Застосування 4,5,6,7-тетрагалогено-1,3–ізоіндоліндіонів як інгібіторів протеїнкінази ск2

Пропонований винахід стосується винайдення нового класу інгібіторів протеінкінази СК2-4,5,6,7тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіонів. Протеїнкіназа СК2 (казеїн кіназа II) задіяна в багатьох сигнальних шляха х клітинного росту та проліферації. СК2 кіназа виявляє інгібуючий вплив на певні клітинні механізми контролю апоптозу і вносить позитивний внесок у фомування онкогенного потенціалу клітини, гіперекспресія цієї кінази у швидко проліферуючих тканинах та в багатьох п ухлинах дозволяє розглядати СК2 як суттєвий фактор процесів пухлиноутворення. СК2 кіназа -перспективна мішень для створення протиракових ліків, а інгібітори СК2 кінази можуть використовуватися у терапії раку (1: Pinna L. Protein Kinase СК2 // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1997. - 29. - P.551-554); (2: Ravi R., Bedi A. Sensitization of Tumor Cells to Apo2 Ligand/TRAIL-induced Apoptosis by Inhibition of Casein Kinase II // Cancer Res. - 2002. - 62. - P.4180-4185); (3:Sarno S., Мого S., Meggio F., Zagotto G., Dal Ben D., Ghisellini P., Battistuta R., Zanotti G., Pinna L. Toward the rational design of protein kinase casein kinase-2 inhibitors (In Process Citation) // Pharmacol Ther. - 2002. - 93(2-3). - P.159). Відомо, що механізм дії деяких противірусних препаратів проти людського цитомегаловірусу (HCMV) та HIV-1 полягає у інгібуванні СК2-кінази, яка опосередковано спричиняє підсилення експресії гену HIV-1 або HCMV на транскрипційному рівні. Таким чином, інгібітори СК2 є інгібіторами транскрипції HIV-1 і можуть бути використані як противірусні препарати (4: Critchfield J. W., Coligan J. E., Folks T. M., Butera S. T. Casein kinase II is a selective target of HIV-1 transcriptional inhibitors // Biochem. - 1997. - 94. - P.6110-6115); (5: De Clercq E. Current lead natural products for the chemotherapy of human immune-deficiency virus (HIV-1) infection // Med. Res. Rev. - 2000. -20(5). - P.323-349). Серед відомих інгібіторів СК2-кінази є поліпептиди (6: Meggio F., Pinna L. A., Marchiori F., Borin G. PolyglutamyI peptides: a new class of inhibitors of type-2 casein kinases // FEBS Lett. - 1983. - 162(2). - P.235238), похідні бензімідазолу (7: Szyszka R., Grankowski Ν., Felczak К., Shugar D. Halogenated benzimidazoles and benzotriazoles as selective inhibitors of protein kinases CK1 and СК2 from Saccharomyces cerevisiae and other sources // Biochim. Biophys. Res. Commun. - 1995. - 208. - P.418-424) та бензотриазолу (8: Sarno S., Reddy H., Meggio F., Ruzzene M., Davies S. P., Donella-Deana A., Shugar D., Pinna L. Selectivity of 4,5,6,7tetrabromobenzotriazole, an ATP site-directed inhibitor of protein kinase СК2 ("casein kinase") // FEBS Lett. 2001. - 496. - P.44-48); (9: Battistutta R., De Moliner E., Sarno S., Zanotti G., Pinna L. A. Structural features underlying selective inhibition of protein kinase СК2 by ATP-site directed tetrabromobenzotriazole // Protein Sci. 2001. - 10. - P.2200-2206), флавоноїди, похідні антрахінону, нафталіну, ксантену та флуорену (З), хіназоліну (10: