Спосіб оцінки експресії тромбоцитарних рецепторів

Спосіб оцінки експресії тромбоцитарних рецепторів шляхом проведення лабораторного дослі 3 метрії має певні недоліки, які можна згрупувати у кілька категорій. По-перше, методика проточної цитофлуоріметрії дозволяє аналізувати лише функцію тромбоцитів. В той же час, вона не дозволяє отримувати морфологічну характеристику досліджуваних клітин. Варто також зазначати, що дослідженню підлягають лише циркулюючі тромбоцити. В той же час, неможливо оцінити функцію пристінкових тромбоцитів, що грають важливу роль у процесах адгезії та агрегації. Проточна цитофлуоріметрія дозволяє отримати лише два альтернативних показника - «процент позитивних до досліджуваного рецептору клітин серед загальної кількості проаналізованих тромбоцитів» або «питому щільність флюоресценції тромбоцитів». У процесі підготовки проби певна частина тромбоцитів спонтанно активується, створюючи тромбоцитарні агрегати. Система детекції у проточній цитофлуоріметрії здатна визначити інтенсивність флюоресценції кожної окремої частки, але не може відрізнити окремий тромбоцит від тромбоцитарного агрегату. По-друге, це недоліки, пов'язані з підготовкою зразків крові та реагентів. Для запобігання спонтанної активації тромбоцитів пробу треба виконати протягом 45 хвилин після забору крові. Процедура фіксації, яка могла б запобігти цьому, передбачена лише для деяких типів моноклональних антитіл. Приготування реагентів та проведення проби залежить від кваліфікації оператора. По-третє, вартість проточних цитофлуоріметрів значно перевищує вартість обладнання для проведення імуногістохімічного дослідження тромбцоцитарних рецепторів. Доступність проточних цитофлуоріметрів є значно обмеженою, що не дозволяє широко використовувати метод у реальній клінічній практиці. Вартість реагентів та допоміжних матеріалів для проведення проб є також значною. Коректна експлуатація проточних цитофлуоріметрів потребує створення спеціальних умов. Так, до приміщення, у якому проводиться методика, пред'являються підвищені вимоги до стерильності та вентиляції. Для функціонування системи потрібна високоочищена вода та майже щоденна експлуатація обладнання із обов'язковою процедурою калібровки. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу оцінки експресії тромбоцитарних рецепторів шляхом використання імуногістохімічної методики дослідження і визначення додаткових показників, що підвищить інформативність та достовірність дослідження, спростить та підвищить доступність методики і забезпечить вибір адекватної терапії тромбозасоційованих патологічних станів. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який полягає у проведенні лабораторного дослідження крові та визначенні питомої щільності флюоресценції тромбоцитів, новим є те, що проводять імуногістохімічне дослідження, додатково визначають морфометричний показник, а саме, площу тромбоциту, та розраховують сумарну 51701 4 щільність флюоресценції (GreyConti) за формулою: GreyContі=Si•GreyLogi, де Si - площа тромбоцита (мкм2), a GreyLogi показник питомої щільності флюоресценції, і якщо показник GreyConti складає більше 1,86 одиниць імунофлюоресценції (ОДІФ), експресію вважають високою. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. До переваг імуногістохімічного визначення тромбоцитарних рецепторів варто віднести наступні. Так, після отримання тромбоцити фіксуються на скельцях із адгезивним покриттям, що запобігає їх спонтанній активації та руйнації. Після цього дослідник не лімітується у жорстких часових умовах проведення дослідження. До приміщення, в якому проводиться методика, пред'являються стандартні вимоги. Для проведення методики можна використовувати флуоресцентні мікроскопи різних виробників, так само, як і моноклональні антитіла. Якість реакції також значно підвищується за рахунок застосування вторинних антитіл. У якості системи аналізу зображення можуть використовуватися кілька доступних ліцензованих систем, деякі з яких є безкоштовними. Система аналізу зображення здібна в автоматичному режимі розрізняти окремий тромбоцит від тромбоцитарного агрегату. Також є можливість проаналізувати зображення у мануальному режимі. Результати дослідження можна документувати у вигляді фотографій. Але головною перевагою імуногістохімічного дослідження є можливість отримати унікальну характеристику кожного окремого тромбоциту з позицій його морфології та функції. Методика дозволяє пов'язати інтенсивність експресії будь-якого тромбоцитарного рецептору із такими морфометричними показниками, як площа та діаметр тромбоцита. Це дає змогу більш глибоко та детально оцінити