Рнк-компонент теломерази ссавця, олігонуклеотид (варіанти), рекомбінантна експресуюча плазміда (варіанти), еукаріотична клітина-хазяїн, трансформована за допомогою рекомбінантної експресуючої плазміди (варіанти

1 Р Н К - компонент теломеразы млекопитающего, отличающийся тем, что он находится по существу в чистом виде и имеет последовательность GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUmJUGUC OAACCCOAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC UGUUUUUCOCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCOGCCGCCU UCCACCGUUCAUUCUAG AGCAAACAAAAAAUGUCAG CUG CUGGCCCGUUC GCCCCOCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCtlGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU UCACCGUUTJCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC GCG АШССШСАС CUAUGGGACGUGCACCCAGG ACUCGGCUCACACAUG C AGlKCCCUUnCCUGUTJGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC CCCDCGCCGGCAGOGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC CAGOGUGCU. О Олигонуклеотид по существу в чистом виде, отличающийся тем, что содержит последовательность, идентичную смежной последовательности РНК - компонента по п 1, длина которой составляет от 10 до 500 нуклеотидов 3 Олигонуклеотид по п 2, отличающийся тем, что при связывании с РНК - компонентом теломеразы человека он ингибирует или блокирует активность теломеразы человека 4 Олигонуклеотид по существу в чистом виде, отличающийся тем, что содержит последовательность, полностью комплементарную смежной последовательности РНК-компонента по п 1, длина которой составляет от 10 до 500 нуклеотидов 5 Олигонуклеотид по п 4, отличающийся тем, что при связывании с РНК-компонентом теломеразы человека он ингибирует или блокирует активность теломеразы человека 6 Рекомбинантная экспрессирующая плазмида, отличающаяся тем, что она содержит олигонуклеотид по п 2 и, кроме того, содержит промотор, находящийся в положении для управления транскрипцией РНК, идентичной по последовательности указанному олигонуклеотиду 7 Рекомбинантная экспрессирующая плазмида, отличающаяся тем, что она содержит олигонуклеотид по п 4 и, кроме того, содержит промотор, находящийся в положении для управления транскрипцией РНК, комплементарной по последовательности указанному олигонуклеотиду 8 Рекомбинантная экспрессирующая плазмида по п 6, отличающаяся тем, что содержащийся в ней указанный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность О 47407 C C G GTACA CG At G GA A CTT A AC T CG A G A TT T T A T A T A T A A TTA G T AC T T C f C TT T T T A A T C CAA T G C r T A A TC C G C ATAAGA A CG A T T CG C A A A AT G G C A G GG G T G T AA CGAT C A CCTG GG C GA C G T C GG CCTC T TAC CG A TT G A G C AG C G T GT A TGG C T G GT GGC A C T G CA AG T GG ACCT A C CG C TC A A CG CG G ACT GG A C C C T T TCAAA A AAA TG T G C T GG CG M C C GCCA TAACCAACA CG G GG T G A G G CGAT C A CA T A GG CGGCC A AT G TG C C T TAC CG TCCG A G T A A A GGAC CT A A C G GG A A GT CGGG C A ACC C A TGCC A C C G A CGG TG A T A C GGT A G CCA A T CT C A C T G C AA A CA A T C T T AAAAAAC TA CG CG G GAGG AGCC GCCAAAAAT GTC A TT T GG AT CC C T TTT C T AC A A A A C C ATAG T G TA T C CCTTA CC T A G C C G A T A TT A G A A T A T AT A A G CTCrC T AA A G CTA A C A GC AG TG A C C TT T CA T A A G T GAGATTCAG T C C T T AAG ATT AAT AATGTA GTAG7TA СACTTG ATTAAAG С CATCCTCTGCT CAAGG AG AGG CT G G AG AA GGC A T T CT AA G G AG AAG G G G G СA G G G TA G GAA CTCG G A CG СATCC CACTGAG С С GAG A CAA G A T T C T G C T G TAGTCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGT GATGATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTT CCTGTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGC AGAGGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAA AGAACCTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGC AACGTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAAGTTTAATTTCCCSTTCCCCCC AACC&GCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCT TGCCCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCGTTTATAAGCCGACTCCCCC GGCAGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGC С ATT Г TTTG T CT AA CC С T AACTG AG AAG GG С GTA G G CG С С G TG С T T T T G С TCCCCGCGCCCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCCGGCGGAAAAGCCTCG GGCTGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTSGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTG CTGGCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCC CGAACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCC ACTGCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGC GACGGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTC CCGCCCCCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGC CTCAC ACATCCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGG AACG CCG ATCGTC С GCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTG ACTGACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTC С AAA G TCG G С С AAAATG AATGG GCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGT TCCT G CGTG G G Т Т С Т С С С GT CTTCCG C T T T T T G T T G С C T T T T ATG G T T G T ATTACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGACGTTTTTGCTTCTC CCAAGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCA TTTTTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGAT CT AAA TG AACATTGG AAATTG T G T T C C T T T A A T G G T C A T C G G T T T A T G C C AG AG G TT AG AAGTT T C T T T T T T G AAAAATT AGACCTTGGCGATGACGTTG AGCAGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT-3'. Q Эукариотная клетка-хозяин, отличающаяся тем, что она трансформирована с помощью рекомбинантной экспрессирующеи плазмиды по п 6, кодирующей молекулу РНК, которая может связываться с белковыми компонентами теломеразы млекопитающего с целью продуцирования активности теломеразы, способной добавлять последовательности повторяющихся единиц нуклеотидов ктеломерам 10 Эукариотная клетка-хозяин, отличающаяся тем, что она трансформирована с помощью рекомбинантной экспрессирующеи плазмиды по п 7, кодирующей молекулу РНК, которая может связываться с белковыми компонентами теломеразы млекопитающего с целью продуцирования активности теломеразы, способной добавлять последовательности повторяющихся единиц нуклеотидов ктеломерам 11 Способ продуцирования рекомбинантного фермента теломеразы, отличающийся тем, что указанный способ включает трансформирование эукариотной клетки-хозяина, которая экспрессирует белковые компоненты теломеразы с помощью рекомбинантного экспрессирующего вектора, кодирующего РНК-компонент по п 9, и культивирование указанных клеток-хозяев, трансформированных с помощью указанного вектора 12 Способ продуцирования рекомбинантного фермента теломеразы, отличающийся тем, что указанный способ включает трансформирование эукариотной клетки-хозяина, которая экспрессирует белковые компоненты теломеразы с помощью рекомбинантного экспрессирующего вектора, кодирующего РНК-компонент по п 10, и культивирование указанных клеток-хозяев, трансформированных с помощью указанного вектора 13 Способ идентификации возможных агентов, модулирующих теломеразу, отличающийся тем, что он включает проведение гетеродимеризации или анализа активности теломеразы, включающего (1) полинуклеотид, являющийся полинуклеоти дом, по существу идентичным РНК-компоненту теломеразы человека, и способный связываться с белком теломеразы человека, (2) по существу очищенный белок теломеразы человека и (3) агент, определение того, ингибируетли указанный агент гетеродимеризацию или теломеразную активность РНК теломеразы человека и белка теломеразы человека, идентификацию агентов, ингибирующих указанную гетеродимеризацию или активность теломеразы, в качестве возможных агентов, модулирующих теломеразу, которые ингибируют активность теломеразы 14 Способ ингибирования активности теломеразы в клетках человека, отличающийся тем, что он включает перенос в клетки экзогенного полинуклеотида, содержащего транскрипционную единицу, имеющую полинуклеотидную последовательность из по меньшей мере 25 последовательно расположенных нуклеотидов, которая по существу идентична последовательности РНК теломеразы человека, оперебельно связанной с гетерологической транскрипционной регуляторной последовательностью, которая способствует транскрипции операбельно связанных полинуклеотидов в указанных клетках 15 Способ ингибирования активности теломеразы в клетках человека, отличающийся тем, что он включает перенос в клетки экзогенного полинуклеотида, содержащего транскрипционную единицу, имеющую полинуклеотидную последовательность из по меньшей мере 25 последовательно расположенных нуклеотидов, которая по существу комплементарна последовательности РНК теломеразы человека, оперебельно связанной с гетерологической транскрипционной регуляторной последовательностью, которая способствует транскрипции операбельно связанных полинуклеотидов в указанных клетках 16 Способ детектирования наличия неопластического состояния у пациента, отличающийся тем, что он включает следующие операции выделение клеточного образца, взятого у пациента, детектирование РНК-компонента теломеразы человека в клеточном образце для определения диагностического значения, сравнение диагностического значения со стандартным значением экспрессии ДНК-компонента теломеразы человека в ненеопластических клетках того же типа, что и в клеточном образце, диагностику наличия неопластического состояния, при котором диагностическое значение значительно превышает стандартное значение, указывая таким образом на наличие нео пласти чес ко го состояния 17 Способ определения наличия РНКкомпонента теломеразы млекопитающего в клетке или клеточном образце, отличающийся тем, что он выбран из группы проведение амплификации с помощью праимера РНК-компонента теломеразы, проведение гибридизации с помощью полинуклеотида РНК-компонента теломеразы 18 Способ определения наличия РНК-компонента теломеразы млекопитающего в клетке или клеточном образце, отличающийся тем, что он выбран из группы проведение амплификации с помощью комплементарной последовательности к праймеру РНК-компонента теломеразы, проведе 5 47407 ниє гибридизации с помощью полинуклеотида, компонента теломеразы комплементарного к полинуклеотиду РНК Настоящее изобретение относится к теломеразе человека, рибонуклеопротеидовому ферменту, включенному в синтез ДНКтеломера человека Изобретение обеспечивает создание способов и составов, относящихся к областям молекулярной биологии, химии, фармакологии, а также медицинской и диагностической техники ДНК на концах или в теломерах хромосом эукариотов обычно состоит из последовательно расположенных повторных простых последовательностей Теломераза представляет собой рибонуклеопротеидный фермент, который синтезирует одну нить теломерической ДНК, используя в качестве матрицы последовательность, содержащуюся внутри РНК-компонента этого фермента См Blackburn, 1992, Annu Rev Biochem 61 113129 в качестве ссылки к описанию данного изобретения До настоящего времени в научной литературе не рассматривался РНК-компонент теломеразы человека, хотя известно, что теломераза человека синтезирует теломерические единицы повторов с последовательностью 5'-TTAGGG-3' См Мопп, 1989, Cell 59 521-529, и Мопп, 1991, Nature 353 454-456 в качестве ссылки Указанный факт не является достаточным для того, чтобы обеспечить выделение и идентификацию оставшейся части нуклеотидной последовательности РНКкомпонента теломеразы человека РНК-компонент теломеразных ферментов Saccharomyces cerevisiae, определенных видов Tetrahymena, a также РНК-компонент других реснитчатых, например Euplotes и Glaucoma, были секвенированы и описаны в научной литературе См Singer и Gottschhng, 21 Oct 1994, Science 266 404-409, Lmgner и др , 1994, Genes & Development 8 19841988, Greider и Blackburn, 1989, Nature 337 331337, Romero и Blackburn, 1991, Cell 67 343-353, и Shippen-Lentz и Blackburn, 1990, Science 247 546552, приведенные здесь в качестве ссылки В отличие от ферментов теломеразы человека ферменты теломеразы указанных реснитчатых синтезируют единицы теломерических повторов Существует настоятельная потребность в большем количестве информации, касающейся теломеразы человека Несмотря на кажущуюся простую природу структурных единиц теломерической ДНК ученым уже давно известно, что теломеры играют важную биологическую роль в сохранении структуры и функции хромосом Не так давно ученые предположили, что потеря теломерической ДНК может действовать как пусковой механизм старения клеток и что регуляция теломеразы может играть важную биологическую роль См Harley, 1991, Mutation Research 256 271-282, используемый здесь в качестве ссылки Были также описаны способы определения активности теломеразы и идентификации соединений, которые регулируют или влияют на актив ность теломеразы, наряду с другими методами, предназначенными для терапии и диагностики старения и иммортализации клеток путем управления длиной теломера и активностью теломеразы См патенты РСТ, № публикации 95/13381, опубликованный 18 мая 1995, 95/13382, опубликованный 18 мая 1995, и 93/23572, опубликованный 25 ноября 1993 г, и регистрационные номера заявок к патентам США номер не присвоен (изобретатели С Harley, N Kim, S Weinnch), поданная 7 июня 1995 г, 08/315214, поданная 28 сентября 1994 г, 08/288501, поданная 10 августа 1994 г, 08/014838, поданная 8 февраля 1993 г, 08/153051 и 08/151477, каждая из которых подана 12 ноября 1993 г, 08/060952, поданная 13 мая 1993 г, 08/038766, поданная 24 марта 1993 г, и 07/882438, поданная 13 мая 1992 г Указанные документы используются в данном описании в качестве ссылок Значительные достижения и новые возможности в области теломеразоопосредованных методов терапии, исследований теломеразы и методов скрининга можно было бы осуществить, если бы нуклеиновая кислота, содержащая РНК-компонент и/или кодирующая белковые компоненты теломеразы, имелась в чистом виде или в виде, поддающемся выделению, и были бы известны нуклеотидные последовательности таких нуклеиновых кислот Настоящее изобретение обеспечивает удовлетворение этих и других потребностей и позволяет осуществить вышеуказанные усовершенствования и возможности Первым аспектом настоящего изобретения является то, что оно обеспечивает получение РНК-компонента, а также гена РНК-компонента, теломеразы человека практически в чистом виде, а также нуклеиновых кислот, содержащих все или по меньшей мере полезную часть нуклеотидной последовательности РНК-компонента теломеразы человека Настоящее изобретение также обеспечивает получение нуклеиновых кислот, содержащих РНК-компонент, из других видов, нуклеиновые кислоты которых в основном гомологичны РНК-компоненту теломеразы человека, включая, но не ограничиваясь этим, РНК-компоненты млекопитающих, например приматов В число других нуклеиновых кислот, используемых в изобретении, входят нуклеиновые кислоты с последовательностями, комплементарными РНКкомпоненту, нуклеиновые кислоты с последовательностями, родственными, но отличающимися от нуклеотидных последовательностей РНКкомпонента, и которые взаимодействуют с РНКкомпонентом или геном РНК-компонента или белковыми компонентами теломеразы человека необходимым образом, и нуклеиновые кислоты, которые не имеют значительную гомологию последовательностей или комплементарность РНК-компоненту или гену РНК-компонента, но 47407 действуют на РНК-компонент желательным и необходимым образом Как более полно описано ниже, нуклеиновые кислоты согласно изобретения включают как молекулы ДНК, так и молекулы РНК, а также модифицированные аналоги каждой из них и служат различным необходимым целям Одним типом полезной нуклеиновой кислоты согласно изобретения является антисмысловой олигонуклеотид, олигонуклеотид, формирующий тройную спираль, или другой олигонуклеотид или миметический олигонуклеотид (например, антисмысловая РНК-пептидная нуклеиновая кислота/полиамидная нуклеиновая кислота), который может быть использован in vitro или in vivo с целью подавления активности теломеразы человека Такие олигонуклеотиды могут блокировать активность теломеразы различными путями, включая такие пути, как предотвращение транскрипции гена теломеразы (например, путем формирования тройной спирали) или за счет связывания с РНК-компонентом теломеразы таким образом, что это препятствует сборке функциональной рибонуклеопротеидовой теломеразы или предотвращает использование РНК-компонента в качестве матрицы при синтезе теломерической ДНК после его сборки в теломеразо-ферментный комплекс Обычно, в зависимости от способа действия, указанные олигонуклеотиды согласно изобретения содержат специфическую последовательность, состоящую из приблизительно 10 до приблизительно 25 200 или более нуклеотидов, которая либо идентична, либо комплементарна специфической последовательности нуклеотидов в РНК-компоненте теломеразы или в гене РНКкомпонента теломеразы В примере осуществления изобретения обеспечивается получение антисмысловых полинуклеотидов, комплементарных полинуклеотидным последовательностям РНК-компонента теломеразы, обычно комплементарных полинуклеотидным последовательностям, которые в основном идентичны природной генной последовательности РНК-компонента теломеразы млекопитающих Подобные антисмысловые полинуклеотиды используются для ингибирования транскрипции и/или стабильности, и/или функциональности видов РНК-компонента теломеразы и таким образом воздействия на уменьшение количества соответствующей активности теломеразы в клетке (например, в нео пласти чес кой клетке пациента) Такие антисмысловые полинуклеотиды могут функционировать в качестве теломеразомодулирующих агентов путем ингибирования образования функционального (каталитически активного и обладающего высокой степенью привязанности) холофермента теломеразы, требуемого для правильной репликации и репарации теломера в клетке Антисмысловые полинуклеотиды могут комбинироваться с другими антинеопластическими терапевтическими модальностями, такими как ионизирующая радиация или хемотерапия (например, с повреждающим ДНК агентом, таким как блеомицин, цисплатин, азотистый иприт, доксирубицин, нуклеотидные аналоги и т д ) Антисмысловые полинуклеотиды могут способствовать гибели клеток в чувствительных клетках (например, в 8 реплицирующих клетках, в которых для репарации или репликации ДНК необходима активность теломеразы) Антисмысловые полинуклеотиды в основном идентичны по меньшей мере 25 смежным нуклеотидам комплементарной последовательности описываемой здесь последовательности РНК теломеразы млекопитающих Антисмысловые полинуклеотиды обычно являются смысловой ДНК, смысловой РНК, полинуклеотидами с метилфосфонатным остовом, полинуклеотидами с фосфоромеркаптидным остовом, полинуклеотидами со смешанным остовом, полиамидными нуклеиновыми кислотами и аналогичными антисмысловыми структурами, известными в данной области В одном аспекте данного изобретения антисмысловой полинуклеотид применяется для ингибирования транскрипции и/или активности РНК-компонента теломеразы и активности теломеразы в клетке, например, в поддающейся репликации клетке человека В примере осуществления изобретения обеспечивается получение полинуклеотид а с ошибочным спариванием матриц, причем указанный полинуклеотид имеет последовательность, в основном идентичную РНК-компоненту теломеразы млекопитающего и содержит матричную последовательность с теломерическими повторами, которая имеет по меньшей мере одно ошибочное спаривание оснований относительно, но в остальном комплементарна, последовательности повторов теломеразы человека 5'-TTAGGG-3' Полинуклеотид с ошибочным спариванием матриц обычно содержит одно ошибочное спаривание нуклеотидов в природной матричной последовательности и может содержать два ошибочных спаривания нуклеотидов в матричной последовательности либо в виде соседних ошибочно спаренных нуклеотидов, либо в которой ошибочно спаренные нуклеотиды разделены одним или более спаренными (комплементарными) нуклеотидами Полинуклеотиды с ошибочным спариванием матриц согласно изобретения обычно способны проявлять активность теломеразы в сочетании с полипептидным компонентом теломеразы человека, осуществляя таким образом ошибочное включение на выбранных позициях(ошибочно спаренных) нуклеотидов в повторяющейся последовательности теломеразы человека, являющейся результатом репликации теломерических повторов, репарации и/или присоединения, генерируя таким образом теломеры на основе постоянного присутствия РНК-компонента мутированной смысловой теломеразы для существенной репликации и поддержания длины теломера Другим типом подходящей нуклеиновой кислоты согласно изобретения является рибоцим, способный специфически расщеплять РНКкомпонент теломеразы человека, обеспечивая инактивацию фермента Еще одним используемым согласно изобретения типом нуклеиновой кислоты является зонд или праймер, который специфически связывается с РНК-компонентом теломеразы человека и таким образом может быть