Фармацевтична композиція, що має активність пригнічувати апетит (варіанти)

і (58) є новими сполуками і цей винахід поширюється на ці сполуки, як такі. Було встановлено, що сполука (1) 3-О-[b-D-теветопіранозил-(1®4)-b-D-цимаропіранозил-(1®4)-b-Dцимаропіранозил]-12b-O-тиглоілокси-14-гідрокси-14b-прегн-5-ен-20-он, його різноманітні аналоги, і його похідні мають активність пригнічення апетиту. Цей винахід також відноситься до композиції або рецептури, яка має активність пригнічення апетиту, в якій активним компонентом є екстракт, отриманий із рослини з роду Trichocaulon або з роду Hoodia, або їх похідних. Ця рослина може бути з видів Trichocaulon piliferum, або Trichocaulon officinale, або з видів Hoodia currorii, Hoodia gordonii, або Hoodia lugardii. Цей винахід також відноситься до композиції або рецептури, яка має активність пригнічення апетиту, в якій активним компонентом є отримана синтетично сполука формули (1), або її похідні, або аналоги, які наведені вище, із посиланням на сполуки (2)-(14). Згідно з іншим аспектом винаходу був розроблений спосіб пригнічення апетиту за допомогою введення людині або тварині відповідної дози засобу пригнічення апетиту, і який містить екстракт з рослини роду Trichocaulon або з роду Hoodia. Цей екстракт може бути введений в композицію або рецептуру, яка також містить інші фармацевтично прийнятні компоненти. Засіб пригнічення апетиту може бути виділений природною сполукою або синтезованою хімічною сполукою формули (1), або її похідними, або її аналогами, які наведено вище. Композиція або рецептура, яка пригнічує апетит, може складатися з засобу пригнічення апетиту, змішаного з фармацевтичним екципієнтом, розріджувачем або носієм. Також можуть бути додані інші підхожі добавки, які містять стабілізатор, а також інші компоненти. Цей винахід відноситься до застосування сполуки (1), або її похідних, або її аналогів у виробництві медикаменту, який має активність пригнічення апетиту. Цей винахід додатково відноситься до застосування сполуки (1), або її похідних, або її аналогів, які наведені вище, для застосування в якості медикаменту, який має активність пригнічення апетиту. Винахід також відноситься до способу пригнічення апетиту за допомогою введення людині або тварині ефективної дози описаної вище композиції. У винаході описаний засіб екстракції стероїдного глікозиду, який має активність пригнічення апетиту, із рослинного матеріалу, отриманого з рослини з роду Trichocaulon або з роду Hoodia. Таким чином, цей винахід відноситься до екстракту, отриманого з рослинного матеріалу роду Trichocauion або з роду Hoodia, і який містить практично чистий стероїдний глікозид формули (1). Винахід також відноситься до харчових продуктів або напоїв, які містять ефективну кількість стероїдного глікозиду формули (1), або його похідних, або його аналогів, описаних вище, які при поглинанні створюють ефект пригнічення апетиту. Молекулярно-генетичні дослідження призвели до значно кращого розуміння регулювання апетиту, насичення і ваги тіла. У цих дослідженнях були виявлені численні центральні шляхи регулювання, опосередковані рядом нейропептидів. Підтримка нормальної ваги тіла досягається за допомогою складного балансу між надходженням енергії, споживанням їжі і витратою енергії. Гомеостаз енергії піддається значному числу впливів, які у кінцевому рахунку контролюються мозком. Різноманітні сигнали включають такі почуття, як відчуття пахощів ісмаку, і шлунково-кишкові сигнали, такі як роздутість шлунково-кишкового тракту, хімічні сигнали шлункової мукозе і метаболіти, які утворилися в крові, такі як жирні кислоти і глюкоза. В основному було встановлено, що нейропептид Υ (ΝΡΥ), який негативно регулюється лептином, є одним з регуляторів поведінки при харчуванні. Було також показано, що експресія ендогенного антагоніста для рецепторів меланокортина, є основою для ожиріння конкретної моделі (миша ob/ob). Зрозуміло, дефіцит на рецептору меланокортину MС4 повністю реплікує синдром ожиріння. Інші медіатори, які, як було показано, відіграють роль в енергетичному балансі, включають бомбезин, галонін і глюкагоноподібний пептид-1. Не зв'язуючи себе теорією, заявник вважає, що сполука (1) і її аналоги, які описані вище, діють як агоністи рецептору меланокортину МС4. Результатом цього може бути регулювання нейропептиду Y, а також збільшення вмісту холецистокініну. Поряд з Іншими ефектами, впливом холецистокініну може бути інгібування звільнення шлунка. Відповідно, цей винахід відноситься до композиції, яка має активність пригнічення апетиту і включає агоніст рецептора меланокортину МС4. Цей агоніст може бути екстрактом або сполукою, яка описана вище, зокрема сполукою формули (1). Композиція може бути змішана з фармацевтичним ексципієнтом, розріджувачем або носієм, причому, за бажанням, її готують у формі одиничного дозування. Цей винахід додатково відноситься до застосування агоністу рецептору меланокортину МС4 при виробництві медикаменту, який має активність пригнічення апетиту, до агоністу рецептору меланокортину МС4, призначеному для використання в якості медикаменту, який має активність пригнічення апетиту, до способу пригнічення апетиту шляхом введення людині або тварині ефективної дози композиції, яка містить описаний вище агоніст рецептору меланокортину МС4, і до застосування агоністу рецептору меланокортину МС4 для пригнічення апетиту і/або подолання ожиріння в людей або тварин. Далі цей винахід і його ефективність будуть додатково описані з посиланням на наступні приклади і креслення, без обмеження об'єму винаходу. На фіг.1 показана послідовна схема загального способу екстракції першого неочищеного екстракту, який пригнічує апетит, із рослинного матеріалу рослини з роду Trichocaulon або Hoodia. На фіг.2 подані результати біологічного аналізу, проведеного на щура х із використанням частково очищеного метанольного екстракту Trichocaulon piliferum. На фіг.3 і 4 подана схема кращого варіанту здійснення способу винаходу для одержання екстракту рослинного матеріалу з роду Trichocaulon або Hoodia; і На фіг.5 і 6 графічно показане представлення зміни процентної ваги тіла щурів різноманітних груп протягом від -7 до 7 діб і від 0 до 7 діб відповідно при дослідженні повторної дози, із використанням екстракту соку і висушеного розпиленням екстракту соку рослинного матеріалу з роду Hoodia gordonii. Приклад 1 Загальний спосіб екстракції першого неочищеного екстракту, який пригнічує апетит, і очищеного екстракту, який пригнічує апетит, рослинного матеріалу з роду Trichocaulon або з роду Hoodia ілюструється за допомогою послідовної схеми фіг.1. Приклад 2 Біологічні аналізи, проведені на щурах із використанням частково очищеного метанольного екстракту, отриманого способом, відповідно до прикладу 1, показують, що екстракт дійсно виявляє активність пригнічення апетиту. Ця активність пригнічення апетиту активним екстрактом може бути продемонстрована за допомогою типового прикладу впливу метанольного екстракту Trichocaulon piliferum на щурів як графічно подано на фіг.2. З фіг.2 можна бачити, що у випробуваній групі щурів, які одержали дозу екстракту на п'яту добу, виявляється значно знижене споживання їжі протягом наступних дво х діб, в той час як у контрольній групі не відзначене порівняне зниження споживання їжі. Споживання їжі у випробуваній групі повертається до норми і фактично збільшується, починаючи з 8 доби і далі. Приклад 3 Кращий варіант втілення способу згідно з винаходом для отриманого екстракту, який має активність пригнічення апетиту, проілюстрований схематично за допомогою прикладу на фіг.3 і 4, які разом характеризують цей широкий спосіб. Проте можна