Біопрепарат для лікування і профілактики піхвових дисбактеріозів “пробіоваг”

Біопрепарат для лікування і профілактики піхвових дисбактерюзів що містить молочнокислі бактерії виду Lactobacillus plantarum наповнювач, який відрізняється тим, що як молочнокислі бак терії виду Lactobacillus plantarum він містить штам Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5002 і додатково штам молочнокислих бактерій Streptococcus sahvanus subsp thermophilus ВКПМ В-3813 при такому співвідношенні компонентів, об % Lactobacillus plantarum ВКПМ У5002 (1,0-5,0)хЮ8 живих мікробних клітин у 1 мл фізіологічного розчину) 80-84 Streptococcus sahvanus subsp thermophilus ВКПМ У-3813 (1,05,0)х109 живих мікробних клітин у 1 мл фізіологічного розчину) 12-14 Наповнювач 2-8 Винахід відноситься до області біотехнологм і може бути використаний в медицині, акушерськогінекологічній практиці як біопрепарат для профілактики і лікування піхвових дисбактерюзів жінок У гінекологічній практиці ПІХВОВІ дисбактерюзи прийняли загрозливий характер Вони характеризуються різким зниженням (до 65%), а то і повною відсутністю молочнокислих бактерій, що є стабілізуючим чинником здоров'я статевої сфери жінок Для відновлення нормальної мікрофлори застосовують препарати, що складаються з живих клітин корисних мікроорганізмів В даний час ВІДОМІ препарати, застосовувані в гінекологічній практиці для санації жінок, що страждають запальними захворюваннями геніталій ацилакт [1], ваплак, [2], лактобактерш [3] До складу цих препаратів входять штами молочнокислих бактерій, що мають антагоністичну активність у відношенні патогенних мікроорганізмів, присутніх у ПІХВІ при різних патологічних процесах Основу цих препаратів складають види молочнокислих бактерій Lactobacillus acidophilus, L fermentum, L plantarum Найбільш близьким по сутності і результату, що досягається, є еубютичний лактобактерш препарат Lactobactermum siccum для застосування в гінекологічній практиці [4] В основу лактобактеріну входить люфілізована маса живих клітин лактобацил видів Lactobacillus fermentum 90-TC-4 і L plantarum B-PA-3 Лікувальний ефект препарату обумовлений антагоністичною дією мікробних клітин лактобацил відносно патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів - збудників запальних захворювань жіночої статевої сфери, а також жінок з порушеннями чистоти піхви III - IV ступеня Ефект забезпечується, з одного боку, здатністю штамів лактобацил до активного кислото утворення, з іншого боку - один зі штамів - L Fermentum 90_ТС-4 має здатність продукувати лізоцим Йому також властива середньоадгезивна активність, відповідальна за прикріплення клітин до піхвового епітелію Зазначені штами здатні продукувати молочну кислоту тільки на середовищах, що містять як джерело харчування вуглеводні компоненти (такі, як глюкоза, у меншому ступені лактоза) Ці ж вуглеводи служать середовищем для харчування умовно патогенних (УПЕ) і патогенних мікроорганізмів По швидкості засвоєння вуглеводного субстрату УПЕ випереджають ріст лактобацил Повноцінний ріст їх на середовищах уже через 24 години, а в лактобацил - тільки через 48 годин, що 1 о> (О ю 45697 не дає можливість цим штамам швидко розмножуватися у піхвовому каналі, створити бар'єр для ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ мікрофлори, що інфікує Недоліком відомого препарату лактобактершу є також той факт, що адгезивні властивості штамів оцінювалися на моделі еритроцитів людини, а не на піхвових клітинах і були віднесені до середньоадгезивних Надалі один зі штамів - L fermentum 90-ТС-4 - був додатково оцінений і на моделі клітин піхвового епітелію в основному як низькоадгезивний Це підтверджується тим, що тільки 2 клітини цього штаму адгезуються на кожній з 50-и епітеліальних клітин піхви Низька адгезія виявляється в 62,5% досліджених варіантах, що свідчить про їх низьку колонізувальну здатність, що створює захисний бар'єр на шляху проникнення патогенних мікроорганізмів Отже, лікувальний ефект такого препарату недостатньо виражений Крім того, необхідно враховувати той факт, що L fermentum 90-TC-4 відноситься до гетероферментативних лактобацил, добре ферментує глюкозу з утворенням кислоти і газу У той же час відомо, що газоутворення створює умови, сприятливі для розмноження і домінування мікроорганізмів, що приводять до піхвового дисбактеріозу При цьому різко знижується ефективність біопрепарату В основу винаходу покладена задача створити такий піхвовий біопрепарат, у якому шляхом сполучення паличкоподібних і кокових клітин досягається підвищення адгезії