использован, например, для детектирования наличия теломеразы в образце В конечном счете используемые согласно изобретения нуклеиновые 47407 кислоты включают рекомбинантные экспрессирующие плазмиды, предназначенные для продуцирования нуклеиновых кислот согласно изобретения Одним из особо полезных типов такой плазмиды является плазмида, используемая для генотерапии человека Существует много разновидностей плазмид согласно изобретения для генотерапии человека, включая не только те плазмиды, которые кодируют антисмысловые олигонуклеотиды или рибоцимы, но и плазмиды, которые уравляют экспрессией РНК-компонента теломеразы человека или делетированного или измененного другим образом (мутированного) варианта РНК-компонента теломеразы человека (или других видов, последовательности РНКкомпонента которых в основном гомологичны РНК-компоненту человека) или гена РНКкомпонента теломеразы человека В варианте воплощения изобретения полинуклеотид, имеющий участок, комплементарный РНК-компоненту теломеразы млекопитающих, достаточный для специфической гибридизации в физиологических условиях, разрезается по ковалентной связи дополнительного химического заместителя либо в период, либо после синтеза полинуклеотидов, формируя таким образом разрезанный полинуклеотид, способный к специфической гибридизации с указанным РНКкомпонентом теломеразы Разрезанный полинуклеотид может локализоваться в эндогенной теломеразе, имеющей указанный РНК-компонент, в котором указанный разрезанный полинуклеотид приводит к изменению или химической модификации РНК-компонента и/или белкового компонента теломеразы, и таким образом модифицирует обычно путем восстановления ферментативную активность теломеразы В примере осуществления изобретения обеспечивается создание полинуклеотидов, которые пригодны для диагностики болезней, связанных с отклоняющимся от нормы количеством и/или структурой РНК-компонента теломеразы Полинуклеотидные зонды, содержащие последовательности, которые в основном идентичны или комплементарны нуклеотидной последовательности РНК-компонента теломеразы млекопитающих, могут быть использованы для диагностики заболеваний (например, неоплазии или преднеоплазии) путем детектирования большого количества РНК-компонента теломеразы и/или структурных изменений РНК-компонента теломеразы (например, усечение, изменения последовательностей, делеции или инсерции и т д ) , и/или реаранжировки или амплификации гена РНК-компонента теломеразы в клетках, полученных от пациента, или детектирования патогномоничного аллеля РНКкомпонента теломеразы млекопитающего (например, посредством анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов или специфического для аллеля ЦПР (цепная полимеразная реакция )анализа) Детектирование часто может осуществляться путем гибридизации in situ, используя меченый (например, 3 Р, 35 S, , 14 C, 3 Н, флуоресцентный, биотинилированный, дигоксигенинилированный) антисмысловой полинуклеотид, комплементарный РНК-компоненту 10 теломеразы млекопитающих, хотя могут быть использованы нозерн-блоттинг, дот-блоттинг или гибридизация в растворе на объеме РНК или поли А+ РНК, выделенной из образца клетки, как может быть использована и амплификация ЦПР или ЦАР с применением праймеров, специфических к РНКкомпоненту теломеразы Клетки, которые содержат измененное количество (обычно значительно увеличенное) РНК-компонента теломеразы по сравнению с ненеопластическими клетками того же типа (ов) клеток, идентифицируются как возможно пораженные клетки, например, пред неопластические или явно неопластические, и могут быть идентифицированы как клетки с метастатическим потенциалом Аналогично, детектирование патогномоничных реаранжировок или амплификации локуса РНК-компонента теломеразы или тесно связанных лоций в образце клетки указывает на наличие патологического состояния или на предрасположение к развитию патологического состояния (например, рака, генетического заболевания) Полинуклеотидные зонды РНК-компонента теломеразы также используются для судебной идентификации личности, например для анализа на отцовство или для идентификации подозреваемых уголовных личностей или неизвестных трупов Во втором аспекте, изобретение предполагает создание способов лечения состояния, связанного с активностью теломеразы внутри клетки или группы клеток за счет контактирования клетки (ок) с терапевтически эффективным количеством агента, который изменяет активность теломеразы в этой клетке Такие агенты включают нуклеиновые кислоты, кодирующие РНК-компонент теломеразы, олигонуклеотиды, формирующие тройную спираль, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, плазмиды и другие генотерапевтические векторы (например, аденовирусные векторы, аденосвязанные вирусные векторы и т д ) для генотерапии человека путем экспрессии РНК-компонента теломеразы, антисмысловой РНК к РНКкомпоненту теломеразы или РНК-компоненту теломеразы с ошибочным спариванием, как это описано выше В аспекте, взаимосвязанным с предшествующим, изобретение обеспечивает получение фармацевтических составов, содержащих указанные терапевтические агенты вместе с фармацевтически приемлемым носителем или солью, которые могут включать каплю в липофекционном комплексе, липосоме или иммунолипосоме для целевой вставки терапевтического агента Изобретение также обеспечивает получение комбинации таких теломеразоопосредованных терапевтических агентов с другими фармацевтическими препаратами, такими как антинеопластические агенты или другие цитотоксические или цитостатические агенты, противогрибковые агенты (например, для лечения больных СПИДом), нуклеотиды, нуклеозиды и их аналоги, а также другие фармацевтические агенты, пригодгые для лечения болезненных состояний, таких как неолплазия, гиперплазия, ВИЧ- инфекция/СПИД и связанные с ними патологии, а также другие заболевания, характеризуемые анормальным 12 11 47407 теломерическим метаболизмом Способы могут ческое старение клеток или другие медицинские включать использование разрезанного полинуксостояния, связанные с фукцией теломеразы, и леотида, способного специфически гибридизироболее специфические состояния и заболевания, ваться с РНК-компонентом теломеразы в теломекоторые предполагают изменения в структуре или разе млекопитающего, в которой разрезанный избыток РНК-компонента теломеразы или генной полинуклеотид вводится в клетки млекопитающепоследовательности, или которые связаны с алго, обладающие активностью теломеразы, и полелем РНК-компонента патогномоничной теломедавляет активность теломеразы за счет локализаразы, что может быть обнаружено с помощью поции в РНК-компоненте теломеразы и инактивации лиморфизма рестрикционных фрагментов и/или или ингибирования активности теломеразы специфической к аллелю ЦПР или другим подходящим для этой цели способом Обычно указанИзобретение также обеспечивает получение ный способ используется для диагностики заболетерапевтических агентов, которые ингибируют вания (например, неоплазии) у человека, при этом неоплазию или апоптоз за счет модуляции функдиагностический анализ (например, определение ции теломеразы посредством ингибирования или количества и/или структуры РНК-компонента теусиления образования РНК-компонента теломераломеразы) используется для определения того, зы, такие агенты могут использоваться в качестве имеется ли заранее обусловленная патагномофармацевтических препаратов Указанные фарничная концентрация или структура РНКмацевтические препараты используются для лекомпонента теломеразы в клетках биологической чения различных заболеваний людей и животных, пробы, взятой у пациента, если анализ показыванапример, неоплазии, гиперплазии, нейродегенеет наличие патогномоничного количества РНКративных болезней, старения, СПИДа, грибковой компонента теломеразы, выходящего за пределы инфекции и т д В примере осуществления изонормального, диапазона (например, за пределы бретения агент содержит генотерапевтический заранее определенной патогномоничной конценвектор, способный транскрибировать последоватрации), пациент диагностируется как имеющий тельность РНК-компонента теломеразы или ее болезненное состояние или предрасположенность комплемент или, в ином случае, ферментативно к болезни неактивный РНК-компонент теломеразы, который может с таким же успехом ингибировать образоВ четвертом аспекте настоящее изобретение вание функционального холоэнзима теломеразы обеспечивает получение препаратов рекомбиВ третьем аспекте изобретение обеспечивает создание диагностических методов определения уровня, количества или наличия РНК-компонента теломеразы человека, теломеразы или активности теломеразы в клетке, клеточной популяции, образце ткани или экстракта любого из вышеуказанного В аспекте, взаимосвязанном с предшествующим, настоящее изобретение позволяет получить необходимые реагенты для таких способов (включая праймеры и зонды, упомянутые выше), произвольно упакованные в кит-форму вместе с инструкциями для использования кита, при осуществлении способа диагностики Настоящее изобретение обеспечивает создание способа диагностики заболевания (например, неоплазии) у человека, при котором диагностический анализ (например, полинуклеотидная гибридизация in situ фиксированных клеток с помощью меченого зонда РНК-компонента теломеразы, которая специфически связывает РНК-компонент теломеразы человека или генные последовательности) используется для определения наличия в биологической пробе пациента заранее определенной патогномоничной концентрации РНКкомпонента теломеразы, если анализ показывает, что концентрация РНК-компонента теломеразы выходит из диапазона, соответствующего нормальной концентрации (например, находится за пределами заранее определенной патогномоничной концентрации), ставится диагноз, что пациент имеет болезненное состояние или предрасположенность к нему В варианте выполнения изобретения полинуклеотиды согласно изобретения используются для диагностики патологических состояний или генетических заболеваний, включающих неоплазию, гиперплазию, раннее или аномальное физиологи нантной теломеразн и создание способов для производства таких препаратов Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает получение рекомбинантной теломеразы человека, которая содержит белковые компоненты теломеразы человека, а также белковые комспоненты теломеразы от такого вида млекопитающих, где РНКкомпонент в значительной степени гомологичен РНК-компоненту теломеразы человека в связи с рекомбинантным РНК-компонентом, созданным согласно изобретения Молекулы такого рекомбинантного РНК-компонента согласно изобретения представляют собой молекулы, которые отличаются от молекул природного РНК-компонента одной или более заменами основания, делециями, терминальными добавками и/или инсерциями, а также молекулы РНК-компонента, идентичные молекуле природного РНК-компонента, которая продуцируется в рекомбинантных клеткаххозяевах Способ получения таких молекул рекомбинантной теломеразы включает трансформирование эукариотной клетки-хозяина, которая экспрессирует белковые компоненты теломеразы с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, кодирующим молекулы РНК-компонента согласно изобретения, и культивирование указанных клеток-хозяев, трансформированных указанным вектором в условиях, при которых белковый компонент теломеразы и РНК-компонент теломеразы экспрессируются и собираются в виде активной молекулы теломеразы, способной к присоединению последовательности (необязательно той же последовательности, которая присоединена природной теломеразой) к теломерам хромосомной ДНК В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает создание способов очистки белко 13 47407 14 вых компонентов теломеразы человека, а также увеличение степени нековалентного связывания белковых компонентов теломеразы из вида млемежду РНК- и белковым компонентами теломеракопитающих от РНК-компонента, который в значизы, определяются таким образом в качестве возтельной мере гомологичен РНК-компоненту теломожных агентов модулирования теломеразы Отмеразы человека Настоящее изобретение также носительная величина нековалентного обеспечивает создание способов выделения и связывания может быть определена любым подидентификации нуклеиновых кислот, кодирующих ходящим способом, включая определение специтакие белковые компоненты В аспекте, взаимофической связывающей аффинности, например, связанном с вышеукаазнным, настоящее изобрепосредством конкурентного связывания, опредетение обеспечивает получение очищенной телоление каталитической активности теломеразы на меразы человека и очищенной теломеразы вида подходящей матрице теломерических повторов млекопитающего с РНК-компонентом, в значиили с помощью другого подходящего анализа тельной мере гомологичным РНК-компоненту тефункционального нековалентного взаимодействия ломеразы человека, а также очищенных нуклеимежду РНК- и белковым компонентами теломерановых кислот, кодирующих один или более зы млекопитающего, например, изменение подкомпонентов таких препаратов теломеразы Навижности в геле, или анализа АЭФП (анализ элекстоящее изобретение также обеспечивает полутрофоретической подвижности) чение фармацевтических составов, содержащих в В примере осуществления анализа нековакачестве активного ингредиента белковые комполентного связывания для детектирования возненты теломеразы или нуклеиновую кислоту, коможных агентов, модулирующих теломеразу, один дирующую или взаимодействующую с нуклеиноили оба компонента (РНК-или белковый) метят вой кислотой, которая кодирует белковый подходящей детектируемой меткой и нековаленткомпонент теломеразы ное связывание определяют раздельно в присутствии и в отсутствии агента, выбранного из бибВ шестом аспекте настоящее изобретение лиотеки или банка агентов Определение обеспечивает создание способов идентификации нековалентного связывания включает измерение агентов, которые модулируют (т е ингибируют, степени связывания меченого компонента телоусиливают или изменяют специфичность) активмеразы (РНК-или белкового компонента) со своим ность теломеразы млекопитающего Такие модуродственным компонентом теломеразы (белковым лирующие теломеразу агенты часто представляют компонентом или РНК-компонентом соответственсобой небольшие молекулы (например, менее, но) независимо от того, метится ли указанный чем приблизительно 3000 Дальтон) и могут исродственный компонент теломеразы отдельно или пользоваться для модификации активности телоне метится, например, с помощью отлавливания меразы in vitro и in vivo , чаще всего для получе(например, иммобилизацией) связанных комплекния терапевтического эффекта, и применяются в сов, содержащих указанный меченый компонент качестве лабораторных реагентов и/или фармателомеразы и указанный родственный компонент цевтических препаратов теломеразы, и отделение (например, путем выВ примере осуществления изобретения премывания) несвязанного меченого компонента тедусматривается создание способов идентификаломеразы из указанных связанных комплексов, ции возможных агентов, имеющихся в банке или генерируя таким образом отделенную связанную библиотеке, которые модулируют активность тефракцию и детектируя связанные комплексы в ломеразы путем модуляции нековалентной связи отделенной связанной фракции путем определеРНК-компонента теломеразы млекопитающего с ния наличия детектируемой метки Агенты, котобелковым компонентом теломеразы РНКрые продуцируют статистически значимое уменькомпонент теломеразы может быть продуцирован шение или увеличение нековалентного из рекомбинантнои матрицы в клетке-хозяине или связывания РНК- и белкового компонентов телопри необходимости химически синтезирован меразы, идентифицируются таким образом в каОбычно белковый компонент теломеразы млекочестве возможных модулирующих теломеразу питающего, например, компонент, который может агентов Агенты, которые уменьшают нековалентбыть очищен от клеток, экспрессирующих теломеное связывание, являются возможными ингибиторазу, и у которого может быть удален природный рами (или антагонистами) теломеразы, в то время РНК-компонент теломеразы (например, посредсткак агенты, увеличивающие нековалентное связывом обработки РНКазой), вводят в контакт с РНКвание компонентов теломеразы, являются возкомпонентом теломеразы млекопитающего в подможными агонистами теломеразы ходящих условиях водного раствора с целью обеспечения нековалентной связи между РНК - и В примере осуществления изобретения возбелковыми компонентами в отсутствии присоедиможные модулирующие теломеразу агенты иденненного агента(т е при управляемой реакции святифицируются по их способности осуществлять зывания) Степень нековалентного взаимодейстстатистически значимое увеличение или уменьвия между РНК-компонентом теломеразы и шение ферментативной активности теломеразы белковым компонентом в присутствии одного или млекопитающего, содержащей очищенный белкоболее агентов, выбранных из библиотеки или банвый компонент теломеразы и РНК-компонент тека агентов, сравнивают со степенью нековалентломеразы ного взаимодействия в контролируемой реакции В примере осуществления изобретения возсвязывания, содержащей РНК- и белковый компоможные модулирующие теломеразу агенты иденненты теломеразы и не имеющей агента(ов), агентифицируют по их способоности осуществлять ты, которые продуцируют статистически значимое статистически значимое уменьшение или увели 15 47407 16 чение в транскрипции репортернои полинуклеолеотида в условиях анализа теломера, агент тидной последовательности (например, в гене обычно добавляют к указанному составу для бета-галактозидазы, гене люциферазы, гене оценки нековалентной связи и/или активности теHPRT), операбельно связанной странскрипциальломеразы по сравнению с контрольным составом, ной регуляторной последовательностью гена РНКв котором указанный агент отсутствует компонента теломеразы млекопитающего, преВ седьмом аспекте изобретение также предуимущественно гена РНК-компонента теломеразы сматривает получение нулевых аллелей генов человека, в метаболически активной клетке млеРНК-компонента теломеразы млекопитающего, копитающего В одном из вариантов эндогенный например такого, который продуцируют путем наген РНК-компонента теломеразы в клетке млекоцеливания гомологичного гена гетерологичного питающего совмещен с гомологичной целевой полинуклеотида в ген РНК-компонента теломераконструкцией для размещения репортернои полизы млекопитающего для функциональной инактинуклеотидной последовательности в операбельвации гена РНК-компонента теломеразы Изобреной связи со стоящей выше транскрипционной тение также обеспечивает создание модельных регуляторной последовательностью (например, животных, кроме человека, содержащих нулевой промотором) эндогенного гена РНК-компонента аллель РНК-компонента теломеразы и, в качестве теломеразы в хромосомном локусе эндогенного варианта, создание модельных животных, кроме гена В альтернативном варианте экзогенный почеловека, гомозиготных для нулевых аллелей линуклеотид, содержащий репортерный полинукРНК-компонента теломеразы и у которых практилеотид, операбельно связан с областью регулячески отсутствует эндогенная активность теломеции транскрипции гена РНК-компонента разы, что обусловлено отсутствием эндогенного теломеразы млекопитающего (например, с промоРНК-компонента теломеразы Такие модельные тором и со стоящими выше сайтами связывания животные используют в качестве коммерческих транскрипционного фактора), экзогенный полиреагентов для токсилогического скрининга, для нуклеотид переносят в клетку млекопитающего, в продажи в научно-исследовательские фармацевкоторой он может негомологично интегрироваться тические лаборатории с целью проведения иденв область хромосом и/или поддерживают или рептификации или исследования модулирующих телицируют в качестве эписомного полинуклеотида ломеразу агентов, в качестве домашних животных Агенты, которые продуцируют статистически знаи домашнего скота, помимо других целей чимую модуляцию транскрипции репортерного В восьмом аспекте изобретение предусматриполинуклеотида в клетках, обрабатываемых агенвает создание способа иммортализации клеток том, идентифицируют таким образом как возможмлекопитающих, например, необходимых ферные модулирующие теломеразу млекопитающего ментируемых клеток в биореакторе или требуемоагенты го клеточного штамма, обладающего преимуществами в качестве исследовательского Составы для идентификации возможных мокоммерческого реагента Указанный способ вклюдулирующих теломеразу агентов обычно содерчает введение в клетку млекопитающего полинукжат (1) белковый компонент теломеразы млеколеотида, который экспрессирует функциональный питающего, например, такой компонент, который РНК-компонент теломеразы, способный формироможет быть очищен от клеток млекопитающего, вать функциональный фермент теломеразы в экспрессирующих теломеразу, преимущественно присутствии белкового компонента теломеразы клеток приматов (например, человека), и