Спосіб іммобілізації a-амілази

Реферат: UA 76072 U UA 76072 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, зокрема до способу отримання іммобілізованих ферментів і може бути використана в харчовій, промисловості, а також в медичній та лабораторній практиці. Відомий спосіб іммобілізації комплексу ферментів, до складу яких входить ліпаза, на харчових волокнах з використанням як середовища насиченого 20 % розчину поліетиленоксиду (ПЕО) та 10 % полівінілового спирту (ПВС), приготованих на 5 % розчині бури (тетраборату натрію) (див. Кравченко І.А. та ін. Іммобілізація ферментів замісної терапії на харчових волокнах. Доповіді НАН України, 1997, № 3, с. 182-186). Але відомий спосіб має суттєві недоліки: при іммобілізації на харчових волокнах втрачається 69-78 % вихідної ліполітичної активності; складність способу, пов'язана з подрібненням до порошкоподібного стану іммобілізованого препарату, отриманого шляхом насичення харчових волокон 20 %-им розчином ПЕО. Існує спосіб іммобілізації ліполітичних ферментів, який передбачає включення ферменту в полівініловий спирт і подальше нанесення його на матрицю, попередньо насичену 2 % розчином бури. Як матрицю використовують активований вуглецево-волокнистий матеріал з 3 сумарним об'ємом пор 0,41-1,3 см /г, а процес ведуть при співвідношенні фермент: полівініловий спирт: матриця - (0,8-1,2):(0,11-0,17):(24-72) відповідно (див. патент України № 7861 (51) МПК (2005): C12N 11/00 Спосіб іммобілізації ліполітичних ферментів). Недоліком даного способу є використання полівінілового спирту для включення ферменту. Даний компонент являється синтетичним матеріалом і не підлягає біодеградації. Відомий спосіб іммобілізації протеази С (див. патент України на корисну модель № 31802), в якому включення ферменту проводять наступним чином: готують суспендований розчин 3 протеази С, для чого 35 мг ферменту розчиняють в 5 см натрій-фосфатного буферного 3 розчину (0,033 моль/дм , рН 7, 4). Отриману суспензію при температурі 37 °C і ретельному 3 перемішуванні повільно вливають в 3 см гелеподібного продукту з бурих морських водоростей "Ламідан". В результаті включення отримують іммобілізовану протеазу С у вигляді суміші, якій надалі в залежності від потреб можна надати необхідну форму. Зберігають іммобілізованій препарат у холодильнику при температурі 0-4 °C. Але спосіб має суттєві недоліки: наявність великої іонної сили розчину, що створюється в гелі, унеможливлює ймовірність іммобілізації на ньому лужних травних ферментів, збереження активності трипсину у складі гелеподібного продукту з бурих морських водоростей "Ламідан" зберігається всього на 19,5 %. Другим недоліком є те, що іммобілізована протеаза С у вигляді продукту гелеподібної структури деяким чином є несприятною за органолептичними показниками для вживання перорально. Окрім того, проведення процесу іммобілізації ферменту при температурі 37 °C передбачає додаткові затрати енергії. Існує спосіб іммобілізації трипсину, що передбачає включення ферменту в полімерну матрицю гелеподібної структури (див. патент України на корисну модель № 66429). Іммобілізацію трипсину проводять наступним чином: спочатку змішують водні розчини пектину і трипсину та витримують 10-15 хвилин, після цього додають розчин хітозану в 1 % оцтовій кислоті. Суміш витримують 10-15 хвилин і піддають ліофільному сушінню. Розчин пектину, трипсину і хітозану беруть в масовому співвідношенні, рівному (1-2):(0,5-1):(1-2) відповідно. Пектин і хітозан беруть в концентрації 0,25-1 %. Але недолік даного способу полягає в тому, що максимальне збереження активності характерно тільки для іммобілізованих травних протеаз, а активність, наприклад, -амілази в комплексі з полісахаридами значно знижується (на 80…90 % від вихідної