Застосування пророщеного зерна пшениці як трофічного середовища “біоконт”

Застосування пророщеного зерна пшениці як трофічного середовища для вирощування штамів мезофільних молочнокислих стрептококів, мезофільних і термофільних молочнокислих паличок. Корисна модель відноситься до мікробіологічної промисловості, а саме, до трофічних середовищ і стосується середовища для культивування лактобактерій, які використовують для готування заквасок при консервуванні кормів з рослинної' сировини, і може бути використана, наприклад, для готування біологічного консерванту "БІОКОНТ" на основі ба к концентрата кефірного грибка. Відомі способи готування молочнокислої закваски для консервування продуктів рослинного походження, що передбачають культивування молочнокислих стрептококів і паличок на рідкому живильному середовищі, включаючому крейду, обрат і кукурудзяний екстракт. Відомий також "Спосіб готування молочнокислої закваски для консервування продуктів рослинного походження" [Авт.св. СРСР №492268, МПК-3 А23КЗ/00, БВ-43-75р.], у якому живильне середовище містить суху молочну сироватку (34-36г/л), сухий кормовий концентрат вітаміну Ві2(5-7г/л ) і крейду (4-6г/л). Недоліком вищевказаних живильних середовищ є висока вартість їх, а також досить складна технологія готування молочнокислих заквасок. Відомий "Спосіб культивування молочнокислих чи пропіоновокислих бактерій" [Авт.св. СРСР №1711788, МПК-5 А23КЗ/00, БВ-6-92р.], у якому використано живильне середовище, наступного складу, г/л: рибне борошно (10,0), пептон (5,0), глюкоза (20,0), лактоза (20,0), (NH4)2SO4 (2,0), крохмаль н/раств. (10,0), СаСО3 (5,0), NaCI (5,0), вода (до 1л). Недоліком цього живильного середовища є його висока вартість і складна технологія культивування бактерій з використанням цього середовища. - * Відомий "Спосіб культивування молочнокислих і пропіоновокислих бактерій" [Авт.св. СРСР №1769837, МПК-5 А23КЗ/00, БВ-39-92р.], у якому живильне середовище містить джерела вуглецю, азоту, мінеральні солі і відхід виробництва розеофунгіна у вигляді гідролізата міцелію продуцента, далі по тексту - живильна суміш АМС (без гідролізата міцелію). Незважаючи на відносно високий бактеріальний титр одержуваної закваски, спосіб і склад характеризуються складною технологією одержання і високою вартістю кінцевого продукту. У роботах М.С. Карпова і Р.Н. Єкимової [М.С. Карпов, Р.Н. Єкимова, "Удосконалення силосних заквасок", від. АН Казахської РСР, T.VII, 1963р.] для одержання силосної закваски з високим бактеріальним титром використовувалося ліофільне і калориферне сушіння рідких заквасок, зроблених на середовищах з кукурудзяного відвару чи кукурудзяного екстракту з додаванням пептону, цукру, крейди, хлористого натрію, сірчанокислого амонію. Зазначена технологія відрізняється надзвичайно високою вартістю виробництва силосної закваски через необхідність використання вакуумного низькотемпературного сушіння. Відомі роботи з використанням ущільнених середовищ для вирощування лактобактерій, що значно підвищили бактеріальні титри заквасок. Так, наприклад, Я.Й. Клаар досліджував ущільнені середовища на молоці, житньому, гороховому, вівсяному борошну з додаванням автолізата кормових дріжджів, сірчанокислого марганцю, ацетату натрію і крейди [Я.І. Клаар, "Заводське виробництво щільних заквасок". Праці Естонської сільськогосподарської академії, Тарту, 1970р., №71]. Однак, даний склад ущільнених живильних ю со (О < 11365 активні речовини. Вони роблять стимулюючий середовищ свідчить про досить складну техноловплив, позитивно впливають на відновлення всіх гію виробництва цих заквасок. життєвих процесів, обмін речовин і діяльність нерВідомі способи і склади для виробництва завової системи, зміцнення зубів. Уже через 1-2 тиквасок на більш простих ущільнених середовищах, жня в хворих настає поліпшення стану здоров'я в у яких як основний інгредієнт використовувалися лікуванні від хронічних захворювань: туберкульопшеничні висівки, наприклад: зу, бронхіальної астми, виразки шлунка, виразки - "Живильне середовище ТПП" для вирощудванадцятипалої кишки, каменеутворення в різних вання штамів амілолитичного молочнокислого органах. Знижується сприйнятливість до простудстрептокока", що засновані на застосуванні пшених захворювань. Ніж довше застосовувати проничних висівок як живильного середовища для рослу пшеницю, тим яскравіше виражений її позивирощування штамів амілолитичного молочнокистивний ефект"; лого стрептокока Streptococcus lactis diastaticus [Патент України №48853А, МПК-7 А23КЗ/00, бюл. - буклет першої харчової фабрики оздоровчих №8, 2002р.]; продуктів "Наша спадщина" - "Пробуджені зерна" "Кожен злак - не просто продукт харчування, що - "Трофічна суміш "ЛАКТИС" [Патент України має ті чи ІНШІ живильні властивості. Це живий па№48852А, МПК-7 А23КЗ/00, бюл. №8, 2002р.], на росток, що дрімає під глибокою оболонкою зерна і основі пшеничних висівок, що додатково містить чекає моменту пробудження. Це живе утворення, цукор, крейду, ацетат натрію, сульфат марганцю і що володіє своєрідною енергетикою, має величезводу, при цьому суміш містить зазначені компонений запас мінеральних речовин, вітамінів, мінеранти при наступному співвідношенні, мас.%: лів, мікроелементів. Коли насіння пробуджується, пшеничні висівки 45-50 вивільняється неймовірний енергетичний потік. цукор 3,0-3,5 Відбуваються природні хімічні перетворення. Викрейда 1,0-2,0 робляються ферменти, що утворять концентровані ацетат натрію • 1,0-2,0 живильні речовини в продукти, необхідні для росту сульфат марганцю 0,1 -0,2 рослини. Вітамін С і інші вітаміни, що містяться в вода Інше. насінні в незначної кількості, при пробудженні Відомі трофічні і живильні суміші характеризуутворяться досить інтенсивно, наприклад, зміст ються нескладною технологією вирощування штавітаміну Е збільшується в три рази і засвоюється мів амілолитичного молочнокислого стрептокока, він, принаймні, у десять разів ефективніше, ніж однак вони мають порівняно високу вартість комвідповідний синтетичний препарат. Крім того, папонентів. ростки мають властивість біогености: вони живі і Відоме використання паростків пшениці й інможуть віддавати вашому організму свою життєву ших злаків у дієтичному і лікувальному харчуванні, енергію. У пробуджених зернах крохмаль цілком наприклад: трансформується в розчинні форми, зберігаючи - журнал "Здоров'я" №2, 2002р. - "Паростки при цьому повноцінний набір харчових волокон, пшениці своїми корисними властивостями зобов'ямінеральних речовин (фосфор, калій, магній, зані харчовим волокнам. Є в проростках вітаміни кальцій, залізо, мідь, цинк і ін.) і вітамінів (груп В, групи С, Е, В, мінеральні речовини. Паросток воС, РР, Е, В-каротина, провітаміни А). Мінеральні лодіє великою життєвою силою й енергетикою."; речовини в пробуджених насіннях хелатировани, - журнал "Фізкультура і спорт" №2, 1994р. - "У тобто вони знаходяться в природному стані - зв'язародку, а також в оболонці зосереджені білки, зані з амінокислотами і тому добре засвоюються корисні жири, олії і клітковина, мікроелементи і людським організмом. При цьому мінеральні речовітаміни. Іншими словами, цільні зерна містять усі вини беруть участь в утворенні і дії усіх ферментів необхідні речовини для нормального функціонуі підтримують визначене значення електричного вання організму. У результаті промислового помезаряду на мембранах усіх кліток, охороняючи їх від лу і просівання зерен оболонки і зародки попадавторгнення мікробів". ють у висівки, що йдуть, в основному, на корм худобі. Вони містять вуглеводи і крохмалі, а також Усі вищенаведені приклади підтверджують наречовини, необхідні для біологічної' активності."; явність у пророслому зерні пшениці вітамінів, ферментів, гормонів, мінеральних речовин, мікро- журнал "Допоможи собі сам", №7, 1996р. елементів, біологічно активних речовин. "Введення в раціон харчування пророслої' пшениці