використовувати різноманітні інші методики, як буде зрозуміло спеціалістам в цій області техніки. Звернемося до фіг.3: рослинний матеріал із роду Trichocaulon або з роду Hoodia надходить у змішувач 3 по лінії подачі 1, наприклад, змішувач Уорінга, з розчинником, у вигляді розчину метиленхлорид/метанол, який вводять по лінії подачі 2. Гомогенізований продукт подають по лінії 4 на стадію розділення 5, наприклад, у вигляді фільтра або центрифуги, а залишки рослинного матеріалу видаляють по лінії 27. Суміш розчинник/екстракт подають по лінії 6 на стадію випарювання 7, де розчинник видаляють, наприклад, за допомогою роторного випарника. Висушений неочищений екстракт подають по лінії 8 на стадію додаткової екстракції 9 з додаванням розчину метиленхлорид/вода, введеного по лінії подачі 29, для додаткової екстракції, і потім по лінії 11 на стадію розділення 13, звідки водну фракцію видаляють по лінії 31. Розчинену фракцію екстракту подають по лінії 15 на стадію висушування 17, де розчинник випарюють, наприклад, за допомогою роторного випарника. Звернемося до фіг.4: висушений екстракт подають по лінії 10 на стадію екстракції 12. На цю стадію екстракції 12 також подають по лінії 14 розчин метанол/гексан для подальшого очищення і екстракції висушеного екстракту. Суміш екстракт/метанол/гексан подають по лінії 16 на стадію розділення 18, звідки гексанову фракцію видаляють по лінії 20, і потім суміш метанол/екстракт подають по лінії 22 на стадію висушування 24. На стадії висушування 24 розчинник видаляють, наприклад, випарюють за допомогою роторного випарника. Висушений, частково очищенийактивний екстракт подають по лінії 26, із додаванням метанолу по лінії 28, на стадію розчинення 30, і розчинену фракцію подають по лінії 36 у хроматографічну колонку 38. В цій колонці 38 фракцію, розчинну в метанолі, додатково фракціонують, з використанням силікагелю і розчинника - 30% метанол/хлороформ, на різноманітні фракції, які схематично позначені як фракції I-V. Відповідно до фактичної методики фракціонування, здійсненої заявником, при фракціонуванні одержують такі кількості фракцій: І (3,9г), II (2,6г), III (2,1г), IV (1,1г) і V (2,0г). Ці фракції оцінюють індивідуально методом підхожого біологічного аналізу (ця стадія не показана), і ті фракції, позначені як фракції І і II, які проявили помітну активність пригнічення апетиту, подають по лініях подачі, 40 і 42 в колони 44 і 46 відповідно, де їх додатково фракціонують і очищають на хроматографічній колонці, знову використовуючи силікагель і систему хлороформ: метанол=9:1. Підфракції II (А)-(С), отримані з колонки 44, при випробуванні не показали помітної активності пригнічення апетиту, і їх можна повертати в цикл для додаткового хроматографічного очищення. Підфракції І (A)-(L), отримані з колонки 46, також оцінювали (стадія випробування не показана), і було встановлено, що підфракція І (С) має помітну активність пригнічення апетиту. Підфракцію І (С) подають по лінії 48 для подальшого фракціонування і очищення, використовуючи силікагель і елюент 9:1 етилацетат: гексан. Після випробування встановлено, що з отриманих очищених фракцій, фракція І (С) (іі) має помітну активність. Очищений продукт ідентифікують методом ядерної магнітної спектроскопи (ЯМР), (показано нижче в таблицях 1 і 2), воно є сполукою (1). Приклади 4-13 ілюструють методики синтезу, за допомогою яких можна одержати проміжні сполуки і стероїд (15) відповідно до "першої альтернативної методики". Приклад 4 12b,15a-Дигідроксипрогестерон (17) Культури Calonectria decora (ATCC 14767) одержують інокулюванням культураль-ного середовища, яке містить 900г сахарози, 30г гідрофосфату калію, 300мл концентрату Чапека, 300мл рідини для замочування кукурудзи і 30л дистильованої води в 150 колбах, ємністю 500мл. Через 5 діб струшування при 26°С додають 150г прогестерону (16) в суспензії 1,5л Твіну 80 (0,1%-ний розчин). Культури інкубують ще протягом 5 діб і потім обробляють шляхом центрифугування, декантації, екстракції середовищем з хлороформом з наступним випарюванням, щоб одержати 75г (45%) дигідроксипрогестеррну (17). Спектр 1Н-ЯМР (CDCI3): 5,71 (1Н, с, Н-4); 4,12-4,22 (1Н, м, Н-15); 4,43 (1Н, ш. с, ОН); 3,46-3,53 (1Н, дд, J=4,6Гц, Н-12); 2,16 (3Н, с, Н-21); 1,18 (3Н, с, Н-19); 0,74 (3Н, с, Н-18). Приклад 5 12b-гідрокси-15a-(пара-толуолсульфоніл)-прогестерон(18) Розчиняють у 300мл сухого піридину 75г (0,22моль) дигідроксипрогестерону (17) і охолоджують до 0°С. Додають краплями 46г (0,24моль) сульфонілхлориду толуолу в 200мл сухого піридину в реакційну суміш при 0°С. Реакційну суміш перемішують протягом ночі при 0°С, і реакцію переривають, додаючи 500мл води. Водний шар екстрагують 1л етилацетату, і органічний екстракт промивають 6-молярною гідрохпоридною кислотою (3 рази по 1л), 500мл водного насиченого розчину гідрокарбонату натрію, 500мл водного насиченого розчину хлориду натрію і 500мл води. Органічний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати 98г (92%) пара-толуолсульфонованого прогестерону (18) у вигляді в'язкої темно-жовтої олії. Спектр 1Н-ЯМР (СDСІ3): 7,7 (2Н, д, J=14Гц, Н-2,6); 7,34 (2Н, д, J=8,4Гц, Н-3,5); 5,67 (1Н, с, Н-4); 4,86-4,93 (1Н, м, Н-15); 3,45-3,50 (1Н, дд, J=4,6Гц, Н-12); 2,44 (3Н, с, H-4); 2,15 (3Н, с, Н-21); 1,13 (3Н, с, Н-19); 0,74 (3Н, с, Н-18). Приклад 6 12р-гідрокси-D14-прогестерон (19) Розчин 98г (0,19моль) тозилованого прогестерону (18) у 500мл 2,4,6-триметилколідину кип'ятять зі зворотним холодильником 3год. при 150°С. Реакційну суміш о холоджують і виливають у 500мл води. Водний шар екстрагують 1л етилацетату, після чого органічний шар промивають 6-молярною гідрохлоридною кислотою (3 рази по 1л), 500мл водного насиченого розчину гідрокарбонату натрію, 500мл водного насиченого розчину хлориду натрію і 500мл води. Після висушування сульфатом магнію і фільтрування етилацетат випарюють, і сиру суміш очищають хроматографічно на силікагелі, елююють сумішшю 1:10 ацетону і хлороформу, щоб одержати 50г (78%) 12b-гідрокси-D14-прогестерону (19) у вигляді темно-червоної олії. Спектр 1Н-ЯМР (CDCI3): 5,73 (1Н, с, Н-4); 5,28 (1Н, дд, J=2,2Гц, Н-15); 4,41 (1Н, ш. с, ОН); 3,49-3,52 (1Н, дд, J=4,3Гц, Н-12); 2,80-2,84 (1Н, дд, J=9,2Гц, Н-17); 2,14 (3Н, с, Н-21); 1,19 (3Н, с, Н-19); 0,89 (3Н, с, Н-18). Приклад 7 3,12b-Діацетоксипрегна-3,5,14-трієн-20-он (20) Розчин 50г (0,15моль) гідрокси-D14-прогестерону (19) у 1,5л ацетилхлориду і 750мл оцтового ангідриду кип'ятять зі зворотним холодильником протягом 2год. Реакційну суміш виливають у 1л холодного етилацетату і при перемішуванні додають водний насичений розчин гідрокарбонату натрію доти, поки не припиниться виділення пухирців газу. Відокремлюють етилацетатний шар від шару розчину гідрокарбонату натрію і промивають додатковими порціями (3 рази по 700мл) водного насиченого розчину гідрокарбонату натрію, після цього 700мл водного насиченого розчину хлориду натрію і остаточно 700мл води. Органічний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати 60г (93%) 3,12b-діацетоксипрегна3,5,14-трієн-20-ону (20) у вигляді оранжевої олії. Спектр 1Н-ЯМР (CDCI3): 5,68 (1Н, с, Н-4); 5,44 (1Н, м, Н-6); 5,31 (1Н, дд, J=2,2Гц, H-15); 4,82-4,86 (1Н, дд, J=4,5Гц, Н-12); 3,10-3,18 (1Н, т, J=9,5Гц, Н-17); 2,18 (3Н, с, 12-ацетил); 2,08 (3Н, с, Н-21); 1,02 (3Н, с, Н-19); 1,01 (3Н, с, Н-18). Приклад 8 3,12b-Діацетокси-20,20-етилендіоксипрегна-3,5,14-трієн (21) Розчиняють в 1л бензолу 60г (0,14ммоль) діацетоксисполуки (20) і додають 60мл етиленгліколю і 1г паратолуолсульфонової кислоти. (Бензол попередньо збезводнюють кип'ятінням з пасткою Діна-Старка). Суміш кип'ятять при перемішуванні і азеотропному видаленні води