который обычно отделяется от связанного РНКДругие особенности и преимущества изобрекомпонента, если таковой имеется, посредством тения будут очевидны из последующего описания, обработки РНКазой или другой обработки, сорисунков, примеров и формулы изобретения вместимой с удалением РНК-компонента и сохраОпредиления нением способности белка к восстановлению акТермин "полинуклеотид РНК-компонента тетивности теломеразы в присутствии родственного ломеразы", используемый в данном описании, РНК-компонента теломеразы при подходящих обозначает полинуклеотид, состоящий из по условиях связывания, (2) РНК-компонент теломеменьшей мере 20 нуклеотидов, при этом полинукразы млекопитающего, предпочтительно РНКлеотид содержит сегмент из по меньшей мере 20 компонент человека, продуцированный путем нуклеотидов, которые по меньшей мере на 85% транскрипции рекомбинантного полинуклеотида в идентичны природной последовательности РНКклетке и (3) условия водного раствора (например, компонента теломеразы млекопитающего, обычно физиологические условия, условия определения РНК-компоненту теломеразы примата, например, теломеразы, т е анализ на присутствие теломеРНК-компоненту теломеразы человека или обезьразы) и необязательно (4) репортерный полинукяны Некоторые полинуклеотиды РНК-компонента леотид, содержащий по меньшей мере одну спотеломеразы, имеющие вариации последовательсобную к репликации или протяженную ностей по сравнению с природной последоваповторяющуюся последовательность теломеразы тельностью РНК-компонента теломеразы или ее млекопитающего, обычно комплементарную покомплементом, могут быть пригодными в качестве следовательности комплементарного матричного зондов гибридизации, праймеров ЦПР, умноженучастка повторяющейся последовательности теных копий ЦАР, ошибочно спаренных РНКломера указанного РНК- компонента и необязакомпонентов и т д тельно (5) нуклеотиды, подходящие для репликаТермин "соответствует " используется в данции и/или расширения указанной повторяющейся ном описании для обозначения того, что полинукпоследовательности (ей) репортерного полинуклеотидная последовательность гомологична (те 18 17 47407 идентична, не строго эволюционно связана) всей помощью поиска по методу подобия согласно или части эталонной полинуклеотидной последоPearson and Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci вательности или что полинуклеотидная последо( U S A ) 85 2444, посредством компьютеризировательность идентична эталонной полинуклеованных реализаций этих алгоритмов (GAP, тидной последовательности В отличие от BESTFIT, FASTA TFASTA в пакете программ мавышеуказанного, термин "комплементарный с" тематического обеспечения 7,0 генетических исиспользуется в данном описании для обозначения следований, разработанных группой компьютеритого, что комплементарная почследовательность зации, Висконсин, 575 Science Dr, Madison, Wl) гомологична всей или части эталонной полинукили посредством просмотра, и выбирается наилеотидной последовательности Например, нуклучшее выравнивание (те получение в результалеотидная последовательность "ТАТАС" соответте наивысшего процента гомологии над окном ствует эталонной последовательности "ТАТАС" и сравнения), достигаемое различными способами комплементарна эталонной последовательности Термин "идентичность последовательностей" "GTATA" означает, чтодве полинуклеотидные последвательнсти являются идентичными (те на основе Для описания взаимосвязи между двумя или нуклеотид к нуклеотиду) над окном сравнения более полинуклеотидами в последовательности Термин "процент идентичности последовательноиспользуются следующие термины "эталонная стей" означает, что указанный процент рассчитыпоследовательность", "окно сравнения", "идентичвают путем сравнения двух оптимально сцентриность последовательностей", "процент идентичнорованных над окном сравнения сти последовательностей" и "существенная иденпоследовательностей, определения количества тичность" Термин "эталонная позиций, в которых для обеих последовательнопоследовательность" относится к определенной стей находится идентичное основание нуклеинопоследовательности, используемой в качестве вой кислоты (например, А, Т, С, G, U или I ) с цеосновы для сравнения последовательностей, эталью выявления количества спаренных позиций, лонная последовательность может быть сокраделения количества спаренных позиций на общее щенным 'вариантом большей последовательночисло позиций в окне сравнения (т е размер окна) сти, например, сегментом полноразмерной и умножения полученного результата на 100, попоследовательности гена РНК-компонента телолучая таким образом искомый процент идентичмеразы В общем случае, длина эталонной послености Термин "существенная идентичность" в довательности составляет по меньшей мере 20 данном описании означает характеристику полинуклеотидов, часто эта длина составляет по нуклеотидной последовательности, в которой поменьшей мере 25 нуклеотидов, а часто по меньлинуклеотид содержит последовательность, шей мере 50 нуклеотидов Поскольку каждый из имеющую по меньшей мере 80-процентную идендвух полинуклеотидов может (1) содержать потичность последовательностей, преимущественно следовательность ( то есть, часть полной поли85-процентную идентичность, зачастую 89 95нуклеотидной последовательности), которая попроцентную идентичность, более типично - по добна последовательности указанных двух меньшей мере 99-процентную идентичность пополинуклеотидов, и (2) может кроме того содерследовательностей по сравнению с эталонной жать последовательность, которая дивергентна последовательностью над окном сравнения, сопоследовательности укаазнных двух полинуклеодержащим по меньшей мере 20 нуклеотидных тидов, сравнение последовательностей двух или позиций, чаще над окном, содержащим по меньболее полинуклеотидов обычно выполняется пушей мере 30 50 нуклеотидов, где процент идентем сравнения последовательностей укаазанных тичности последовательностей вычисляется пудвух полинуклеотидов над "окном сравнения" для тем сравнения эталонной последовательности с идентификации и сравнения локальных участков полинуклеотидной последовательностью, которая подобия последовательностей может включать делеции или вставки, составИспользуемый в данном описании термин "окляющих в целом 20% или менее от эталонной но сравнения" относится к концептуальному сегпоследовательности над окном сравнения Этаменту, состоящему из по меньшей мере 25 смежлонная последовательность может быть сокраных позиций нуклеотидов, где полинуклеотидную щенным вариантом большей последовательности, последовательность можно сравнить с эталонной например, сегментом полноразмерной последовапоследовательностью, содержащей по меньшей тельности гена РНК-компонента теломеразы, расмере 25 смежных нуклеотидов, и где часть полисматриваемой в данном описании нуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции Специфическая гибридизация определяется (т е разрывы) порядка 20 или менее процентов по как образование гибридов между полинуклеотисравнению с эталонной последовательностью дом зонда (например, пол и нуклеотид ом согласно (которая не содержит добавлений или делеции) изобретения, который может включать замены, для оптимального выравнивания указанных двух делецию и/или добавки) и специфическим мипоследовательностей Оптимальное выравнивашень-пол инуклеотидом (например, РНКние последовательностей для выравнивания окна компонентом теломеразы или последовательносравнения может быть осуществлено с помощью стью геномного гена, в котором зонд предпочтиалгоритма локальной гомологии по Smith и тельно гибридизируется со специфической мишеWaterman (1981) Adv Appl Math 2 482, с помонью, так что, например, единственная полоса, щью алгоритма выравнивания гомологии по соответствующая одному или более виду РНКNeedleman и Wunsch (1970) J Мої Biol 48 443, с компонента теломеразы (или специфически гид 19 47407 рализованного или процессированного вида РНКкомпонента теломеразы) может быть идентифицирована на нозерн-блоте РНК, полученной из подходящей клетки (например, соматической клетки, экспрессирующей РНК-компонент теломеразы) Полинуклеотиды согласно изобретения, которые специфически гибридизируются с РНКкомпонентом теломеразы млекопитающего или теломерическими последовательностями человека, могут быть получены на основе данных последовательности, полученной здесь в соответствии со способами и термодинамическими принципами, известными в данной области и описанными в Mamatis et al , Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed, (1989), Cold Spring Harbor, NY and Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc , San Diego, CA, которые используются в данном описании в качестве ссылок Используемый в данном описании термин "подходящие условия связывания" относится к условиям водного раствора, при которых РНКкомпонент теломеразы связывается с родственным белковым компонентом и образует ферментативно-активный холофермент теломеразы, способный к каталитической репликации, репарации и/или добавлению теломерических повторов из подходящей матрицы, содержащей теломерические повторы, такая матрица с теломерическими повторами может как присутствовать, так и отсутствовать Часто подходящими условиями связывания могут быть физиологические условия Используемый в данном описании термин "физиологические условия" относится к температуре, рН, ионной силе, вязкости и подобным им биохимическим параметрам, характеризующим состояние живого организма и/или обычно присущим внутриклеточному состоянию в живой культивированной клетке млекопитающего, особенно условия, присущие ядру указанной клетки млекопитающего Например, внутриядерные или цитопластические условия в клетке млекопитающего, выращенной в типичных лабораторных условиях культивирования, являются физиологическими условиями Подходящими условиями осуществления реакции in vitro для получения транскрипционных коктейлей in vitro являются обычные физиологические условия, что может быть подтверждено на ряде примеров известных в данной области ядерных экстрактов В общем случае, физиологические условия in vitro могут предусматривать наличие 50 200 мМ NaCI или KCI, рН 6,5 8,5, 20 45°С и 0,001 10 мМ двухвалентного катиона (например, Мд++, Са++), предпочтительно 150 мМ NaCI или Kcl, рН 7,2 7,6, 5 мМ двухвалентного катиона, и часто включает 0,01 1,0% неспецифического белка ( например, бычьего сывороточного альбумина, БСА) Зачастую может присутствовать неионный детергент (Tween, NP-40, Triton X-100), обычно приблизительно от 0,001 до 2%, в типовом варианте 0,05 0,2% в объемном отношении Определенные водные условия могут быть выбраны специалистом в соответствии с обычными методами В общем случае, могут быть выполнены следующие условия водного раствора, имеющего 20 буферные свойства 10 250 мМ NaCI, 5 50 мМ трис НС1, рН 5 8, с необязательной добавкой двухвалентного катиона(ов) и/или хелатов металлов, и/или неионных детергентов, и/или мембранных фракций, и/или антивспенивательных агентов, и/или сцинциллятов Используемые в данном описании термины "метка" или "меченый" относятся к введению детектируемого маркера, например, с помощью введения радиомеченой аминокислоты или присоединения к полипептиду биотиниловых частей, которые могут быть продетектированы с помощью маркированного авидина (например, стрептовидина, содержащего флуоресцирующий маркер или ферментативную активность, которые могут быть обнаружены оптическими или калориметрическими методами В данной области известны и могут быть использованы различные способы введения меток в полипептиды и гликопротеиды Примерами меток для полипептидов могут служить, но не ограничиваясь ими, следующие метки радиоизотопы (например, 3 Н, 14С, S, I, 1311), флуоресцирующие метки (например, ФИТЦ, радомин, лантанидные фосфаты), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена обыкновенного, бета- галактоз ид аза, люцифераза, щелочная фосфатаза), биотиниловые группы, заранее определенные полипептидные эпитопы, узнаваемые по вторичному репортеру (например, пары последовательностей "лейциновой застежки", связывающие сайты вторичных антител, полипептидактиватор транскрипции, домены связывания металлов, эпитопные метки) В некоторых вариантах метки прикрепляются с помощью спейсерных плеч различной длины для уменьшения потенциального стерического несоответствия Используемый в данном описании термин "статистически значимый" означает результат (т е выборку данных опыта), который в общем случае по меньшей мере на два стандартных отклонения ниже или выше среднего значения по меньшей мере трех отдельных результатов контрольной выборки данных и/или который является статистически значимым по определению t-теста Стьюдента или другого допускаемого в данной области измерения статистической значимости Используемые в данном описании термины "патогномоническая концентрация", "патогномоническое количество" и "патогномонический паттерн гибридизации" относятся к концентрации, количеству или паттерну локализации, соответственно, РНК-компонента теломеразы в образце, которые показывают наличие патологического (например, нео пласти чес ко го, старения, иммунодефицитного, нейродегенеративного, воспалительного и т д) состояния или предрасположения к развитию неопластического заболевания, такого как карциома, саркома или лейкоз Патогномоническое количество - это количество РНК-компонента теломеразы в клетке или клеточной образце, которое выходит за пределы диапазона нормальных клинических значений, которые устанавливаются посредством ожидаемых и/или ретроспективных статистических клинических исследований В общем случае, пациент с неопластическим заболеванием (например, карциомой, саркомой или лей 22 21 47407 козом) имеет количество РНК-компонента в клетке эндогенного гена, обычно экспрессируется в осили образце ткани, выходящее за пределы диапановном в тот же самый временной и клеточный зона концентраций, характерных для нормальных типоспецифический паттерн, как и в природном здоровых людей, обычно патогномоническая конгене центрация отличается по меньшей мере на приИспользуемый в данном описании термин близительно одно стандартное отклонение от "транскрипционная единица" или "транскрипционсредней нормальной величины, более типично ный комплекс" относятся к полинуклеотидной поприблизительно на два стандартных отклонения следовательности, которая содержит структурный или более от средней нормальной величины Одген (экзоны), цис-действующий связанный промонако практически все клинические диагностичетор и другие цис- действующие последовательноские тесты дают некоторый процент ложных пости, требуемые для осуществления эффективной ложительных и отрицательных результатов транскрипции структурных последовательностей, Чувствительность и избирательность диагностидистальные регуляторные элементы, необходического исследования должны быть достаточнымые для требуемой тканевоспецифической и эвоми, чтобы удовлетворить диагностическую цель и люционной транскрипции структурных последовалюбые релевантные регуляторные требования В тельностей, и дополнительные цисобщем случае, способы диагностики согласно последовательности, имеющие важное значение изобретения используются для идентификации для эффективной транскрипции и трансляции (налиц, возможно подверженных заболеванию, обеспример, сайт полиаденилирования, последовапечивая получение дополнительного параметра тельности, управляющие стабильностью мРНК) при различных способах диагностики заболеваИспользуемый в данном описании термин ния, выполняемых компетентным специалистом "транскрипционная модуляция относится к способности либо усиления транскрипции, либо ингиИспользуемый здесь термин "аллель болезни" бирования транскрипции структурной последоваотносится к аллелю гена, который способен протельности, связанной в цис, такое усиление или дуцировать поддающееся распознаванию заболеингибирование может зависеть от появления спевание Аллель болезни может быть доминантным цифического события, например, стимуляции инили рецессивным и может приводить к заболевадуктором и/или может обнаруживаться только в нию непосредственно или в сочетании со специопределенных типах клеток фическим генетическим фоном или предшествующим патологическим состоянием Аллель Используемый в данном описании термин "реболезни может присутствовать в генофонде или гуляторный участок транскрипции" относится к генерироваться вновь у человека за счет соматипоследовательности ДНК, содержащей функциоческой мутации нальный промотор и любые связанные элементы транскрипции (например, энхансер, рамку ССААТ, Используемый здесь термин "антинеопластирамку ТАТА, сайт SP1 и т д ) , которые имеют суческий агент" относится к агентам, которые облащественное значение для транскрипции полинукдают функциональным свойством ингибирования леотидной последовательности, операбельно свясоздания млм развития неоплазмы у человека, занной с регуляторным участком транскрипции зачастую включая ингибирование метастазов или метастатического потенциала Используемый в данном описании термин Используемый в данном описании термин "нулевой аллель" означает, что генный локус со"операбельно связанный" относится к связыванию держит по меньшей мере одну мутацию или струкполинуклеотидных элементов в их функциональтурное изменение, так что нулевой аллель почти ной взаимосвязи Нуклеиновая кислота является не может направлять эффективную экспрессию операбельно связанной, если она расположена в продукта функционального гена Термин "модельфункциональной взаимосвязи с другой последоная клетка" означает клетку, имеющую по меньвательностью нуклеиновой кислоты Например, шей мере один нулевой аллель эндогенного гена, промотор или энхансер, операбельно связан с обычно гомозиготного для нулевого аллеля Таким кодирующей последовательностью, если он влияобразом, например, модельная клетка может быть ет на транскрипцию кодирующей последовательгомозиготной для нулевых аллелей в локусе РНКности компонента теломеразы, так что модельная клетка почти не обладает способностью экспрессироТермин "операбельно связанный" означает, вать РНК-компонент теломеразы что последовательности ДНК будучи связанными, являются обычно смежными, а при необходимости Фиг 1 Активность теломеразы из клеток, эксобъединить две кодирующие области белка прессирующих матрично-мутированный в экстраксмежными и в врамке считывания Однако, потах, фракционированных на диэтиламиноэтилскольку энхансеры обычно функционируют, когда сефарозе из мутантных экспрессирующих стаони отделены от промотора несколькими тысячабильных трансформантов была исследована для ми гетероциклических оснований нуклеиновой определения активности теломеразы, используя кислоты, а интронные последовательности могут обычные способы анализа при различных условииметь различную длину, некоторые полинуклеоях реакции Экстракты из клеток, экспрессируютидные элементы могут быть операбельно связащих MuC+17 TRC3 (ЛИНИИ ны, но не являться смежными Структурный ген 1,4,7,10,13,16,отмеченные знаком С*), МиС TRC-3 (например, tk -ген вируса герпеса человека, ВГЧ), (линии 2,5,8,11,14,17, отмеченные знаком С) или который операбельно связан с полинуклеотидной МиА ТРСЗ(линии 3,6,9,12,15,18, отмеченные знапоследовательностью, соответствующей транском А), были исследованы при нормальных услокрипционной регуляторной последовательности виях реакции (линии 1-6), нормальных условиях с 23 47407 добавлением 0,5 мМ ддЦТФ (дидезоксицитидин-5' - трифосфат) (линии 7-9), нормальных условиях с удалением дТТФ (дезоксидитиотреитол) и добавлением 0,5 мМ ддТТФ (линии 10-12) или нормальных условиях с удалением дАТФ (дезоксиаденозинтрифосфат) и добавлением 0,5 мМ ддАТФ (линии 13-18) Реакционная смесь в линиях 1-9 содержала 8 мкМ общего дГТФ, 1 мкМ из которого составлял 32Р-дГТФ(800 Ки/мМ) Для облегчения детектирования мутантной теломеразы реакционная смесь в линиях 10-18 содержала 8 мкМ общего дГТФ, 2 мкМ из которого составлял 32Р-дГТФ (800 Ки/мМ) Экстракты обрабатывали рибонуклеазой, свободной от ДНКазы (20 мкг/мл в течение 10 минут при 30°С перед анализом теломеразы (линии 1-3, 16-18) Фланкирующие линии содержат маркеры ДНК с размерами в нуклеотидах (nt), как это показано на рисунке (см Фиг 1) Фиг 2 Уровень устойчивого состояния РНКкомпонента теломеразы (РТч) и РНК GAPDH определяли, используя количественный анализ ОТЦПР Результаты контроля показывают, что все количественные показатели ЦПР находились в линейном диапазоне до 25 циклов Анализ ОТЦПР проводили для пяти нормальных теломеразо-негативных клеточных линий (1-5) и пяти опухолевых теломеразно- позитивных клеточных линий (6-10) 1) первичная линия клеток легкого плода, 2) первичная линия клеток кожи руки плода, 3) первичная линия клеток предстательной железы взрослого, 4) первичная линия клеток синовиальных фибробластов, 5) фибробластов крайней плоти, 6) меланомы LOX, 7) лейкоза U251, 8) NCIH23 рака легкого, 