робить оздоровлюючу дію і омолоджуючий вплив Однак дотепер невідоме використання пророна організм, тому що в ній міститися вітаміни і різні слого зерна пшениці як трофічного середовища ферменти, що стимулюють життєдіяльність органідля вирощування штамів мезофільних молочнокизму, оптимізуючі обмін речовин, що зміцнюють слих стрептококів, мезофільних і термофільних нервову систему. Проросла пшениця вживається молочнокислих паличок, що входять до складу для відновлення життєвого тонусу, для більш ліофілізованої культури прямого внесення - концешвидкого виходу зі стану нездужання після хворонтрату грибкової кефірної закваски. би, для зміцнення органів подиху, зміцнення зубів, Задачею корисної моделі є розробка нового поліпшення стану волосся"; трофічного середовища для вирощування штамів мезофільних молочнокислих стрептококів, мезо- газета "Кримська правда", 4 квітня 1995р. фільних і термофільних молочнокислих паличок, "Дієта Бирхер-Боннера. Сира рослинна їжа навіть що містяться в кефірній заквасці з використанням при досить великому обсязі відрізняється низькою пророслого зерна пшениці як єдиного інгредієнту і калорійністю і винятково малою кількістю жирів, досягнення технічного результату - підвищення білків і вуглеводів. У зерні, що проростає, містятьякості трофічного середовища. ся вітаміни групи В і інші, ферменти, біологічно 11365 Поставлена задача досягається застосуванням відомого пророслого зерна пшениці як трофічного середовища для вирощування штамів мезофільних молочнокислих стрептококів, мезофільних і термофільних молочнокислих паличок, що містяться у кефірній заквасці. Дріблена маса пророслого зерна пшениці є основним і єдиним компонентом живильного середовища для росту і розвитку лактобактерій. Вуглеводи входять до складу насінь зернових культур, наприклад, пшениці, ячменю, кукурудзи, у вигляді цукрів, декстриноподібних речовин, крохмалю, геміцелюлоз і клітковини. Цукор живильний і енергетичний матеріал, необхідний для розвитку дріжджів і мікроорганізмів. Крохмаль під дією ферменту амілази утворює цукор мальтозу, необхідний для розвитку мікроорганізмів. У таблиці 1 зазначен хімічний склад зерна різних культур [Н.П. Козьмина, В.Л. Кретович. Біохімія зерна і продуктів його переробки. М., "Агропромиздат", 1985р., 237с]. Таблиця 1 Хімічний склад зерна різних культур в % Культура Пшениця озима: виконані зерна середні зерна щуплі зерна Пшениця ярова Кукурудза Просо Просо завалене Ячмінь Вода 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Білок 10,0 11,0 13,5 13,2 9.9 10,6 10,5 9,5 По хараюгеру шумування молочнокислі бактерії поділяються на дві основні групи: - гомоферментативні - які утворюють зі сбраживаючих цукріе молочну кислоту і дуже незначну кількість побічних продуктів; - гетероферментативні - які утворюють з цукрів крім молочної кислоти значну кількість оцтової кислоти, газу й інших речовин. Молочнокислі бактерії відносяться до групи гетеротрофних бактерій, тобто бактерій, що потребують для свого розвитку в достатній кількості легкодоступних готових органічних речовин: білках, вуглеводах, жирах, вітамінах, амінокислотах, простих цукрах і ін., крім того, різні види лактобактерій мають потребу у визначених складах і формах готових живильних речовин. При цьому, перераховані вище речовини повинні бути присутніми у живильному середовищі у засвоюваних формах, придатних для поглинання живими клітинами бактерій. З цієї причини дослідницькі публікації повні безліччю рецептів І складів живильних середовищ, деякі з який зазначені вище. Відомо, ЩО багато бактерій збуджують молочнокисле шумування, при якому молекула гексози розпадається на дві частини молочної кислоти: С 6 Н іг О 6 =2СНзСНОН • СООН+22,5ккал. гексоза молочна кислота Молочнокисле шумування протікає з виділенням енергії, що використовується мікроорганізмами для розмноження. Дріжджі і молочнокислі бактерії роблять один на одного сприятливий вплив і 'їхні взаємини