до піхвових клітин, білків і гликопротешів, відповідальних за приживлюваність молочнокислих бактерій в організмі жінок і виключення газоутворення Завдяки цьому препарат володіє високою антагоністичною активністю у відношенні патогенних мікроорганізмів, здатністю продукувати лізоцим, вітаміни групи В, високою швидкістю росту Для рішення задачі запропонований біопрепарат для лікування і профілактики піхвових дисбактерюзів, що містить молочнокислі бактерії виду Lactobacillus plantaram і наповнювач, у якому, ВІДПОВІДНО до винаходу, як молочнокислі бактерії виду Lactobacillus plantarum він містить штам Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5002 і додатково штам молочнокислих бактерій Streptococcus sahvanus subsp thermophilus ВКПМ В-3813, при такому співвідношенні компонентів, об % Lactobacillus plantarum ВКПМ В5002 (1,0 - 5,0) х 108 живих мікробних клітин у 1 мл фізіологічного розчину) 80 - 84, Streptococcus sahvanus subsp thermophilus ВКПМ У-3813 (1,0 5,0) х 109 живих мікробних клітин у 1 мл фізіологічного розчину) 12-14, Наповнювач 2-8, Штами, використовувані як основ пропонованого піхвового пробютика, характеризуються середнім і високим ступенем адгезивності до піхвового епітелію, здатністю гнітити газоутворювальну мікрофлору й адсорбуються на білках і глікопротеінах, що знаходяться у тканинах організму людини і мікроорганізмах, входячи до складу клітинних оболонок, і беручи участь тим самим у МІЖКЛІТИННІЙ адгезії макро- і мікроорганізму Це й обумовлює високу ефективність пропонованого препара ту Наповнювач необхідний для захисту життєздатності клітин при ліофільнім висушуванні Бактерії характеризуються також здатністю адсорбуватися до білків і глікопротешів, що виконують захисну функцію Нами вперше показано, що в ролі рецепторів для адгезинів штамів лактобацил і стрептококів пробютика можуть бути одночасно фібронектин, трансферин, у- гл °булін, конканавалин-А і муцин Використовували метод реакцію адсорбції бактерій (РБС) до цих субстратів, що закріплювали на полістироловій поверхні (див таблицю 1) Штами одержували шляхом їхньої селекції по ознаці адсорбції клітин до іммобілізованих специфічних білків і глікопротешів, а також здатності придушувати газоутворення мікроорганізмів, що викликають піхвовий дисбактеріоз Штами депоновані у Всеросійській колекції промислових мікроорганізмів під реєстраційними номерами Lactobacillus plantarum В-5002, Str sahvanus subsp thermophilus В-3813 Вивчення здатності прикріплюватися до епітеліальних клітин піхви проводили, використовуючи метод Т А Брилене Про ступінь адгезивності штаму судили по індексу адгезивності мікроорганізму (ІАМ)- середній КІЛЬКОСТІ мікробних клітин, що прикріпилися до піхвової епітеліальної клітини, з обліку 50-ти, що беруть участь в адгезивнім процесі клітин епітелію піхви (див таблицю 2) Здатність штамів пробютика гнітити газоутворювальну мікрофлору вивчали на живильному середовищі, найбільше оптимальнім, як для росту штамів молочнокислих бактерій, так і газоутворювальних МПБ, що містить по 1% глюкози, лактози, агар-агару і 5% дріжджового автолізату Випробувано три концентрації суспензій клітин штамів пробютика, що гнітять газоутворення 108 - 10 10 КУО в 1мл Цілком затримувала розвиток газоутворювальних бактерій суміш штамів, що мала (об %) Lactobacillus plantarum ВКПМ-В-5002 - 80 - 84, Str sahvanus subsp thermophilus ВКПМ-В-3813 12-14 і наповнювач 2-8 (див таблицю 3) Біомаса L plantarum 1 x 108 і біомаса Streptococcus sahvanus subsp thermophilus має 1 x 109 живих мікробних клітин у 1мл, люфілізованих у знежиреному молоці з додаванням сахарозно желатинового середовища в співвідношенні 1 1 Спосіб одержання препарату Готують живильне середовище (МРС), оптимальне для росту молочнокислих бактерій Кожен штам вирощують окремо 3 цією метою в різні ємності для вирощування, що містять по 2л живильного середовища вносять по 5% посівного матеріалу Вирощування роблять у термостаті при t = 37°С L plantarum вирощують 24 години, a Streptococcus sahvanus subsp thermophilus - 18 годин Титр клітин склав КУО (0,5 - 1,0) х 107 паличок і (1,0 - 1,5) х 108 коків у 1мл Культуральні рідини центрифугують роздільно для одержання сирих концентратів живої біомаси, згущених у 10 разів Біомаса ВІДПОВІДНО склала 1,0 х 108 - L plantarum і (1,5 - 2,0) х 10 Str sahvanus subsp thermophilus Сухий препарат одержували ліофільним висушуванням Приклад 1 КІЛЬКІСТЬ ЖИВИХ КЛІТИН у 1 Г сухого препарату склала, (1,0 -5,0) х 108 - L plantarum і 45697 (1,0 - 5,0) x 10 Str sahvanus subsp thermophilus шенню до