Спосіб отримання молокозсідального ферментного препарата

Изобретение может быть использовано в пищевой промышленности для и з готовления твердых сыров. Цель изобретения - повышение активности целе вого продукта и упрощение процесса за счет использования активного продуцента штамма М-81 сапрофитного дерево разрушающего базидиального гриба Hirschioporus l a r i c i n u s ВКІШ F-263, культивируемого на глкжозопептонной среде, охлаждения ее до температуры 4-5°С, осаждения фермента сернокислым аммонием при 55-80%-ном насыщении с последующей его очисткой от низкомолекулярных веществ и белков, • не растворимых в воде, методом гтализа против охлажденной дистиллированной воды при температуре 4-5 С и дальнейшей очисткой фермента методом электрофореза в параллельных пластина ках полиакриламидного геля. Актив(О ность ферментного препарата 1700 000 ед/г. ••ч ІРПФ-К с 1 1395672 Изобретение относится к производству ферментных препаратов, в частности молокосвертывающего фермента, путем культивирования сапрофитного с дереворазрушающего базиднального гриба Hirschioporus laricinus (Karst.) RyU на жидкой питательной среде. Полученный ферментный препарат может быть использован в качестве замению теля сычужного фермента - реннина, при производстве твердых сыров. Белки, обладающие молокосвертывающей активностью, подвергают дальнейшей очистке с помощью метода электрофореза в параллельных пластинках полиакриламидного геля. Полученный водорастворимый белок вносят в количестве 0,1 мл в каждую ячейку верхнего геля. Их в приборе Д6, Для электрофоретического разделения белков используют 7,5^-гшй щелочной гель. В щелочном геле белки мигрируют к аноду, поэтому нижний электрод камеры подклюЦелью изобретения является повышечают к гнезду выпрямителя (УИП), ние активности целевого продукта и упрощение процесса. 15 имеющему знак шпос(+). Верхний электрод присоединяют к знаку минус (-). Способ состоит в следующем, В начале электрофореза, до вхождения ІЧтамм Hirschioporus laricinus ВКПМ индикаторной краски в разделяющий F-263 (М-81) культивируют на каждой гель, поддерживают ток 80 мА при напитательной среде следующего состава, пряжении 210 В. Затем повышают ток до г/л: 20 180 мА при напряжении 470 В. ЗаканчиГлюкоза • ' 10,0 вают фракционирование белков при подЛегстон ' 3,0 ходе индикаторной краски к нижнему краю разделяющего геля. "Электрофорез KH2PO4 0,6 длится примерно 3 ч. Затем сняв бокоMgSO4- 7Н г О 0,5 25 вые стекла прибора, срезают концентZnS04!'7H20 0,001 рирующий гель и вынимают из кювет 0,05 CaCU пластинки разделяющего геля. Для опДистиллированная вода до I л. ределения электрофоретической подвижПитательную среду разливают в коности молокосвертывающего фермента нические колбы и стерилизуют в авто- 30 отрезают три ячейки разделяющего геля клаве под давлением 1 атм в течение и фиксируют 7%-ным раствором трихлорАО мин. Кислотность среды после стеуксусной кислоты в течение 20 мин. рилизации составляет «4,5-5,5 рН. ЯоЗатем отмывают гель от трихлоруксуссевиой мицелий выращивают на агариной кислоты дистиллированной водой зированной глюкозокартофельнои среде, эс (трикды по 10 мин) и окрашивают в тесусло-агаре и на жидкой питательной чение ночи в 0,02%-ном растворе красреде. Инкубируют штамм М-81 в терсителя Кумасси ярко-голубой Г-250, мостате ТС-80М при 30°С. приготовленного в смеси этиловый спирт - вода - уксусная кислота Максимальная молокосвертывающая активность у ттаима М-81 на среде с 40 (10:30:1). Избыток красителя отмывают раствором, состоящим их этой ' же глюкозой наблюдается на 10-15 сут смеси растворителей. Отмытый от крароста, затем несколько снижается и к сителя гель используют для определе30 сут падает в 3 раза. ния относительной электрофоретичесОсаждение белков по фракциям из ^ кой подвижности зон молокосвертываюкультурального фильтрата осуществляют щего Фермента и служит эталоном для путем увеличения концентрации серновыявления локализации фермента в кислого аммония на 10%. Фракцию белпластинках геля, не подвергшихся фикка, выпавшую в осадок, отцентрифугисации и окраске красителем. Отмытый ровывают на рефрижераторной центригель накладывают на пластинки разде50 ляющего геля и отмечают место нахожфуге в течение 15 мин при U-5 С и подвергают первичной очистке с помодения зон молокосвертывающего ферменщью диализа против охлажденной диста, которые вырезают, объединяют^ затиллированной воды в холодильнике в мораживают и растирают в ступке. Растечение 18 ч. В качестве полупрони-" тертую массу заливают холодной дисцаемой мембраны используют целлафано- •*•* тиллированной водой для экстракции вую пленку, поры которой пропускают белков, которая длится в течение 2вещества с молекулярным весом до 3 ч. Затем гомогенат центрифугируют 7000-10000. 