9) опухоли ободочной кишки SW620, 10) опухоли груди MCF7 Продукты ЦПР были маркированы с помощью 3 Р, внесены в 6% ПААГ и подсчитаны, используя люминесцентный счечик радиоактивности Относительная транскрипция выражается в произвольных единицах ФигЗ Средняя длина терминальных рестрикционных фрагментов (ТРФ) в антисмысле РНКкомпонента теломеразы и в векторных контрольных клетках Клетки НеТе7, которые стабильно экспрессируют 10-3-РТч антисмысловой или векторный контроль, были выбраны в среде гигромицина или пуромицина и отобраны через 23 УУП (уровень удвоения популяции) после транфекции Была очищена ядерная ДНК, осуществлен разрез с помощью Hmfl и Rsal и проведены опыты на 0,5% геле агарозы ДНК была определена в геле с помощью олигонуклеотидаЛТАСЮС) для маркировки теломерических терминальных рестрикционных фрагментов (ТРФ) Гель сканировали с помощью молекулярного динамического счетчика радиоактивности и среднее значение ТРФ подсчитывали так, как это описано в (Allsopp et al (1992) Proc Natl Acad Sci (USA) 89 10114) Пунктирные линии указывают на среднюю величину ТРФ для антисмысловых и контрольных групп 24 Фиг 4 Схематическое представление способа ЦПР in situ Описание предпочтительных вариантов выполнения изобретения Настоящее изобретение предусматривает создание способов, реагентов, генетически модифицированных животных и клеток, а также фармацевтических составов, относящихся к рибонуклеопротеидовой теломеразе человека Используемая в дальнейшем терминология и лабораторные методики в культуре клеток, молекулярной генетике и химии и гибридизации нуклеиновых кислот, описанные ниже, могут включать хорошо известные и обычно используемые в данной области методики Стандартные методики используются для осуществления способов получения рекомбинантной нуклеиновой кислоты, синтеза полинуклеотидов, и выращивания и трансформации микробов (например, электропорация, липофекция) Указанные методики обычно применяются известным в данной области образом в соответствии с различными источниками информации (см , главным образом, Sambrook et al Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2d ed (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N Y , которая используется в данном описании в качестве ссылки), которые используются на протяжении всего описания Олигонуклеотиды могут быть синтезированы на синтезаторе олигонуклеотидов типа AppliedBio Systems в соответствии с инструкциями, поставляемыми изготовителем Способы амплификации ЦПР описаны в следующих источниках, относящихся к данной области (PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification ed HA Erhch, Freeman Press, New York, NY (1992), PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, eds Inms, Gelfland, Smsky, and White, Academic Press, San Diego, CA (1990), Mattila et al (1991) Nucleic Acids Res 19 4967, Eckert, KA and Kunkel, ТА (1991) PCR Methods and Applications 1 17, PCR, eds McPherson, Quirkes, and Taylor, IRL Press, Oxford, и патент США 4,683,202, используемые в данном описании в качестве ссылок) Изобретение частично основано на шокировании и выделении РНК-компонента теломеразы человека и гена для этого РНК-компонента, включая связанные транскрипционные контрольные элементы Ниже показана нуклеотидная последовательность РНКкомпонента теломеразы человека Для удобства последовательность показана с использованием стандартных сокращений, принятых для рибонуклеотидов (А - рибоаденин, G - рибогуанин, С - рибоцитидин, U - уридин) Специалисты в данной области понимают, что показанная ниже последователтьность также отражает последователтьность кДНК, в которой рибонуклеотиды замещены дезоксирибонуклеотидами ( причем уридин замещен тимидином) 47407 25 5 0 G G U C GG GG G G G C G CG G U G G C A U U U U G U G G A G A G U C C U G A C G G U C CU U U G C UA C UA U A AG G G A G G C U C U U C C C G G G AC C AC GGA G C UG C C G G U U G U C C C C C U U U U U C U A O U A C G C GAA C U XX U C G C G U U C C C G C U C G G G G A A G C CyC G C C U да 150 2Й0 UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUCCUGGCCCGUUC 250 GCCCCUCCCGCGACCUGCGGCGGGUCCCUGCCCACCCCCCGAACCCCGCC 3№ UGCAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC 550 GAAGAGUUGGGCUCUGUCACCCGCCCGUCUCUCGGGGGCCAGGGCGAGGU 400 UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC 450 GCGAUUCCCUGAGCUAUGGCACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC ACOUCCCUUUCCUCUUGCUCGCCGGAACCCCGAUCGUCCGCAUCCCUCAC 550 CCCCUCGCCGGCAGUGGGGCCUUGUGAACCCCCAAACCliGACUGACUGCCC 559 CFGUCUGCU Вышеуказанная последовательность показана в направлении 5' -3' и пронумерована для последующих ссылок Полагают, что матричная последовательность РНК-компонента расположена в пределах области, определяемой нуклеотидами 50-60 (5'-CUAACCCUAAC-3'), которая комплементарна теломерической последовательности, составленной из приблизительно одной и двух третей единиц теломерических повторов Эта последовательность была выделена из клонов кДНК и из геномного клона РНКкомпонента При первом транскрибировании РНКкомпонента из соответствующего гена по меньшей мере несколько продуцированных РНКтранскриптов намного длиннее, чем последовательность из приблизительно 560 нуклеотидов, показанная выше, и в действительности могут содержать более тысячи нуклеотидов Однако полностью функциональная молекула теломеразы может быть собрана из транскриптов, состоящих из вышеукаазнной последовательности из приблизительно 560 нуклеотидов Полагают, что 3' конец РНК-компонента нативной теломеразы находится внутри области, определяемой нуклеотидами 514-559 вышеуказанной последовательности, анализ показывает, что 3' -конец может быть U - остатком нуклеотида 538 Молекулы рекомбинантного РНК-компонента, содержащие меньше, чем нуклеотиды 1-559 вышепоказанной последовательности, также могут использоваться для получения активной теломеразы Геномный клон идентифицировали и выделяли из геномной библиотеки ДНК человека, введенной в лямбда -вектор FIXII Геномный клон, содержащий последовательности гена РНКкомпонента, включал вставку из приблизительно 15 т п н и был обозначен как клон 28-1 Ген локализовали на дистальном конце q плеча хромосомы 3 Информация о последовательности, полученная из сайта распознавания рестриктазы SaulllAI на одном конце вставки из приблизительно 15 т п н до внутреннего сайта распознавания рестриктазы Hmdlll, который содержит всю последовательность зрелого РНК-компонента, а также контрольные элементы транскрипции гена РНКкомпонента лямбда-клона 28-1 показаны ниже с использованием стандартных сокращений дезоксирибонуклеотида и изображены в направлении 5' -3' 26 GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACT 100 CASGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTGACA 150 AGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGJiAAGAAGGGTTTGAGATAAT 200 GTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATT 250 TAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGGTAAAftA 300 CAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTAT 350 GAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGG • ' ' 4GO GSGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGSCAGCGACAACTCCAC 450 GGAGTTTATGTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCAT • ' ' * ' 500 TTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGG 550 TGCGGTOGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGT 600 GGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAA 650 CCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCG 700 CCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACC 750 CGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCA ' ' 800 GCCTGGGCGAAAGAGCAAGXCTCCGXCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAAT 350 TTATGGTGGATTACTCCCCTCrrrrrACCTCATCAAGACACAGCACTACT 900 TTAAAGCAA-^GTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAG 950 ATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACITGATTAAAGCCAT 1000 ! CCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCAPTCTAAGOAGAAGGGGGCftG 1050 GGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAG 1100 TCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGAT 1150 GATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTCTCTTAGGCCcrAAAATCTTCCT 1200 GTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGA 1250 GGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGA 1300 AGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAAC ' ' * ' 1350 GTCCTTCCTCATGCCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAAC 1400 CAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGflGAGTCAGCTTGG 1450 5 С CAATCCGTG CGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTUTUAGCCGA CTCGCCCGGC 1500 AGC«CftCCGGGTTGCGGAGGGftGGGTGGGCCTCGG ASSGGTGGTGGCCAT 1550 TTTTTGTCTAACCCTiUCTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTrGCTCC 1600 CCGCGCSCTGTTTTTCTCG CTGACTTTC &GCGGGCG3AAAAGCCTCG6CC 1S50 1700 G CCCGTTCG CCCCTCCCGGG ACCTGCGG CGGGTCGCTGCCCSG CCCCCGA 1750 ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGG CCGG GGCTTCTCCGGftGGCACCCA CT 1E00 G CC ACCGCG AAGAGTrGGG CT GTGTCAGCCGCGGGTCTCTCCGGGGCG AG 1BS0 1900 CGCGCGGCGCGATTCCCTGSGCTATOGGACGTGCACCCAGGacTCGGCTC ' ' 1950 ДСАСАЇ'ВС A GTTCGCTTTCCTGTTGGTG GGGGG AACGCCG ATCGTG CG CX 2000 TCCGTCftCXCCTCGCCGGCACTGGGeGCTTGTGAACCCCCftAACCTGACT 2050 GACIGGSCCaGTGTGCTGCAAATTGGCAGGfiGACGTGAaGGCaCCTCCAA 2100 h GTCGGCC AAAATG SATOG QCAGTQ AGCCGGGGITGCCTGGAGCCG-rTC С 21S0 •TGCGTGGGTXCTCCCGTCTICCGCTrTTTGTTGCCTTTTATGGTSaTSTT 2200 22S0 T 2300 A 2350 A 2400 2425 AGTAGGATATAMSCCCSCAAGCTf Последовательность РНК-компонента начинается у основания 1459 В последовательности идентифицируются различные элементы контроля 27 47407 транскрипции Консенсусная последовательность А/Т BOX находится в последовательности нуклеотидов от 1431 до 1436, консенсусные последовательности PSE находятся в последовательности нуклеотидов от 1406 до 1414, а также в последовательности нуклеотидов 1508-1526, консенсусная последовательность СААТ Box находится в последовательности нуклеотидов от 1399 до 1406, консенсусная последовательность SP1 находится в последовательности нуклеотидов 1354-135 и консенсусная последовательность элемента, отвечающего бета/гамма-интерферону, находится в последовательности нуклеотидов 1234-1245 Устойчивая транскрипция гена РНК-компонента теломеразы человека в клетках человека, таких как НТ1080 (экспрессирующих теломеразу) почти не изменяется, когда последовательности, расположенные выше нуклеотида 1159, удаляются в векторы, которые устойчиво трансфекцируются в клетки ДНК от беличьей обезьяны, которая, как полагают, находится среди наиболее генетически дивергентных приматов кроме человека по отношению к человеку, содержит ген РНК-компонента теломеразы, который поддается амплификации праймерами ЦПР, содержащими последовательности, которые соответствуют или комплементарны заявляемой полинуклеотидной последовательности РНК-компонента теломеразы человека Полагают, что другие не относящиеся к человеку приматы обладают генами РНК-компонента теломеразы, которые также поддаются амплификации праймерами ЦПР, выделенными из последовательности гена РНК-компонента теломеразы человека Полинуклиотиды РНК-компонента теломеразы Заявляемые последовательности РНКкомпонента теломеразы млекопитающего и его гена, как показано выше для теломеразы человека, а на рис 5 для теломеразы беличьей обезьяны, делают возможным конструирование выделенных полинуклеотидов, содержащих последовательность из по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, обычно по меньшей мере из 20-25 смежных нуклеотидов, которая в значительной мере идентична последовательности РНК-компонента теломеразы млекопитающего или последовательности гена РНК-компонента млекопитающего Кроме того, последовательности РНК-компонента теломеразы млекопитающего (и гена) делают возможным конструирование зондов гибридизации нуклеиновой кислоты и праймеров ЦПР, которые могут использоваться для детектирования последовательностей РНК и ДНК родственного РНКкомпонента теломеразы и/или гена в клетке, клеточном образце, тканевом срезе, реакционном сосуде, гибридизационной мембране и т д Полинуклеотиды, содержащие последовательности Р Н К-компонента теломеразы млекопитающего, могут включать последовательности, способствующие транскрипции (экспрессирующие последовательности), последовательности, стабилизирующие РНК и т п Основными принципами конструирования таких полинуклеотидов с точки зрения раскрытой ниже информации о последовательности и направленности изобретения хорошо 28 известны в данной области и описаны Maniatis et al , Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2 n d Ed (1989), Cold Spring Harbor, NY Например, но не ограничиваясь этим, такие полинуклеотиды могут включать промотор и, необязательно, энхансер для использования в эукариотных экспрессирующих хозяевах и необязательно последовательности, необходимые для репликации вектора Типичная эукариотная экспрессирующая кассета включает полинуклеотидную последовательность, которая, будучи транскрибированной, продуцирует транскрипт РНК-компонента теломеразы млекопитающего, такая полинуклеотидная последовательность связана в направлении вниз ( т е в транскрипционной ориентации от 5' до 3' подходящего промотора, например, ВГЧ тк (тимидинкиназа)-промотора или фгк (фосфоглицераткиназа)- промотора, необязательно связанного с энхансером Кроме того, там, где экспрессия функционального РНК-компонента теломеразы нежелательна, полинуклеотиды согласно настоящего изобретения не нуждаются в транскрибировании транскрипта функционального РНК-компонента теломеразы Полинуклеотиды согласно этого изобретения могут служить в качестве зондов гибридизации и/или праймеров ЦПР (умноженных копий), и/или олигомеров ЦАР для детектирования последовательности РНК или ДНК РНКкомпонента теломеразы С другой стороны, полинуклеотиды согласно настоящего изобретения могут служить в качестве зондов гибридизации или праймеров для детектирования последовательности РНК или ДНК родственных генов или гена РНК-компонента теломеразы родственных видов, обычно видов млекопитающих Для подобного применения гибридизации и ЦПР полинуклеотиды согласно настоящего изобретения не нуждаются в транскрибировании функционального РНК-компонента теломеразы Таким образом, полинуклеотиды согласно настоящего изобретения могут содержать значительные делеции, добавки, замены и/или транспозиции нуклеотидов до тех пор, пока сохраняется специфическая гибридизация или специфическая амплификация в последовательности РНК-компонента теломеразы млекопитающего Геномные или кДНК клоны РНК-компонента теломеразы и соответствующие последовательности генов могут быть выделены из библиотеки клонов (например, имеющиеся в Clontech, Palo Alto, CA), используя зонды гибридизации, сконструированные на основе раскрытых в данном описании нуклеотидных последовательностей и обычные способы гибридизационного скрининга (например, Benton WD and Davis RW (1977) Science 196 180, Goodspeed et al (1989) Gene 76 1) В случае, если необходим клон кДНК, он преимущественно выбирается из библиотек клонов, содержащих кДНК, полученную из РНК соматической клетки или РНК другой клетки, экспрессирующей РНК-компонент теломеразы С другой стороны, синтетические полинуклеотидные последовательности, соответствующие всем или части последовательностей, раскрытых в данном описании, могут быть сконструированы посредст 29 47407 вом химического синтеза олигонуклеотидов Кроме того, цепная полимеразная реакция (ЦПР), использующая праймеры на основе данных о последовательности, раскрытой в данном описании, может использоваться для амплификации фрагментов ДНК из геномной ДНК, пулов РНК или библиотек клонов кДНК Способ ЦПР описан в патентах США 4,683,195 и 4,683,202 Такие полинуклеотиды находят различное применение, например, в качестве зондов РНКкомпонента теломеразы, матриц для продуцирования функционального или нефункционального РНК-компонента теломеразы в клетках, в качестве коммерческих диагностических реагентов для стандартизации метода детектирования РНКкомпонента теломеразы, в качестве генотерапевтических полинуклеотидов для применения на животных, такие полинуклеотиды могут также использоваться в качестве кормов, источников энергии от горючих веществ, поглощающих ультрафиолетовое излучение солнцезащитных агентов и растворов с повышенной вязкостью, а также другие виды использования Рассмотренные в настоящем описании плазмиды, которые были сконструированы при клонировании РНК-компонента теломеразы человека и гена для РНК-компонента, являются важными аспектами настоящего изобретения Указанные плазмиды могут использоваться для продуцирования РНК-компонента, а также гена РНКклмпонента, теломеразы человека в почти чистом виде, что является другим важным аспектом настоящего изобретения Кроме того, специалисты в данной области понимают, что целый ряд других плазмид, а также неплазмидные нуклеиновые кислоты в почти чистом виде, которые содержат всю или по меньшей мере полезную часть нуклеотидной последовательности РНК-компонента теломеразы человека, являются полезными материалами, получаемыми при воплощении настоящего изобретения В отношении нуклеиновых кислот и препаратов, содержащих указанные нуклеиновые кислоты согласно изобретения, специалисты считают главным то, что нуклеиновые кислоты согласно изобретения включают как молекулы ДНК, так и молекулы РНК, а также их синтетические аналоги неприродного происхождения и гетерополимеры дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и/или их аналоги Определенный состав нуклеиновой кислоты или ее аналога согласно изобретения зависит от цели использования материала и от окружающей среды (сред), в которую должны поместить материал Для достижения целого ряда целей были сконструированы модифицированные, синтетические неприродные нуклеотиды, которые остаются стабильными при использовании в различной окружающей среде, например в среде, где присутствуют нуклеазы, как это известно в данной области Модифицированные или синтетические неприродные нуклеотиды по сравнению с природными рибо-или дезоксирибонуклеотидами могут отличаться в отношении углевода (сахара), фосфатной связи или участков основания нуклеотида или могут даже содержать ненуклеотидное основание (или вообще не иметь осно 30 вания) в некоторых случаях См , например, Arnold et al , патент РСТ, номер публикации WO 89/02439, озаглавленный "Ненуклеотидные связующие реагенты для нуклеотидных зондов", используемый в данном описании в качестве ссылки Также как и нуклеиновые кислоты согласно изобретения могут содержать большое разнообразие нуклеотидов, так и эти нуклеиновые кислоты могут служить выполнению самых разнообразных целей Выделение родственных генов Как показано в последующем описании, получение очищенных нуклеиновых кислот, содержащих последовательность РНК-компонента теломеразы человека, обеспечивает создание ценных диагностических и терапевтических способов и реагентов, а также другие важные преимущества Одним из главных преимуществ, обеспечиваемых настоящим изобретением, является то, что способы и реагенты согласно изобретения могут быть использованы для выделения РНК-компонента и генов для РНК-компонента теломеразы из любого вида млекопитающих, которые имеют РНКкомпонент, существенно гомологичный РНКкомпоненту человека согласно настоящего изобретения Выражение "по существу гомологичный" соответствует такой степени гомологии, которая требуется для специфической гибридизации олигонуклеотида или последовательности нуклеиновой кислоты РНК-компонента человека с последовательностью нуклеиновой кислоты последовательности РНК-компонента других видов млекопитающих При такой существенной гомологии специалисты в данной области могут использовать нуклеиновые кислоты и олигонуклеотидные праймеры и зонды согласно изобретения для идентификации и выделения существенно гомологичных последовательностей Например, можно зондировать геномную или библиотеку фрагментов кДНК для детектирования гомологичных последовательностей Можно также использовать праймеры, соответствующие участкам последовательности РНК-компонента и амплификацию ЦПР в условиях малой или умеренной строгости для амплификации специфической гомологичной последовательности нуклеиновой кислоты из препаратов РНК или ДНК, полученных от вида млекопитающего За счет использования этих и других аналогичных методик специалисты в данной области могут легко выделить не только различные нуклеиновые кислоты РНК-компонента из клеток человека, но также гомологичные нуклеиновые кислоты РНК-компонента из клеток других млекопитающих, например, из клеток приматов, домашнего скота, т е крупного рогатого скота, овец, лошадей, собак, котов, грызунов, таких как крыс, мышей и хомяков В свою очередь, эти нуклеиновые кислоты могут использоваться для выведения трансгенных животных, представляющих большую ценность