протягом 16год. До охолодженого розчину додають 500мл водного насиченого розчину гідрокарбонату натрію. Потім цю суміш промивають 500мл розчину хлориду натрію, 500мл води і сушать сульфатом магнію. Розчинник випарюють, і сиру суміш очищають хроматографічно на колонці з силікагелем, елююють сумішшю етилацетату і гексану (2:8), щоб одержати 35г (53%) етилендіоксипрегна-3,5,14-трієну (21). Спектр 1Н-ЯМР (CDCI3): 5,68 (1Н, с, Н-4); 5,45 (1Н, м, Н-6); 5,31 (1Н, дд, J=2,2Гц, H-15); 4,73-4,85 (1Н, дд, J=4,4Гц, Н-12); 3,78-3,98 (4Н, м, етилендіоксі); 2,16 (3Н, с, 3-ацетил); 1,29 (3Н, с, Н-21); 1,12 (3Н, с, Н-19); 1,02 (3Н, с, Н-18). Приклад 9 3b,12b-Дигідрокси-20,20-етилендіоксипрегна-5,14-дієн-12-ацетат(22) Суспендують в 500мл етанолу 35г (0,077моль) дієнолацетату (21) і при 0°С додають 2,8г (0,074моль) боргідриду натрію. Реакційній суміші дають нагрітися до кімнатної температури і перемішують її протягом ночі. Більшу частину розчинника видаляють у вакуумі, суміш розбавляють 500мл води і екстрагують 500мл етилацетату. Наступна обробка включає хроматографування на силікагелі, який елююють сумішшю ацетону і хлороформу (1:10), щоб одержати 25г (80%) 3b-спирту (22). Спектр 1Н-ЯМР(CDCI3): 5,41 (1Н, м, Н-6); 5,28 (1Н, дд, J=2,2Гц, H-15); 4,72-4,81 (1Н, дд, J=4,4Гц, Н-12); 3,82-4,02 (4Н, м, етилендіоксі); 3,45-3,59 (1Н, м, Н-3); 2,03 (3Н, с, 12-ацетил); 1,28 (3Н, с, Н-21); 1,10 (3Н, с, Н19); 1,01 (3Н, с, Н-18). Приклад 10 3β,12b-Дигідрокси-20,20-етилендіоксипрегна-5,14-дієн (23) Краплями 3b-спирт (22) в 300мл осушеного тетрагідрофурану (25г, 60,2ммоль) додають в суспензію 2,7г (72,2ммоль) алюмогідриду літію в 500мл осушеного тетрагідрофурану. Реакційну суміш перемішують 24год. при кімнатній температурі, після чого обережно додають 2,7мл води і перемішують додатково 10хв. Потім додають 2,7мл 15%-го розчину гідроксиду натрію, і суспензію перемішують протягом 10 хвилин, фільтрують, висушують сульфатом магнію і розчинник випарюють, щоб одержати 20г (90%) 3b,12b-дигідроксипрегнадієна (23). Спектр 1Н-ЯМР (CDCI3): 5,36 (1Н, м, Н-6); 5,23 (1Н, дд, J=2,2Гц, Н-15); 3,96-4,06 (4Н, м, етилендіоксі); 3,413,52 (1Н, м, Н-3); 3,32-3,36 (1Н, дд, J=4,3Гц, Н-12); 1,31 (3Н, с, Н-21); 1,01 (3Н, с, Н-19); 0,96 (3Н, с, Н-18). Спектр 13С-ЯМР (CDCI3): 152,4 (С-14); 140,2 (С-15); 121,1 (С-15); 119,7 (С-6); 111,1 (С-20); 79,8 (С-12); 71,6 (С-3); 63,7 і 63,6 (етилендіоксі); 58,8 (С-17); 19,0 (С-19); 11,9 (С-18). 3β,12b-Дигідрокси-14,15-епокси-20,20-етилендіоксипрегн-5-ен; 3b,12b-Дигідрокси-5,6-епокси-20,20-етилендіоксипрегн-14-ен Додають 211мг (1,5ммоль) N-бромацетаміду до розчину, який перемішують, 500мг (1,34ммоль) 5,14-дієну (23) в 100мл ацетону, 2,5мл оцтової кислоти і 5мл води при 0°С. Через 15 хвилин до реакційної суміші додають 50мл 5%-го розчину сульфіту натрію. Ацетон випарюють, і водний шар екстрагують дихлорметаном (3 рази по 50мл). Органічний шар висушують сульфа том магнію, фільтрують і випарюють. До продукту додають 1мл піридину і суміш перемішують 0,5год. Потім до реакційної суміші додають 100мл дихлорметану, і дихлорметан промивають 5%-ним розчином лимонної кислоти (3 рази по 100л), 50мл водного насиченого розчину гідрокарбонату натрію і 50мл води. Органічний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати 360мг (69%) суміші 14,15- і 5,6-епоксидів у вигляді білої піни. Цю суміш епоксидів не вдалося розділити хроматографічно на колонці з силікагелем. Приклад 11 3b,12b-Дигідрокси-14,15-епокси-20,20-етилендіоксипрегн-5-ен (24) Суміш 14,15- і 5,6-епоксидів (14,4г; 37ммоль) у 200мл осушеного тетрагідрофурану додають у суспензію 1,69г (44,4ммоль) алюмогідриду літію в 300мл осушеного тетрагідрофурану. Реакційну суміш перемішують 24год. при кімнатній температурі, після чого її обробляють, як описано раніше, за допомогою додавання 1,69мл води і 1,69мл 15%-го розчину гідроксиду натрію. Після фільтрації і випарювання розчинника сирий продукт очищають хроматографічно на колонці із силікагелем, використовуючи суміш метанолу і хлороформу (1:9) у якості розчинника, щоб одержати 300мг (2,1%) 14,15-епокси-20,20-етилендіоксилрегн-5-ену (24), який не прореагував. Спектр 1Н-ЯМР (CDCI3); 5,31 (1Н, м, Н-6); 3,82-3,98 (4Н, м, етилендіоксі); 3,43-3,52 (1Н, м, Н-3); 3,41 (1Н, с, Н-15); 3,31-3,35 (1Н, дд, J=4,3Гц, Н-12); 1,29 (3Н, с, Н-21); 1,17 (3Н, с, Н-19); 1,02 (3Н, с, Н-18). Спектр 13С-ЯМР (CDCI3): 139,8 (С-5); 120,8 (С-6); 112,1 (С-20); 77,2 (С-12); 75,4 (С-14); 61,0 (С-15); 22,3 (С21);19,2 (С-19); 9,5 (С-18). Приклад 12 3b,12b,14b-Тригідрокси-20,20-етилендіоксипрегн-5-ен (25) 14,15-Епоксид (24) (300мг; 0,77ммоль) у 10мл осушеного тетрагідрофурану додають у суспензію 300мг (7,89ммоль) алюмогідриду літію в тетрагідрофурані. Реакційну суміш кип'ятять зі зворотним холодильником 48год. Після додавання 0,3мл води і 0,3мл 15%-го розчину гідроксиду натрію і фільтрації, як описано раніше, суміш очищають хроматографічно на колонці з силікагелем, використовуючи суміш метанолу і хлороформу (1:9) в якості розчинника, щоб одержати 250мг (83%) Тригідроксипрегнену (25). Спектр 1Н-ЯМР (CDCI3): 5,38 (1Н, м, Н-6); 3,98 (4Н, м, етилендіоксі); 3,43-3,53 (1Н, м, Н-3); 3,25-3,32 (1Н, дд, J=4,1Гц, Н-12); 1,32 (3Н, с, Н-21); 1,01 (3Н, с, Н-19); 0,98 (3Н, с, Н-18). Спектр 13С-ЯМР (CDCI3): 139,1 (С-5); 122,1 (С-6); 112,2 (С-20); 85,1 (С-14); 75,1 (С-12>; 71,6 (С-3); 23,4 (С21); 19,4 (С-19); 8,9 (С-18). Приклад 13 3b,12b,14b-Тригідроксипрегн-5-ен (15) Етилендіоксипрегнен (25) (250мг, 0,64ммоль) розчиняють у 13,4мл оцтової кислоти і у воді, після цього при сушінні виморожуванням одержують 200мг (89%) тригідроксистероїду (15) із температурою плавлення (т.пл.) 228-235°С (в літературі 225-235°С). М+ 348, [(a D]20=35° [в лі тературі +29°]. Спектр 1Н-ЯМР (CDCI3): 5,39 (1Н, м, Н-6); 3,56-3,62 (1Н, т, J=8,1Гц, Н-17); 3,42-3,51 (1Н, м, Н-3); 3,28-3,39 (1Н, дд, J=4,3Гц, Н-12); 2,23 (3Н, с, Н-21); 1,01 (3Н, с, Н-19); 0,90 (3Н, с, Н-18). Спектр 13С-ЯМР (CDCI3): 217,7 (С-20); 138,9 (С-5); 122,2 (С-6); 85,5 (С-14); 73,6 (С-12); 71,6 (С-3); 57,0 (С17); 55,1 (С-13); 43,6 (С-9); 42,1 (С-4); 37,3 (С-1); 36,8 (С-10); 35,9 (С-8); 34,5 (С-15); 32,9 (С-21); 31,5 (С-16); 30,1 (С-2); 27,4 (С-7); 24,4 (С-11); 19,4 (С-19); 8,3 (С-18). Приклади 14-19 ілюструють методики синтезу, за допомогою яких можна одержати проміжні сполуки і стероїд (15) відповідно до "другої альтернативної методики". Приклад 14 20,20-Етилендіокси-3b-толуол-пара-сульфонілоксипрегна-5,14-дієн-12b-ол-ацетат(26) Розчин 650мг пара-толуолсульфонілхлориду (3,4ммоль) у 10мл піридину краплями додають у суміш 1,3г (3,1ммоль) 20,20-етилендіокси-прегна-5,14-дієн-3b,12b-діол-12-ацетату (22) в 15мл піридину при 0°С. Реакційну суміш лишають перемішуватися протягом 24год. при кімнатній температурі, після чого в реакційну суміш додають роду. Розчин екстрагують (2 рази по 50мл) етилацетатом, етилацетний шар промивають лимонною кислотою (5 разів по 50мл), 100мл водного насиченого розчину гідрокарбонату натрію, 100мл водного насиченого розчину хлориду натрію і 100мл води. Етилацетний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують, випарюють, і очищають методом флеш-хроматографії на колонці, використовуючи суміш (8:2 по об'єму) гексану і етилацетату в якості елюенту, щоб одержати 1,5г (84%) β-Ο-тозилстероїду (26). Знайдено М (молекулярна маса)=570,271; для C32H42O7S=570,273. 1 Н-ЯМР d: 1,021 (3Н, с, Н-19); 1,131 (3Н, с, Н-18); 1,282 (3Н, с, Н-21); 2,021 (ацетат-метил); 2,431 (3Н, с, Арметил); 3,883 (4Н, м, етилендіоксі); 4,75 (1Н, дд, J=10,8Гц і 5,2Гц, Н-12); 4,89 (1Н, м, Н-30); 5,281 (1Н, дд, J=4,2Гц і 2,1Гц, Н-15); 5,388 (1Н, м, Н-6); 7,341 (2Н, д, J=8,2Гц, АрН); 7,746 (2Н, д, J=8,2Гц, АрН). 