можуть розглядатися як симбіотичні. Разом з тим, у природі існує джерело формування живильного середовища, до складу якого входять найрізноманітніші готові живильні речовини. Маються на увазі живильні речовини, що з'яв Вуглеводи 70,0 68,5 64,0 66,1 67,2 58,6 65,1 67,0 Жир 1,7 1,9 2,2 2,0 4,4 3,9 4,2 2,1 Зола 1,7 1,7 2,6 1,9 1,3 3,8 2,7 2,5 Клітковина 1,6 1,9 2,7 1,8 2,2 8,1 2,5 4,0 ляються в насіннях рослин при їхньому проростанні, наприклад, при проростанні зерна пшениці. У набряклому при зволоженні зерні пшениці відбуваються різноманітні складні фізіологічні і біохімічні процеси, енергійно протікають складніші перетворення мінеральних і органічних речовин, наприклад, у пророслому зерні міститься речовина, яка здатна перетворювати крохмаль у цукор і декстрин. За спрощеною схемою, фермент амілаза, проникаючи в ендосперм зерновки, перетворює запасений у ньому нерозчинний крохмаль у розчині у воді цукри; фермент ліпаза розщеплює жири до водорозчинних жирних кислот, а протеліаза і пептідаза гідролізують білок в амінокислоти, яки також добре розчиняються у воді. Таблиця 2 Зміст цукрів (у перерахуванні на суху речовину) у % і крохмалю у % (относит, сухої речовини) у зерні різних культур Культура Пшениця Ячмінь Кукурудза Просо Цукор 2,0-5,0 6,0-7,0 1,50-3,70 0,50 Крохмаль 58-76 56-66 60-70 20-28 Під впливом фітогормонів ауксину, гибберилина, цітокинина клітки зародкового паростка зерновки, одержавши водорозчинні живильні речовини, починають енергійно поділятися і зерновка проростає [Життя рослин, т.5, М., "Освіта", 1980р.]. Якщо це так, то пробуджена маса пшениці, яка багата легко рухливими живильними речовинами і фітогормонами, може стати оптимальним середовищем для росту і розвитку лактобактерій і, отже, на такому середовищі можна одержати бактеріа 11365 льний концентрат з дуже високим бактеріальним титром. У таблиці 3 приводяться матеріали по речовинному складу зерна пшениці, що свідчать про 8 його високу збагаченість білками, цукрами, крохмалем, жирами [В.А. Кротович. БІОХІМІЯ зерна і хліба. АН СРСР, М. 1958р.]. Таблиця З Речовинний склад анатомічних частин пшениці, % Анатомічні частини Ендосперм Зародок Алейроновий шар Білок 12,9 41,3 28,7 Крохмаль 78,8 Сахара 3,5 25,1 4,2 Перетворення приведених у таблиці 3 нерухомих живильних речовин під впливом ферментів при проростанні пшениці в різноманітні легкорухливі амінокислоти і цукри, безумовно забезпечить лактобактерії достатнім рівнем харчування при найвищих темпах розмноження. Оптимальна температура розмноження молочнокислих бактерій є 28°С. У зв'язку з цим температура термостатування бі окон серванта не повинна перевищувати 28±1"С, тому що при температурі більше 29°С збільшуються марні витрати енергії на підвищення температури, а при температурі менше 27°С розмноження молочнокислих бактерій сповільнюється. Чим вище вологість зерна, тим швидше йде розвиток і розмноження більшості мікроорганізмів у зерновій масі. При комплексному вивченні активності фітогормонів різних типів (ауксинів, гибберелинів, цитокінинов) об'єктом дослідження служили насіння і паростки зернових культур, наприклад, кукурудзи, пшениці і ячменя. Зріле сухе насіння замочували в дистильованій воді протягом 24 години і пророщували: кукурудзи - протягом 72 годин, пшениці протягом 24 годин, ячменя - протягом 48 годин при температурі 24-25°С на вологому фільтрувальному папері. При виході насінь зернових культур, у т.