Liu XG., Liang NC. Inhibitory effect and its kinetic analysis of tyrphostin AG1478 on recombinant human protein kinase СК2 holoenzime // Acta Pharmacol Sin. - 2002. - 23(6). - P.556-561), ізохіноліну (11: Chijiwa Т., Hagiwara M., Hidaka H. A newly synthesized selective casein kinase I inhibitor, N-(2-aminoethyl)-5chloroisoquinoline-8-sulfonamide, and affinity purification of casein kinase I from bovine testis // J. Biol. Chem. 1989. - 264(9). - P.4924-4927). Але, е фективність та специфічність згаданих інгібіторів, особливо флавоноїдів, є недостатньою для застосування в клінічній фазі досліджень. Отже, пошук високоспецифічних інгібіторів СК2, що пригнічували б активність СК2 у низьких концентраціях є актуальним завданням. Авторами цієї заявки встановлено, що серед похідних 1,3-ізоіндоліндіону (фталіміду) інгібіторів СК2кінази раніше знайдено не було. В основу пропонованого винаходу поставлена задача: синтез 4,5,6,7-тетрагалогено-1,3ізоіндоліндіонів, визначення їх інгібіторних властивостей щодо СК2 кінази та селективності по відношенню до інших протеїнкіназ. Поставлена задача вирішується пропонованим винаходом, а саме, застосуванням 4,5,6,7тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіонів як інгібіторів протеїнкінази СК2. Суть винаходу пояснюється за допомогою графічних матеріалів: На фіг.1 показано загальну стр уктур у ряду 4,5,6,7-тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіонів. На фіг.2 показано залежність активності СК2 кінази від концентрації інгібіторів 3.1(б), 3.2(а), 3.6(г), 3.9(в). Авторами проведено синтез ряду 4,5,6,7-тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіонів та виявлено інгібіторні властивості щодо СК2 кінази. Серед тестованих 49 похідних найвищу активність показали: 2-(4,5,6,7тетрайодо-1,3-діоксо-2,3-дігідро-1H-2-ізоіндоліл)пропанова кислота (a) (IC50=0,15 mM ); 2-(4,5,6,7-тетрайодо1,3-діоксо-2,3-дігідро-1H-2-ізоіндоліл)оцтова кислота (б) (IC50=0.39 mM ); З-гідроксиб-тетрайодо-І.З-діоксо.Здігідро-ІА/-2-ізоіндоліл)пропанова кислота (В) (IC50=0.41 mM ); 3-феніл-2-(4,5,6,7-тетрайодо-1,3-діоксо-2,3дігідро-1/-2-ізоіндоліл)пропанова кислота (Г) (ІС50=1.1 mM ) (загальну структур у ряду 4,5,6,7-тетрагалогено1,3-ізоіндоліндіонів наведено на фіг.1, хімічні структури сполук а, б, в, г - в таблиці 2). Матеріали і методи. Контроль за проходженням реакції та чистотою синтезованих сполук здійснювався хроматографічне на пластинах "Silufol UV-254", елюент: хлороформ - метанол (9:1). Структуру одержаних сполук доведено за допомогою ПМР-спектрів. Спектри ПМР записані в ДМСО-D6 на приладі "Varian" з робочою частотою 300МГц і внутрішнім стандартом -тетраметилсиланом. Величини хімічних зсувів визначались з точністю до 0.001м.ч. Синтез 4.5.6.7-тетрагалогено-1.3-ізоіндоліндіонів (1.1-1.19; 2.1-2.20; 3.1-3.10) 4,5,6,7-Тетрагалогено1,3-ізоіндоліндіони (1.1-1.19; 2.1-2.20; 3.1-3.10) були синтезовані модифікацією методів (12-14). Розчин 0.01моль 4,5,6,7-тетрагалогенфталевого ангідриду і 0.011моль відповідної амінокислоти у 5мл диметилформаміду кип'я тили 5 хвилин, охолоджували, виливали у воду, фільтрували. Ви ходи сполук 1.11.19; 2.1-2.20; 3.1-3.10; 85-93%. 