13 С-ЯМР d:13,493 κ (С-18); 19,002к (С-19); 21,612к (Ар-метил)*; 21,671к (С-21)*; 24,175к (ацетат-метил); 63,401т (етилендіоксі); 63,498т (етилендіоксі); 71,531с (С-13);80,912д (С-12); 82,531д (С-3); 111,363с (С-20); 120,881д (С-15); 121,461д (С-6); 123,715-133,917 (ароматичні); 139,903 (С-14); 151,722с (С-5); 170,819с (естерокарбоніл). *можуть взаємно замінюватися. Приклад 15 20,20-етилендіокси-3a,5-цикло-5a-прегн-14-ен-6b,12b-діол-12-ацетат (27) Розчин 1,2г (2,1ммоль) 3b-толуол-пара-сульфонілоксипрегна-5,14-дієну (26) і 2,2г (22,4ммоль) ацетату калію в 250мл води і 500мл ацетону кип'ятять зі зворотним холодильником при 60°С протягом 16год. Ацетон випарюють, і водний шар екстрагують 200мл етилацетату. Етилацетатний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. При розділенні суміші методом флеш-хроматографії, використовуючи суміш (9:1 за об'ємом) хлороформу й ацетону в якості елюенту, одержують 530мг (61%) 3a,5-цикло-похідного (27) у вигляді жовтої олії. Знайдено Μ=416,262; для С25Н36О 5S потрібно М=416,263. 1 Н-ЯМР d: 0,288 (1Н, дд, J=8,1; 4,9Гц, 4-На); 0,477 (1Н, дд, J=4,4Гц і 4,4Гц, 4-Hb); 1,025 (3Н, с, Н-19); 1,121 (3Н, с, Н-18); 1,256 (3Н, с, Н-21); 1,989 (3Н, с, ацетат-метил); 3,302 (1Н, дд, J=2,8Гц і 2,8Гц, Н-6); 3,784-3,947 (4Н, м, етилендіоксі); 4,721 (1Н, дд, J=8,5Гц і 5,6Гц, Н-12); 5,232 (1Н, дд, J=3,9Гц і 1,9Гц, Н-15). 13 С-ЯМР d: 11,678т (С-4); 12,298к (С-18); 19,971к (С-19); 23,623к (С-21); 24,153k (ацетат-метил); 63,700т (етилендіоксі); 63,788т (етилендіоксі); 73,591д (С-6); 80,551д |С-12); 111,126с (С-20); 118,778д (С-15); 152,959 (С-14); 170,991с (естерокарбоніл). Приклад 16 20,20-етилендіокси-3a,5-цикло-5a-прегн-14-ен-6b,12b-діол (28) Розчин 500мг (1/2ммоль) 3a,5-циклопохідного (27) у 20мл тетрагідрофурану краплями добавляють у суспензію 50мг (1/3ммоль) алюмогідриду літію в 10мл тетрагідрофурану. Реакційну суміш перемішують 4год, і реакцію переривають, додаючи 50мкл води. Через 30 хвилин добавляють 50мкл 15°-го розчину гідроксиду натрію, і перемішування продовжують ще протягом 30 хвилин. Добавляють 150мкл води, і реакційну суміш фільтрують. Тетрагідрофурановий розчин висушують сульфатом магнію, фільтрують, випарюють і очищають методом флеш-хроматографії, використовуючи суміш (8:2 за об'ємом) хлороформу й ацетону в якості елюенту, одержують 370мг (83%) діолу (28) у вигляді олії. Знайдено Μ=374,250; для С23Н34О 4 потрібно М=374,252 1 Н-ЯМР d: 0,298 (1Н, дд, J=8,1; 4,9Гц, 4-На); 0,510 (1Н, дд, J=4,4Гц і 4,4Гц, 4-Нь); 0,985 (3Н, с, Н-19); 1,055 (3Н, с, Н-18); 1,325 (3Н, с, Н-21 ); 3,318 (1Н, дд, J=3,0Гц і 3,0Гц, Н-6); 3,363 (1Н, дд, J=11,4Гц і 4,2Гц, Н-12); 4,019 (4Н, м, етилендіоксі); 4,622 (1Н, с, ОН), 5,255 (1Н, дд, J=3,9Гц і 1,9Гц, Н-15). 13 С-ЯМР d: 11,681т (С-4); 12.243К (С-18); 19,844к (С-19); 23,604к (С-21); 63,620т (етилендіоксі); 63,733т (етилендіоксі); 73,569д (С-6); 77,478д (С-12); 111,125с (С-20); 118,702д (С-15); 152,912 (С-14). Приклад 17 20,20-Етилендіокси-14,15b-епокси-3a,5-цикло-5a,14b-прегнан-6b,12b-діол (29) Добавляють 150мг (1,1ммоль) N-бромацетаміду в розчин 340мг (0,91ммоль) 20,20-етилендіокси-3a,5-цикло-5a-прегн-14-ен6b,12b-діолу (28) у 20мл ацетону, 0,25мл води і 0,25мл оцтової кислоти при 0°С. Через 15хв. до реакційної суміші добавляють 20мл 5%-го розчину сульфіту натрію. Ацетон випарюють при зниженому тиску, і розчин, що залишився, екстрагують дихлорметаном (3 рази по 30мл). Дихлорметановий шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють до концентрованого об'єму 50мл. До суміші добавляють 0,5мл піридину і суміш перемішують ще 1год. Потім дихлорметановий шар промивають 5%-ним розчином лимонної кислоти (3 рази по 30мл), 30мл водного насиченого розчину гідрокарбонату натрію і 30мл води. Дихлорметановий шар висушують сульфатом магнію, фільтрують, випарюють і очищають методом флеш-хроматографїї, використовуючи суміш (9,5:0,5 за об'ємом) хлороформу і метанолу в якості елюенту, щоб одержати 180мг (51%) епоксиду (29) у вигляді білої Піни. Знайдено Μ=390,245; для С23Н34О2 потрібно М=390,247. 1 Н-ЯМР d: 0,287 (1Н, дд, J=8,1; 4,9Гц, 4-На); 0,501 (1Н, дд, J=4,4Гц і 4,4Гц, 4-Нь); 0,978 (3Н, с, Н-19); 1,048 (3Н, с, Н-18); 1,321 (3Н, с, Н-21); 3,318 (1Н, дд, J=3,1Гц і 3,1Гц, Н-6); 3,355 (1Н, дд, J=11,2Гц і 4,1Гц, Н-12); 3,491 (1Н, с, Н-15) 4,001 (4Н, м, етилендіоксі); 4,901 (1Н,с, ОН). 13 С-ЯМР d:11,668т (С-4); 11,973к (С-18); 19,515к (С-19); 23,519к (С-21); 59,910д (С-15); 63.601т (етилендіоксі); 63,713т (етилендіоксі); 72,501д (С-14); 73,571д (С-6); 77,471д (С-12); 111,085с (С-20). Приклад 18 20,20-Етилендіокси-6b,12b,14b--тригідрокси-3a,5-цикло-5a,14b-прегнан (30) Добавляють розчин 170мг (0,44ммоль) епоксиду (29) у 10мл тетрагідрофурану Ш суспензію 20мг (0,53ммоль) алюмогідриду літію в 5мл тетрагідрофурану. Реакційну суміш кип'ятять зі зворотним холодильником 2год., після чого добавляють 20мкл води, і перемішування продовжують протягом 30 хвилин. Добавляють 20мкл 15%-го розчину гідроксиду натрію, і перемішування продовжують ще протягом 30 хвилин. Добавляють додатково 60мкл води, і суспензію перемішують 1год. Після фільтрації суспензію висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють тетрагідрофуран. При розділенні отриманої суміші методом флеш-хроматографії, використовуючи суміш (9:1 за об'ємом) хлороформу і метанолу в якості елюенту, одержують 90мг (53%) цільового тріолу (30) у вигляді прозорої олії. Знайдено Μ=392,261; для С23Н38О5 потрібно М=392,263. 1 Н-ЯМР d: 0,287 (1Н, дд, J=8,1; 4,9Гц, 4-Н2); 0,510 (1Н, дд, J=4,4Гц і 4,4Гц, 4-Нь); 0,971 (3Н, с, Н-19); 1,042 (3Н, с, Н-18); 1,319 (3Н, с, Н-21 ); 3,321 (1Н, дд, J=3,0Гц і 3,0Гц, Н-6); 3,321 (1Н, дд, J=11,1Гц і 3,9Гц, Н-12); 3,561 (1Н, с, ОН) 4,084 (4Н, м, етилендіоксі);4,671(1Н, с, ОН). 13 С-ЯМР d:11,668т (С-4); 11,971к (C-18); 19,511k (C-19); 23,520k (C-21); 63,612т (етилендіоксі); 63,711т (етилендіоксі); 73,483д (С-6); 76,051 д (С-12); 84,307с (С-14); 111,099с (С-20). Приклад 19 3b,12b,14b-Тригідрокси-14b-прегн-5-ен-20-он (15) Суміш 80мг тріолу (30) (0,20ммоль) у 20мл ацетону і 10мл гідрохлоридної кислоти (1М) кип'ятять зі зворотним холодильником при 60°С протягом 2год. Реакційну суміш охолоджують і добавляють 20мл насиченого розчину гідрокарбонату натрію. Ацетон випарюють, і водний шар екстрагують хлороформом (3 рази по 20мл). Хлоро-формовий шар висушують суль фатом магнію, фільтрують і випарюють, одержуючи епімерні тригідроксистероїди (15a і 15β) (42мг, 61%). При розділенні 15мг епімерної суміші (5a і 15β) методом флеш-хроматографії, використовуючи суміш (9:1 за об'ємом) хлороформу і метанолу в якості елюенту, одержують 10мг чистого 17b-епімеру (15а); температура пл. 224-229°С (з ацетону) (у літературі 226-223°С). Знайдено Μ=348,234; С-72,32; Н-9,21%; для С21Н32О4 потрібно С-72,38; Н-9,26%; М=348,236; і 3мг 17a-епімеру (15B); температура пл. 183-191°С (з ацетону) (у літературі 184-196°С). 3b,12b,14b-Тригідрокси-14b-прегн-5-ен-20-он (15а): 1 Н-ЯМР d: 0,963 (1Н, с, Н-19); 1,192 (3Н, с, Н-18); 2,236 (3Н, с, Н-21); 3,325 (1Н, дд, J-11.2 і 3,9Гц, 12-Н); 3,464 (1Н, с, ОН); 3,514 (1Н, м, Н-3); 3,598 (1Н, дд, J-9,6Гц і 9,6Гц, Н-17); 4,255 (1Н, с, ОН); 5,383 (1Н, м, Н-5). 13 С-ЯМР d:11,678т (С-4); 8,275к(С-18); 19,414к (С-19); 24,400т (С-11); 24,581т (С-16); 27,443т (С-7); 30,062т (С-2); 32,972к (С-21); 34,543т (С-15); 35,864д (С-8); 36,975с (С-10); 37,337т (С-1); 42,144т (С-4); 43,565д (С-9); 55,101с (С-13); 57,038д (С-17); 71,597д (С-3); 73,558д (С-12); 85,566с (С-14); 122,223д (С-6); 138,932с (С-5); 217,011с (С-20). 