1395672 в центриЛуге (8000 об/мин) при 4-5* С и начинают отсчет времени, который в течение 15 мин. Надосадочную жидзаканчивают при появлении в пробирках кость сливают и подвергают лиофильплотного сгустка. Бремя, затраченное ной сушке. Полученный препарат имеет на образование сгустка, условно счивид поропіка светло-кремового цвета, тают молокосвертывающей активностью, хорошо растворимого в воде. Молоковыраженной в минутах.За единицу молосвертыварнцая активность этого препакосвертывающей активности принимают рата составляет 1700000 ед/г. количес тво фермента, необходимое для П р и м е р . Выращивание штамма 10 свертывания 100 мл молока за 40 мин М-81 осуществляют в конических колпри 35 С и рассчитывают по формуле, бах на 1 л, содержащих 300 мл сте40-100«К , М С А е Д / Г ралыгой глюкозопептонной среды с рН препарата ~ t~~H » 4,5-5,5 в термостате при 30 С поверхгде К - коэффициент разведения препаностным способом в течение 10 сут. рата фермента; 15 Культуральный Лильтрат отделяют от t - время, в течение которого из мицелия путем фильтрования через бу100 мл молока при добавлении мажный фильтр (синяя лента). Затем 1 мл, 0,1%-ного раствора ферфильтрат охлаждают в холодильнике до мента образуется плотный 4 С и осаждают сЬерментный препарат сгусток, мин; сернокислым аммонием. Молокосверты- 20 40 - среднее время свертывания мовающий фермент находится во фракции ' лока при производстве сыра, белка, осаждаемой от 55 до 80%-ного мин; насыщения фильтрата сернокислым аммооб - навеска ферментного препаранием. Выпавший в осадок белок цент25 та, в г. рифугируют и диализируют против охДля осаждения молокосвертывающего лажденной дистиллированной воды в хофермента из культурального фильтрата лодильнике в течение 18 ч. Затем диаиспользуют сернокислый аммоний^ облалиэируемую смесь переносят в центридающий стабилизирующим действием на фужную пробирку и центрифугируют при 30 ферменты и все операции по выделению 8000 об/мин в течение 15 мин. Полуи очистке молокосвертывающего препаченная надосадочная жидкость содеррата не требуют отрицательных низких жит молокосвертывающий фермент, котемператур. торый подвергают дальнейшей очистке Культуральный фильтрат штамма М-81 методом электрофореза в параллельных H i r s c h i o p o r u s l a r i c i n u s патогенными пластинах полиакриламидного геля. 35 токсичными свойствами по отношению к Надосадочную жидкость сливают и подбеспородным белым мышам обоего пола вергают лиосЬильной сушке. Полученный не обладает. препарат имеет вид порошка светлокоричневого цвета, хорошо раствории з о б р е т е н и я мого в воде. Молокосвертывающая ак- 40 Ф о р м у л а Способ получения молокосвертываютивность этого препарата составляет щего ферментного препарата, предус1700000 ед/г. матривающий поверхностное культивирование продуцента H i r s c h i o p o r u s l a r i Молокосвертывающая активность ферментного препарата определяют по ме- 45 c i n u s BKITM F-263 на глюкозопептонной питательной среде до достижения мактодике, предложенной Каваи и Нукай. сима ль но й ак тив но с ти, о тделение миДля этого в 100 мл натурального молоцелия фильтрованием, осаждение ферка вносят 1 мл 15%-ного раствора мента сернокислым аммонием и очистку, СаС1 а , тщательно перемешивают и доводят кислотность субстрата с помощью S0 о т л и ч а ю щ и й с я тем, ч т о , с 10%-ного раствора НС1 до 6,0-6,1 рН. целью повышения активности целевого Затем берут по 10 мл молока в пробирпродукта и упрощения процесса, фильтки и нагревают в водяной бане до рат охлаждают до 4-5 С, осаждение в е 35 С, После этого в каждую пробирку дут при 55-80%-ном насыщении» а очидобавляют 1 мл 0,1%-ного водного 55 С Т К У ~ сначала диализом против охлажраствора сЪерментного препарата. Смесь денной дистиллированной воды при 4 в пробирках встряхивают'и снова ста5 С, затем методом электрофореза в вят в водяную баню при 35°С. В мопараллельных пластинах полиакриламидмент встряхивания пускают секундомер ного г е л я . 1395672 Редактор Т.Лазоренко Составитель И.Привалова Техред Л.Сердюкова Корректор МЛопо Заказ 2468/27 Тираж 520 Подписное В И П Государственного комитета СССР НИИ по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. А/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4