Фармацевтична композиція для лікування неопластичних захворювань з використанням сполук катехіну

Представлений винахід стосується використання сполук катехіну в комбінації з іншими харчовими компонентами для інгібування матриксних металопротеїназ. Більш особливо, представлений винахід стосується використання композиції, що включає катехін, аскорбінову кислоту, лізин і пролін при лікуванні непластичних захворювань. Поліфенольні сполуки, відомі також як катехіни, присутні в зеленому чаї і були запропоновані для забезпечення захисту проти широкого спектра захворювань, включаючи рак [Mukhtar Η., Ahmed N. J. Clin. Nutr. 71:1698S-1702S (2000)]. Sadzuka і інші показали, що пероральний прийом зеленого чаю розширив пухлиноінгібувальні впливи доксорубіцину у мишей. Протиракова активність катехінів може відноситися до їх впливів на декілька факторів, залучених до проліферації ракових клітин і їх метастазу. Кате хіни, як відомо, викликають зупинення клітинного циклу в людських клітинах карциноми [Ahmad N., Feyes D. К., Nieminen A. L, Agarwal R., Mukhtar H. J. Natl. Cancer Inst. 89:1881-1886 (1997)]. Для захисту від запалення і цитокинів, викликаних пухлинами також залучається поліфенольна фракція зеленого чаю. Поліфенольні сполуки представлені як 30% сухої маси у зеленому чаї. Вони включають флаваноли, флавандіоли, флавоноїди і фенольні кислоти. Флаваноли є найбільш переважними серед поліфенолів у зеленому чаї і зазвичай відомі як катехіни, існує чотири головних катехіни в зеленому чаї: 1) (-) - епікатехін, 2) (-) - епікатехін-3-галат, 3) (-) - епігалокатехін і 4) (-) - епігалокатехін-3-галат (EGCG). Серед катехінів, EGCG є основною поліфенольною складовою в зеленому чаї. EGCG є сильною антиоксидантною сполукою [J. Cell. Biochem. 265:236-257 (1996)) і може придавати властивості протиракової дії зеленого чаю. Було описано, що сполуки катехіну здійснювали свою протиметастатичну дію через попередження процесу ангіогенезу тканин [Cao Y., Cao R. Nature 398:381 (1999)]. Також було показано, що EGCG, що противодіє дії урокінази (активатор u-плазміногену), одного з ферментів, що найчастіше експресуються у клітинах раку у людини [Jankun J., Selman S. H., Swiercz R., Skrzypczak J. E. Nature: 387-567 (1997)]. Однак, встановлено, що біозасвоєння поліфенолів у людей є надзвичайно низьким [Chen L, Lee M.J., Yang C.S. Drug Metab. Dispos. 25: 1045-1050 (1997); Yang C.S., Chen L, Lee M.J., Balentine D.A., Kuo M.C., Schantz S. Cancer Epidemol. Biomark. Prev. 7: 351-35 (1998); Bell J.R., Donovan J.L., Wong R., Waterhouse H., German J.B., Walzem R.L., Kasim K. J. Clin. Nutr. 71:103-108 (2000); Sherry Chow H.H., Cai Y., Alberts D.S., Hakim I., Dorr R., Shahi F., Crowell J.A., Yang S.C., Hara H. Cancer Epidemol. Biomark. Prev. 10: 53-58 (2001)]. Таким чином, наведені джерела інформації включені в даний опис у всій своїй повноті у вигляді посилань. Низька концентрація в тканині дуже зменшує терапевтичне значення поліфенолів, включаючи EGCG. Існує постійна необхідність в виявленні кращої композиції, що містить поліфеноли, що є ефективною при лікуванні неопластичних захворювань. Несподівано було знайдено композицію, що включає катехіни, аскорбінову кислоту, пролін і лізин, що можуть викликати сильну протипроліферативну і протиметастатичну дію проти неопластичних захворювань. Представлений винахід стосується композиції біохімічних речовин, що включають катехін, антиоксидант, пролін і лізин, що є е фективними при лікуванні захворювань людини. Представлений винахід стосується композиції біохімічних речовин, що включають катехін, антиоксидант, пролін і лізин, що є е фективними в інгібуванні матриксної металопротеїнази. Представлений винахід стосується способу лікування неопластичних захворювань, зв'язаних з надмірною деградацією екстрацелюлярного матриксу, що включає призначення ефективної кількості композиції, що включає сполуку катехіну, антиоксидант, пролін і лізин. Фіг.1 зображує інгібувальні впливи EGCG на клітинну проліферацію ракових клітин