для скрининга и испытания фармацевтических преператов, регулирующих активность теломеразы Например, используя плазмиду согласно изобретения, можно промоделировать ген РНК-компонента или заменить ген природного РНК-компонента на рекомбинантный индуцируемый ген в mus spretus эмбриональной 32 31 47407 стволовой клетке, а затем создать трансгенную новкой после каждого этапа и контроля за фоном мышь, которую можно использовать в качестве сигнала зонда (и необязательное детектирование модели или опытного образца для исследования сигнала с помощью авторадиограммы и/или разаболеваний возрастного характера или старения диоактивного подсчета фосфора, если используВ приведенном ниже примере 9 показывается, ется радиомеченый зонд) и прекращение этапов каким образом подобная методология использопромывки при достижении требуемого соотношевалась для идентификации и выделения последония сигнал/шум, определяемого экспериментальвательностей РНК-компонента приматов ным образом Другие гомологи РНК-компонентов теломераПолинуклеотиды, содержащие последовазы человека и обезьяны и/или родственных генов тельности из по меньшей мере приблизительно могут быть идентифицированы и выделены путем 30 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей скрининга подходящей библиотеки геномных и мере 100 нуклеотидов, соответствующие или комкДНК клонов млекопитающих кроме человека, плементарне рассмотренным в данном описании например, выделенных из мыши, крысы, кролика, нуклеотидным последовательностям последовагвинейской свиньи, хомяка, из псовых, бычьих, тельностей РНК-компонента теломеразы человека овечьих, волчьих, свиных или других геномных или обезьяны, могут служить в качестве праймеили кДНК библиотек в подходящем векторе, таком ров ЦПР и/или зондов гибридизации для идентикак дрожжевые искусственные хромосомы, космификации и выделения генов зародышевой линии, ды или лямбда-бактериофаг (например, лямбдасоответствующих заявляемым последовательноCharon 35), полинуклеотидным зондом, содержастям гена и РНК-компонента Указаные гены зарощим последовательность из по меньшей мере 20 дышевой линии могут выделяться различными смежных нуклеотидов (или их комплемента) РНКспособами, обычными в данной области, включая, компонента теломеразы человека или обезьяны но не ограничиваясь гибридизационным скрининили полинуклеотидную последовательность гена гом геномных библиотек в лямбда-бактериофаге Обычно условия гибридизациии и промывания или библиотек космид, или амплификацией ЦПР выполняются с высокой степенью строгости на геномных последовательностей с использованием основе обычных способов гибридизации Позипраймеров, выделенных из заявляемых здесь потивные клоны выделяются и секвенируются Для следовательностей Геномные библиотеки челоиллюстрации, но не для ограничения, полноразвека общеизвестны или могут быть сконструиромерный полинуклеотид, соответствующий послеваны вновь из ДНК человека довательности из 559 нуклеотидов РНКСпециалисту в данной области понятно, что компонента теломеразы человека, может быть замещения, делеции и добавления нуклеотидов маркирован и использован в качестве зонда гибмогут вводиться в полинуклеотиды согласно изоридизации для выделения геномных клонов из бретения Разновидность нуклеотидной последобиблиотеки геномных клонов не человеческого вательности может быть получена из полиморпроисхождения в лямбда- EMBL4 или лямбдафизмов последовательности различных аллелей GEM11 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin), и т п Однако подобные замещения, делеции и типовыми условиями гибридизации для скрининга добавления нуклеотидов не должны в значительбляшек (Benton and Davis (1978) Science 196 180, ной степени нарушать способность полинуклеотиDunn et al (1989) J Biol Chem 264 13057) могут да гибридизироваться с одной из полноразмерных быть 50% формамид, 5 x SSC (раствор хлорида и полинуклеотидных последовательностей РНКцитрата натрия) или SSPE, 1-5 х раствор Денхаркомпонента теломеразы человека или обезьяны, та, 0,1-1% SDS (додецил сульфат натрия), представленных в данном описании в условиях 100 200мкг фрагментированной гетерологичной 7 гибридизации, которые являются существенно ДНК или тРНК, 0-10% декстран сульфата, 1 х 10 строгими для получения специфической гибридидо 1 х 10 8 циклов в минуту/мл денатурированного зации зонда с удельной активностью, равной приблизительно 1 х 10 циклов в мин/мкг и инкубация при Полинуклеотиды РНК-компонента теломеразы температуре 42°С - 37°С в течение приблизительмлекопитающего могут представлять собой коротно 6-36 часов Условия предгибридизации в оские олигонуклеотиды (например, с длиной новном идентичны вышеуказанным, за исключе200 100 оснований), например, для использованием того, что зонд не используется , а время ния в качестве зондов гибридизации и праймеров инкубации обычно сокращается Условия промыЦПР (ЦАР) Полинуклеотидные последовательнования обычно предусматривают 1 -Зх SSC, 0,1-1% сти могут также содержать часть большего полиSDS (додецил сульфат натрия), 45-70°С с измененуклеотида (например вектор клонирования, сонием промывочного раствора через каждые придержащий клон РНК-компонента теломеразы) и близительно 5- 30 минут Для выделения полимогут быть слиты с помощью полинуклеотидной нуклеотидов РНК-компонента теломеразы не связи с другой полинуклеотидной последовательчеловеческого происхождения с помощью полиностью Обычно полинуклеотиды РНК-компонента нуклеотидного зонда РНК- компонента теломерателомеразы содержат по меньшей мере 25 послезы человека часто предпочитают гибридизацию довательных нуклеотидов, которые в основном при меньшей степени строгости, например, темидентичны последовательности гена или РНКпературе приблизительно равной 39 С, и послекомпонента природной теломеразы, чаще полидующей промывке при следующих температурных нуклеотиды РНК-компонента теломеразы содеррежимах комнатная температура, 37°С, 39°С, жат по меньшей мере 50 100 последовательных 42°С, 45°С, 50°С, 55°С, 60°С, 65°С и 70°С с остануклеотидов, которые в основном идентичны последовательности РНК-компонента теломеразы 33 47407 34 млекопитающего Однако специалистам понятно, екая амплификация последовательности РНКчто минимальная длина полинуклеотида РНКкомпонента теломеразы человека Однако такие компонента теломеразы, необходимая для спезамещения, делеции и добавления нуклеотидов цифической гибридизации с целевой последоване должны в значительной мере нарушать спотельностью РНК-компонента теломеразы, зависит собность полинуклеотида гибридизироваться с от нескольких факторов содержание G/C, распопоследовательностью гена или РНК-компонента ложение ошибочно спаренных оснований (если теломеразы в условиях гибридизации, которые таковые имеются), степени уникальности послеявляются достаточно строгими для осуществледовательности по сравнению с популяцией целения специфической гибридизации вых полинуклеотидов и химической природы поНапример, но, не ограничиваясь этим, полилинуклеотида, например, метилфосфатного нуклеотид РНК-компонента теломеразы человека остова, полиамидной нуклеиновой кислоты, фосможет содержать последовательность нуклеотифоротиолата и т д ), а также от других факторов дов от 48 до 209, которая, как полагают, достаточна для восстановления холоэнзима теломеразы При необходимости умноженные копии ЦПР человека в присутствии белкового компонента для амплификации в основном полноразмерных теломеразы реплик кДНК могут выбираться специалистом, 1 5исходя из его опыта, подобным образом можно UCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCC выбрать и умноженные копии для амплификации CCGCGCGCUGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCC участков гена РНК-компонента теломеразы (челоUCGGCCUGCCGCCUUCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAA UGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCC-3' века или обезьяны) или как ДНК Каждую из указанных последовательностей 5'можно использовать в качестве зондов гибридиTGTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCC зации или умноженных копий ЦПР для детектироGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGG CCTGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAG вания наличия РНК-компонента теломеразы с цеCTGCTGGCCCGTTCGCCCCTCCC-3' лью, например, диагностики нео пласти чес ко го Кроме того, полинуклеотид РНК-компонента заболевания, характеризуемого наличием в клеттеломеразы человека может содержать или соках повышенного или пониженного уровня РНКстоять из нуклеотидов 1-559 и может включать компонента теломеразы или для выполнения ткатерминальные добавки других нуклеотидов или невого типирования ( например, идентификации нуклеотидных последовательностей Матричнотканей, характеризуемых экспрессией РНКползучий вариант, состоящий из нуклеотидов от компонента теломеразы) и т п Последовательно48 до 209, но в котором изменена матричная пости можно также использовать для детектироваследовательность теломерических повторов, спония последовательностей геномного гена РНКсобен конкурировать с укороченным РНКкомпонента теломеразы в пробе ДНК, например, компонентом, содержащим последовательность для проведения судебно-медицинского анализа дикого типа от 48 до 209 для связывания белковоДНК (например, посредством анализа полиморго компонента теломеразы и восстановления хофизма рестрикционных фрагментов (ПМРФ), раслоэнзима теломеразы пределения длины(длин) продуктов ЦПР и т д ) или для диагностики заболеваний, характеризуеСтруктурный анализ РНК-компонента теломемых амплификацией и/или перестройками гена разы человека указывает на участки, имеющие РНК-компонента теломеразы склонность к образованию вторичных структур, например, петель шпильки Например, участок в Например, но, не ограничиваясь этим, может пределах от приблизительно нуклеотида 200 до быть использована следующая пара олигонуклеонуклеотида 350 РНК-компонента теломеразы четидных праймеров для амплификации полинукловека, имеет в основном характер петли шпильлеотидных последовательностей РНК-компонента ки Другие участки РНК-компонента теломеразы теломеразы (например, кДНК) или в качестве зонтакже имеют выраженный характер вторичной дов гибридизации (например, в качестве биотиниструктуры С точки зрения указанной вторичной лированных или меченых на конце олигонуклеоструктуры другие нуклеотидные последовательтидных зондов) ности, которые по данным компьютерного анализа 5^AGCACALTGGCCCAG T СЛСГСЛССТТТС-З' и принимают форму аналогичных вторичных структур, могут быть заменены специалистами Хотя Специалистам в данной области известны целый ряд компьютерных программ пригоден для другие подходящие праймеры ЦПР, праймеры определения нуклеотидных последовательностей, ЦАР, зонды гибридизации, праймеры и другие принимающих в основном характер эквивалентаналогичные им средства с точки зренгия заявных вторичных структур, могут быть использованы ляемых последовательностей, которые к тому же программы FOLD, SQUIGGLES, CIRCLES, могут быть получены Полинуклеотиды РНКDOMES, MOUNTAINS, STEMLOOP и др из пакета компонента теломеразы человека и их комплепрограмм анализа последовательностей UWGCG менты могут служить в качестве зондов гибридиПодобным образом ненуклеотидные структурные зации или праймеров для детектирования послекопии, например, пептидные нуклеиновые кислоты довательностей РНК или ДНК РНК-компонента и т п могут быть сконструированы с помощью теломеразы млекопитающего Для такого примепрограмм молекулярного моделирования в каченения гибридизации и ЦПР они могут содержать стве копий характерной вторичной структуры учасущественные делеции, добавления, замещения стка(ов) РНК-компонента теломеразы человека, и/или транспозиции нуклеотидов, пока сохраняеткоторый подлежит копированию Такие структурся специфическая гибридизация или специфиче 35 36 леазоустойчивость, более прочное связывние и т д ), чем нуклеиновые аналоги, в которых используются природные нуклеотиды Другие способы придания олигонуклеотидам устойчивости к нуклеазе включают способы, описанные в патенте РСТ, номер публикации 94/12633 Дополнительные варианты воплощения изобретения, направленные на модуляцию активности теломеразы, включают способы, в которых используются специфические антисмысловые полинуклеотиды, комплементарные всем или части последовательностей РНК-компонента теломеразы человека (РТч), таким как антисмысловые полинуклеотиды, комплементарные гену РНКкомпонента теломеразы человека или его транскрибированной РНК, включая укороченные формы, которые могут быть связаны с холоэнзимом теломеразы Такие комплементарные антисмысловые полинуклеотиды могут включать замещения, добавления, делеции или транспозиции нуклеотидов пока сохраняется специфическое связывание с релевантной целевой последовательностью, соотвеоствующей РНК-компоненту теломеразы или его гену в качестве функционального свойства полинуклеотида Комплементарные антисмысловые полинуклеотиды включают растворимые антисмысловые олигонуклеотиды РНК или ДНК, которые могут гибридизироваться специфически с видом РНК-компонента теломеразы и предотвращать транскрипцию гена РНКкомпонента теломеразы (Ching et al (1989) Proc Natl Acad Sci U S A 86 10006, Broder etal (1990) Ann Int Med 113 604, Loreau etal (1990) FEBS Letters 274 53, Holcenberg et al WO91/11535, u s s n 07/530,165, WO91 /09865, WO91 /04753, WO90/13641, EP 386563, каждый из которых используется в данном описании в качестве ссылки Таким образом, антисмысловые полинуклеотиды ингибируют продуцирование функционального РНК-компонента теломеразы Поскольку экспрессия РНК-компонента теломеразы (интенсивность транскрипции и/или стабильность РНК) связаны с активацией и ферментативной активностью холоэнзима теломеразы, антисмысловые полинуклеотиды, которые предотвращают транскрипцию РНК, соответствующую РНК-компоненту теломеразы, и/или взаимодействие РНК-компонента теломеразы с белковым компонентом теломеразы человека, и/или взаимодействие РНК-компонента теломеразы с теломерическими последовательностями, могут подавлять активность теломеразы и/или реверсировать фенотип, например, обеспечивать иммортализацию или нео пласти чес кую трансформацию клеток, экспрессирующих активность теломеразы при отсутствии антисмысловых полинуклеотидов Составы, содержащие терапевтически эффективную дозу антисмысловых полинуклеотидов РНК-компонента теломеразы, могут вводиться для лечения заболеваний, которые требуют активности теломеразы для клеточного патогенеза (например, неоплазии) или ингибировать образование гаметы или сохранение (т е служить контрацептивом), если это необходимо Можно продуцировать антисмысловые полинуклеотиды различной длины, хотя подобные антисмысловые полинуклеотиды обычно 47407 ные копии могут быть использованы с терапевтической или другими целями (например, конкурентный антагонист и т д ) Антисмысл Одним из наиболее ценных видов нуклетновой кислоты согласно изобретения является антисмысловой олигонуклеотид, который может использоваться in vivo или in vitro для ингибирования активности теломеразы человека Антисмысловые олигонуклеотиды содержат специфическую последовательность из приблизительно 10 до приблизительно 25 200 или более (те достаточно больших для формирования стабильного дуплекса, но достаточно малой, в зависимости от способа доставки, для введения in vivo, если это необходимо) нуклеотидов, комплементарных специфической последовательности нуклеотидов в РНК-компоненте теломеразы человека Механизм действия таких олигонуклеотидов может включать связывание РНК-компонента либо для предотвращения сборки функциональной рибонуклеопротеидовой теломеразы, предотвращения РНК-компонента от использования в качестве матрицы для синтеза теломерической ДНК, дестабилизации РНК-компонента теломеразы и уменьшения времени его периода полураспада и/или для ингибирования транскрипции гена РНКкомпонента теломеразы Характерные антисмысловые олигонуклеотиды согласно изобретения, которые служат для ингибирования активности теломеразы in vivo или in vitro, включают вышеупомянутые олигонуклеотиды в связи с тестами по определению того, содержит ли клон pGRN7 кДНК для РНК-компонента теломеразы человека Три таких олигонуклеотида, как это указано выше, использовались для демонстрационного ингибирования активности теломеразы in vitro Последовательность каждого из этих трех олигонуклеотидов показана ниже ТЗ 5'-CTCAGTTAGGGTTAGACAAA-3', РЗ 3'-CGCCCTTCTCAGTTAGGGTTAG-3', ТАЗ 5'-GGCGCCTACGCCCTTCTCAGTT-3' Эти олигонуклеотиды могут также использоваться для ингибирования активности теломеразы в клетках человека Специалисты в данной области понимают, что настоящее изобретение обеспечивает создание широкого ряда антисмысловых олигонуклеотидов, способных подавлять активность теломеразы Другим применяемым олигонуклеотидом согласно изобретения является олигонуклеотид Tel-AU, который имеет последовательность 5'CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3' и который подобно любому из антисмысловых олигонуклеотидов согласно изобретения может быть синтезирован, используя фосфоротиоатные нуклеотиды, хирал-метилфосфонаты, природные нуклеотиды или их смеси для придания стабильности и получения желательного Т т Специалисты в данной области понимают, что целый ряд модифицированных нуклеотидных аналогов, таких как О-метил рибонуклеотиды, фосфоротиоатные нуклеотиды и метилфосфонатные нуклеотиды могут использоваться для получения нуклеиновых кислот согласно изобретения, которые обладают требуемыми свойствами в большей степени (например, нук 37 47407 содержат последовательность, состоящую из по меньшей мере 25 последовательных нуклеотидов, которые существенно комплементарны полинуклеотидной последовательности РНК-компонента природной теломеразы и которые полностью комплементарны последовательности РНКкомпонента теломеразы человека, зачастую будучи комплементарными последовательности РНКкомпонента теломеразы, которая комплементарна последовательности теломерических повторов или комплементарна части РНК-компонента теломеразы, которая контактирует с полипептидной субъединицей теломеразы Антисмысловые полинуклеотиды могут быть продуцированы из гетерологичной экспрессирующей кассеты в клетке, инфицированной вирусной нуклеиновой кислотой, или в трансгенной клетке Гетерологичная экспрессирующая кассета может являться частью генотерапевтического вектора, например, аденовирусного или аденосвязанного вирусного вектора, или другого генотерапевтического вектора Гетерологичная кассета может быть на полинуклеотиде, который не способен к независимой репликации и который переносится в клетки любым из ряда подходящих способов, известным специалистам в данной области (например, липофекцией, липосомами, иммунолипосомами, электропорацией и т д ) С другой стороны, антисмысловые полинуклеотиды могут содержать растворимые олигонуклеотиды, которые вводятся во внешнюю среду либо в культуральную среду in vitro, либо в интерстициальные промежутки и жидкие среды организма (например, в кровь, спинномозговую жидкость) для применения in vivo Было показано, что растворимые антисмысловые полинуклеотиды, присутствующие во внешней среде, получают доступ в цитоплазму и подавляют специфические виды РНК В некоторых вариантах антисмысловые полинуклеотиды содержит метилфосфонат составляющие, С-5 пропенил составляющие, 2 фторорибозные сахара или являются полиамидными нуклеиновыми кислотами (ПНК) (Egholm et al (1992) J Am Chem Soc 114 1895, Wittung et al (1994) Nature 368 561, Egholm et al (1993) Nature 365 566, Hanvey et al (1992) Science 258 1481, приведенные в данном описании в качестве ссылок Что касается общих способов, относящихся к антисмысловым полинуклеотидам, см Antisense RNA and DNA, (1988), DA Melton, Ed , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) Кроме смысловых олигонуклеотидов согласно изобретения можно сконструировать олигонуклеотиды, которые привязываются к дуплексной нуклеиновой кислоте либо в в РНК-компоненте со шпилькой, либо в гене РНК-компонента, образуя нуклеиновую кислоту, содержащую тройную спираль, для ингибирования активности теломеразы Такие олигонуклеотиды согласно изобретения конструируются, используя правила спаривания оснований для образования тройной спирали и нуклеотидной последовательности РНКкомпонента (Cheng et al (1988) J Biol Chem 263 15110, Fernn and Camenni-Otero (1991) Science 354 1494, Ramdas et al (1989) J Biol Chem 264 17395, Strobe! etal (1991) Science 254 1639, Hsieh 38 et al (1990) j h c i t , Rigas et al (1986) Proc Natl Acad Sci (U S A ) 83 9591, используемые здесь в качестве ссылок) Такие олигонуклеотиды могут блокировать активность теломеразы различным образом, включая предотвращение транскрипции гена теломеразы или путем связывания с дуплексным участком РНК-компонента теломеразы таким образом, чтобы не дать возможность РНКкомпоненту либо образовать функциональную рибонуклеопротеидовую теломеразу, либо