морфофункціональні властивості тромбоцитів за різних патологічних станах та проводити моніторинг ефективності лікування антитромбоцитарними агентами. Спосіб здійснюють таким чином. У хворих проводили забір венозної крові в об'ємі 9 мл у пластикові пробірки, що містять 1мл 2,7% розчину трилону Б та 200мкл універсального антіпротеазного коктейлю. Отримували багату на тромбоцити плазму шляхом центрифугування протягом 7 хвилин на швидкості 1000об/хв. Після цього за допомогою автоматичного дозатора обережно переносили плазму у інші пластикові пробірки. Для виділення тромбоцитів отриманий матеріал центрифугували на швидкості 3000об/хв. протягом 10 хвилин. Краплю тромбоцитарної суміші наносили на ультратонкі скельця із адгезивним покриттям та висушували при кімнатній температурі. Після цього мазки фіксували 100% метанолом. Для визначення специфічних маркерів тромбоцитів використовували імунофлюоресцентний метод за допомогою специфічних моноклональних антитіл. На окремі скельця з мазками тромбоцитів наносили розчин досліджуваного антигену в 0,1М 5 фосфатному буфері (рН=7,4) у відношенні 1:1000 та інкубували у вологій камері протягом доби при Т=+4°С. Далі скельця тричі по 10хв. відмивали 0,1М фосфатним буфером (рН=7,4) і протягом 1 години (Т=37°С) інкубували із вторинними антитілами у розчині з 0,1 М фосфатним буфером (рН=7,4) у відношенні 1:64. У якості вторинних антитіл використовували козячі антитіла до повної молекули IgG миші, які кон'юговані з FITC. Після інкубації скельця промивали 0,1М фосфатним буфером і заключали в суміш гліцерину і фосфатного буферу у відношенні 9:1 для дослідження методом флюоресцентної мікроскопії. Оброблені гістологічні препарати досліджували на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення. Зображення, отримане на флюоресцентному мікроскопі за допомогою високоемісійного світлофільтру (спектр збудження 450-490нм, спектр емісії 500-550нм), через високочутливу відеокамеру негайно вводили в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення. При цьому виключався ефект «вигоряння» препарату, пов'язаний із поступовим руйнуванням молекули FITC під впливом тривалого ультрафіолетового опромінення. Відеокадр із імунофлюоресценцією оцифровували за денситометричною шкалою із 256 градаціями сірого кольору. З кожного скельця вводили 10 випадкових полів зору, що давало змогу проаналізувати від 1500 до 2500 тромбоцитів. Аналіз відеокадрів проводився у автоматичному режимі за допомогою пакету комп'ютерних програм. При цьому в автоматичному режимі визначалися ділянки із статистично значущою флюоресценцією, характерною для тромбоцитів, імунопозитивних до визначаємого CD-маркеру. Основними морфометричними показниками тромбоцитів були: 1. площа тромбоциту (Area), мкм2; 2. еквівалентний діаметр тромбоциту (DCircl), мкм, що розраховувався як діаметр кола, площа якого відповідала площі тромбоциту. Основними денситометричними показниками тромбоцитів були: 1. питома щільність флюоресценції (GreyLog), ум. од. імунофлюоресценції - ОДІФ, що розраховувалась за формулою: GreyLogi=|lg(Di/BGg)|, де Dі - показник інтенсивності флюоресценції клітини, BGg - показник неспецифічної флюоресценції препарату (так званий «фон»). Цей показник відповідав інтенсивності експресії відповідних поверхневих антигенів; 2. сумарна щільність флюоресценції (GreyCont), умовні одиниці імунофлюоресценції ОДІФ, що розраховувалася за формулою: GreyContі=Si•GreyLogi, де Si - площа (мкм2) тромбоциту, a GreyLogi показник питомої щільності флюоресценції. Цей показник відповідав сумарній щільності відповідних поверхневих антигенів (CD-маркерів). Якщо показник GreyConti складає більше 1,86 одиниць імунофлюоресценції (ОДІФ), експресію вважають високою. Всі вказані показники визначалися індивідуально для кожного тромбоцита у автоматичному 51701 6 режимі, що дозволяло отримати їх унікальну характеристику. Приклади. Хворий Н., 1951р.н., був госпіталізований до кардіологічного відділення 6-ої міської клінічної лікарні 09.12.2008р. із діагнозом "Ішемічна хвороба серця. Стенокардія напруження III ФК. Постінфарктний кардіосклероз (Q-передній інфаркт міокарду від 05.03.2008). Серцева недостатність ІІА стадії, II ФК. Цукровий діабет 2 типу, середньої важкості, стадія компенсації», номер історії хвороби 8360. Хворий П., 1953р.