молочної залози (MDA-МБ 231). Фіг.2 зображує синергічні інгібувальні впливи комбінації EGCG, аскорбінової кислоти, проліну і лізину на клітинну проліферацію ракових клітин товстого кишечнику (MD A-МБ 231). Фіг.3 зображує синергічні інгібувальні впливи комбінації EGCG, аскорбінової кислоти, проліну і лізину на клітинну проліферацію ракових клітин товстого кишечнику (НСТ116). Фіг.4 зображує, що EGCG (20мкг/мл) інгібує інвазію Матригелю раковими клітинами молочної залози приблизно до 25%. Комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину інгібує приблизно 65%. Комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину з EGCG (20мкг/мл) повністю інгібує (приблизно 100%) інвазію Матригелю. Фіг.5 зображує, що комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину з EGCG (20мкг/мл) синергічно інгібує до 100% інвазію Матригелю клітинами меланоми (А2058). Фіг.6 зображує зимограму, що показує, як EGCG зменшує активність ММР2, виділених раковими клітинами молочної залози. Фіг.7 зображує нормальну морфологію клітин меланоми після дослідження інвазії Матригелю. Фіг.8 зображує зміни, викликані комбінацією аскорбінової кислоти, проліну і лізину в морфології клітин меланоми. Фіг.9 зображує апоптичні ефекти комбінації аскорбінової кислоти, проліну і лізину з EGCG. В іншому втіленні, представлений винахід стосується композиції, що включає катехіни, що присутні в екстрактах чаю, червоного вина в комбінації з іншими харчовими компонентами, для синергічних впливів при лікуванні неопластичних захворювань і широкого спектра інших захворювань. Харчові компоненти, що охоплені даною заявкою включають, але не обмежуються тими, що детально описуються в даній заявці. Сполуки катехіну можуть використовуватися в комбінації з іншими антиоксидантами, такими як вітамін Е, глютатіон, з іншим флавоноїдами, з сприяючими агентами такими, як фолієва кислота і з металами як селен, що, як відомо, відповідно змінюють активність матриксних металопротеїназ, що дозволить нам знизити ефективну концентрацію, при якій EGCG може виявляти свою протипухлинну дію . В іншому втіленні, представлений винахід стосується композиції, що включає катехіни, що є е фективною в зменшенні перетворення нормальних соматичних клітин організму в злоякісні клітини. В іншому втіленні, представлений винахід стосується композиції, що включає катехіни, що є е фективною в попередженні клітинної проліферації злоякісних клітин і в зменшенні синтезу, секреції і/або активності матриксних металопротеїназ широкого спектра, що перетравлюють екстрацелюлярний матрикс (ЕЦМ). В іншому втіленні, представлений винахід стосується способу попередження і лікування станів, викликаних неопластичними утвореннями шляхом призначання такої композиції, що включає катехіни, аскорбінову кислоту, пролін і лізин перорально або застосуванням місцево. Представлений винахід описується у подальших деталях з посиланням на наступні приклади, не обмежуючись визначеним винаходом. Загальні Умови Експерименту (а) Клітинні лінії В дослідженнях використовувалися наступні лінії ракових клітин, отримані від АТСС: (і) Ракові клітини молочної залози людини MDA-МБ 231 (іі) Ракові клітини товстого кишечнику людини НСТ 116 (ііі) Клітини меланоми людини А 2058 (б) Дослідження Клітинної Проліферації Для дослідження впливів катехінів і харчової композиції на клітинну проліферацію ракових клітин людини, різноманітні лінії ракових клітин були культуровані в планшети на 24 комірки, використовуючи умови культивування, що зазначені АТСС (постачає клітинні лінії). Клітини повністю інкубували протягом від 3 до 4 днів (до досягнення коалесценції). Загальну кількість клітин у комірці з культурою позначали забарвленням клітин вітальним барвником (МТТ) з наступним визначенням ОГ забарвленого розчину. МТТ забарвлює тільки мертві клітини і кількість поглиненого барвнику співвідноситься з кількістю мертвих клітин у культурі. Відсоток інгібування розраховували шля хом порівняння ОГ груп, що піддавали лікуванню з ОГ контрольних гр