служить в качестве матрицы для синтеза теломерической ДНК Обычно, в зависимости от способа действия, олигонуклеотиды, образующие тройную спираль, согласно изобретения содержат специфическую последовательность из приблизительно 10 до приблизительно 25 200 и более(те достаточно большие для формирования устойчивой тройной спирали, но достаточно малые, в зависимости от способа доставки, для введения in vivo, если это необходимо) нуклеотидов, "комплементарных" (в этом контексте "комплементарный" означает способность образовывать устойчивую тройную спираль) специфической последовательности в РНК-компоненте теломеразы или гене РНК-компонента теломеразы Кроме антисмысловых и образующих тройную спираль олигонуклеотидов согласно изобретения для ингибирования активности теломеразы могут быть также использованы смысловые олигонуклеотиды, идентичные в последовательности по меньшей мере части РНК-компонента теломеразы человека Олигонуклеотиды этого типа согласно изобретения характеризуются содержанием либо (1) меньшей, чем полная последовательность РНК-компонента, требуемой для формирования функционального фермента теломеразы, либо (2) полной последовательностью РНК-компонента, требуемой для формирования функционального фермента теломеразы, а также заменой или инсерцией одного или более нуклеотидов, которые воздействуют на РНК, делая ее нефункциональной В обоих случаях наблюдается ингибирование активности теломеразы, обусловленное "мутантным" РНК-компонентом, связывающим белковые компоненты теломеразы человека для образования неактивной молекулы теломеразы Таким образом, механизм действия таких олигонуклеотидов включает сборку нефункциональной рибонуклеопротеидовой теломеразы или предотвращение сборки функциональной рибонуклеопротеидовой теломеразы В качестве примера можно привести матрично-ползучий вариант, состоящий из нуклеотидов от 48 до 209, но в котором изменена матричная последовательность теломерических повторов Такие матричноползучие варианты способны конкурировать за связь с белковым компонентом теломеразы Смысловые олигонуклеотиды этого типа согласно изобретения содержат специфическую последовательность из по меньшей мере 20, 50, 100, 200, 400, 500 или более нуклеотидов, идентичную специфической последовательности нуклеотидов в РНК-компоненте теломеразы человека Кроме того, антисмысловые полинуклеотиды могут содержать дериватный заместитель, который в основном не участвует в гибридизации с 39 47407 РНК-компонентом теломеразы млекопитающего Антисмысловые полинуклеотиды, которые были модифицированы путем добавления химических заместителей, могут быть введены в метаболически активную эукариотную клетку для гибридизации с РНК-компонентом теломеразы в клетке Обычно такие антисмысловые полинуклеотиды разрезаются и дополнительные химические заместители присоединяются либо во время, либо после синтеза полинуклеотидов соответственно и, таким образом, локализуются в комплементарной последовательности РНК-компонента теломеразы, где они продуцируют изменение или химическую модификацию в локальной последовательности ДНК или в белковом компоненте теломеразы Предпочтительные присоединенные химические заместители включают европий (III) тексафирин, сшивающие агенты, псорален, хелаты металлов (например, железо/ЕДТК-хелат для катализируемого гидролиза железа), топоизомеразы, эндонуклеазы, экзонуклеазы, лигазы, фосфодиэстеразы, фото динамические порфирины, хемотерапевтические препараты (например, адриамицин, доксирубицин), интеркалирующие агенты, модифицирующие основание агенты, иммуноглобулиновые цепи и олигонуклеотиды Железо/ЕДТК-хелаты являются наиболее предпочтительными химическими заместителями там, где требуется локальный гидролиз полинуклеотидной последовательности (Hertzberg et al (1982) J Am Chem Soc 104 313, Hertzberg and Dervan (1984) Diochemistry 23 3934, Taylor et al (1984) Tetrahedron 40 457, Dervan, PB (1986) Science 232 464) Предпочтительные химические процессы прикрепления включают непосредственное связывание, например, путем добавленной реактивной аминогруппы (Corey and Schultz (1988) Science 238 1401, которая используется в данном описании в качестве ссылки) и другие химические процессы непосредственного связывания, хотя могут быть также использованы и другие методы связывания антител стрептавидин/биотин и дигоксигенин/антидигоксигенин Способы связывания химических заместителей описаны в патентах США 5,135 720, 5,093,245 и 5,055,556, которые используются здесь в качестве ссылок Специалист в данной области на основе своего опыта может использовать и другие химические процессы связывания Полинуклеотиды, которые соответствуют всему или значительной части РНКкомпонента теломеразы млекопитающего (т е "смысловые" полинуклеотиды), могут быть также разрезаны и использованы для вступления в реакцию с последовательностями теломерических повторов в геноме и продуцирования аддуктов или другой модификации химической среды на теломерических участках хромосом Матрицы ошибочного спаривания Таким образом, другой полезный олигонуклеотид согласно изобретения содержит измененную или мутированную последовательность РНКкомпонента теломеразы человека В работе Yu et al , 1990, Nature 344 126 показано, что мутированная форма РНК-компонента теломеразы Tetrahymena может быть включена в теломеразу клеток Tetrahymena и что такое введение оказы 40 вает на эти клетки вредное воздействие Введение мутированных форм РНК-компонента теломеразы человека может оказывать аналогичное воздействие на клетки человека, которые в противном случае имеют активность теломеразы, не воздействующую на нормальные клетки человека, которые не имеют активности теломеразы Такие мутированные формы включают формы, в которых последовательность 5'-СТААСССТА-3', мутирована до 5'-САААСССАА-3', З'-ССААССССАА-З' или 5'-СТСАСССТСА-3' Каждая из этих измененных последовательностей РНК-компонента изменяет единицы теломерических повторов, введенных в хромосомную ДНК, воздействуя таким образом на структуру и функцию хромосомы Такие олигонуклеотиды могут быть сконструированы так, чтобы содержать участки распознавания рестрикционного фермента, который можно использовать в диагностических методах определения присутствия измененного РНК-компонента путем сжигания рестрикционного фермента теломерической ДНК или протяженного субстрата теломеразы Для иллюстрации этого аспекта изобретения был выполнен сайт-специфический мутагенез путем использования плазмиды (обозначенной pGRN33, имеющейся в Американской коллекции тканевых культур (АКТК) под инвентарным номером АКТК 75926), которая содержит фрагмент Hmd-Sacl с размером 2,5 т п н из лямбда клона 28-1 (см нижеприведенный пример 7), а также область начала репликации SV40 (но без активности промотора) Полученные плазмиды, обозначенные pGRN34 (содержащую 5' САААСССАА-3'), PGRN36 (содержащую 5'-ССААССССАА- 3') и pGRN37 (содержащую 5' -СТСАСССТСА-3'), были трансформированы в эукариотные клетки-хозяева (293-клеточную линию, экспрессирующую большой Т антиген вируса SV40), после чего проводили анализ теломеразы, используя экстракты клеток из трансформантов Исследования показали, что активность теломеразы в клетках приводит к образованию нуклеиновых кислот, содержащих измененные последовательности, указывающие, что геномный клон содержит функциональный ген РНКкомпонента и что плазмиды содержат измененный, но функциональный ген РНК-компонента Эти результаты показывают, каким образом настоящее изобретение обеспечивает создание препаратов рекомбинантной теломеразы и способов получения таких препаратов Настоящее изобретение обеспечивает получение рекомбинантной теломеразы человека, содержащей белковый компонент теломеразы человека в функциональной взаимосвязи с рекомбинантным РНКкомпонентом согласно изобретения Молекулы такого рекомбинантного РНК-компонента согласно изобретения включают молекулы, отличающиеся от молекул природного РНК-компонента одной или более заменой оснований, делециями или инсерциями, а также молекулы РНК-компонента, которые идентичны молекуле-природного РНКкомпонента, которая продуцируется в рекомбинантной клетке-хозяине Способ продуцирования таких молекул рекомбинантной теломеразы вклю 42 41 47407 чает трансформирование эукариотной клеткипатент РСТ, № публикации 94/03596, используехозяина, которая экспрессирует белковые компомом в данном описании в качестве ссылки, антиненты теломеразы с помощью рекомбинантного смысловые и рибозимные функции могут быть вектора экспрессии, который кодирует молекулу объединены в одном олигонуклеотиде Более тоРНК-компонента согласно изобретения, и культиго, рибозимы могут содержать один или более вирует указанную клетку-хозяин, трансформиромодифицированных нуклеотидов или модифициванную с помощью указанного вектора при таких рованных связей между нуклеотидами, как это условиях, что белковые компоненты и РНКописано выше в связи с рассмотрением иллюсткомпонент экспрессируются и собираются для ративных антисмысловых олигонуклеотидов сообразования активной молекулы теломеразы, гласно изобретению В одном из аспектов каталиспособной к добавлению последовательностей тическая субъединица рибонуклеазы Р ( человека (необязательно той же последовательности, доили Е coli) модифицируется (см Altman S (1995) бавленной с помощью природной теломеразы) к Biotechnology 13 327) для генерирования направтеломерам хромосомной ДНК Другие используеляющей последовательности, которая соответстмые варианты таких экспрессирующих векторов вует участку РНК-компонента теломеразы млекорекомбинантной ДНК (или плазмид) включают питающнго, спаривающего основания с плазмиды, содержащие ген РНК-компонента тепоследовательностью теломерных повторов, таломеразы человека с делецией, инсерцией или кие варианты рибонуклеазы Р могут расщеплять другой модификацией, которая делает ген нетеломерические последовательности В одном из функциональным Такие плазмиды особенно поаспектов каталитическая субъединица рибонуклезны для генотерапии человека с целью "моделеазы Р (человека или Е coli) модифицируется с лирования" эндогенного гена РНК-компонента, целью генерирования направляющей последовахотя для необратимой гибели обработанных клетельности, которая комплементарна участку РНКток необходима высокоэффективная система компонента теломеразы, так что вариант рибонуктрансформации и рекомбинации леазы Р может расщеплять РНК-компонент теломеразы Такие сконструированные рибозимы моВарианты рибозимов гут быть экспрессированы в клетки или Другие олигонуклеотиды согласно изобретеперенесены с помощью различных средств (нания, именуемые рибозимами, могут также испольпример, липосом, иммунолипосом, непосредстзоваться для ингибирования активности теломевенного ввода в клетки и т д ) Другие типы риборазы В отличие от антисмысловых и других зимов (группа I интрона рибозимов (Cech T (1995) олигонуклеотидов, описанных выше, которые свяBiotechnology 13 323), рибозимы рыбы-молота заны с РНК, ДНК или белковым компонентом те(Edgmgton SM (1992) Biotechnology 10 256) могут ломеразы, рибозим не только связывает, но также быть сконструированы на основе информации о специфически расщепляет и таким образом позаявляемой в данном изоберетении последоватенциально инактивирует целевую РНК, напрительности РНК-компонента теломеразы для катомер, РНК-компонент теломеразы человека Такой лического расщепления Р Н К-компонента телорибозим может содержать 5' - и 3' - терминальные меразы человека и/или последовательности последовательности, комплементарные РНК тетеломерических повторов человека ломеразы В зависимости от сайта расщепления рибозим может приводить к инактивации ферменТаким образом, изобретение обеспечивает та теломеразы См патент РСТ, № публикации создание широкого ряда олигонуклеотидов для 93/23572, см выше Специалисты в данной обласингибирования активности теломеразы Такие ти после рассмотрения последовательности РНК олигонуклеотиды могут использоваться в спосоРНК-компонента теломеразы человека отметят, бах терапии согласно изобретения для лечения что существует несколько полезных рибозимных болезней, причем указанные способы включают целевых сайтов, которые восприимчивы к расщевведение пациенту терапевтически эффективной плению посредством, например, мотива рибозима дозы ингибитора или активатора теломеразы сорыбы-молота Рибозимы этого типа, иллюстригласно изобретения Можно измерить степень инрующие настоящее изобретение, представляют гибирования или активирования для определения собой показанные ниже рибозимы, которые являколичества агента, кооторый должен быть введен ются молекулами РНК, имеющими показанные в терапевтически эффективную дозу, используя ниже последовательности протоколы анализов, приведенные в нахожящихся в одновременном рассмотрении завках к патенту США и в патенте РСТ, № публикации 93/23572, 1 5--UACGGUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAAAAAU.3-, упомянутом выше Как указано в этих заявках и 2 5P-UUAGGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGACAAAA-3', обсуждено выше, ингибирование активности те3 5'-UCUCAGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUA У, ломеразы приводит к гибели иммортализованной и 4 5'~CCCGACACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCCGCG-3 клетки, в то время как активирование активности теломеразы может увеличить репродуктивную продолжительность жизни клеток Терапия с приДругие оптимальные целевые сайты для рименением ингибирования теломеразы является бозимоопосредствованного ингибирования активэффективным средством лечения опухолей, ности теломеразы могут быть определены, как это включая неконтролируемый рост иммортализоописано Sullivan et al в патенте РСТ, № публикаванных клеток, а активация теломеразы является ции 94/02595 и Draper et al в патенте РСТ, № пубэффективным средством лечения, направленного ликации 93/23569, используемые в данном описана предотвращение физиологического старения нии в качестве ссылок Как описано Ни et al , 43 47407 клеток Доставка агентов, ингибирующих или блокирующих активность теломеразы, например антисмыслового олигонуклеотида, олигонуклеотида, формирующего тройную спираль, рибозима или плазмиды, которая управляет экспрессией мутантного РНК-компонента теломеразы, может предотвратить действие теломеразы и, в конце концов, привести к старению и гибели обработанных клеток Аспекты терапии и профилактики Кроме вышеуказанного настоящее изобретение направлено на создание способов терапии, которые обеспечивают то, что нормальные клетки остаются мортализованными, например, РНКкомпонент может быть модифицирован с использованием стандартных способов генной инженерии для уничтожениря всего или части природного гена, кодирующего компонент (например, путем мутагенеза in vitro) за счет генетической рекомбинации После этого такие клетки становятся необратимо мортальными Этот способ используется в генотерапии, когда нормальные клетки, модифицированные таким образом, что они содержат экспрессирующие плазмиды, вводят пациенту, не желая при этом ввести канцерогенные клетки или, если такие клетки все-таки введены, то эти клетки оказываются необратимо мортальными Поскольку теломераза является активной только в опухолевых, зародышевых и определенных стволовых клетках кроветворной системы, на другие клетки не влияет терапия, предусматривающая подавление теломеразы Можно также предпринять шаги для избежания контакта ингибитора теломеразы с зародышевыми или стволовыми клетками, хотя это может быть и несущественно Например, поскольку зародышевые клетки экспрессируют активность теломеразы, инргибирование теломеразы может отрицательно сказаться на сперматогенезе и жизнеспособности спермы, допуская , что ингибиторы теломеразы могут быть эффективными контрацептивами или агентами стерилизации Однако такое влияние контрацептивов может оказаться нежелательным для пациента, получающего ингибитор теломеразы согласно изобретения для лечения рака В таких случаях можно вводить ингибитор теломеразы согласно изобретения так, чтобы обеспечивалось продуцирование ингибитора только в период терапии, с тем чтобы негативное воздействие на зародышевые клетки было только временным В других терапевтических способах согласно изобретения используется нуклеиновая кислота РНК теломеразы согласно изобретения для стимулирования активности теломеразы и увеличения репродуктивных клеточных циклов Эти способы могут осуществляться за счет достаки в клетку рибонуклеопротеида функциональной рекомбинантной теломеразы согласно изобретения Например, рибонуклеопротеид может быть доставлен в клетку в липосоме, или ген РНКкомопнента теломеразы человека (или рекомбинантный ген с различными регуляторными элементами) может быть использован в эукариотной экспрессирующей плазмиде (с или без кодирования последовательности для экспрессии белковых компонентов теломеразы) для активирования ак 44 тивности теломеразы в различных нормальных клетках человека, в которых в противном случае отсутствует детектируемая активность теломеразы из-за низких уровней экспрессии РНКкомпонента или белкового компонента теломеразы Если РНК- компонент теломеразы недостаточен для стимулирования активности теломеразы, то он может быть трансфецирован наряду с генами, экспрессирующими белковые компоненты теломеразы, для стимулирования активности теломеразы Таким образом, изобретение предусматривает создание способов лечения состояния, связанного с активностью теломеразы внутри клеток или группы клеток путем контактирования клетки(ок) с терапевтически эффективным количеством агента, изменяющим активность теломеразы в этой клетке Клетки, которые включают лишние реплики гена РНК-компонента теломеразы, могут проявлять повышенную активность теломеразы и связанное с этим увеличение репродуктивных клеточных циклов Такая терапия может осуществляться ex vivo на клетках для последующего введения в организм-хозяин или может осуществляться in vivo Преимущества стабилизации или увеличения длины теломера за счет добавления экзогенных генов теломеразы ex vivo в нормальные диплоидные клетки включают стабилизация теломера может задержать старение клеток и позволить потенциально нелимитированную амплификацию клеток, и нормальные диплоидные клетки с увеличенным репродуктивным клеточным циклом могут культивироваться in vitro при тестировании лекарств, наработке вирусов и для других полезных целей Более того, стволовые клетки различных типов, амплифицированные ex vivo, могут быть использованы в клеточной терапии определенных заболеваний, как это указано выше Стабилизация теломера может способствовать также предотвращению распространения рака в репликацирующихся клетках за счет защиты теломеров от их критического укорачивания на грани гибели клеток Во время кризиса происходит массовая геномная нестабильность из-за потери защитного эффекта теломерической кэпгруппировкой "Генетическая надстройка" повторно перемещается и почти все клетки гибнут Редкие клетки, которые возникают при этом процессе, обычно явялются анеуплоидами с многочисленными перестройками гена и прекращают восстанавливать стабильность в своих теломерах за счет экспрессии теломеразы Если кризис может быть предотвращен за счет сохранения длины теломеров, то геномная нестабильность, связанная с кризисом, может быть также предотвращена, ограничивая риск того, что отдельная клетка будет подвержена требуемому количеству генетических мутаций, приводящих к зарождению метастатического рака Клетки, которые могут быть предназначены для терапии с помощью гена теломеразы (терапия, предусматривающая увеличение активности теломеразы в клетке-мишени, включают, но не ограничиваются этим, кроветворные стволовые клетки (СПИД и постхемотерапия), васкулярные 45 46 тивное количество ингибитора или активатора теломеразы согласно изобретения Фармацевтические составы ингибиторов теломеразы согласно изобретения включают мутантный РНК-компонент теломеразы человека, антисмысловой олигонуклеотид или олигонуклеотид, образующий тройную спираль, который связывает РНК-компонент или ген РНК-компонента теломеразы человека или рибозим, способный расщеплять РНК-компонент теломеразы человека, или их комбинации или другие фармацевтические препараты в фармацевтически доступном носителе или соли Другие фармацевтические составы согласно изобретения содержат препарат активатора теломеразы, например, очищенную теломеразу человека или мРНК белковых компонентов теломеразы и РНКкомпонента теломеразы, и используются для лечения заболеваний, связанных с физиологическим старением В этом аспекте смысловой мутированный РНК-компонент теломеразы млекопитающего вводят в клеточную популяцию, указанный смысловой мутированный РНК-компонент теломеразы содержит по меньшей мере одно ошибочное спаривание оснований относительно последовательности повторов теломеразы человека, но способен проявлять активность теломеразы в сочетании с полипептидным компонентом