Спосіб визначення інтенсивності біохімічного процесу

1. Спосіб визначення інтенсивності біохімічного процесу, що включає протікання вказаного процесу в герметичному об'ємі культурального середовища, розміщеного в ємності, який відрізняється тим, що як ємність використовують пластичну ємність і біохімічний процес починають, попередньо стиснувши ємність у відкритому стані, зафіксувавши об'єм культурального середовища та загерметизувавши ємність, а інтенсивність процесу визначають за швидкістю відновлення пустого об'єму ємності. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як ємність використовують ПЕТ-пляшку. Винахід відноситься до області аналізу матеріалів шляхом визначення їх фізико-хімічних властивостей, зокрема, шляхом вимірювання об'єму газу, що виділяється із матеріалу, і може бути використаний при дослідженні біохімічних процесів. Велика кількість біохімічних процесів супроводжується виділенням газів (бродіння, денітрифікація, утворення сірководю, тощо) (Пирог Т.П. Загальна мікробіологія. - К.: НУХТ, 2004. - 333с.) [1]. При дослідженні таких процесів виникає необхідність вимірювати інтенсивність газоутворення, щоб за отриманими даними побудувати графіки залежності об'єму газу, що утворився, від того чи іншого фізіолого-біохімічного процесу досліджуваного мікробного об'єкту (приросту біомаси, швидкості споживання субстрату тощо). При діагностуванні природного матеріалу на наявність мікроорганізмів здатних до газоутворення (виявлення денітрифікаторів, сульфатредукторів, метаноутворювальних бактерій тощо), також необхідно спостерігати за об'ємом газів, які виділяються. Відомий спосіб вивчення біохімічних процесів, наприклад, процесу спиртового бродіння, за накопиченням газів, що виділяються (Векірчик К.М. Практикум з мікробіології. - К. Либідь, 2003 - с. 97) [2]. Суть способу [2] полягає в наступному. Дослідження проводять на установці, яка складається з конічної колби об'ємом 250 см3, закритої гумовою пробкою, в яку вставлена газовідвідна трубка, зовнішній кінець якої занурений у посудину з водою. Для збирання газу зовнішній кінець трубки з'єднують з пробіркою, розміщеною в посудині. Для проведення дослідження процесу у конічну колбу, описаної вище установки, вносять культуральне середовище, що містить 3-5 г пресованих дріжджів (мікробний матеріал) і наливають 100см3 15%-ного розчину сахарози (поживне середовище) і закривають пробкою з газовідвідною трубкою, зовнішній кінець якої занурюють у посудину з водою і з'єднують з пробіркою для збирання вуглекислого газу. Загальну кількість газу, що виділився внаслідок проходження біохімічного процесу, визначають за допомогою зважування дослідної установки з культуральною рідиною, яке проводять відразу коли був поставлений дослід, і по його закінченню. Виявлена при цьому різниця вказує на кількість вуглекислого газу, що утворився. Кількість вуглекислого газу, що виділилась залежить від кількості вихідного мікробного матеріалу (дріжджів) та сахарози в поживному середови (19) UA (11) 92938 (13) C2 (21) a200812869 (22) 04.11.2008 (24) 27.12.2010 (46) 27.12.2010, Бюл.№ 24, 2010 р. (72) ГВОЗДЯК ПЕТРО ІЛЛІЧ, САПУРА ОЛЕНА ВАСИЛІВНА, ГЛОБА ЛЕОНІД ІВАНОВИЧ (73) ІНСТИТУТ КОЛОЇДНОЇ ХІМІЇ ТА ХІМІЇ ВОДИ ІМ. А.В. ДУМАНСЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) EP 0340902 A1, 08.11.1989. US 4152213, 01.05.1979. US 5047331, 10.09.1991. US 4270381, 02.06.1981. RU 99108700 A, 10.02.2001. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія.-К.:НУХТ, 2004.C.333-339. Векірчик К.М. Практикум з мікробіології.-К. Либідь, 2003.-C.97-100. 