уп. (в) Дослідження Інвазії Матригелю Дослідження інвазії Матригелю проводилися, використовуючи Ма тригель (Becton Dickinson) внесення в сумісних планшетах на 24 комірки. Це дослідження є надійним іспитом для оцінювання метастазу раку. Клітини фібробласту людини засівали і вирощували у планшетах на 24 комірки, використовуючи культуральне середовище, що містить -10% сироватки. Коли фібробласти досягали коалесценції, культуральне середовище із сироваткою вилучали і замінювали свіжим середовищем без сироватки. Комбінацію сполук катехіну плюс харчову композицію додавали до середовища без сироватки і ракові клітини людини засівали на верхню поверхню Матригель внесень. Через 18 годин, середовище вилучали. Деяку кількість середовища зберігали для зимографічних досліджень. Клітини на верхній поверхні внесень обережно зішкрібали ватяним тампоном. Клітини, що проникнули через Матригель мембрану і мігрували в більш низьку поверхню Матригелю, забарвлювали Quick барвником і підраховували під мікроскопом. (г) Зимографічні Дослідження Середовище (25-30мкл) від досліджень інвазії Матригелю застосовувалося до Novex зимографічних гелів (Invitrogen). Гелеві планшети обробляли і забарвлювали, як рекомендовано виготовлювачем. Смуги матриксних металопротеїназ (MMPs) ідентифікували на основі їх відомих молекулярних мас. (д) Мор фологічні Дослідження Морфологію ракових клітин людини, що мігрували в більш низьку поверхню Матригель мембрани, забарвлювали Quick барвником і фотографували під мікроскопом (100х). Приклад 1 Інгібувальні Впливи Галату Епігалокатехіну (EGCG) на Клітинну Проліферацію Ракових Клітин Молочної Залози Людини (MDA MB 231) В цих дослідженнях, 5´104 ракових клітин молочної залози (MDA MB 231) засівали в кожну з комірок планшету на 24 комірки. Як контрольну гр упу, приймали ракові клітини молочної залози, що вирощували в середовищі Лєбовіца, доповненого 10% фетальною сироваткою великої рогатої худоби (FBS). Як групу, що піддавали лікуванню, приймали ракові клітини молочної залози, що вирощували в середовищі Лєбовіца, доповненого 10% фетальною сироваткою великої рогатої худоби (FBS) плюс або 0, 10, 20, 50, 100 або 200мг/мл EGCG. Планшети інкубували в умовах навколишнього повітря (без додаткового СО2) протягом 4 днів. Наприкінці періоду, культуральне середовище вилучали і клітини в кожній комірці забарвлювали МТТ. Надлишок МТТ барвника вимивали. Ракові клітини забарвлені МТТ, розчиняли в 1мл розчину DMSO. Оптичну густину (ОГ) розчину визначали для кожної комірки. ОГ для комірки була прямо пропорційна кількості мертвих клітин. ОГ ракових клітин забарвлених МТТ, що були попередньо культуровані при відсутності EGCGT, використовувалася як відносна і розглядалася як 100. Відсоток інгібування розраховували, використовуючи формулу: % Інгібування=(ОГ Відносна - ОГ Тестованого Лікування)/ Відносна ОГ´100%. EGCG при 20, 50, 100 і 200мкг/мл викликав 3, 34, 66 і 70% інгібування клітинної проліферації ракових клітин людини відповідно (Фіг.1). EGCG при 10мкг/мл не інгібував клітинну проліферацію. Приклад 2 Інгібувальний Вплив Комбінації Аскорбінової кислоти. Проліну і Лізину з Різними Концентраціями EGCG на Клітинну Проліферацію Ракових Клітин Молочної Залози Людини (МDА МВ 231) Загальна процедура цих досліджень залишається такою як у Прикладі 1. В цих дослідженнях, основне культуральне середовище доповнювали наступними добавками: і) аскорбіновою кислотою (100мкМ) + пролін (140мкМ); іі) аскорбіновою кислотою (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ); ііі) аскорбіновою кислотою (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ) плюс 20мг/мл EGCG; iv) аскорбіновою кислотою (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ) плюс 50мг/мл EGCG; або ν) аскорбіновою кислотою (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ) плюс 100мг/мл EGCG. Аскорбінова кислота + пролін не викликали ніякого інгібування клітинної проліферації. Аскорбінова кислота + пролін + лізин інгібували клітинну проліферацію приблизно до 14% (Фіг.2). Комбінація аскорбінової кислоти + пролін + лізин плюс 20мкг/мл EGCG викликала 20% інгібування (Фіг.2). 