Спосіб визначення сили адгезії клітин до підкладки

Реферат: Спосіб визначення сили адгезії клітин до підкладки, який передбачає подачу рідини на диск, що обертається, на поверхню якого нанесено клітини, визначення напруги зсуву, що необхідна для відокремлення клітин від поверхні диска та розрахунок сили адгезії клітин. Подачу рідини на диск здійснюють дозовано у вигляді струменя. UA 73311 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ СИЛИ АДГЕЗІЇ КЛІТИН ДО ПІДКЛАДКИ UA 73311 U UA 73311 U 5 10 15 Корисна модель належить до галузі нанобіотехнології і може бути використана при створенні біоінженерних матеріалів. Адгезія клітин до підкладок, які виготовлені з різних матеріалів і з різним нанорельєфом, є початковою стадією проліферації та диференціації клітин на підкладці і відіграє вирішальну роль щодо утворення біоінженерних конструкцій. Відомий спосіб визначення сили адгезії клітин до підкладки за допомогою плоскопаралельної течії, що має ламінарний характер [1]. Течія утворюється вздовж підкладки, на якій розміщено клітини, в спеціальному каналі з дуже малою висотою (від 17 мкм до 1,5 мм). При поступовому збільшенні швидкості течії під впливом напруги зсуву клітини починають або відокремлюватися від підкладки, або переміщуватися по ній за течією (в залежності від типу клітин). Цей момент фіксується під мікроскопом при великому збільшенні за допомогою кінокамери. Знаючи об'ємну витрату рідини, її в'язкість і геометричні параметри каналу, за допомогою закону Пуазейля визначають напругу зсуву на поверхні, на якій розміщено клітини, за формулою: 6Q , h2 w де  - напруга зсуву, Па;  - динамічна в'язкість рідини, Пас;  3 Q - об'ємна витрата рідини, м /с; h і w - висота і ширина каналу, м, відповідно. 20 25 30 35 40 45 50 Звідси визначають силу адгезії клітини до підкладки: F  10,26   R 2 , де R - радіус клітини, м. Недоліком способу є те, що він потребує використання складного устаткування (мікроскоп, кінокамера), що дорого коштує. Крім того, для визначення напруги зсуву обов'язковим є розміщення клітин в зоні повністю розвинутої ламінарної течії. При цьому швидкість течії необхідно постійно контролювати, тому що неконтрольоване нарощування швидкості течії може призвести до переходу характеру течії від ламінарного до турбулентного, що не дасть можливості застосовувати закон Пуазейля, а отже і реалізувати спосіб. Найбільш близьким технічним рішенням до способу, що заявляється, є спосіб визначення сили адгезії клітин до підкладки за допомогою диска, що обертається [2]. Диск, на поверхню якого нанесено клітини і який приєднано через вал до електродвигуна, розміщують в ємності таким чином, щоб запобігти потраплянню рідини на електродвигун. Для цього використовують герметичний електродвигун або встановлюють ущільнювач на валу електродвигуна. Далі ємність герметизують і заповняють рідиною. Рідина, яка знаходиться в ємності, не повинна мати вільної поверхні, тобто над нею не повинно бути повітря, інакше у процесі обертання диска над ним буде виникати повітряна лійка, а шар рідини, який тече по диску, буде двофазним (з домішками бульбашок повітря). Це не дасть можливості розрахувати напругу зсуву на поверхні диска, оскільки властивості рідини будуть зміненими. Єдиним способом запобігання цього є вакуумування ємності. Диск обертається у рідині з заданою частотою, яка вимірюється за допомогою тахометра. За рахунок обертання диска на його поверхні створюється примежовий шар рідини, що рухається по поверхні диска. Під впливом напруги зсуву, що при цьому виникає на поверхні диска, клітини, які адгезовані на поверхні диска, відокремлюються від неї. Оскільки швидкість течії рідини по поверхні диска збільшується при її русі вздовж радіуса диска, то також збільшується і напруга зсуву. При цьому з поверхні диска змиваються клітини, що розташовані ближче до його периферії, а ті клітини, що розташовані ближче до центру в зоні, де напруга зсуву ще не є достатньо великою, залишаються на поверхні диска. Після зазначеного проміжку часу обертання диска припиняють, а рідину з ємності зливають. Диск фотографують, після чого по фотографії заміряють радіус, починаючи з якого клітини на поверхні диска будуть відсутніми, і визначають критичне значення напруги зсуву, яке необхідно для відокремлення клітин від поверхні диска. Напругу зсуву розраховують за формулою:    0,8r 3 55  0,5 , де r - радіус, на якому залишаються клітини, м; 3  - щільність рідини, кг/м ;   n / 30 - кутова швидкість обертання диска, рад/с; n - частота обертання диска, об/хв. Звідси визначають силу адгезії клітини до поверхні диска, тобто до підкладки, за формулою: 1 UA 73311 U 5 10 15 20 25 F  10,26   R2 , де R - радіус клітини, м. Недоліком способу є його складність, що пов'язано з необхідністю герметизації і вакуумування ємності, а також герметизації двигуна для запобігання потрапляння до нього рідини. Крім цього спосіб є неточним, тому що при заповненні ємності рідиною і при її зливанні виникає течія рідини відносно поверхні диска, що може призвести до неконтрольованого змиву клітин з його поверхні, зменшення радіусу розміщення клітин і, як наслідок, до неточного визначення критичної напруги зсуву. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити відомий спосіб визначення сили адгезії клітин до підкладки таким чином, щоб він забезпечив можливість спростити процес визначення при одночасному підвищенні його точності. Ця задача вирішується тим, що в способі визначення сили адгезії клітин до підкладки, який передбачає подачу рідини на диск, що обертається, на поверхню якого нанесено клітини, визначення напруги зсуву, що необхідна для відокремлення клітин від поверхні диска, та розрахунок сили адгезії клітин за формулою: F  10,26   R2 , де  - напруга зсуву, Па; R - радіус клітини, м, згідно з корисною моделлю, подачу рідини на диск здійснюють дозовано у вигляді струменя, а напругу зсуву визначають за формулою:   2r , де   n / 30 - кутова швидкість обертання диска, рад/с; n - частота обертання диска, об/хв; r - радіус, на якому залишаються клітини, м;  - щільність рідини, кг/м3; 1/ 3  3Qv  - товщина шару рідини на диску, м;      2r 2 2  Q - об'ємна витрата рідини, м3/с; 2 v - кінематична в'язкість рідини, м /с. 30 35 40 45 50 Дозована подача рідини у вигляді струменя на поверхню диска замість занурення його у рідину, як у найближчому аналогу, виключає необхідність проведення герметизації і вакуумування обладнання, що значно спрощує його реалізацію. При цьому підвищується точність визначення напруги зсуву, оскільки виключається можливість виникнення неконтрольованої течії на поверхні диска. Спосіб здійснюють таким чином. Диск, на поверхню якого нанесено клітини, приєднують через вал до електродвигуна. Навкруги диска розміщують збірник відпрацьованої рідини і змитих клітин. До електродвигуна приєднують тахометр, який заміряє частоту обертання електродвигуна, що дорівнює частоті обертання диска. Після включення електродвигуна і досягнення необхідної частоти обертання на поверхню диска з дозатора подають рідину у вигляді струменя. Під впливом відцентрової сили рідина тече по поверхні диска. При протіканні рідини на поверхні диска виникає напруга зсуву. При досягненні напругою зсуву критичної величини клітини починають змиватися з поверхні диска. Також під впливом відцентрової сили рідина з клітинами зривається з краю диска і потрапляє в збірник. Через зазначений проміжок часу подачу рідини на поверхню диска припиняють. Далі відключають електродвигун і припиняють обертання диска. Диск фотографують, після чого по фотографії заміряють радіус, починаючи з якого клітини на поверхні диска будуть відсутніми, і визначають критичне значення напруги зсуву, яке необхідно для відокремлення клітин від поверхні диска. Напругу зсуву розраховують за формулою:   2r , де  - напруга зсуву, Па;   n / 30 - кутова швидкість обертання диска, рад/с; n - частота обертання диска, об/хв.; r - радіус, на якому залишаються клітини, м;  - щільність рідини, кг/м3; 2 UA 73311 U 1/ 3  3Qv  - товщина шару рідини на диску, м;      2r 22  Q - об'ємна витрата рідини, м3/с; 2 v - кінематична в'язкість рідини, м /с. 5 10 Звідси розраховують силу адгезії клітини до поверхні диска, тобто до підкладки, за формулою: F  10,26   R 2 , де R - радіус клітини, м. Джерела інформації: 1. Detry J.G., Deroanne C., Sindic M. Hydrodynamic systems for assessing surface fouling, soil adherence and cleaning in laboratory installations // Biotechnol. Agron. Soc. Environ-2009. - Vol. 13, N 3. - P. 427-439. 2. Garsia A.J., Huber F., Boettiger D. Force required to break 51 integrin-fibronectin bonds in intact adherent cells is sensitive to integrin activation state // The journal of biological chemistry-1998. - Vol.273, N 18. - P.10988-10993. 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 30 Спосіб визначення сили адгезії клітин до підкладки, який передбачає подачу рідини на диск, що обертається, на поверхню якого нанесено клітини, визначення напруги зсуву, що необхідна для відокремлення клітин від поверхні диска та розрахунок сили адгезії клітин за формулою: F  10,26   R2 , де  - напруга зсуву, Па; R - радіус клітини, м, який відрізняється тим, що подачу рідини на диск здійснюють дозовано у вигляді струменя, а напругу зсуву визначають за формулою:   2r , де   n / 30 - кутова швидкість обертання диска, рад/с; n - частота обертання диска, об/хв; r - радіус, на якому залишаються клітини, м; 3  - щільність рідини, кг/м ; 1/ 3  3Qv    - товщина шару рідини на диску, м;    2r 22  3 Q - об'ємна витрата рідини, м /с; 2 v - кінематична в'язкість рідини, м /с. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3