теломеразы человека, продуцируя ошибочное включение в выбранные нуклеотидные позиции в повторе теломеразы человека, генерируя таким образом теломеры, которые базируются на постоянном присутствии смыслового мутированного РНКкомпонента для существенной репликации Предусмотрен терапевтический способ, при котором смысловой мутированный РНК-компонент теломеразы добавляют в клеточную популяцию в течение значительного периода времени для введения теломерических последовательностей, которые являются в основном нефункциональными в качестве матриц для РНК-компонента природной теломеразы млекопитающего, за которой следует удаление смыслового мутированного РНК-компонента теломеразы, что приводит к быстрому уменьшению средней длины теломера в популяции клеток и усиленному старению и отмиранию клеток В технологии приготовления лекарственного средства, пригодного для парантерального, назального, орального или другого способа введения может быть предусмотрен терапевтический агент См патент РСТ, № публикации 93/23572, упомянутый выше 47407 эндотелиальные клетки (сердечные и церебрососудистые болезни), кожные фибробласты и базальные кожные кератиноциты (заживление ран и ожогов), хондроциты (артриты), астроциты головного мозга и глиальные микрофаги (болезнь Альцгеймера), остеобласты (остеопороз), клетки сетчатой оболочки (болезни глаз) и панкриатические островковые клетки (диабеты 1-ого типа) Обычно терапевтические способы согласно изобретения включают введение олигонуклеотида, который выступает в роли ингибитора или стимулятора активности теломеразы в физиологических условиях in vivo и будут оставаться стабильными в этих условиях Как отмечено выше, модифицированные нуклеиновые кислоты могут применяться для придания такой стабильности, также как и для обеспечения доставки олигонуклеотида в нужную ткань, орган или клетку Способы, пригодные для доставки олигонуклеотидов для терапевтических целей, описаны Inouye et al , патент США 5,272,065, используемый в качестве ссылки В то время как олигонуклеотиды могут вводиться непосредственно в качестве лекарства в подходящем фармацевтическом препарате, их также можно вводить, используя генотерапию и экспрессирующие рекомбинантную ДНК плазмиды согласно изобретения Одна из таких плазмид описана ниже в примере 8 В общем случае, такие плазмиды содержат промотор и, необязательно, энхансер (выделенный из любых содержащихся внутри промотора последовательностей), которые служат для управления транскрипцией олигонуклеотида, а также другие регуляторные элементы, которые обеспечивают поддержание эписомного состояния или хромосомной интеграции и высокоуровневую транскрипцию, если это необходимо Векторы на основе аденовируса часто используют для генотерапии и являются подходящими для применения их совместно с реагентами и способами согласно настоящего изобретения См патенты РСТ, №№ публикации 94/12650, 94/12649 и 94/12629 Для таких целей используются следующие промоторы металлотионеиновый промотор, постоянный аденовирусный основной поздний промотор, индуцируемый дексаметазоном промотор вируса опухоли молочной железы мышей (ВОМЖМ), промотор SV40, промотор pollll MRP, основной промотор вируса паростальной саркомы мышей (ВПСМ), индуцируемый тетрациклином промотор ЦМВ (цитомегаловирус) ( например, непосредственно ранний промотор ЦМВ человека) и основной промотор ЦМВ Плазмида, применяемая для генотерапии, может содержать другие функциональные элементы, например, селектируемые маркеры, идентифицирующие участки и другие гены Экспрессирующие рекомбинантную ДНК плазмиды могут также использоваться для получения олигонуклеотидов согласно изобретения для доставки средствами, отличными от генотерапии, хотя более экономичным может оказаться создание коротких олигонуклеотидов посредством химического синтеза in vitro В связанных с этим аспектах в изобретении особое внимание уделяется фармацевтическим составам, включающим терапевтически эффек Способы диагностики Настоящее изобретение обеспечивает создание способов диагностики и реагентов дополнительно к фармацевтическим составам и терапевтическим способам, описанным выше Изобретение обеспечивает создание способов диагностики для определения уровня, количества или наличия РНК-компонента теломеразы человека, теломеразы или активности теломеразы в клетке, клеточной популяции или образце ткани Во взаимосвязанном аспекте настоящее изобретение обеспечивает создание реагентов, применяемых для таких способов, необязательно помещенных в кит вместе с инструкциями для использования кита при практическом применении 47 47407 способа диагностики Как отмечено выше в связи с рассмотрением тестов, связанных с определением того, что клон pGRN7 содержит кДНК РНКкомпонента теломеразы человека, уровни РНКкомпонента в опухолевых клетках возрастают Таким образом, детектирование РНК-компонента является полезным способом диагностики клеток опухоли Кроме того, зонды или праймеры, которые специфически связаны с РНК-компонентом теломеразы человека (или любой нитью гена РНКкомпонента), могут быть использованы в диагностических способах детектирования наличия в образце нуклеиновой кислоты теломеразы Праймеры и зонды являются олигонуклеотидами, которые комплементарны, и таким образом связаны, с целевой нуклеиновой кислотой Хотя праймеры и зонды могут отличаться по последовательности и по длине, основным отличительным фактором является фактор функции праймеры служат для инициации синтеза ДНК, как при амплификации ЦПР, в то время как зонды обычно используются только для связывания с целевой нуклеиновой кислотой Типовые длины праймера или зонда могут находиться в диапазоне от 8 до 20 30 или более нуклеотидов Праймер или зонд может быть также промаркирован для облегчения детектирования (те обычно для таких целей используются радиоактивные или флуоресцентные молекулы) или очистки/разделения (т е часто для этих целей используется биотин или авидин) Особо предпочтительный способ диагностики согласно изобретения включает детектирование последовательности РНК-компонента теломеразы в клетке или в образцах тканей, взятых у пациентов, подозреваемых в риске заболевания раком Такие способы обычно включают связывание меченого зонда или праймера с последовательностью РНК-компонента в таких условиях, когда только полностью спаренные (комплементарные) последовательности связаны (гибридизированы) друг с другом Детектирование меченого материала, связанного с РНК в образце, соотносится с наличием активности теломеразы и наличием раковых клеток Некоторые клетки могут экспрессировать РНК-компонент теломеразы, но оставаться теломеразонегативными из-за отсутствия экспрессии белковых компонентов теломеразы При необходимости детектирования наличия активности теломеразы в таких клетках необходимо вначале выделить белок, а затем определить, содержит ли белковая фракция РНК-компонент теломеразы, что сигнализировало бы о наличии активности теломеразы Способы диагностики согласно изобретения могут быть особо применимы при детектировании наличия активности теломеразы в тканевых биопсиях и гистологических сегментах, в которых указанный способ реализуется in situ, обычно после амплификации РНКкомпонента теломеразы, используя специфические праймеры ЦП Р согласно изобретения Изобретение также обеспечивает создание полинуклеотидных зондов для диагностики болезненных состояний (например, неоплазии или преднеоплазии) путем детектирования РНКкомпонента теломеразы или перестройки, или 48 амплификации гена РНК-компонента теломеразы в клетках, взятых у пациента, или детектирования аллеля РНК-компонента патогномоничной теломеразы (например, посредством анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов или аллель-специфического ЦПР анализа) Обычно детектирование осуществляют посредством гибридизации in situ с использованием меченого (на32 32 14 3 пример, Р, S, С, Н, флуоресцентного, биотинилированного, дигоксигенинилированного) полинуклеотида РНК-компонента теломеразы, хотя может быть использовано нозернблоттирование, дот-блоттирование или гибридизация раствора на основной массе РНК или поли А+ РНК, выделенной из клеточного образца, а также амплификация ЦПР с использованием праймеров, специфических для РНК-компонента теломеразы Клетки, содержащие измененное количество РНК-компонента теломеразы по сравнению с ненеопластическими клетками того же типа(ов) клетки идентифицируются в качестве возможных больных клеток Аналогично, детектирование патогномоничных перестроек или амплификации локуса гена РНК-компонента теломеразы или тесно связанных локусов в образце клетки указывает на наличие паталогического состояния или предрасположения к развитию патологического состояния (например, рака, генетического заболевания) Полинуклеотидные зонды можно также использовать для судебной экспертизы личности, например, для установления отцовства или идентификации подозреваемых в криминальных действиях или неизвестных трупов В пределах человеческой популяции могут быть незначительные отклонения в основной первичной последовательности РНК-компонента теломеразы, включая варианты аллелей, полиморфизмы рестрикционных сайтов и аллели РНКкомпонента теломеразы, связанные с генетическим заболеванием При необходимости умноженные копии ЦПР для амплификации в основном полноразмерных реплик РНК-компонента теломеразы могут быть выбраны по усмотрению исследователя Аналогичным образом могут быть выбраны умноженные копии для амплификации участков гена РНКкомпонента теломеразы или РНК Экспрессия РНК-компонента теломеразы В зависимости от длины и целевого предназначения праймера, зонда или другой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательности РНК-компонента теломеразы человека, могут быть использованы экспрессирующие плазмиды согласно изобретения Например, может быть выполнено рекомбинантное продуцирование полноразмерного РНК-компонента согласно изобретения с использованием экспрессирующей рекомбинантную ДНК плазмиду согласно изобретения, содержащую нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность РНКкомпонента, находящуюся в положении для транскрипции под контролем подходящего промотора Клетки-хозяева для таких плазмид могут быть прокариотными или эукариотными, а промотор, а также другие регуляторные элементы и селектируемые маркеры, выбранные для введения в 49 47407 экспрессирующую плазмиду, зависят от клеткихозяина, используемой для продуцирования Неповрежденный ген РНК-компонента, т е промотор, содержащий любые регуляторные последовательности на 5' -участке гена и кодирующий РНК-компонент участок могут быть использованы для экспрессии РНК-компонента в клетки человека, включая клетки, которые иммортализованы посредством вирусной трансформации или рака Промотор гена РНК-компонента может быть упорядочен, однако по этой и другим причинам может возникнуть необходимость в экспрессии РНК-компонента под контролем отличного от него промотора С другой стороны, промотор гена РНКкомпонента может использоваться независимо от кодирующей РНК-компонент последовательности для экспрессии других представляющих интерес кодирующих последовательностей Например, можно исследовать транскрипционную регуляцию гена РНК-компонента за счет слияния промотора гена РНК-компонента с кодирующей последовательностью для получения последовательности, кодирующей репортер, например, кодирующей последовательности для бета-галактоз ид азы или другого фермента или белка, экспрессия которого может легко контролироваться Таким образом, промотор или другие регуляторные элементы гена РНК-компонента теломеразы человека могут использоваться не только для экспрессии РНКкомпонента, но также белковых компонентов теломеразы человека, антисмысловых или других олигонуклеотидов, а также представляющих интерес других генных продуктов в клетки человека Экспрессирующие плазмиды, содержащиенеповрежденный ген РНК-компонента теломеразы человека, могут быть особенно полезны для ряда целей, включая генотерапию Специалисты в данной области понимают, что широкий набор экспрессирующих плазмид может быть использован для продуцирования требуемых нуклеиновых кислот согласно изобретения и что термин "плазмида", используемый в данном описании, относится к любому типу нуклеиновой кислоты (из фага, вируса, хромосомы и т д ), которая может использоваться для ввода специфической генетической информации в клетку-хозяин и сохранения этой информации во времени Выделение белкового компонента теломеразы Реагенты согласно настоящего изобретения также позволяют клонировать и выделять нуклеиновые кислоты, кодирующие белковые компоненты человека, а также ферменты теломеразы других млекопитающих, что ранее не представлялось возможным Доступ к таким нуклеиновым кислотам обеспечивает дополнительные преимущества относительно преимуществ, обеспечиваемых нуклеиновыми кислотами, содержащими последовательности нуклеиновых кислот РНК-компонента теломеразы человека Например, как это показано выше, терапевтические преимущества согласно настоящего изобретения могут возрасти в некоторых случаях за счет использования очищенных препаратов белковых компонентов теломеразы человека и за счет доступа к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные белковые компоненты Нуклеиновые кислоты согласно изобретения, 50 52 51 47407 ферментативной активности теломеразы См содержащейся внутри РНК-компонента, например, Autexier and Greider, 1994, Genes and Development белковых компонентах РНК-компонента теломе8 563-575, используемый в данном описчании в разы человека Имеется несколько форматов, качестве ссылки РНК конструируется так, чтобы включая сдвиг геля, связывание на фильтре, футона содержала метку, подобную эпитопному мепринтинг, норзвестерн (зонд РНК белкового блота) чению белков Метка может представлять собой и фотосшивка, для детектирования такой связи и РНК-последовательность, с которой прочно свявыделения компонентов, которые специфически зан лиганд, например, антитело со специфической связаны с РНК-компонентом Эти анализы можно последовательностью РНК, белок, связывающий использовать для идентификации связывающих нуклеиновую кислоту, имеющую специфическую белков, для отслеживания очистки связывающих последовательность или органический краситель, белков, для установления характеристики сайтов который прочно связан со специфической послесвязывания РНК, для определения молекулярного довательностью РНК Толерантность теломеразы размера связывающих белков, для мечения белдля последовательности и расположения метки ков с целью предварительного выделения и для может быть исследована с использованием станпоследующей иммунизации животных с целью дартных способов Синтез измененного РНКгенерации антител для получения антител, искомпонента и этапы восстановления согласно этопользуемых для выделения белка или идентифиго метода можно также выполнять in vivo Аффинкации нуклеиновой кислоты, кодирующей белок в ный захват, использующий иммобилизованный связанной системе транскрипциил'рансляции лиганд для метки РНК, далее можно использовать Очистка белкового компонента теломеразы для выделения фермента млекопитающего Скрининг экспрессии также можно использоБелковый компонент теломеразы млекопивать для выделения белковых компонентов фертающего может быть очищен с помощью обычных мента теломеразы При этом способе кДНК эксбиохимических способов от теломеразо экспреспрессирующие библиотеки могут быть сирующих клеток, таких как клетки НТ1080, клетки скринированы с помощью меченой РНК теломера293 и другие подходящие линии иммортализованзы, а белки, кодирующие кДНК, которые специфиных клеток Например, но не ограничиваясь этим, чески связаны с РНК теломеразы, могут быть теломеразу человека можно в значительной стеидентифицированы Молекулярный генетический пени очистить от экстрактов клеток в соответствии подход, использующий трансляционное ингибиросо способом, описанным в заявке к патенту США вание, может также использоваться для выделе08/288,501, поданной 10 августа 1994 г, которая ния нуклеиновых кислот, кодирующих белковые используется в данном описании в качестве ссылкомпоненты фермента теломеразы При этом споки Экстракты теломеразы млекопитающего могут собе последовательности РНК теломеразы слибыть очищены от РНК-компонента теломеразы ваются с верхней частью селектируемого маркепутем обработки рибонуклеазой или другим подра При экспрессии в подходящей системе ходящим средством для диссоциации и/или деселектируемый маркер явялется функциональградации РНК-компонента теломеразы, оставляя ным При кодировании кДНК экспрессируется свяв то же время белковый компонент теломеразы зывающий РНК теломеразы белок, при этом белок практически неповрежденным и способным к воссвязан со своей последовательностью распознастановлению путем добавления экзогенного РНКвания, блокируя таким образом трансляцию секомпонента теломеразы, например такого, котолектируемого маркера и, таким образом, позволяя рый может быть продуцирован рекомбинантно или идентифицировать клон, кодирующий белок В подобным образом Очищенный таким образом других вариантах этого спосба заблокированная белковый компонент теломеразы и необязательно трансляция селектируемого маркера позволяет очищенный от эндогенного РНК-компонента телорасти трансформированным клеткам Другие сисмеразы, можно использовать в описанных здесь темы, которые можно использовать, включают скрининг-анализах и для других целей "ловушечную систему взаимодействия", описанГенотерапия ную в патенте РСТ, № публикации WO 94/10300, Перенос экзогенного генетического материала "одногибридную" систему, описанную Li в клетки (те ДНК-опосредствованная трансфекandHerskowitz, 17 Dec 1993, Science 262 1870ция) является ценным способом базового иссле1874, and Zervos et al , 29 Jan 1993, Cell 72 223дования в клеточной биологии и молекулярной 232, и "двухгибридную" систему, которую можно генетике, а также основой для создания эффекприобрести в фирме Clontech тивных способов генотерапии человека До сих пор большинство опытов по исследованию переАнализы на связывание РНК теломеразы или носа генов основывалось на использовании репактивности теломеразы для детектирования спеликационно-дефективных вирусных векторов, нецифических связывающих белков и активности сущих терапевтическую полинуклеотидную могут использоваться для облегчения очистки последовательность как часть ретровирусного фермента теломеразы и идентификации нуклеигенома (Miller et al (1990) Мої Cell ВЫ 10 4239, новых кислот, кодирующих белковые компоненты Kolberg R (19920 J NIH Res 4 43, Cornetta et al фермента Например, нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности РНК-компонента, (1991) Hum Gene Ther 2 215) Аденовирусные могут использоваться в качестве аффинных реавекторы для возможного использования в генотегентов для выделения, идентификации и очистки рапии человека также описаны Rosenfeld et al пептидов белков или других составов, которые (1992) Cell 68 143 специфически связаны с последовательностью, Другим способом переноса гена в генотерапии 53 47407 человека является физический перенос плазмиды ДНК непосредственно в клетки опухоли in situ В отличие от вирусным векторам, которые должны размножаться в культивированных клетках, плазмида ДНК может быть очищена до однородного состояния, что уменьшает таким образом потенциал ее патогенного загрязнения В некоторых случаях (например, для клеток опухоли) нет необходимости, чтобы экзогенная ДНК устойчиво внедрялась в трансдуцированную клетку, поскольку неустойчивая экспрессия может быть достаточной для умерщвления клеток опухоли Липосомоопосредованный перенос ДНК описан рядом исследователей (Wang and Huang (1987) Biochem Biophys Res Commun 147 980, Wang and Huang (1989) Biochemistry 28 9508, Litzmger and Huang (1992) Biochem Biophys Acta 1113 201, Gao and Huang (1991)Biochem Biophys Res Commun 179 280, Feigner WO91/17424.WO91/16024) Иммунолипосомы в качестве носителей экзогенных полинуклеотидов также описаны у Wang and Huang (1987) Ргос Natl Acad Sci (USA) 84 7851, Trubetskoy et al (1992) Biochem Biophys Acta 1131 311 Гипотетически можно ожидать, что иммунолипосомы имеют клетки улучшенного типа по сравнению с липосомами благодаря присоединению специфических антител, предположительно связанных с поверхностными антигенами специфических типов клеток Behr et al (1989) Ргос Natl Acad Sci (USA) 86 6982, сообщают об использовании липополиамина в качестве реагента для возможной самотрансфекции без необходимости использования любого дополнительного фосфолипида для образования липосом Соответственно, полинуклеотид, в основном идентичный по меньшей мере 25 нуклеотидам, предпочтительно от 50 до 100 нуклеотидам или более последовательности РНК-компонента теломеразы или ее комплимента, операбельно связывается с гетерологичным промотором для образования транскрипционной единицы, способной экспрессировать РНК-компонент теломеразы или антисмысловой