патогенних і умовно патогенних мікроЦе найбільш оптимальне співвідношення штамів, організмів, виділених з піхви жінок, що страждають при якому спостерігалася найбільш висока прикріпіхвовим дисбактеріозом різної етіології Антагоніплюваність клітин до піхвового епітелію і найбільстична активність виявляється на безвуглеводноша здатність до придушення газоутворювальної му середовищі, тобто не тільки за рахунок молочмікрофлори ної кислоти, яка продукується штамами Приклад 2 Сиру біомасу кожного штаму і супробіотика, а і за рахунок біологічно активних рехий препарат одержували як описано вище, але човин, що виділяють клітини цих бактерій КІЛЬКІСТЬ живих клітин у 1г сухого препарату одерПри використанні суміші штамів у препараті L 8 жували у межах (0,5 - 1,0) х 10 паличкоподібних plantarum і Str sahvanus subsp thermophilus спо9 клітин L plantarum і (6,0 - 10,0) х 10 - кокових клістерігається синергізм антагоністичної дм пробіотин Str sahvanus subsp thermophilus У отриманого тика на патогенну й умовно патогенну мікрофлору препарату КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН З ВИСОКОЮ адгезивною (див таблицю 4) активністю збільшилося до 80%, але на 50% зниДослідження ефективності пробіотика при піхзилася здатність гнітити ріст газоутворювальної вових дисбактерюзах у жінок проводили на базі мікрофлори Інституту педіатри, акушерства і гінекологи АМН Приклад 3 Сиру біомасу кожного штаму і суУкраїни Зміни В складі мікрофлори піхви - в Інстихий препарат одержували як описані вище, але туті мікробіологи і вірусологи НАНУ КІЛЬКІСТЬ живих клітин у 1 г сухого препарату одерДжерела інформації жували в межах (2,5 - 7,0) х 108 паличкоподібних 1 В В Поспелова, и др , Медицинские аспекклітин L plantarum і (0,1 -1,0) х 109 - кокових клітин ты микробной экологии - М 1991 -С 95-210 Str sahvanus subsp thermophilus В отриманого 2 Р Villeneuve, М R Lefrancqis, L Н Вогпрепарату КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН З ВИСОКОЮ адгезивною deleau Rapport final de Recherche Institut Rosell Inc активністю зменшилося до 50%, здатність гнітити Speciahste en cultures Lactiques - Canada Montreal ріст газоутворювальної мікрофлори залишилася 1992 - p 40 на МІСЦІ В останніх двох прикладах активність 3 Патент RU № 2133272 МПК C12N1/20, 1999 препарату знизилася 4 И В Соловьева, Антибиотики и микроэкоЯк показали іспити, препарат характеризуєтьлогия человека и животных - М 1988 - с 158 ся високою антагоністичною активністю по відно Адсорбція молочнокислих гликопротеінах у РБС Штами L plantarum S. saiivaritts subsp. thermophillus бактерій на іммобілізованих Таблиця 1 білках и Середня кількість бактерій, що прикріпилися до іммобілізованих білків і гликопротеінів у РБС: Муцину ТрансферФібронеу-глобу- Конканавактину ліну-А рину ліну 320 400 200 70 100 80 20 ЗО 160 280 Таблиця 2 Адгезія штамів молочнокислих бактерій пробіотика і прототипу до епітелію піхвових кліток % епітеліальних кліток, що володіють різною адгезивністю: Штами молочнокислих бактерій низька адгезія (до 2-х бактерій) Lactobacillus ptanlarum B-PA-3 Lfermentum 9Q-TC-* (21) L planlarum ВКГТМ-ВB-5002 Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ВКПМВ-3813 Суміш штамів: B-5002-8 частей; В~3813-2части середня адгезія (2-4 бактерії) висока адгезія (більш 4 бактерій) — — — 37,5 37,5 25,0 0 82,0 18,0 0 50,0 50,0 0 30,0 70,0 Таблиця З Гноблення росту газоутворювальних бактерій штамами молочнокислих бактерій пробіотика Розведення смивів піхви (1 мл) Види молочнокислих бактерій Lactobacillus plantarum 10'* !05 io z 10° Z 1O' ю-3 10J ВКПМ^5002 Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ВКПМ-В-3813 Суміш обох штамів В-5002 - 8 частей В-3813-2части Контроль (фізіологічний розчин) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Утворення газу при концен-трації кліток пробіотика в 1 мл,% 10а 10у 1ОІУ 80 80 50 20 80 80 50 0 80 50 10 0 50 50 20 10 80 80 50 0 50 20 0 0 10 0 0 0 80 80 0 0 0 0 0 0 Таблиця 4 Антагоністичні властивості штамів молочнокислих бактерій, що входять до складу піхвового пробіотика Зони шгибування росту (діаметр, мм)) Середовище МРС Ферментолізат кукурудзяного борошна Культури, що тестуються L. plantarum ВКПМ-В-5002 Вас. subtilis Е. coli Pr, vulgaris St aureus Pseud aerugirwsa Candida alhicans Вас. subtilis E. coli Pr. vulgaris 5/. aureus Pseud aeruginosa Candida albicans Str.saJivarius, subsp, thermophilus ВКПМ-В-3813 Суміш піхвовий препарат 4 5 5 1 1 2 2 2 0 5 5 6 8 0 4 4 0 4 3 3 5 4 2 0 5 2 2 3 0 5 3 7 0 3 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 5 6