активності) порівняно з вільним ферментом. Найбільш близьким до заявлюваного є спосіб іммобілізації -амілази на поліетерсульфонових мембранах методом "Layer by Layer" (див. Наукові записки. - Т. 79. Хімічні науки і технології Національного університету "Києво-Могилянська академія" - 2008 р. - С. 4044). Поліетерсульфонові мембрани попередньо відмивали в дистильованій воді протягом 1 год. Модифікування проводили з боку селективного шару мембрани. Розчин полістиренсульфонату (PSS) з концентрацією 0,02 М в 0,5 М NaCl наносили на селективний шар мембрани першим та витримували протягом 5 хв. Перед і після нанесення шару -амілази поверхню мембрани інтенсивно відмивали дистильованою водою. Концентрацію ферменту змінювали від 25 до 1000 од. акт./мл, рН модифікуючого розчину в діапазоні 2-6. Процедуру повторювали до нанесення необхідної кількості шарів. Даний спосіб обрано прототипом. Прототип і спосіб, що заявляється, співпадають в наявності операції включення -амілази в полімерні структури за принципом поліелектролітної взаємодії протилежно заряджених функціональних груп молекул полімерів. Але спосіб за прототипом має суттєвий недолік: додаткові операції модифікування поліетерсульфонової мембрани розчином полістиренсульфонату ускладнюють технологічний 1 UA 76072 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 процес, крім того використання синтетичного полімерного носія для іммобілізації -амілази унеможливлює його біодеградацію та може викликати алергічні реакції. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити удосконалений спосіб іммобілізації -амілази, в якому шляхом включення ферменту в полісахаридну біополімерну матрицю при додаванні хлориду кальцію забезпечити значне збереження активності ферменту, біосумісність з активною складовою та біодеградацію матриці для іммобілізації. Поставлена задача вирішена в способі іммобілізації -амілази, що передбачає включення ферменту в полімерну матрицю, тим, що спочатку змішують водні розчини пектину і та хлориду кальцію, після цього додають розчин -амілази, витримують 10-15 хвилин, потім до вказаної суміші додають розчин хітозану в 1 % оцтовій кислоті, суміш витримують 10-15 хвилин і піддають ліофільній сушці. Розчини пектину, хлориду кальцію, -амілази і хітозану беруть в масових співвідношеннях (1-2):(0,1-1):(0, 1-1):(1-2) відповідно. Новим у корисній моделі, що заявляється, є включення -амілази до поліелектролітного комплексу хітозан-пектин, який є біодеградовним та виконує функціонально-фізіологічні функції природних ентеросорбентів. Комплекси хітозан--амілаза-пектин мають високу амілолітичну активність. Відмінною особливістю такого способу іммобілізації ферментів є відсутність контакту ферменту з розчинниками, які спричиняють денатуруючу дію на білки. Показано, що зв'язування ферменту з матрицею відбувається в основному за рахунок електростатичних взаємодій. Такий характер взаємодії дозволяє зберегти третинну структуру білка і, отже, його активність. Використання полісахаридів як полімерної матриці дозволяє зберегти 80-85 % активності іммобілізованої таким чином -амілази, що має пролонговану дію. Невідома технологія іммобілізації ферменту, зокрема а-амілази, в якій як полімерні складові використовуються пектин, СаСl2 і хітозан в суміші. Вказані компоненти полімерної матриці підібрані експериментально. Як аніонні комплексоутворювачi, крім пектину, використовували також агар та карагінан, а як катіонний комплексоутворювач - казеїн. При змішуванні розчинів пектину з казеїном або хітозану з карагінаном, або хітозану з агаром - утворення гелеподібної структури не спостерігалось. Відмічалось деяке збільшення в'язкісних характеристик даних сумішей, на відміну від суміші хітозану з пектином. Змішування