4,5,6,7-Тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіони були тестовані на інгібування активності СК2 кінази in vitro. Об'єм реакційної суміші був 30мкл. Для буферу використовувалось 20μΜ Tris-HCI, pH7,5 при 25°С; 50 μΜ КСІ; 10μΜ МдСІ. Для кожної реакції брався: 1 мікрограм пептидного субстрату (~500μΜ; England Biolabs); 10 одиниць (0.02мкл при концентрації 500000/мл у водному буферному розчині) рекомбінантної людської СК2 кінази (England Biolabs). Реакційна суміш готувалася без додавання АТФ при кімнатній температурі, була поділена на аліквоти по 1,5мл. До реакційної суміші додавали 1-0,5мкл стокового розчину інгібітору у 100% ДМСО з концентрацією 5μΜ. Кожна реакція повторювалася двічі, одержаний результат не відрізнявся більш, ніж на 10-15%. Розчин АТФ го тувався окремо. Для кожної реакції бралося 0,05mCi γ-Р32 АТФ. Фінальна концентрація АТФ була 33μΜ, загальна концентрація міченої та неміченої АТФ-40μΜ. Реакція починалася після додавання до суміші АТФ. Час реакції - 20 хвилин при Τ30°С (у знайдених умовах експотенційна фаза реакції закінчується за 25-30 хвилин). Реакцію зупиняли додаванням 20мкл 5% фосфорної кислоти і переносили продукти реакції на 20мм фільтр із целюлозо-фосфатного паперу (Whatman). Фільтр промивали тричі 0,5% фосфорною кислотою на шейкері в 200мм чашці Петрі при кімнатній температурі і висушували при 36°С. Для детекції мічених продуктів використовали LKB γ-лічильник Черенкова. Для позитивного контролю використовували ДМСО без інгібітора у тій же кількості - 1мкл, що і у дослідах з розчином інгібітора в ДМСО. Негативний контроль проводився з використанням відомого інгібітора СК2 кінази - кверцитину, що при концентрації 0,8-0,5 mM інгібував активність СК2 кінази на 70-50%. Контроль над неспецифічною адсорбцією (без додавання ензиму) проводився час від часу і не перевищував 5%. На першому етапі здійснювався прескринінг сполук при концентрації досліджуваної речовини-інгібітора mM . 10 Результати і обговорення. Нами синтезовано та тестовано на інгібування активності СК2 кінази in vitro 49 похідних 4,5,6,7-тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіону (1.1-1.19; 2.1-2.20; 3.1-3.10) (фіг.1). Результати прескринінгу, хімічні структури (або назви) замісників R; Hal сполук 1.1-1.19; 2.1-2.20; 3.1-3.10 наведені в Таблиці 1 та на фіг.1. Дані прескринінгу свідчать про те, що сполуки 1.7, 1.9, 2.14-2.16, 2.32 інгібують активність СК2 кінази при концентрації 10 mM більше, ніж на 60%, вони були відібрані для більш детального дослідження при декількох концентраціях. Знайдені для сполук 3.1-3.6, 3.9, 3.10 величини IC50 та хімічні структури наведено у Таблиці 2. Найбільш активними інгібіторами виявилися сполуки: 3.2 (ІС50=0.15 mM ), 3.1 (ІС50=0.39 mM ), 3.9 (ІС50=0.41 mM ), 3.6 (ІС50=1.1 mM ). 3 метою дослідження селективності інгібіторів 3.1, 3.2, 3.6, 3.9 по відношенню до СК2 кінази було проведено біологічні тести на інгібування інших протеїнкіназ: GSK3 та CDK5. Встановлено, що для ци х кіназ IC50>10 mM для всіх чотирьох сполук 3.1, 3.2, 3.6, 3.9, тобто ці дані дають можливість говорити про селективну дію сполук 3.1, 3.2, 3.6, 3.9 на СК2 кіназу. Для тестованого ряду 49 похідних 4,5,6,7-те трагалогено-1,3-ізоіндоліндіону можна зробити деякі висновки стосовно залежності інгібіторної активності від структури сполуки. Серед 19 похідних 4,5,6,7тетрахлоро-І.