3b,12b,14b-Тригідрокси-14b-прегн-5-ен-20-он(15B): 1 Н-ЯМР d: 0,996 (1Н, с, Н-19); 1,144 (3Н, с, Н-18); 2,221 (3Н, с, Н-21); 3,339 (1Н, дд, J=9,4 і 9,4Гц, 17-H); 3,492 (1Н, м, Н-3); 3,629 (1Н, дд, J=11,1Гц і 3,9Гц, Н-12); 3,712 (1Н, с, ОН); 4,325 (1Н, с, ОН); 5,383 (1Н, м, Н-5). Приклади 20-28 ілюструють методики синтезу, за допомогою яких можна одержати проміжні сполуки, щоб одержати перший моносахарид (40). Приклад 20 Метил-4,6-О-бензиліден-a-D-глюкопіранозид (32) Суміш 30г (0,15моль) метил-a-D-глюкопіранозиду, 70мл бензальдегіду і 20г хлориду цинку перемішують 24год. при кімнатній температурі. Реакційну суміш виливають у крижану воду і суміш перемішують ще 15хв. Білий осад відфільтровують і промивають діетиловим етером. Тверду речовину перемішують 15хв. із 10%-ним розчином метабісульфіту натрію, фільтрують і промивають водою. Тверду речовину кристалізують із суміші хлороформу й ефір у, створюючи бензиліденовий продукт (32) (31г, 72%). Приклад 21 Метил-4,6-О-бензиліден-2-О-тозил-a-D-глюкопіранозид (33) До розчину 31г (0,12моль) бензиліден-глюкози (32) у 100мл піридину краплями добавляють 25г (1,2 екв.) пара-тозолсульфонілхлориду в 100мл піридину при 0°С. Реакційну суміш перемішують 48год. при кімнатній температурі. До реакційної суміші добавляють лід. Білу тверду речовину, що утворилася, промивають водою і перекрис-талізовують із гарячого етанолу, одержуючи тозиловану глюкозу (33) (28г, 60%). Приклад 22 Метил-4,6-О-бензиліден-3-O-метил-a-D-альтропіранозид (34) Тозилат (33) (28г, 64ммоль) у розчині метилату натрію (7г натрію в 150мл метанолу) нагрівають 48год. в автоклаві при 110°С. Реактор охолоджують і в реакційну суміш добавляють твердий діоксид карбону. Після фільтрації метанол випарюють, і потім тверду речовину обробляють водою. Водний шар екстрагують 3 рази хлороформом. Хлороформовий шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. Сиру суміш очищають на хроматографічній колонці із силікагелем, елююючи сумішшю 9:1 хлороформу й ацетону, щоб одержати альтрозид (34) (10г, 52%) Приклад 23 Метил-6-бром-4-O-бензоїл-3-O-метил-6-деокси-a-D-альтропіранозид (35) Добавляють 10г (33ммоль) бензиліденальтрозиду (34) до розчину 7,6г N-бромсукциніміду і карбонатубарію (20г) у тетрахлоридом карбону, і реакційну суміш Згод. кип'ятять зі зворотним холодильником при 75°С. Реакційну суміш фільтрують і шар тетрахлориду карбону промивають водою. Органічний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати сполуку 6-бромальтрозид (35) (9г, 69%). Приклад 24 Метил-4-O-бензоїл-3-O-метил-6-деокси-a-D-альтропіранозид (36) Добавляють краплями 18г боргідриду натрію в 30мл води до розчину бромальт-розиду (35) (9г, 23ммоль) і 18г хлориду нікелю в 300мл етанолу при 0°С. Реакційну суміш 1год. кип'ятять зі зворотним холодильником при 75°С і потім її фільтрують. Етанол випарюють і водний шар, що залишився, екстрагують хлороформом (3 рази). Хлороформовий шар висушують суль фатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати 6-деоксиальтрозид (36) (5г, 72%). Приклад 25 4-О-Бензоїл-3-О-метил-6-деокси-ab-D-фенілтіоальтропіранозид (37) Фенілтіотриметилсилан (5мл) і триметилсилілтрифлуорметансульфонат (2мл) добавляють при 0°С до розчину 6-деокси-альтрозиду (36) (5г, 17ммоль) у 200мл дихлорметану. Реакційну суміш перемішують 6год. при кімнатній температурі. До реакційної суміші добавляють насичений розчин гідрокарбонату натрію. Дихлорметановий шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. Сиру суміш очи щають на хроматографічній колонці із силікагелем, елююючи сумішшю 9:1 хлороформу й ацетону, щоб одержати abфенілтіоальтрозид (37) (4г, 63%). Приклад 26 4-О-Бензоіл-3-О-метил-2-фенілтіо-2,6-дидеокси-ab-D-флуорцимаропіранозид (38) Трифлуорид діетиламіносульфур у (0,65г) швидко добавляють при 0°С до розчину ab-фенілтіоальтрозиду (37) (0,5г, 1,33ммоль) у дихлорметані. Реакційну суміш перемішують 0,5год. при 0°С і потім добавляють насичений розчин гідрокарбонату натрію. Дихлорметановий шар відокремлюють від водного шару, висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати ab-флуорцимарозу (38) (450мг, 90%). Приклад 27 4-O-Бензоїл-3-O-метил-2-O-mреm-бутилдиметилсиліл-ab-D-фенілтіоальтрозид (39) 6-Деоксіальтрозид (37) (5г) силілують, використовуючи 3г mреm-бутилдиметилсилілхлориду і 3г імідазолу в 50мл піридину. Реакційну суміш обробляють, екстрагуючи її етилацетатом, промивають етилацетатний шар 6-нормальною гід-рохлоридною кислотою, потім гідрокарбонатом натрію й остаточно водою. Етилацетатний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють щоб одержати силілований бензоїлфенілтіоальтрозид (39) (80%). Приклад 28 3-О-Метил-2-О-mреm-бутилдиметилсиліл-ab-D-фенілтіоальтрозид (40) Силілований бензоїл-фенілтіоальтрозид (39) (6г) обробляють метилатом натрію (100мл) протягом 4год. Метанол випарюють і до реакційної суміші добавляють воду. Водний шар підкисляють оцтовою кислотою (до рН 5) і екстрагують етилацетатом. Етилацетатний шар промивають водою, висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати силілований метил-фенілтіоальтрозид (40) (75%). Приклади 29-37 ілюструють методики синтезу, за допомогою яких можна приготувати проміжні сполуки, щоб одержати другий моносахарид (50). Приклад 29 1,2:5,6-Ді-О-ізопропіліден-a-D-глюкофураноза (42) Добавляють краплями 40мл сульфатної кислоти в розчин a-D-глюкози (41) (50г, 0,28моль), в 1л ацетону при 0°С. Реакційну суміш перемішують 24год. і потім її нейтралізують, використовують 6М розчин гідроксиду натрію. Ацетон випарюють, і водний шар екстрагують хлороформом (2 рази). Хлороформовий шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. При кристалізації з циклогексану одержують діізопропіліденглюкозу (42) (41г, 57%). Приклад 30 1,2:5,6-Ді-O-ізопропіліден-3-O-метил-a-D-глюкофураноза (43) cc-D-тюкофуранозу (42) (41г, 0,16моль) добавляють краплями до суспензії 5г гідриду натрію в 200мл тетрагідрофурану. Через 0,5год. до реакційної суміші добавляють краплями 25г метилйодиду в 100мл тетрагідрофурану і потім суміш перемішують 24год. У реакційну суміш добавляють воду і потім суміш екстрагують 3 рази ефіром. Ефірний шар висушують суль фатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати метилзахищену глюкозу (43) (38г, 83%). Приклад 31 3-О-метил-ab-D-глюкопіранозид (44) Метилдіізопропіліденову сполуку (43) (38г, 0,14моль) розчиняють у 700мл оцтової кислоти (50%), і цей розчин кип'ятять зі зворотним холодильником 18год. Після Охолодження випарюють оцтову кислоту. Сирий продукт очищають на хроматографічній колонці, елююючи сумішшю хлороформ: метанол: ацетон: вода (70:27:2: 1), щоб одержати 3-О-метил-ab-D-глюкопіранозид (44) (13г, 50%). Приклад 32 Метил 3-О-метил-ab-D-глюкопіранозид (45) 3-О-Метил-ab-D-глюкопіранозид (44) (10г) розчиняють у 50мл метанолу і 1мл концентрованої гідрохлоридної кислоти і кип'ятять зі зворотним холодильником протягом ночі. Добавляють твердий гідрокарбонат натрію, і реакційну суміш фільтрують. Метанол випарюють, щоб одержати метил 3-О-метил-abD-глюкопіранозид (45) (95%). Приклад 33 Метил 4,6-О-бензиліден-3-О-метил-ab-глюкопіранозид (46) Глюкопіранозид (45) (8г) перемішують при кімнатній температурі в розчині 20мл бензальдегіду і хлориду цинку (5г). Через 24год. добавляють лід, і водний шар екстрагують хлороформом. Хлороформовий шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. Бензальдегід видаляють за допомогою вакуумної перегонки, і продукт очищають на хроматографічній колонці із силікагелем, елююючи сумішшю ацетону і хлороформу (0,5:9,5), щоб одержати бензиліден-ab-глюкопіранозид (46) (60%). Приклад 34 Метил 4-O-бензоїл-3-O-метил-6-деокси-ab-глюкопіранозид (47) Бензиліденову сполуку (46) (5г) кип'ятять зі зворотним холодильником при 80°С у суміші 3,7г Nбромсукциніміду і 4г