н., був госпіталізований до кардіологічного відділення 6-ої міської клінічної лікарні 27.11.2008р. із діагнозом "Ішемічна хвороба серця. Стенокардія напруження III ФК. Постінфарктний кардіосклероз (Q-передній інфаркт міокарду від 05.03.2008). Серцева недостатність ІІА стадії, II ФК», номер історії хвороби 7304. Оскільки обидва пацієнти мали в анамнезі тромбоз-асоційоване ускладнення в формі інфаркту міокарду, було вирішено дослідити активність маркеру активації тромбоцитарного гемостазу Рселектину - у плазмі крові, а також експресію цього рецептора на поверхні тромбоцитів. Для цього у хворих вранці натщесерце проводили забір венозної крові в об'ємі 9 мл у пластикові пробірки, що містили 1мл 2,7% розчину трилону Б та 200мкл універсального антіпротеазного коктейлю («Sigma-Aldrich», США). Отримували багату на тромбоцити плазму шляхом центрифугування протягом 7 хвилин на швидкості 1000об/хв. Після цього за допомогою автоматичного дозатора обережно переносили плазму у інші пластикові пробірки. Для виділення тромбоцитів отриманий матеріал центрифугували на швидкості 3000 об/хв. протягом 10 хвилин. Краплю тромбоцитарної суміші наносили на ультратонкі скельця із адгезивним покриттям «Super Frost Plus» («Menzel Gmb & Co KG», Німеччина) та висушували при кімнатній температурі. Після цього мазки фіксували 100% метанолом («Merk», Німеччина). Для визначення специфічних маркерів тромбоцитів використовували імунофлюоресцентний метод за допомогою специфічних антитіл виробництва «Diaclone» (Франція). Для визначення експресії трансмембранного глюкопротеїду Р-селектину тромбоцитів використовували моноклональні антитіла миші (IgGl) проти CD62P (клон НІ62Р) людини. На окремі скельця з мазками тромбоцитів наносили розчин Р-селектину в 0,1М фосфатному буфері (рН=7,4) у відношенні 1:1000 та інкубували у вологій камері протягом доби при Т=+4°С. Далі скельця тричі по 10хв. відмивали 0,1М фосфатним буфером (рН=7,4) і протягом 1 години (Т=37°С) інкубували із вторинними антитілами у розчині з 0,1М фосфатним буфером (рН=7,4) у відношенні 1:64. У якості вторинних антитіл використовували козячі антитіла до повної молекули IgG миші, які кон'юговані з FITC (Sigma Chemical, США). Після інкубації скельця промивали 0,1М фосфатним буфером і заключали в суміш гліцерину і фосфатного буферу у відношенні 9:1 для дослідження методом флюорісцентної мікроскопії. 7 51701 Оброблені гістологічні препарати досліджували на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 («Kontron Elektronik», Німеччина). Зображення, отримане на мікроскопі AXIOSKOP («Zeiss», Німеччина) за допомогою високоемісійного світлофільтру 38НЕ («Zeiss», Німеччина) (спектр збудження 450-490нм, спектр емісії 500-550нм), через високочутливу відеокамеру COHU-4922 («COHU Inc.», США) негайно вводили в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386. При цьому виключався ефект «вигоряння» препарату, пов'язаний із поступовим руйнуванням молекули FITC під впливом тривалого ультрафіолетового опромінення. Відеокадр із імунофлюоресценцією оцифровували за денситометричною шкалою із 256 градаціями сірого кольору. З кожного скельця вводили 10 випадкових полів зору, що давало змогу проаналізувати від 1500 до 2500 тромбоцитів. Аналіз відеокадрів проводився у автоматичному режимі за допомогою пакету програм VIDAS2.5 («Kontron Elektronik», Німеччина). При цьому в автоматичному режимі визначалися ділянки із статистично значущою флюоресценцією, характерною для тромбоцитів, імунопозитивних до визначаємого CD-маркеру. Хворий Н. із супутнім цукровим діабетом 2 типу мав наступні показники: рівень Р-селектину у Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 8 плазмі - 68,8нг/мл. Імуногістохімчне дослідження тромбоцитів: 1. середній діаметр тромбоцитів - 1,59мкм. 2. середня площа тромбоцитів - 2,3мкм2. 3. питома щільність флюоресценції - 2,75ОДІФ. 4. сумарна щільність флюоресценції - 6,49ОДІФ Хворий П. без анамнезу цукрового діабету 2 типу мав наступні показники: рівень Р-селектину у плазмі - 62,07нг/мл. Імуногістохімчне дослідження тромбоцитів: 1. середній діаметр тромбоцитів -1,55мкм. 2. середня площа тромбоцитів - 2,21мкм2. 3. питома щільність флюоресценції - 0,73ОДІФ. 4. сумарна щільність флюоресценції -1,7ОДІФ. Рівень Р-селектину у плазмі обох хворих суттєво не відрізнявся. Проте питома вага рецепторів на поверхні тромбоцитів була майже у 4 рази вищою у хворого із супутнім цукровим діабетом 2 типу. При цьому середній діаметр та площа тромбоцитів були подібними. Проведений аналіз активності тромбоцитарного гемостазу за допомогою імуногістохімічного дослідження дозволив виявити більш високу експресію Р-селектину на поверхні тромбоцитів у хворого із цукровим діабетом 2 типу. Запропонована методика дозволяє проводити більш коректну та детальну оцінку стану системи тромбоцитарного гемостазу у хворих із різними тромбоз-асоційованими патологічними станами. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601