3 щі. А інтенсивність проходження біохімічного процесу залежить, у свою чергу, від швидкості виділення СО2. При цьому даний спосіб передбачає визначення інтенсивності біохімічного процесу (бродіння) за кількістю СО2, який виділився по закінченню бродіння. Таким чином, відомий спосіб [2] не передбачає визначення інтенсивності біохімічних процесів за швидкістю виділення газу, що утворюється в процесі бродіння. Крім того, слід відмітити, складність самої установки та ненадійність дотримання герметичності. Найбільш близьким аналогом до винаходу за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб визначення інтенсивності процесу бродіння (Т.П. Слюсаренко. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств. - Μ.: Легкая и пищевая промышленность, 1984 - с. 98) [3]. Суть способу [3] полягає в наступному. Дослідження проводять на установці, яка складається з конічної колби об'ємом 250 або 300 см3, закритої гумовою пробкою, в яку вставлений затвор. В середину затвору залита концентрована сірчана кислота, яка пропускає вуглекислий газ, що виділяється при бродінні, і затримує пари води і спирту. Для повної герметичності гумова пробка заливається парафіном. Дослід проводять наступним чином. Готують синтетичне поживне середовище (наприклад середовище Рідерна) такого складу, (%об'ємні): Сахароза - 15,0, Пептон - 0,5, KН2РO4 - 0,3, MgSO4 0,1. Потім 150 см3 приготовленого поживного середовища заливають у колбу ємністю 250 см3. Також у цю ж саму колбу вносять 25 см3 заздалегідь приготовленого мікробного матеріалу, який являє собою дріжджову суспензію, (об'єм мікробної культури (дріжджів), у суспензії варіюється від 1-1,5 до 8-10% (об'ємних)). Потім колбу закривають гумовою пробкою із вставленим затвором, заповненим концентрованою сірчаною кислотою, для виходу вуглекислого газу. Біохімічний процес в культуральному середовищі вказаного складу проводять при температурі 28-30°С протягом трьох діб. При цьому інтенсивність біохімічного процесу визначають за кількістю СО2, що виділяється під час бродіння. Кількість СО2 визначають за допомогою зважування дослідної установки на технічних терезах з точністю до 0,01 г. Зважування проводять відразу після того, як у колбу дослідної установки було залито культуральну рідину і створено герметичність, а потім його повторюють через 4, 8, 12, 24, 36, 48 і 72 години. Тобто, на скільки грамів зменшилась вага установки, стільки грамів СО2 виділилось назовні. За отриманими результатами складають відповідні таблиці і будують графіки залежності виділення вуглекислого газу від часу, тобто визначають інтенсивність біохімічного процесу. Недоліками даного способу визначення інтенсивності біохімічних процесів є досить тривалий час підготовки досліду, а також те, що при протіканні І біохімічного процесу не передбачено збирання утворених газів для подальшого їх дослідження, (встановлення їх складу, тощо),та 92938 4 складність і ненадійність експлуатації дослідної установки (ємності, з яких складається дана установка виготовлені зі скла). В основу винаходу поставлено завдання удосконалити спосіб визначення інтенсивності біохімічного процесу, використовуючи герметичні ємності з пластичного матеріалу та забезпечуючи збирання газу, що утворюється в біохімічному процесі. Все вказане вище забезпечує скорочення часу на підготовку досліду, підвищення надійності експлуатації установки та її спрощення, а також розширення функціональних можливостей за рахунок вимірювання об'єму газу в процесі його утворення та його збирання, визначення його складу та встановлення природи мікробного об'єкту. Для вирішення поставленої задачі запропоновано спосіб визначення інтенсивності біохімічного процесу, що включає протікання вказаного процесу в герметичному об'ємі культурального середовища, розміщеного в ємності, в якому, згідно з винаходом, як ємність використовують пластичну ємність і біохімічний процес починають, попередньо стиснувши ємність у