ч. і пшениці, зі стану спокою, на тлі немінливого складу сухої речовини різко зростає сира маса за рахунок посиленого надходження в насіння води. Слідом за поглинанням води в насінні починається утилізація запасних речовин і міняється співвідношення регуляторів росту (стимуляторів і інгібіторів). Гибберелини викликають утворення в алейроновому шарі альфа-амілази - ферменту, що розщеплює крохмаль ендосперму до розчинних цукрів, яки служать енергетичним і будівельним матеріалом для молочнокислих бактерій. Таким чином, проведені дослідження показали, що при набряканні та проростанні зерна пшениці зміст легкодоступних цукрів у них зростає, при подальшому росту паростка - знижується, гибберелини виявлені лише в зерні, яке набухає і проростає. У зв'язку з чим, при створенні дійсного трофічного середовища, набрякання зерна пшениці проводять протягом 30±20 годин, а проростання протягом 36+12 годин, тому що з джерел науковотехнічної літератури відомо, що для харчування, розмноження і росту молочнокислих бактерій не Клітковина 0,2 2,5 16,2 Пептозани Жир 2,7 0,7 9,7 | 15,0 36,6 36,6 Зола 0,5 6,3 6,5 обхідні, в основному, лише цукри й енергія для розподілу і розмноження лактобактерій, та достатня кількість вологи. Якщо набрякання насінь пшениці проводити менше 10 годин, то наявний у них крохмаль не встигає цілком розщепитися до розчинних цукрів, що зменшує можливості трофічного середовища для розмноження лактобактерій, а збільшення часу набрякання насінь пшениці більш 50 годин веде до непродуктивного збільшення часу технологічного циклу і невиправданого завантаження устаткування. Проведення проростання насінь пшениці менше 24 годин не дозволяє одержати масова поява проростків пшениці, а при збільшенні часу проростання насінь пшениці більш 48 годин цукру й енергія дарма витрачаються на підтримку процесу пророщення насінь пшениці, що зменшує можливості живильного по середовища розмноженню і росту лактобактерій. При цьому якщо температура замочування і пророщення насінь пшениці складає близько 16°С, той час цих технологічних операцій - замочування і пророщення - збільшується до максимальних значень зазначених вище тимчасових діапазонів проведення цих операцій, а при температурі замочування і пророщення близько 24°С час проведення цих операцій зменшується до мінімальних значень зазначених вище тимчасових діапазонів проведення цих операцій. Проведення операцій замочування і пророщення насінь пшениці при температурі менш 16°С недоцільно, тому що не тільки різко збільшується час проведення цих операцій, але і зменшується ефективність їхнього проведення, а проведення операцій замочування і пророщення при температурі більш 24°С збільшує енергетичні витрати на підтримку заданого діапазону температури без суттєвого виграшу в одержанні кінцевого результату по зазначених операціях. При цьому переривання спокою у зерні пшениці, що проростає, здійснюється за допомогою зсуву стимуляторно-Інгібіторного співвідношення убік стимуляторів: у зерні активізується біосинтез гормонів, перетворення зв'язаних форм у вільні, відбувається перерозподіл регуляторів між окремими частинами насіння в залежності від функціонального призначення. Так, гибберелини беруть участь в ініціюванні процесу проростання і регуляції мобілізації резервів, а також разом з ауксинами в регуляції росту паростків. 11365 Цитокінини можуть брати участь у мобілізації живильних речовин у процесі проростання. Ауксини відіграють важливу роль у процесі надходження води в зростаючі клітки: на стадії набрякання зерна, що характеризується більш інтенсивним поглинанням води. Ростові речовини вищих рослин не впливають на ріст і розмноження лактобактерій, яки входять до складу концентрату. Високий зміст цукрів і крохмалю в пророслому зерні пшениці цілком забезпечує харчуванням лак 10 тобактерії І сприяють їхньому розмноженню до необхідного титру універсального бюконсерванту "БЮКОНТ" (10 16 лактобактерій у 1 гр закваски). Проведені дослідження показали, ідо живильне середовище "БЮКОНТ" з пророслого зерна пшениці з подальшим здрібленням його, дійсно є придатним для росту і розвитку лактобактерій. У таблиці 4 наводяться дані по бактеріальному титру біоконсерванта "БІООНТ", виготовленого з дрібленого пророслого зерна пшениці (середовище "БЮКОНТ"). Таблиця 4 Рекомендуєми бактеріальні титри і дози внесення біоконсервантів Марка біоконсерванта АМС Алма-Ата ПКБ Алма-Ата Лактокалдарин Алма-Ата Лактіс Сімферополь Біокон Сімферополь БЮКОНТ Сімферополь Бактеріальний титр, Рекомендуема доза внесення млрд/м біоконсерванта, г/т Ю х і 0й 1,5 10x10 а 1,5 Юх10и 1,5 Юх10 м 50,0 10,0 1ь 10х10 5,0 Дані таблиці 4 свідчать, що у порівнянні із широковідомими силосними заквасками Казахстану [використані матеріали Нугматжинова К.