розчинів хітозану з пектином супроводжувалось гелеутворенням та замутненням системи, які спостерігали протягом 30 хвилин. Спектрофотометричне дослідження показало, що оптична щільність дисперсій, яку визначали через кожні 5 хвилин (=345 нм) досягала постійного значення (D=0,82 опт. од) через 10-15 хвилин від початку поєднання компонентів комплексу, що вказує на закінчення процесу комплексоутворення. Тому в режимі вибрано час витримки саме 10-15 хвилин. Співвідношення пектину, СаСl2, а-амілази та хітозану також підібрано експериментально. Комплекс отримували послідовним змішуванням розчинів пектину з СаСl2, -амілази i хітозану. Використовували хітозан з молекулярною масою 245 кДа і ступенем деацетилювання 67,2 %, яблучний пектин з молекулярною масою 12 кДа і ступенем метоксилювання 66,4 %, -амілазу з активністю 120 од/мг. Масове співвідношенні компонентів у комплексі (пектин: СаСl2:-амілаза: хітозан) становило (1-2):(0,1-1):(0,1-1):(1-2). Концентрацію 5 полісахаридів-комплексоутворювачів варіювали в iнтервалі від 0,25 до 1 %, -амілази - від 0,1 до 1 %, СаСl2 - від 0,1 до 1 %. Процес взаємодії компонентів супроводжувався гелеутворенням, в той час як кожен з полісахаридів окремо при взаємодії з -амілазою в даних умовах не здатен до утворення гелю. Процес комплексоутворення завершується через 10-15 хв з моменту з'єднання компонентів комплексу. Включення ферменту в матрицю становило 100 %. ІПЕК з амілолітичною активністю піддавали ліофільному сушінню при 37 °C, після чого визначали активність ферменту. Приклад 1. В ємність помістили 15 мл 0,5 % водного розчину пектину і до нього додавали 15 мл 0,1 % водного розчину СаСl2, після чого додавали 15 мл 0,5 % водного розчину -амілази. Суміш перемішали і витримали протягом 15 хв. Потім до суміші додали 30 мл 0,25 % розчину хітозану в 1 % оцтовій кислоті, перемішали і витримали протягом 15 хв. Отриману гелеву масу після цього помістили в металеві бюкси і піддали ліофільному сушінню при 37 °C протягом 10 год. Отриманий продукт має губчату пористу структуру, колір від світло-сірого до кремового. Вміст вологи складає 8-10 %. Приклад 2-7. Здійснювали аналогічно тому, як наведено в прикладі 1, але компоненти брали в різних співвідношеннях. Результати наведені в таблиці. Встановлено, що найбільшу амілолітичну активність (85,2 % від максимально можливої) має комплекс, отриманий при масовому співвідношенні пектин: СаСl2: -амілаза: хітозан - 2:0,2:1:2 2 UA 76072 U 5 (приклад 1), при цьому співвідношення функціональних груп пектину і хітозану становить 1:1, що відповідає утворенню стехіометричного ІПЕК. При різному співвідношенні функціональних груп пектину та хітозану в комплексі спостерігається зменшення протеолітичої активності ІПЕК. Така тенденція пояснюється утворенням нестехіометричних асоціатів, в котрих включення -амілази здійснюється не повністю. Таблиця Амiлолітична активність (АА) ІПЕК в залежності від співвідношення та його компонентів № зразка Пектин V, мл 1 30 2 20 3 30 4 30 5 15 6 20 7 20 СаСl2 V, мл -Амілаза V, мл 3 15 3 20 3 15 3 15 3 15 3 20 3 10 Хiтозан V, мл 30 20 30 15 30 20 40 АА, % від max 85,1 54,42 44,32 25,62 29,55 27,12 23,14 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб іммобілізації -амiлази, що передбачає включення ферменту в полімерну поліелектролітну матрицю, який відрізняється тим, що спочатку змішують водні розчини пектину і СаСl2, потім додають водний розчин -амілази та витримують 10…15 хв, після чого додають розчин хітозану в 1 % оцтовій кислоті, суміш витримують 10…15 хвилин і піддають ліофільному сушінню, при цьому розчини пектину, СаСl2, -амілази і хітозану беруть в масовому співвідношенні (1-2):(0,1-1):(0,1-1):(1-2) відповідно. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3