відкритому стані, зафіксувавши об'єм культурального середовища та загерметизувавши ємність, а інтенсивність процесу визначають за швидкістю відновлення пустого об'єму ємності;причому, як ємність використовують ПЕТ-пляшку. Використання ємності з пластичного матеріалу дозволяє створити анаеробні умови, витискаючи культуральною рідиною, при стисканні ПЕТпляшки, весь об'єм повітря, після чого пляшку щільно загвинчують пластмасовою кришкою. Тобто, досягається герметичність ємності, а градуювання ємності і її герметичність дозволяють з високою точністю і надійно вимірювати об'єм газу, що утворюється. Причому, об'єм газу вимірюється періодично при протіканні біохімічного процесу. За величиною об'єму газу, що виділяється за певний проміжок часу (швидкість утворення СО2), протягом всього процесу визначають інтенсивність біохімічного процесу в цілому. Аналіз виділеного газу дає можливість визначити наявність у мікробному матеріалі природу тих мікроорганізмів, які зумовлюють утворення даного газу. Таким чином, сукупність суттєвих ознак способу, що заявляється, є необхідною і достатньою для досягнення забезпечуваного винаходом технічного результату - спрощення та підвищення надійності експлуатації дослідної установки, скорочення часу підготовки досліду, також розширення функціональних можливостей способу, завдяки визначенню природи мікробного матеріалу. Спосіб реалізується наступним чином. Визначення інтенсивності біохімічних процесів здійснювали за допомогою герметичної ємності, в якості якої використовували ПЕТ-пляшки, виготовлені з м'якого прозорого пластика промисловим способом. Герметичність даної пляшки досягається за рахунок нагвинчування пластмасової кришки. Градуюванняоб'єму здійснюють, заливаючи певний об'єм рідини та наносячи зверху до низу відповідні поділки. В ємність поміщають культуральне середовище, яка містить поживне середовище та мікробний 5 матеріал, не заповнюючи при цьому весь об'єм пляшки. В якості поживного середовища використовували рідке мінеральне середовище складу 1 (KН2РO4; NaHCO3; (NH4)2SO4 та NaNO2) 2 (розчин сахарози), а в якості мікробного матеріалу 1(активний мул, відібраний з очисних споруд Бортницької станції аерації), 2(дріжджова суспензія). Стискають пляшку таким чином, щоб культуральна рідина піднялась до верхньої межі горловини пляшки і герметично закривають кришкою. Після герметизації ємність деформується під дією створеного вакуумного середовища. При протіканні біохімічного процесу, газ, що виділяється, заповнює об'єм пляшки зверху до низу і за позначками визначають об'єм газу, що утворився за певний проміжок часу. На основі отриманих даних були побудовані графіки залежності об'єму газу, що утворився за певний проміжок часу, де на Фіг.1 представлена крива швидкості виділення газу при протіканні біохімічного процесу в активному мулі, а на Фіг.2 крива швидкості виділення газу в процесі спиртового бродіння. Після закінчення біохімічного процесу для визначення хімічного складу газу, що утворився, за допомогою шприца його відбирають на аналіз. Якщо відібраний газ являє собою сірководень, це свідчить про наявність у досліджуваному мікробному матеріалі сульфатредукторів, якщо газом являється метан - в мікробному матеріалі присутні метаноутворюючі бактерії, а якщо азот - то це вказує на наявність денітрифікаторів або ANAMMOXбактерії, в залежності від складу поживного середовища. Приклади виконання за винаходом Приклад І Беруть заздалегідь проградуйовану зверху до низу ПЕТ-пляшку ємністю 500 см3 (дослідна установка), в яку поміщають 350 см3 рідкого мінерального поживного середовища наступного складу 3 (мг/ см ): KН2РO4 - 700, NaHCO3 -1400, ((NH4)2SO4 - 471, NaNO2 - 247, та вносять 50 см3 активного мулу. Потім пляшку стискають таким чином, щоб