20мкг/мл одного EGCG викликали тільки 3% інгібування (Приклад 1). Таким чином, комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину діє синергічно з EGCG для інгібування клітинної проліферації. Приклад 3 Інгібувапьні Впливи Комбінації Аскорбінової кислоти. Проліну і Лізину з Різними Рівнями EGCG на Клітинну Проліферацію Ракових Клітин Товстого Ки шечнику Людини (НСТ116) В цьому дослідженні, ракові клітини товстого кишечнику людини вирощували в середовищі МакКоя 5А з 10% фетальною сироваткою великої рогатої худоби в а тмосфері 5% СO2. Загальна процедура і дослідження лікування були такими, як використовувалися в Прикладі 2. Комбінація аскорбінової кислоти, проліну і лізину з EGCG синергічно підвищила інгібувальні впливи на клітинну проліферацію від 0% до 31% при 20мкг/мл EGCG і приблизно до 95% при 50мкг/мл EGCG (Фіг.3). Інгібувальні ефекти egcg і комбінації аскорбінової кислоти. проліну і лізину на інвазію матригелю раковими клітинами Приклад 4 Інгібувальні Впливи Змінних Рівнів EGCG і Комбінації Аскорбінової кислоти. Проліну і Лізину з Різними Рівнями EGCG на Інвазію через Матригель Ракових Клітин Молочної Залози (MDA MB 231) Загальна процедура для дослідження інвазії Матригелю була описана вище. В цьому дослідженні, ракові клітини молочної залози (5´104) засівали на кожне внесення. До середовища Лєбовіца додавали різні добавки. Планшети інкубували в термостаті в умовах навколишнього повітря без додаткового СО2. Композиція, що включає 20 або 50мкг/мл EGCG в середовищі інгібувала інвазію раковими клітинами молочної залози приблизно до 26% і 100% відповідно. В той час як аскорбінова кислота (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ) в середовищі викликали 65% інгібування, комбінація аскорбінової кислоти (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ) плюс 20мкг/мл EGCG повністю інгібувала (інгібування 100%) інвазію ракових клітин (Фіг.4). Приклад 5 Інгібувальні Впливи Змінних Рівнів EGCG і Комбінації Аскорбінової кислоти. Проліну і Лізину з Різними Рівнями EGCG на Інвазію Через Матригель Клітин Меланоми Людини (А2058) Загальна процедура для дослідження інвазії Матригелю була описана вище. Клітини меланоми людини (А2058) (5´104) засівали на кожне внесення. Різні добавки додавали до DMEM. Планшети інкубували в термостаті в умовах атмосфери з 5% СО2. В той час як комбінація аскорбінової кислоти (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ) викликала тільки 13% інгібування, комбінація аскорбінової кислоти (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ) плюс 20мкг/мл EGCG повністю попереджала інвазію клітин меланоми через Матригель (Фіг.5). Зимографічні дослідження Приклад 6 Впливи Змінних Рівнів EGCG на ММР2 Продукцію Раковими Клітинами Молочної Залози Людини (MDA MB 231) Середовище від різноманітних обробок в дослідженні інвазії Матригелю (Приклад 4) застосовували до Novex Зимографічного гелю (invitrogen). Планшети обробляли і забарвлювали, як рекомендовано виготовлювачем. Смуги матриксних металспротеїназ (MMPs) ідентифікували на основі їх відомих молекулярних мас (Фіг.6). Зимограма культурального середовища від досліджень інвазії Матригелю показала, що 20мкг/мл EGCG в середовищі зменшує продукування ММР2 і повністю інгібує продук ування ММР9 (Фіг.6). При концентраціях 50мкг/мл і 100мкг/мл EGCG, дії і ММР2 і ММР9 були повністю інгібовані (Фіг.6). Клітинна Морфологія Приклад 7 Впливи EGCG і Комбінації Аскорбінової кислоти. Проліну і Лізину на Клітинну Мор фологію Клітин Меланоми Людини (А2058) Мікрофотографії ракових клітин в основному середовищі, як вони мігрували через Матригель показані Фіг.7. Включення комбінації аскорбінової кислоти (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ) у середовищі змінило морфологію клітин (Фіг.8). Розширення клітин з характерним збільшенням ядра було очевидним. Додавання 20мкг/мл EGCG до комбінації аскорбінової