полинуклеотид РНК-компонента теломеразы в клетку человека Подобная транскрипционная единица может содержаться в трансгене, аденовирусном векторе или в другой генотерапевтической модальности для доставки в клетки человека, например, для терапии теломеразообусловленных заболеваний (например, неоплазии) Подходящие способы доставки конструкции, экспрессирующей смысловой или антисмысловой РНК-компонент теломеразы, выбирается исследователем, исходя из установившейся практики и регуляторных требований Варианты трансгенных животных Геномные клоны РНК-компонента теломеразы млекопитающих, в частности гены РНКкомпонента теломеразы, существенно идентичные РНК-компоненту теломеразы мышей можно использовать для создания гомологичных нацеливающих конструкций для генерирования клеток и трансгенных животных, отличных от человека, которые имеют по меньшей мере один функционально разрушенный аллель РНК-компонента теломеразы Правила для конструирования гомологичных нацеливающих конструкций можно найти в 54 следующих источниках Rahemtulla et al (1991) Nature 353 180, Jasm et al (1990) Genes Devel 4 157, Koh et al (1992) Science 256 1210, Molina et al (1992) Nature 357 161, Grusby et al (1991) Science 253 1417, Bradley et al (1992) Bio/Techchnology 10 534, используемых в данном описании в качестве ссылок Гомологичное нацеливание можно использовать для генерирования так называемой "модельной" мыши, которая гетерозиготна или гомозиготна инактивированному аллелю РНК-компонента теломеразы Такие мыши могут быть проданы в качестве подопытных животных для проведения исследований в области создания иммуносистем, неоплазии, сперматогенеза, а также могут быть использованы в качестве домашних животных, для получения животного белка (корма) и для других целей Химеровые целевые мыши выводят согласно Hogan et al Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) and Teratocarcmomas and Embryonic Stem Cells A Practical Approach, E J Robertson, ed , IRL Press, Washington, D c , (1987), используемые в данном описании в качестве ссылок Эмбрионными стволовыми клетками манипулируют в соответствии с опубликованными методиками (Teratjcarcmomas and Embryonic Stem Cells A Practical Approach, E J Robertson, ed , IRL Press, Washington, D/C/ (1987), Zjilstra et al (1989) Nature 342 435, Schwartzberg et al (1989) Science 246 799, каждая из которых используется в данном описании в качестве ссылки) Кроме того, реплика геномного гена или кДНК РНК-компонента теломеразы может быть использована для конструирования трансгенов с целью экспрессирования РНК-компонента теломеразы на высоких уровнях и/или под транскрипционным контролем последовательностей транскрипционного контроля, которые обычно не находятся рядом с геном РНК-компонента теломеразы Например, но не ограничиваясь этим, конститутивный промотор, например, ВГЧ-тк или пжк-промотор) или специфическая для данной клеточной линии транскрипционная регуляторная последовательность (например, промотор/энхансер гена CD4 или CD8)Moryr быть операбельно связаны с полинуклеотидной последовательностью РНК-компонента теломеразы с целью образования трансгена (обычно в сочетании с селектируемым маркером, например, с экспрессирующей нео ген кассетой) Такие трансгены могут вводиться в клетки (например, ES-клетки, кроветворные стволовые клетки), при этом могут быть получены трансгенные клетки и трансгенные животные, отличные от человека Трансгенные клетки и/или трансгенные животные, отличные от человека могут использоваться для скрининга антинеопластических агентов и/или потенциальных карциногенов, посколоьку сверхэкспрессия РНК- компонента теломеразы или неподхоходящая экспрессия теломеразы может привести к преднеопластическому или неопластическому состоянию Скрининг агента Полинуклеотиды РНК-компонента теломеразы, препараты белкового компонента теломеразы, матрицы повтора теломера и реакции связывания 55 56 та В предпочтительных вариантах температура реакции составляет по меньшей мере приблизительно 15 градусов по Цельсию, более предпочтительно от 35 до 42 градусов по Цельсию, а время инкубации составляет приблизительно по меньшей мере 15 секунд, хотя более длительный срок инкубации предпочтительнее, так что в некоторых вариантах достигается равновесное связывание Кинетика связывания и термодинамическая устойчивость связанных комплексов определяют диапазон, в котором можно варьировать продолжительность, температуру, соль, рН и другие условия реакции Однако для любого частного варианта необходимые условии реакции связывания могут быть легко определены специалистом, используя обычные в данной области способы, которые могут включать анализ связывания с применением анализа по Scatchard, анализа по Hill и другие способы (Proteins, Structures and Molecular Principles (1984) Creighton (ed ), W H Freeman and Company, New York) 47407 и т п на практике используются в соответствии с экспериментальными примерами В общем случае белковые компоненты теломеразы получают обычной очисткой от теломеразо экспрессирующих клеток млекопитающего и удаляют из сопутствующего РНК-компонента перед их использованием в рассматриваемом анализе Специфические условия водного раствора выбираются специалистом в соответствии с обычными способами Как правило, могут использоваться следующие условия для водного буфера 10 250 мМ NaCI, 5 50 мМ трис Hhl, pH 5 8, при необязательной добавке двухвалентного катиона(ов), и/или хелатных соединений металлов, и/или неионных детергентов и/или мембранных фракций Специалисты в данной области понимают, что добавления, делеции, модификации (например, рН) и замещения (например, NCI на KCI или замена буфера) могут выполняться при указанных основных условиях Модификации основных условий реакции связывания могут осуществляться пока в контрольной реакции(ях) происходит формирование специфического холоэнзима и/или активности теломеразы Условия, которые не обеспечивают специфическое связывание и расщепление в контрольных реакциях (отсутствие включенного агента), не подходят для использования в анализах связывания Предпочтительно для определения связывания РНК-компонента теломеразы с иммобилизованным белковым компонентом теломеразы РНКкомпонент теломеразы метится детектируемым маркером, обычно биотиниловой группой, флуоресцентным участком или введенным радиомеченым нуклеотидом В качестве подходящего маркирования белкового компонента теломеразы используют, но не ограничиваются этим, радиомечение путем введения радиомеченой аминокислоты (например, 14С-меченый люцин, 3 Нмеченый глицин, 3 S-меченый метионин), радиомечение посредством посттрансляционной радиоиодинации с помощью 1251 или 1311 (например, с помощью реакции Bolton-Hunter и хлорамина Т), мечение путем посттрансляционного фосфорилирования с помощью Р (например, фосфорилаза и неорганический радиомеченый фосфат), флюоресцентного мечения путем введения флюоресцентной метки (например, флюоресцина или родамина) или мечение с помощью других обычных методов, известных в данной области В вариантах, в которых один из видов полипептида иммобилизуют путем связывания с субстратом, другой компонент обычно метят с помощью детектируемого маркера Меченые белковый компонент или РНКкомпонент теломеразы вводят в контакт с иммобилизованным белковым или РНК-компонентом теломеразы соответственно и определяют способность агента изменять количество меченого компонента, который становится иммобилизованным (те , который связывает смежный компонент теломеразы и захватывается) Можно варьировать время и температуру инкубации при реакции связывания до тех пор, пока выбранные условия позволяют осуществлять специфическое связывание в контрольной реакции при отсутствии аген Специфическое связывание меченого белкового компонента теломеразы с иммобилизованным РНК-компонентом теломеразы соответственно определяют путем включения немеченого конкурентного белка (например, альбумина) и/или немеченой РНК После завершения реакции связывания детектируют количество меченого вида(ов), который в данном случае связан с иммобилизованным видом Например, но не ограничиваясь этим, после подходящего для связывания периода инкубации удалют жидкую фазу, содержащую неиммобилизованный меченый белковый компонент теломеразы, а субстрат, содержащий иммобилизованный связанный вид холоэнзима теломеразы и любой меченый белковый компонент теломеразы, связанный с указанным холоэнзимом, промывают в подходящем буфере, необязательно содержащем немеченый блокирующий агент(ы), а промывочный буфер удаляют После промывания определяют количество детектируемой метки, остающейся специфически связанной с иммобилизованным меченым компонентом (например, оптическим, ферментативным, авторадиографическим или другими радиохимическими способами) В некоторых вариантах предусматривается добавление немеченых блокирующих агентов, которые ингибируют неспецифическое связывание В качестве таких блокирующих агентов можно указать, но не ограничиваясь этим, следующие агенты ДНК тимуса теленка, ДНК спермы лосося, дрожжевую РНК, олигонуклеотиды различной длины смешанной последовательности (случайной или псевдослучайной последовательности), альбумин бычьей сыворотки, неионные детергенты (NP-40, Tween, Triton X-100 и др), белки нежирного сухого молока, реактив Денхардта, поливинилпиролидон, фиколл и другие блокирующие агенты Специалисты могут по своему усмотрению выбирать блокирующие агенты в подходящей концентрации для использования в анализе связывания В вариантах, где РНК-компонент или белковый компонент теломеразы является иммобилизованным, может быть использована ковалентная 57 47407 или нековалентная связь с субстратом Химизм ковалентной связи включает, но не ограничивается этим, хорошо исследованные в данной области способы (Kadonaga and Tijan (1986) Proc Natl Acad Sci ( U S A ) 83 5889) Одним из примеров такой связи, не носящим ограничительный характер, является ковалентная связь с субстратом, полученным с помощью цианогенбромида (например, CNBr- сефароза 4В) Может оказаться желательным использование спейсера для уменьшения потенциальной стерической помехи от субстрата Нековалентное связывание белков с субстратом включает, но не ограничивается этим, связывание белка с заряженной поверхностью или связывание со специфическими антителами В одном из вариантов возможные терапевтические агенты идентифицируют за счет их способности блокировать связывание белкового компонента теломеразы с РНК-компонентом теломеразы Обычно РНК-компонент теломеразы, используемый при этих способах, содержит последовательность природного РНК-компонента теломеразы млекопитающего (например, РНК-компонент человека), хотя иногда используют последовательности мутантного РНК-компонента теломеразы, если мутантный РНК-компонент теломеразы связан с белковым компонентом теломеразы в условиях контрольного анализа (например, в физиологических условиях) В одном из вариантов выполнения изобретения возможные модулирующие теломеразу агенты идентифицируют по их способности обеспечивать статистически значимое уменьшение или увеличение транскрипции репортерной полинуклеотидной последовательности (например, ген бета-галактозидазы, ген люциферазы, ген HPRT), операбельно связанной с транскрипционной регуляторной последовательностью гена РНК-компонента теломеразы млекопитающего, преимущественно гена РНКкомпонента теломеразы человека в метаболически активной клетке млекопитающего Репортерный ген (например, HPRT) может быть вставлен в сайт рестрикции или тупоконечный сайт дц кДНК РНК-компонента теломеразы млекопитающего с тем, чтобы генерировать гомологичную нацеливающую конструкцию или трансген, где в жизнеспособной клетке млекопитающего репортерный ген находится под транскрипционным контролем промотора эндогенного гена РНК-компонента теломеразы и связанных транскрипционных контрольных элементов Агенты, осуществляющие дозозависимую транскрипционную модуляцию репортерного гена, идентифицируют таким образом как возможные теломеразомодулирующие агенты В одном из вариантов выполнения изобретения эндогенный ген РНК-компонента теломеразы в клетке млекопитающего нацеливают с помощью гомологичной нацеливающей конструкции для размещения репортерной полинуклеотидной последовательности в операбельной связи с верхней частью транскрипционной регуляторной последовательности (например, промотора) эндогенного гена РНК-компонента теломеразы в хромосомном локусе эндогенного гена В альтернативном варианте экзогенный полинуклеотид, 58 содержащий репортерный полинуклеотид, операбельно связан с транскрипционным регуляторным участком гена РНК-компонента теломеразы млекопитающего (например, промотора и верхними сайтами связывания транскрипционного фактора), экзогенный полинуклеотид переносится в клетку млекопитающего, в которой он может негомологично включаться в местоположение хромосом и/или удерживаться или реплицироваться в качестве эписомного полинуклеотида Агенты, которые осуществляют статистически значимую транскрипционную модуляцию репортерного полинуклеотида в клетках, обработанных агентом, идентифицируются таким образом как возможные агенты, модулирующие теломеразу млекопитающего Агенты, модулирующие теломеразу, которые уменьшают способность клетки восстанавливать разрушение теломера или подавлять репликацию теломера (например, посредством конкурентно ингибирующей эндогенной природной теломеразы), являются возможными антинеопластическими агентами или сенсибилизирующими агентами, которые сенсибилизируют клетки (например, неопластические клетки) к агентам разрушения теломера (например, к алкалирующим агентам или ионизирующей радиации) Возможные антинеопластические агенты затем исследуют, кроме того, на антинеопластическую активность путем анализа, который обычно проводят для предсказания их пригодности для использования в качестве антинеопластических лекарственных средств для человека Примерами таких анализов, но не ограничиваясь этим, являются (1) анализ на способность возможных агентов ингибировать способность независимых от закрепления трансформированных клеток к росту в мягком агаре, (2) анализ на способность уменьшать онкогенность трансформированных клеток, трансплантированных голым мышам, (3) анализ на способность к реверсированию морфрлогической трансформации трансформированных клеток, (4) анализ на способность уменьшать рост трансплантированных опухолей у голых мышей, (5) анализ на способность подавлять образование опухоли или преднеопластические клетки в моделях животных, обладающих спонтанным или химически индуцированным онкогенезом и (6) анализ на способность индуцировать более дифференцированный фенотип в трансформированных клетках, в которые вводят агент Анализы для детектирования способности агентов к ингибированию или усилению белкового компонента теломеразы связывание РНКкомпонента теломеразы и/или ферментативной активности теломеразы обеспечивает легкий высокопроизводительный скрининг банков агентов (например, библиотек составов, библиотек пептидов и т п) для идентификации антагонистов или агонистов теломеразы Такие антагонисты и агонисты могут модулировать активность теломеразы и таким образом модулировать компетентность теломерических повторов и репликационного потенциала Введение эффективной дозы агента, способного специфически ингибировать у пациента ак 59 тивность теломеразы, можно использовать в качестве терапевтического или профилактического способов лечения патологических состояний (например, рака, воспалений, лимфопролиферативных заболеваний, автоиммунных болезней, невродегенеративных заболеваний и т п), которые эффективно излечиваются за счет модуляции активности теломеразы и восстановления и репликации ДНК Как будет понятно специалистам в данной области после прочтения этого описания, настоящее изобретение обеспечивает создание ценных реагентов, относящихся к теломеразе человека, а также способов терапии и диагностики Данное описание в силу необходимости включает ограниченный набор таких способов, которые не должны толковаться как ограничивающие объем изобретения Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из последующих примеров и формулы изобретения Нижеприведенные примеры описывают специфические аспекты, иллюстрирующие изобретение, и способы, используемые для выделения и идентификации РНК-компонента теломеразы человека, специалистами в данной области Примеры не следует рассматривать как ограничивающие изобретение, поскольку в них приведена только специфическая методология, необходимая для понимания и практической реализации изобретения Экспериментальные примеры Клонирование РНК-компонента теломеразы человека потребовало создания нового способа, включающего негативную селекцию и циклы позитивной селекции, описанных ниже Однако первоначально была сделана попытка клонирования РНК-компонента с использованием обратной транскрипции и способа клонирования концов кДНК, называемого амплификацией 5'-RACE ЦПР Реакция обратной транскрипции начиналась с помощью праймера, идентичного единице повтора на однонитевом участке теломерической ДНК человека и .таким образом, комплементарному последовательности, которая, как полагают, присутствует в РНК-компоненте теломеразы человека Праймер также содержал на своем 5' -конце последовательность, соответствующую сайту распознавания рестрикционного фермента Однако, когда кДНК , продуцированная с помощью реакции обратной транскрипции и амплификации ЦПР, была исследована посредством электрофореза в геле и анализа нуклеотидной последовательности полосок нуклеиновой кислоты, присутствующей в геле, были обнаружены только последовательности рибосомной РНК Аналогичные проблемы встретились, когда были сделаны попытки изменить этот 5' - RACE подход, используя гнездовые праймеры Попытку успешного клонирования начинали с получения кДНК из очищенных препаратов теломеразы человека, а также из линий клеток, обладающих активностью теломеразы человека, и из линий клеток, не обладающих детектируемой активностью теломеразы человека Способ, используемый для получения кДНК подробно описан в нижеприведенном Примере 1 Два этапа негатив 47407 60 ной селекции и последующие циклы положительной селекции использовали в сочетании с приготовлением кДНК из двух клеточных линий человека для уменьшения концентрации нежелательных последовательностей и увеличения концентрации желательных последовательностей РНК-компонента Этапы негативной селекции включали приготовление биотинилированного продукта ЦПР из кДНК, полученной из клеточной линии человека, не имеющей детектируемой активности теломеразы Биотинилированныи продукт ЦПР денатурировали, а затем повторно гибридизировали в растворе, содержащем значительно меньшую концентрацию небиотинилированного продукта ЦПР (100 частей биотинилированного продукта к 1 части небиотинилированного продукта) из кДНК, полученной из клеточной линии человека, не имеющей активности теломеразы Если бы существовала возможность того, что негативная клеточная линия теломеразы содержит небольшое количество РНК-компонента, этап гибридизации проводили бы с целью различения или селекции только в отношении ярко выраженной РНК в обеих клеточных линиях После гибридизации по отобранному Со t, чтобы позволить проведение гибридизации наиболее ярко выраженной РНК, нежелательный материал удаляли за счет связывания со стрептавидинилированными магнитными частицами, надосадочная жидкость, остающаяся после сбора частиц, содержала требуемую кДНК для РНК-компонента теломеразы человека Процесс амплификации ЦПР кДНК описан в нижеприведенном Примере 2 Затем этот материал обогащали до желательного уровня кДНК путем последовательных циклов позитивной селекции На этапе положительной селекции биотинилированныи зонд, комплементарный предсказанной матричной последовательности РНК-компонента теломеразы человека, гибридизировали с продуктом ЦПР из обогащенного (за счет негативной селекции) образца амплифицированной с помощью ЦПР кДНК из клеточной линии человека, обладающей активностью теломеразы После гибридизации комплексы зонд/мишень связывали с авидинилированными магнитными гранулами, которые затем собирали и использовали в качестве источника нуклеиновой кислоты, обогащенной по последовательностям РНК-компонента в последующих циклах позитивной селекции Процесс позитивной селекции более детально описан в нижеприведенных Примерах 3 и 4 После третьего цикла позитивной селекции продукты амплификации отделяли посредством электрофореза на геле, а участки геля, соответствующие нуклеиновым кислотам с размером, равным приблизительно 200 п н , удаляли Затем нуклеиновые кислоты элюировали из участков геля и амплифицировали с помощью ЦПР Продукты амплификации ЦПР гидролизировали с помощью рестрикционного фермента Notl, после чего вводили путем лигирования в сайт Notl плазмиды pBluescnptllSK+, которая имеется в фирме Stratagene Полученные в результате плазмиды трансформировали в клетки-хозяева Е coh, а от