Г., Гаврилової Н.Н. "Інструкція з застосування сухого бактеріального концентрату "Казахсил" для силосування кормів". Алма-Ата, 1983р., а також "Результати аналізу біоконсервантів "БІОКОН" і "БЮКОНТ" на бактеріальний титр". Республіканська СЕС, АР Крим, 2003 - 2005р.], біоконсервант "БЮКОНТ" перевершує аналогічні відомі силосні закваски Казахстану по бактеріальному титру майже в 10 7 разів, а також перевершує відомі сімферопольські силосні закваски: "Лактіс" - у 10 6 разів і "Біокон" - 5 х Ю 3 разів. Технологія готування трофічного середовища "БЮКОНТ" 1. Зерно пшениці на початку зміни засипають у ванну і заливають водопровідною водою. 2. Перемішують зерно з водою. Сміття, що піднялося, з поверхні видаляють, брудну воду зливають. 3. Промивання зерна повторюють три рази. 4. Заливають промите зерно водопровідною водою. Шар води над зерном повинний бути не менш 20см, 5. Замочують зерно і періодично перемішують ЙОГО ДО КІНЦЯ ЗМІНИ. 6. Наприкінці зміни брудну воду зливають і заміняють її чистою водопровідною водою. Шар води над зерном не менш 20см. 7. Залишають зерно на замочуванні. Тривалість замочування 30±20 годин. Оптимальний термін замочування - 48 годин при температурі 20°С. 8. Після замочування зерно перемішують, а воду зливають. 9. Промивають замочене зерно один раз. 10. Промите зерно переносять на піддони, розсипають шаром 10см для пророщення. 11. Зерно на піддонах на початку і наприкінці зміни ворушать і сприскують водопровідною во Рекомендуема доза внесения бактерій, млрд/т 15 15 15 50,0 1Х10 4 5x10' дою. 12. Пророщення закінчують з масового появою паростків (через 36±12 годин). Оптимальний термін пророщування - 24 години при температурі 20°С. На цьому закінчуються технологічні операції по готуванню трофічного середовища "БЮКОНТ", що є об'єктом дійсної корисної моделі. Високий бактеріальний титр і низковитратна технологія готування біоконсерванта "БЮКОНТ" дозволяє знизити дозу внесення до 5г на 1тн силосуємої маси, проти 10г біоконсерванта "БІОКОН" на 1тн силосуемой маси, але при цьому досягається підвищення бактеріального титру, більш ніж у 5 х 1 0 3 разів, у порівнянні з біоконсервантом "БІОКОН". Звідси висока ефективність і надійність застосування біоконсерванта, виготовленого на середовищі "БЮКОНТ" при силосуванні і сенажуванні кормів. Таким чином, можна резюмувати, що при створенні біоконсерванта "БЮКОНТ" (для росту лактобактерій ) найважливішими факторами є; - висока вологість середовища - досягається замочуванням зерна у воді протягом 30±20 годин; - пророщення зерна протягом не більш годин 36±12; - замочування і пророщення зерна пшениці проводять при температурі 20±4°С; - розщеплення крохмалю з одержанням цукрів, які легко засвоюються, а також енергії, необхідної для розмноження бактерій; - відсутність необхідності введення є живильне середовище білків, жирів, фітогормонів, вітамінів, ростових речовин, тому що всі ці речовини синтезуються самостійно в процесі пробудження зерна. З огляду на усе вищевикладене, можна зробити висновок, що задача, поставлена у корисної моделі - розробка нового трофічного середовища 11 11365 12 для вирощування штамів мезофільних молочнокиниці як єдиного інгредієнту - вирішена з досягненспих стрептококів, мезафільних і термофільних ням технічного результату - підвищення якості молочнокислих паличок, що містяться в кефірній трофічного середовища. заквасці, з використанням пророслого зерна пше Комп'ютерна верстка М. Мацело Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Киш, МСП, 03680, Україна ДП "Укра'їнський інститут промисхпової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 42, 01601