кислоти (100мкМ) + пролін (140мкМ) + лізин (400мкМ) у середовищі викликало екстенсивні апоптичні зміни (Фіг.9). Ці результати, описані в прикладах 1-7 вказують, що сильний синергічний вплив викликався EGCG, коли EGCG використовувався з комбінацією аскорбінової кислоти + пролін + лізин. Тому, ці дослідження показують несподіваний синергічний вплив комбінації EGCG і аскорбінової кислоти + пролін + лізин, що дає змогу отримати повну користь від протипроліферативної та протиметастатичноїдії EGCG, при порівняно низькому рівні його концентрації в тканині. Отже, представлені результати мають надзвичайну важливість, оскільки вони можуть давати ефективний рівень катехінів близьких тим, що можуть бути досягнуті в тканинах. Було запропоноване, що проліферація ракових клітин і підвищувальна регуляція їх ферментів викликані збільшеною концентрацією видів агресивного кисню (ROS). В цій ситуації, використання комбінацій різних біологічних антиоксидантів, таких як токофероли, каротиноїди, поряд з іншими сприяючими агентами подібно убі хінолам, біфлавоноїдам, ліпоєвій кислоті, карнітіну забезпечує більш сильну синергічну суміш для лікування вищезгаданих захворювань. Представлений винахід забезпечує несподіване спостереження, що комбінація, яка включає сполуки катехіну викликала б синергічну дію і таким чином уможливлювала б досягнення дуже ефективної протиракової дії при нижчих рівнях катехінів в тканині. Вищезгадані результати відкривають можливість використання різноманітних компонентів у комбінації різних компонентів при ефективних рівнях для попередження й лікування неопластичних захворювань. Будь-якому фа хівцю даної галузі очевидно, що пролін і лізин не обмежуються просто проліном і лізином. Рамки представленого винаходу призначені охопити похідні лізину і його прекурсорів, похідні проліну і його прекурсорів. Будь-якому фа хівцю даної галузі очевидно, що антиоксидант, аскорбінова кислота, повинні охоплювати похідні і прекурсори аскорбінової кислоти. Інші біологічні антиоксиданти включають токофероли і споріднені сполуки, ретиноєву кислоту і споріднені сполуки, каротиноїди і споріднені сполуки, глютатіон і споріднені сполуки, убіхіноли і споріднені сполуки, фолати і споріднені сполуки, біофлавоноїди і споріднені сполуки також як сполуки селену. Клінічні Застосування Винахід зосереджений на превентивному і терапевтичному використанні катехіну в комбінації з антиоксидантом, проліном і лізином. Спільне використання катехіну з антиоксидантом, проліном і лізином збільшує е фективність сполуки катехіну при лікуванні захворювань людини. Захворювання людини включають, але не обмежуються, неопластичні захворювання, запальні стани, інфекційні захворювання, серцево-судинні захворювання й інші патологічні стани, включаючи деградацію екстрацелюлярного матриксу. Такі стани включають патологічний ангіогенез, патологічну інтравазацію, ревматоїдний і остеоартрит, атеросклероз, дилатаційну кардіоміопатію, емфізему й інші хронічні стани. Представлений винахід забезпечує спосіб лікування і попередження захворювань людини, включаючи деградацію екстрацелюлярного матриксу, таку як: і) неопластичні захворювання; іі) запальні стани (включаючи, але не обмежуючись, алергії, емфізему, ревматоїдний артрит, остеоартрит, періодонтит, нейродерматит); ііі) інфекційні захворювання (включаючи, але не обмежуючись, вірусні інфекційні захворювання, такі як нежить, грип, гепатит, герпес, ВІЛ; бактеріальні інфекційні захворювання, такі як пневмонія, туберкульоз, менінгіт, гонорея, сифіліс і або грибкові захворювання; iv) серцево-судинні захворювання (включаючи, але не обмежуючись, атеросклероз, кардіоміопатію, пост-ангіопластичний рестеноз); ν) дегенеративні захворювання (включаючи, але не обмежуючись, остеопороз і артрит); νί) неврологічні розлади (включаючи, але не обмежуючись, хворобу Альгеймера, розсіяний склероз); і νίί) аутоіммунні захворювання (включаючи, але не обмежуючись артрит) шляхом призначення ефективних кількостей композицій, описаних в даній заявці.