карбонатубарію в тетрахлориді карбону. Через 4год. реакційну суміш фільтр ують, і тетрахлорид карбону промивають водою, висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати бромисту сполуку (70%). Цю бромисту сполуку (4,3г) розчиняють у розчині хлориду нікелю (8,6г) у 300мл етанолу при 0°С. У цей розчин краплями добавляють 8,6г боргідриду натрію в 50мл води протягом 15 хвилин. Реакційну суміш кип'ятять зі зворотним холодильником при 100°С протягом 45 хвилин, охолоджують, фільтрують і випарюють. Добавляють хлороформ, і хлороформовий шар промивають водою, висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати 6-деокси-цукор (47) (70%). Приклад 35 4-О-Бензоїл-3-О-метил-1-фенілтіо-6-деокси-ab-глюкопіранозид (48) Деокси-глюкопіранозид (47) (3г) розчиняють у 50мл дихлорметану. У цей розчин добавляють 2г фенілтіотриметилсилану і 0,2мл триметилсилілтрифлуорметансульфонату. Розчин перемішують при кімнатній температурі протягом ночі і після цього добавляють насичений розчин гідрокарбонату натрію. Дихлорметановий шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. Продукт очищають хроматографічно на колонці із силікагелем, елююючи сумішшю етилацетату і гексану (2:8), щоб одержати сполуку (48) (60%). Приклад 36 4-O-Бензоїл-3-O-метил-2-O-півалоїл-1-фенілтіо-6-деокси-ab-глюкопіранозид (49) До розчину 2г глюкопіранозиду (48) у 20мл піридину добавляють 2мл півалоїлхлориду. Розчин перемішують при кімнатній температурі протягом ночі, і потім добавляють воду. Водний шар екстрагують етилацетатомі органічний шар промивають 6Η гідрохлоридною кислотою. Етилацетатний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють, щоб одержати півалоїловий естер (49) (80%). Приклад 37 4-О-Бензоїл-3-О-метил-2-О-півалоїл-1-флуор-6-деокси-b-глюкопіранозид (50) До розчину 2г півапоїлового ефіру (49) у 100мл дихлорметану при 0°С добавляють 1,2г N-бромсукциніміду і 1,2г три флуориду діетиламіносульфуру. Через 1год. добавляють насичений розчин гідрокарбонату натрію. Дихлорметановий шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. βФлуорпіранозид (50) очищають хроматографічно на колонці із силікагелем, елююючи сумішшю е тилацетату і гексану (2:8), (вихід 45%). Приклад 38 ілюструє методику синтезу, за допомогою якої можна одержати сполуку 3-O-[4-O-бензоїл-2фенілтіо-b-D-цимаропіранозил]-12,14b-дигідроксипрегн-5-ен-20-он (51). Приклад 38 3-O-[4-O-бензоїл-2-фенілтіо-b-D-цимаропіранозил]-12,14b-дигідрокси-прегн-5-ен-20-он (51). Добавляють 190мг хлориду стан уму (1ммоль) до розчину 100мг (0,28ммоль) 3b,12b,14bтригідроксипрегнан-5-ен-20-ону (15) і флуорцимаропіранозиду (38) (210мг, 0,56ммоль) в осушеному діетиловому етері і молекулярних ситах 4Å при -15°С. Реакційну суміш витримують при -15°С протягом 3 доби. До реакційної суміші добавляють насичений розчин гідрокарбонату натрію. Ефірний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. Продукт очищають хроматографічно на колонці із силікагелем, елююючи сумішшю хлороформу і метанолу (9,5:0,5), щоб одержати глюкозид (51) (30мг, 15%). Приклади 39-41 ілюструють методику синтезу, за допомогою якої можна сполучити цимарозну групу з теветозною групою. Приклад 39 Теветозо-цимарозний дисахарид (53) Перемішують 1год. при кімнатній температурі 1,5г теветози (50А), 1,3г цимарози (40) і молекулярні сита 4Å в дихлорметані. Реакційну суміш охолоджують до -15°С, і добавляють 0,8г хлориду стануму (SnCI2) і 1,1г трифлуорметансульфонату аргентуму. С уміш перемішують 16год. при -15°С, після чого добавляють 0,5мл тріетиламіну. Продукт реакції фільтрують і випарюють дихлорметан. Дисахарид (53) очищають хроматографічно на колонці із силікагелем, елююючи сумішшю е тилацетату і гексану (2:8), ви хід 15%. Приклад 40 Теветозо-цимарозний дисахарид (54) До розчину 200мг дисахариду (53) у 20мл тетрагідрофурану добавляють 0,4мл флуориду тетрабутиламонію. Суміш перемішують 1год. при кімнатній температурі, після чого добавляють насичений розчин гідрокарбонату натрію. Реакційну суміш екстрагують етилацетатом і етилацетатний шар висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. Дисахарид (54) очищають хроматографічно на колонці із силікагелем, елююючи сумішшю хлороформу й ацетону (9,5:0,5), вихід 60%. Приклад 41 Теветозо-цимарозний дисахарид (55) До розчину 80мг дисахариду (54) у 10мл дихлорметану добавляють 80мкл трифлуориду діетиламіносульфуру при 0°С. Суміш перемішують 0,5год. при 0°С і кімнатній температурі, після чого добавляють насичений розчин гідрокарбонату натрію і ще більше дихлорметану. Дихлорметан висушують сульфатом магнію, фільтрують і випарюють. Дисахарид (55) очищають хроматографічно на колонці із силікагелем, елююючи сумішшю е тилацетату і гексану (1:9), ви хід 65%. Приклад 42 Нижче подані результати трьох таких біологічних досліджень засобу, що пригнічує апетит, як-от a) Тест Ірвіна; b) Дослідження гострої токсичності; і с) Тест втрати апетиту від пероральної дози. а) Тест Ірвіна Ціллю цього тесту є оцінка пригнічуючого апетит засобу винаходу, отриманого з екстракту рослин, як описано вище, відповідно до спрощеного тесту Ірвіна на заспокійливу і седативну дію на тварин. Методика експерименту Засіб, що пригнічує апетит, екстрагують із рослинного матеріалу способом, який описаний заявником вище, і призначають його двом із чотирьох груп тварин (по три у кожній групі): одну гр упу взагалі не обробляли, одна група одержувала розчинник - диметилсульфоксид (ДМСО), одна група одержувала дозу випробуваного зразку, рівну 50мг/кг, і одна група одержувала дозу випробуваного зразку 300мг/кг. Обробку проводять за допомогою внутрішньобрюшинної ін'єкції і спостереження здійснюють у конкретні моменти часу, аж до п'ятьох годин після обробки. При інтерпретації результатів враховують тільки ті симптоми, що відрізняються від що спостерігаються у тварин, оброблених ДМСО. Результати Було ясно, що розчинник ДМСО помітно впливав на тварин, особливо на механізм терморегуляції. У усіх тварин, оброблених розчинником, окремо, або в сполученні з випробуваним зразком, відзначене значне зниження температури тіла. Тварини в групі малого дозування демонструють знижене розселення в клітині і знижену рухову активність, як у всі х інши х групах, включаючи контрольну. Відзначено апатичність у такому же ступені, що і для групи, обробленої ДМСО. Через 15-60 хвилин після обробки спостерігається зменшення дихання. Також у більшому ступені, чим у групі, обробленої ДМСО, спостерігається птозис (закривання вік). Спостерігається реакція вух, а також позитивна реакція пальців, що вказує на зляканість. Після обробки температура тіла впала до 32,7°С. Тварини в групі високого дозування демонструють спочатку знижене розселення в клітині і зниження рухової активності, як у всі х інши х гр упах, але передсмертю, що відбувалася приблизно через 1 годину після обробки, вони демонструють підвищене розселення в клітині і руховій активності. Через 30 хвилин після обробки відбуваються сильні вигнуті симетричні конвульсії. Подих спочатку послабляється, а передсмертю посилюється. Реакція вух була спізнілою, і спостерігалася позитивна реакція пальців, що вказує на зляканість, також як спостерігалося у тварин у групі малої дози. Після обробки температура тіла впала до 30,7°С. Спостерігалася підвищена позиційна пасивність, а також знижений тонус тіла. Спостерігалося ненормальне обертання кінцівок і зменшення міцності захоплення, була відсутня больова реакція і відбувалася втрата рефлексу випрямлення. Обговорення При зіставленні з тваринами контрольної групи й обробленими ДМСО, тварини, що одержали малу дозу (50мг/кг), продемонстрували тільки зменшення дихання і збільшення ступеня закривання