З-ізоіндоліндіону (1.1-1.19) значного інгібування СК2-кінази не виявлено. Сполука 1.17 (Hal=Сl; R=СН(СООН)СН2-(3-індоліл)) при концентрації 10μΜ інгібує СК2-кіназу на 33% (табл.1). Заміна атомів хлору на бром сприяє невеликому підвищенню інгібіторних властивостей. Так, для сполук 1.1 та 2.2 інгібування збільшується на 17%, сполука 2.2 при концентрації 10 mM інгібує СК2-кіназу на 46% (сполука 1.1 - на 29%). В середньому при заміні атомів хлору на бром інгібування СК2-кінази підвищується на 19.3%. Заміна брому на йод ще більше підвищує інгібіторіні властивості сполук. Всі протестовані похідні 4,5,6,7тетрайодо-1,3-ізоіндоліндіону (3.1-3.10) інгібують СК2-кіназу з ІС 50 від 0.15 до 12 mM . Таким чином, для 4,5,6,7-тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіонів інгібіторна активність збільшується в залежності від галогенівзамісників у такій послідовності: J>>Вr>СІ. Отже, знайдено новий класс інгібіторів СК2 кінази - 4,5,6,7-тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіони. Серед тестованих 49 похідних найвищу активність показали: 2-(4,5,6,7-тетрайодо-1,3-діоксо-2,3-дігідро-1 Н-2ізоіндоліл)пропанова кислота(a) (IC50=0.15 mM ); 2-(4,5,6,7-тетрайодо-1,3-діоксо-2,3-дігідро-1/-2ізоіндоліл)оцтова кислота (б) (ІС50=0.39 mM ); 3-гідрокси-2-(4,5,6,7-тетрайодо-1,3-діоксо-2,3-дігідро-1/-2ізоіндоліл)пропанова кислота (в) (ІС50=0.41 mM ); 3-феніл-2-(4,5,6,7-тетрайодо-1,3-діоксо-2,3-дігідро-1/-2ізоіндоліл)пропанова кислота (г) (IC50=1.1 mM ), що може бути використано для подальшої оптимізації активних структур і використанні їх для терапії раку та противірусних захворюваннь. Таблиця 1 Результати прескринінгу сполук 1.1-1.19; 2.1-2.20; 3.1-3.10 (концентрація потенційного інгібітора - 10 mM ) № 1.1 1.2 Замісники Hal R СІ -СН2СООН СІ -СН(СООН)СН2СН(СН3)2 Залишкова активність СК2 кінази,% 71 112 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 1.17 1.18 1.19 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 2.14 2.15 2.16 2.17 2.18 2.19 2.20 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ СІ Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br Br J J J J J J J J J J -СН(СООН)СН2Рh -СН(СООН)СН3 -СН(СООН)СН(СН3)2 -СН2СН2СООН -СН(СООН)СН2СН3 -СН(СООН)СН2СН2СООН -(3-СООН-С6Н4) -(2-СООН-С6Н4) -СН(СООН)СН2СН2СН2СН3 -СН(СООН)СН2СН2СН3 -СН(СООН)СН2СН2СООМН2 -СН(СООН)СН20Н -СН(СООН)СН(ОН)СН3 -СН(СООН)СН2-(4-імідазоліл) -СН(СООН)СН2-(3-індоліл) -CH2-CONH-CH2COOH -СН(СООН)СН(СН3)СН2СН3 -СН(СООН)СН3 -СН2СООН -СН(СООН)СН2СН(СН3)2 -СН(СООН)СН2Рп -СН(СООН)СН(СН3)2 -СН2СН2СООН -СН(СООН)СН2СН3 -СН(СООН)СН2СООН -СН(СООН)СН2СН2СООН -(3-СООН-С6Н4) -(2-СООН-С6Н4) -СН(СООН)СН2СН2СН2СН3 -СН(СООН)СН2СН2СН3 -СН(СООН)СН2СН2СООМН2 -СН(СООН)СН2OН -СН(СООН)СН(ОН)СН3 -СН(СООН)СН2-(4-імідазоліл) -СН(СООН)СН2-(3-індоліл) -CH 2-CONH-CH2COOH -СН(СООН)СН(СН3)СН2СН3 -СН2СООН -СН(СООН)СН3 -СН(СООН)СН(СН3)2 -СН(СООН)СН2СН(СН3)2 -СН(СООН)СН2СН3 -CH(COOH)CH 2Ph -CH(COOH)CH 2COOH -(3-СООН-С6Н4) -СН(СООН)СН2OН -СН(СООН)СН2-(4-імідазоліл) 91 98 103 100 101 89 108 95 104 117 94 103 104 115 67 104 80 70 54 80 80 97 78 82 89 100 73 95 63 71 88 75 69 81 94 71 92 15 3 23 28 31 8.5 58 59 26 36 Таблиця 2 Хімічні структури та IC50 активних сполук 3.1-3.6, 3.9, 3.10 № IC50, mM Хімічна структура I O I 3.1(б) 0,39 N OH I I O O I O I 3.2(a) 0.15 N OH I O I I O O I 3.3 1.4 N OH I I I O O O I 3.4 7.15 N OH I I O O I O I 3.5 1.8 N OH I O I I O O I 3.6(г) 1.1 N OH I O I I O O I OH 3.9(в) 0.41 N OH I O I I O O N I 3.10 NH N 6.02 OH I I O O Література: 1. Pinna L. Protein Kinase CK2 // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 1997. - 29. - P.551-554. 2. Ravi R., Bedi A. Sensitization of Tumor Cells to Apo2 Ligand/TRAIL-induced Apoptosis by Inhibition of Casein Kinase II // Cancer Res. - 2002. -62. - P.4180-4185. 3. Sarno S., Моrо S., Meggio F., Zagotto G., Dal Ben D., Ghisellini P., Battistuta R., Zanotti G., Pinna L. Toward the rational design of protein kinase casein kinase-2 inhibitors (In Process Citation) // Pharmacol Ther. 2002. - 93(2-3). - P.159. 4. Critchfield J. W., Coligan J. E., Folks T. M., Butera S. T. Casein kinase II is a selective target of HIV-1 transcriptional inhibitors // Biochem. - 1997. - 94. - P.6110-6115. 5. De Clercq E. Current lead natural products for the chemotherapy of human immune-deficiency virus (HIV1) infection // Med. Res. Rev. - 2000. -20(5). - P.323-349. 6. Meggio F., Pinna L. A., Marchiori F., Borin G. PolyglutamyI peptides: a new class of inhibitors oftype-2 casein kinases // FEBS Lett. - 1983. - 162(2). -P.235-238. 7. Szyszka R., Grankowski N., Felczak K., Shugar D. Halogenated benzimidazoles and benzotriazoles as selective inhibitors of protein kinases CK1 and CK2 from Saccharomyces cerevisiae and other sources // Biochim. Biophys. Res. Commun. - 1995. - 208. - P.418-424. 8. Sarno S., Reddy H., Meggio F., Ruzzene M., Davies S. P., Donella-Deana A., Shugar D., Pinna L. Selectivity of 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole, an ATP site-directed inhibitor of protein kinase CK2 ("casein kinase") // FEBS Lett. - 2001. - 496. - P.44-48. 9. Battistutta R., De Moliner E., Sarno S., Zanotti G., Pinna L. A. Structural features underlying selective inhibition of protein kinase CK2 by ATP-site directed tetrabromobenzotriazole // Protein Sci. - 2001. - 10. - P. 2200-2206. 10. Liu XG., Liang NC. Inhibitory effect and its kinetic analysis of tyrphostin AG1478 on recombinant human protein kinase CK2 holoenzime // Acta Pharmacol Sin. - 2002. - 23(6). - P.556-561. 11. H.Chijiwa Т., Hagiwara M., Hidaka H. A newly synthesized selective casein kinase I inhibitor, N-(2aminoethyl)-5-chloroisoquinoline-8-sulfonamide, and affinity purification of casein kinase I from bovine testis // J. Biol. Chem. - 1989. - 264(9). - P.4924-4927. 12. Синтези органічних препаратів, Сбірник 12. - Μ.: Мир, 1964. - С.165-167. 13. Гринштейн Дж., Виниц M. Хімія амінокислот і пептидів. - M.: Мир, 1965. - С.406-407. 14. Фізер Л., Фізер M. Реагенти для органічного синтезу. - M.: Мир, T.4. - 1971 - С115-116.