культуральне середовище (поживне середовище і активний мул) піднялось до верхньої межі горловини пляшки. Після цього фіксують об'єм і створюють герметичність, нагвинчуючи пластмасову кришку. В ході протікання анаеробного біохімічного процесу ведуть моніторинг за виділенням газу. Виділений газ поступово заповнює пустий об'єм пляшки зверху до низу. Внаслідок чого, деформована в результаті створеного вакууму пластична ємність починає відновлювати свій об'єм. 92938 6 Об'єм утвореного газу визначають за нанесеними на пластичну ємність позначками. Вимірювання проводять протягом 282 годин (11 діб) через кожні 24 години (результати спостережень занесені до таблиці (графи 1, 2). Залежність виділення утвореного газу (см3) від часу (годин) графічно зображено на Фіг.1. Одержана крива характеризує швидкість протікання біохімічного процесу: - відрізок часу, що становить 48 годин, відповідає лаг-фазі (період адаптації мікробного матеріалу до умов культивування); - відрізок часу, що складає 186 годин (від 48 до 234 години) - відповідає експоненційній фазі (період максимальної швидкості поділу клітин). - Після цього спостерігається період сповільненого росту. Таким чином, даний біохімічний процес проходить з низькою інтенсивністю. Потім проводять аналіз газу, що утворився при протіканні біохімічного процесу, відібравши 50 см3 даного газу шприцом, і ввівши його в газоаналізатор. 80% утвореного газу являє собою азот, що свідчить про наявність в мікробному матеріалі ANAMMOX-бактерій. Використання цих мікроорганізмів дає можливість очищати стічні води від амонійного азоту в анаеробних умовах. Приклад II У проградуйовану зверху до низу ПЕТ-пляшку ємністю 500 см3 (дослідна установка) поміщають 3 250 см 15%-ного розчину сахарози підігрітого до 29°С, та 50 см3 приготовленої дріжджової суспензії (вміст дріжджів у суспензії становить 1г). Потім створюють герметичність та фіксують об'єм аналогічно прикладу 1. Після цього дослідну установку ставлять у термостат, встановлюючи температуру 30°С. Спостереження за ходом анаеробного біохімічного процесу проводять за швидкістю виділення вуглекислого газу. Вимірювання - проводять протягом 72 годин (3 доби) через кожні 4 години (результати спостережень занесені до таблиці (графи 3, 4) Залежність виділення вуглекислого газу (см3) від часу (годин) графічно зображено на Фіг.2. Як видно з Фіг.2, процес спиртового бродіння проходить досить інтенсивно: - відрізок часу, що становить 1,5 години, відповідає лаг-фазі; - відрізок часу, що складає 50,5 годин (від 1,5 до 52 години) - відповідає експоненційній фазі (період максимальної швидкості поділу клітин). - Після цього спостерігається період сповільненого росту. 7 92938 Таблиця Приклад І Приклад II 1 2 3 4 Час, години Об'єм, см3 Час, години Об'єм, см3 0 0 0 0 24 1 4 15 48 5 8 30 72 12 12 50 96 20 16 70 120 37 20 90 144 50 24 110 186 70 28 125 210 82 32 140 234 95 36 150 258 100 40 157 282 100 44 165 48 170 52 180 56 182 8 60 64 68 72 185 187 190 190 Запропонований спосіб визначення інтенсивності біохімічного процесу в порівнянні з відомим способом [3] полягає в наступному. Реалізація способу, що заявляється забезпечує: - Підвищення надійності експлуатації дослідної установки, її спрощення та скорочення часу підготовки досліду за рахунок використання герметичних пластичних ємностей; - Розширення функціональних можливостей завдяки збиранню газу, що виділяється в герметичній ємності, що дозволяє визначати склад утвореного газу, що в свою чергу дасть можливість визначити природу мікробного об'єкту, внаслідок життєдіяльності мікроорганізмів, які у ньому містяться і продукують виділення даного газу. 9 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 92938 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601