вік. Тварини, що одержали високу дозу (300мг/кг) випробуваного зразку, реагували дуже інтенсивно, продемонструвавши конвульсії ісмерть. Всі інші спостереження, проведені з цими тваринами можна приписати тваринам, що знаходяться в конвульсіях і вмирають. Не були відзначені ознаки, що дозволяють припустити заспокійливі або седативні ефекти, такі як помітне зменшення розселення в клітинах, знижена рухова активність і апатія у випробуваних гр упах, що можна було б приписати випробуваному зразку. Отже, можна зробити висновок, що випробуваний зразок летально діє на мишей при дозі 300мг/кг і призводить до пригнічення дихання в мишей при дозі 50мг/кг, уведеній внутрішньобрюшинно з ДМСО в якості розчинника. b) Дослідження гострої токсичності Ціллю цього дослідження є збір інформації про токсичність випробуваного зразку. Методика експерименту Рослинний екстракт, отриманий згідно з винаходом, як описано вище й маючий активність пригнічення апетиту, очи щають і один випробуваний зразок досліджують при введенні зростаючих пероральних доз мишам. Використовують дво х тварин в одній групі дозування, за винятком групи найбільшого дозування, у якому обробляли тільки одну тварину. У день обробки тварин обстежують на стан здоров'я і визначають масу тіла. Дози варіюються від 100 до 3028,5мг/кг. Ці дози розраховують і підмішують у приготовлений картопляний крохмаль таким чином, щоб кожна тварина одержала загальну дозу 0,2 мол. Тварина 13 одержала дозу 0,25мол. Картопляний крохмаль готують, змішуючи 20г крохмалю в невеличкому об'ємі холодної води, добавляють цю суміш у киплячу воду і доводять об'єм до 1л, суспензії дають охолонути до кімнатної температури до її дозування. Тварин першої і другої гр уп обробляють у той же день. За ними спостерігають протягом 24год., і якщо не виявляються які-небудь ознаки токсичності, обробляють таку груп у. Аналогічний підхід застосовують доти, поки не оброблять усіх тварин. Такої програми дотримуються, щоб засвідчитися, що тварини не були оброблені без необхідності, коли доза гострої токсичності була досягнута в попередній групі. Тварин обстежують на клінічні ознаки токсичності відразу ж (через 1-2год.) після обробки і щодня в наступному. Масу тіла визначають 1 раз у тиждень, причому заміряють загальне споживання їжі і води кожною твариною. Тварин, що вижили, безболісно умертвляють за допомогою внутрішньобрюшинної ін'єкції пентобарбітону натрію (доступний у продажу під торговою маркою Euthanaze, CentaurR) на 14 день експерименту. Обстеження післясмерті проводять на цих тваринах, а також на одній тварині, яка померла в ході досліду. Збирають зразки на гістологію. Результати Група 1 (контрольна група) Протягом 14-добового періоду споживання їжі і води було в нормальних межах. Зміни маси тіла також були у нормальних межах. У зразках печінки не помічені гістопатологічні зміни. Група 2 (100мг/кг) Протягом періоду спостережень не помічені клінічні ознаки токсичності. Споживання їжі і води було в нормальних межах і зміни маси тіла також були в нормальних межах. Макроскопічну патологію не спостерігали, і в зразках печінки не помічені гістопатологічні чи морфологічні зміни. Група 3 (200мг/кг) Протягом експерименту для тварин у цій групі не помічені клінічні ознаки токсичності. Споживання їжі і води було нормальним, також як і зміни маси тіла. Не було виявлено макроскопічної патології, але при обстеженні печінки виявлені гістопатологічні зміни. Набрякання гепатоцитів було м'яким (у вигляді замутнення) для тварини 6, але помірним для тварини 5. У гепатоцитах тварини 5 також відбувається помірне водянисте переродження. Група 4 (400мг/кг) Протягом періоду спостережень не помічені клінічні ознаки токсичності, а в ході посмертного дослідження не спостерігалася макроскопічна патологія. При гістології спостерігали помірне набрякання і м'яке водянисте переродження гепатоцитів. Споживання їжі і води і зміна маси тіла у тварини 7 були нормальними. Тварина 8 споживала в сумі майже вдвічі більше їжі, ніж тварина 7 (144,6г і 73,9г відповідно), але збільшення маси тіла склало тільки 0,81г у порівнянні з 2,7 г. Група 5 (800мг/кг) Одна тварина (№10) померла через три дня після навантаження, не виявивши ніяких специфічних ознак. Інша тварина (№9) вижила протягом усього періоду спостережень без яких-небудь ознак токсичності. Споживання води твариною, що вижила, було нормальним (42,42мл), хоча споживання їжі було високим (134,2г). Маса тіла збільшилася на 2,85г, що є самим високим приростом для усіх тварин у цьому експерименті. При посмертному дослідженні тварини 10, що померла незабаром після одержання пероральної дози, знайдено, що легені були переповнені кров'ю. Була відсутня реакція на стороннє тіло, що могло б вказати на інгаляцію випробуваного зразку. Для тварини 9 не спостерігалася макроскопічна патологія. У тварини 10 відзначено м'яке утворення цитоплазматичних вакуолей (водянисте переродження), проте воно було помірним у тварини 9. У обох тварин залозистий цитоплазматичний зовнішній вигляд Печінки був класифікований як помірний. Група 6 (1600мг/кг) Протягом експерименту в жодній з тварин не помічені клінічні ознаки токсичності. При посмертному дослідженні не спостерігалася макроскопічна патологія, але при гістопатологічному дослідженні спостерігалося помірне переродження печінки у тварини 11. У тварини 12 виявлено помірне каламутне набрякання і м'яке водянисте переродження гепатоцитів. Споживання їжі і води, як і збільшення маси тіла було нормальним протягом експерименту. Група 7 (3028,5мг/кг) Тільки одну тварину обробили такою дозою. Для цієї тварини протягом періоду спостережень не помічені які-небудь ознаки токсичності і не спостерігалася макроскопічна патологія. При гістопатологічному дослідженні спостерігали помірне каламутне набрякання і водянисте переродження гепатоцитів. У цієї тварини відзначена втрата маси тіла за період спостережень (-0,82г), але споживання їжі і води було нормальним. Обговорення Оскільки в кожній групі доз було використано дуже мале число тварин, зробити якісь висновки важко. Той факт, що тільки одна тварина померла при низькому рівні дози, без яких-небудь спостережених симптомів, може вказувати на те, щосмерть не була пов'язана з випробуваним зразком, а викликана стресом у ході обробки і/або після її. У групах із підвищеним дозуванням мертві тварини були відсутні і не помічені які-небудь ознаки токсичності, що додатково підтверджує зроблене припущення, що спостережене для тварини 8 підвищене споживання їжі можна була б приписати надлишковому розкиданню їжі, що знайшло відбиток у невеличкому прирості маси тіла. Необхідно мати на увазі, що всі тварини в цьому досліді були оброблені тільки один раз, і що малоймовірно, щоб засіб, що пригнічує апетит, робив помітний вплив на споживання або їжі, або води, або на масу тіла протягом 14-добового періоду, як у випадку цього експерименту. При гістопатологічному дослідженні зразків печінки стало ясно, що патологічні зміни пов'язані з величиною дози: у тварин, що одержали підвищені дози, спостерігалися великі зміни. Спостережена патологія за своїм характером не була метаболічною, а можливо була викликана випробуваним зразком. Ці зміни були тільки дегенеративними і тому оборотними. Не спостерігалися які-небудь необоротні зміни клітин печінки. Тому, можна зробити висновок, що померла тільки одна тварина, що одержала знижену дозу (800мг/кг), проте цясмерть, очевидно, не була пов'язана з випробуваним зразком. У жодній з інших тварин у будь-якій із груп дозувань не спостерігалися які-небудь ознаки токсичності протягом 14-добового періоду спостережень після обробки, і в результаті обробки більше не