 6 тижнів 12,4 10,7 16,9 10,3 9,6 13,3 11,8 10,7 12,8 9,7 6,8 25 °С 40 °C 12 тижнів 4,3 4,6 6,8 4,8 4,5 5,7 2,3 4,3 4,4 3,5 3,4 Криві, обчислені шляхом лінійного регресійного аналізу і підсумовані у Таблиці DEP-13, показують, що композиції, які містять твін 20, мають більш високу швидкість окиснення у разі їх порівняння з композиціями, які містять полоксамер 188, і рівень окиснення, залежний від концентрації твін 20. Ефективність L-метіоніну щодо обмеження окиснення при різних перевірених температурах також показана шляхом порівняння композиції № 9 (твін 20+L-метіонін) з композицією № 3 (твін 20) і композиції № 10 (полоксамер 188+L-метіонін) з композицією № 6 (полоксамер 188). Таблиця DEP-13 Лінійний регресійний аналіз окиснених форм (нахил кривих у % окиснених форм/тиждень) 2-8 °С 25 °С 40 °С IFN-1 0,06 0,14 1,60 IFN-2 0,08 0,16 1,50 IFN-3 0,17 0,38 2,30 IFN-4 0,07 0,21 1,30 IFN-5 0,05 0,16 1,20 IFN-6 0,17 0,29 1,80 IFN-7 -0,01 0,06 1,60 IFN-8 0,03 0,14 1,40 IFN-9 0,02 0,09 1,60 IFN-10 0,00 0,04 1,30 IFN-11 0,02 0,06 0,74 Таблиця DEP-14 Загальний вміст агрегатів (%) за даними SE-HPLC або SDS-PAGE 2-8 °С IFN-1 IFN-2 IFN-3 IFN-4 IFN-5 IFN-6 IFN-7* IFN-8 IFN-9 IFN-10 IFN-11 Час 0 0,8 0,8 1,1 1,2 1,0 1,1 3% 1,2 1,7 1,4 1,4 4 тижні 0,5 0,4 0,6 0,9 1,4 1,8