померло жодної тварини. Єдина пероральна доза випробуваного зразку викликала оборотні зміни клітин печінки, пов'язані з дозою. с) Тест втрати апетиту від пероральної дози Ціллю цього дослідження було визначення активності рослинного екстракту, отриманого згідно з винаходом, і мінімальної ефективної дози; і в той же час - дослідження будь-яких можливих побічних дій, таких як пригнічення дихання, як встановлено в тесті Ірвіна (див. ви ще). Методика експерименту Тварини були розподілені на групи обробки, використовуючи таблицю випадкових чисел. Кожна група обробки складалося з 3 тварин, а в контрольній групі було 6 тварин. Випробуваний зразок дозували молодим самкам щурів із масою тіла 100-150г при акліматизації протягом трьох наступних днів. Тварин ідентифікували за допомогою металевої вушної бірки, впізнавання полегшували мітками марганцівки (КМnО4) на шкурці. Тварин витримували індивідуально в стандартних полікарбонатних клітинах для гризунів, причому вода і порошкоподібні продажні таблетки для гризунів були доступні за бажанням. Споживання води і їжі вимірювали і розраховували протягом кожного дня. Для визначення мінімальної ефективної дози були випробувані п'ять доз. Обробку здійснювали за допомогою орального зонду, причому випробуваний зразок суспендували в картопляному крохмалі. Випробуваною сполукою була сполука (1) - білий гранульований порошок, отриманий з екстракту рослинного матеріалу згідно з винаходом; виміряну кількість випробуваного зразку змішували з препаратом картопляного крохмалю і дозували. Змішування з картопляним крохмалем здійснювали безпосередньо перед щоденним дозуванням. Ці суспензії старанно вимішували з використанням апарату Vorte x до витягу дозованого об'єму для кожної тварини. Був випробуваний ряд із п'ятьох доз, причому контрольна група одержувала тільки речовину носія. Дози вибирали на основі ефектів, що спостерігаються в описаному вище тесті Ірвіна, причому вони складали: Група 1: 0,00мг/кг (контрольна група) Група 2: 6,25мг/кг Група 3:12,50мг/кг Група 4: 25,00мг/кг Група 5: 37,50мг/кг Група 6: 50,00мг/кг Результати Обробка не впливає на здоров'я тварин протягом досліджуваного періоду. В усіх гр упах дозування для тварин, оброблених випробуваним зразком, спостерігається істотно знижений приріст середньої маси тіла протягом досліджуваного періоду, а в трьох із п'яти груп обробки тварини фактично втрачали масу тіла. Середнє споживання їжі була зниженим для всіх груп обробки протягом досліджуваного періоду. У тварин із групи підвищеного дозування спостерігається підвищене споживання води. В усі х група х дозування в жодної з тварин не спостерігають впливу на інтенсивність дихання. При посмертному дослідженні тварини у всі х групах дозування мали крихку печінку, проте макроскопічна патологія не спостерігалася. Обговорення Дані, відібрані протягом періоду акліматизації, підтверджують, що усі включені в цей експеримент тварини, були здорові, причому приріст маси тіла у різноманітних тварин був порівняним. Зменшення приросту маси тіла, а в деяких тварин навіть утрата маси, у сполученні зі зниженим споживанням їжі, переконливо свідчить про пригнічення центру апетиту. Зменшення споживання їжі і зменшення приросту маси тіла спостерігали в експерименті навіть у групі з найменшим дозуванням (6,25мг/кг). Фактично втрата маси тіла спостерігалася в експерименті в групі з дозуванням 12,50мг/кг. Важливо відзначити, що у всіх групах обробки спостерігалося підвищене споживання води при зниженні споживання їжі (фігура 2). Це може бути викликано діуретичним ефектом випробуваного зразку або стимулюванням центрів спраги в мозку. Факт відсутності пригнічення дихання, що спостерігали при дослідженнях гострої токсичності, на який посилалися вище при внутрішньобрюшинному введенні дози, розглядається як позитивний ефект. Це може бути викликано зниженим поглинанням із шлунково-кишкового тракту, із наступною зниженою біологічною доступністю. Проте біологічна доступність випробуваних пероральних доз була достатньою для випробуваного зразку, щоб забезпечити його ефективність. Невеличке зниження дихальної активності, через 1 годину після обробки, у більшості гр уп може бути приписано заповненню шлунку об'ємом дози і наступної пасивності тварин, спостережена в групах обробки тварин крихка печінка може бути обумовлена зміною енергії обміну речовин, вторинним стосовно зниженого споживання їжі, що викликає підвищений жировий обмін речовин і перевантаження печінки.Якщо це дійсно так, то ці зміни можна було б розглядати як перехідні, які могли б відновитися згодом, після досягнення стаціонарного стану або після виведення випробуваного зразку. Можливий вплив на печінку також необхідно додатково досліджувати. Оскільки основною ціллю цього дослідження було вибіркове дослідження, використовували невеличкі групи випробуваних тварин. Це робить статистичну інтерпретацію даних більш складною, особливо коли реакція окремих тварин є цілком різноманітною. Проте ці дані вказують на те, що випробуваний зразок має активність пригнічення апетиту, навіть при найменшій випробуваній дозі (6,25мг/кг). При усіх випробуваних дозах не виявлені які-небудь клінічні ознаки пригнічення дихання. Приклад 43 Зібрані рослини з роду Hoodia, отримані або з природного середовища заселення, або за програмою культивації, спочатку зберігають при 4°С, максимум протягом 48год. Рослини промивають водопровідною водою і після цього нарізають на шматочки±1см. Всі нарізані шматочки об'єднують і потім вичавлюють на гідравлічному пресі при тиску 300бар (30МПа) мінімум протягом 0,5год. на кожне завантаження. Окремо збирають сік, що виділився при пресуванні рослин. Цей сік зберігають при -18°С, доти поки не буде потрібна його подальше обробка. Цей сік сушать розпиленням у придатних умовах, щоб одержати сипучий порошок. Вміст вологи в цьому порошку переважно складає менше за 5% після сушіння розпиленням, і за потребою, його додатково сушать у вакуумній шафі чи використовують сушіння в псевдозрідженому шарі. Як сік, так і матеріал, висушений розпиленням, продемонстрували ефективність у якості засобу пригнічення апетиту, у біологічних дослідженнях на щурах. Експериментальна частина Рослини Hoodia gordonii (50кг) промивають водопровідною водою і після цього нарізають шматками розміром 1см. Потім шматки рослин вичавлюють на гідравлічному пресі при тиску 300бар (30МПа) мінімум протягом 0,5год. на кожне завантаження. Збирають сік і визначають, що його маса складає 10 кг, коли використовують рослини Hoodia gordonii, отримані з природного середовища заселення, і 20 кг, коли використовують рослини Hoodia gordonii, вирощені за програмою культивації. Сік (500г) суша ть розпиленням, використовуючи такі умови: Швидкість потоку 2,85мл/хв Температура на вході 110°С Температура на виході 70°С Температура в камері 78°С Отриманий при сушінні розпиленням порошок являв собою сипучий порошок (22г), з вмістом вологи 6,9%. Порошок, висушений розпиленням, аналізували, використовуючи спосіб рідкофазної хроматографії високого розділення (РХВР), щоб визначити концентрацію активного компоненту. Знайдено, що концентрація активного компонента складає 13 г/кг порошку, висушеного розпиленням. Спосіб аналізу РХВР Елюент - Ацетонітрил: вода (7:3), ізократний Колонка - Зі зверненою фазою С-18 Поглинання УФ - при 225нм Швидкість потоку - 1мл/хв Об'єм введеної проби -10мкл Порошок (10мг), висушений розпиленням, розчиняють у 0,5мл води і 0,5мл ацетонітрилу. Вводять 10мкл цього розчину в колонку РХВР і визначають концентрацію активної сполуки (1), використовуючи стандартну криву, що була поб удована за даними для чистої сполуки (1). Приклад 44