Поживне середовище для визначення солестійкості винограду

Реферат: Поживне середовище для визначення солестійкості винограду містить компоненти за складом Мурасіге-Скуга і включає сіль гідрокарбонат натрію. Додатково містить солі: хлорид натрію, карбонат кальцію, сульфат натрію. UA 80297 U (12) UA 80297 U UA 80297 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до галузі сільського господарства - виноградарство, а саме до селекції та сортовивчення винограду з використанням біотехнологічних прийомів. Для дослідження солестійкості винограду в умовах in vitro використовують поживні середовища, модифіковані внесенням солей хлориду натрію NaCl [Alexander, Groot, 1971], гідрокарбонату калію KНСО3 [Netzer et al.,1991], на які висаджують експланти винограду та проводять наступну оцінку солестійкості рослин за частотою ризогенезу і проліферації та іншими біометричними і фізіолого-біохімічними показниками. З метою клітинної селекції винограду на стійкість до "активного вапна" калусну культуру винограду вирощують на модифікованому поживному середовищі з хлоридом кальцію СаСl2 та карбонатом кальцію СаСО3 [Зленко и др., 2005]. Найближчим аналогом є поживне середовище Мурасіге-Скуга для культивування мікроклонів винограду, до якого вносять гідрокарбонат натрію NaHСО3 у концентраціях 0,3-0,6 г/л; на модифіковане середовище висаджують експланти винограду та через 60 днів визначають наступні параметри у рослин: приживання, вологу та суху масу рослини, вміст заліза у листках, прояви хлорозу за шкалою [Bavaresco et al., 1993]. Спільними ознаками відомого рішення та заявленої корисної моделі є: використання солі NaHСО3 для модифікації поживного середовища та використання біометричних показників рослин для діагностики їх солестійкості. Недоліком корисної моделі є використання лише однієї солі - NaHСО3 - для модифікації середовища з метою створення лужного показника рН, у той час як важливим є вивчення реакції рослин на комплексне засолення, створене різними катіонами та аніонами, зокрема, катіонами кальцію, що, власне, і призводить до захворювання винограду хлорозом. В основі корисної моделі поставлена задача відтворити комплексне природне засолення, щоб у подальшому достовірно оцінити реакцію рослин на стресовий вплив. Технічний результат заявленої корисної моделі виражається у точній та швидкій діагностиці стійкості винограду до різних типів засолення, що є особливо актуальним у селекції підщепних сортів винограду. Поставлена задача вирішується тим, що поживне середовище для визначення солестійкості винограду, яке містить компоненти за складом Мурасіге-Скуга і включає сіль гідрокарбонат натрію, згідно з корисною моделлю, додатково містить солі: хлорид натрію, карбонат кальцію, сульфат натрію, при наступному співвідношенні компонентів, %: NaCl 0,75-2,00 СаСО3 5,0-7,5 Na2SO4 1,0-1,5 NaHCO3 0,1-0,15. Приклад використання корисної моделі. Модифіковані поживні середовища готували на основі стандартного поживного середовища Мурасіге-Скуга за загальноприйнятою методикою [Голодрига П.Я. и др. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда. - Ялта: ВНИИВ, 1986.-56 с.]. Для моделювання засолення ґрунту "активним кальцієм" стандартне поживне середовище МС доповнювали карбонатом кальцію СаСО3, який у складі поживного середовища після його парової стерилізації у автоклаві, є джерелом достатньої кількості іонів кальцію. Кількість карбонату кальцію у поживному розчині для культивування мікроклонів винограду - 250-300 г/л, що відповідає 6,3-7,5 % "активного кальцію" за шкалою Друїно-Гале. Вміст "активного кальцію" в поживному розчині МС (без додавання агару) визначали експериментально за адаптованою методикою Друїно-Гале. Для створення умов содового засолення у поживне середовище вносили 1,0-1,5 г/л соди NаНСО3, сульфатне засолення створювали, доповнюючи поживне середовище 10,0-15,0 г/л Na2SO4, а хлоридне - 7,5-20,0 г/л NaCl. Діапазон концентрацій солей досить широкий, однак він значно звужується в залежності від характеристик досліджуваних сортів винограду. Стресові та контрольне середовище розливали у пробірки по 15 мл у кожну та стерилізували загальноприйнятими методами. Слід також зазначити, що стандартне поживне середовище Мурасіге-Скуга (МС) містить певну кількість катіонів кальцію та натрію, аніонів сульфатів та хлоридів, тому попередньо слід розрахувати молярні концентрації еквівалентів солей і вносити відповідно меншу їх кількість. Після проведення подібних розрахунків визначили кількість солі, яку слід вносити в поживне середовище, аби отримати потрібну її концентрацію (Табл. 1). 1 UA 80297 U Таблиця 1 Концентрації солей у модифікованому поживному середовищі Тип солі СаCО3 NaHCO3 Na2SO4 NaCl 5 10 15 Кількість солі, яку вносять до поживного середовища МС 200 г/л 250 г/л 300 г/л 1,0 г/л 1,5 г/л 9,770 г/л 14,770 г/л 7,130 г/л 9,630 г/л 19,630 г/л Фактична концентрація солі у поживному середовищі МС 5,0 % "активного кальцію" 6,3 % "активного кальцію" 7,5 % "активного кальцію" 0,10 % 0,15 % 1,0 % 1,5 % 0,75 % 1,00 % 2,00 % Модифіковане поживне середовище застосовували для дослідження солестійкості інтродукованого підщепного сорту винограду Б.Р.Кречунел 2 (витримує до 20 % активного кальцію у ґрунті), нового підщепного сорту селекції ННЦ "ІВіВ ім. B.Є. Таїрова" Добриня (є досить стійким до 17-19 % активного кальцію) та підщепної форми Таїровський 1 (польових досліджень солестійкості не проводилось). Для досліджень відбирали мікроклони винограду з добре розвиненим приростом (5-6 вузлів) і кореневою системою та пересаджували на модифіковані поживні середовища в умовах стерильного ламінар-боксу. Контролем було стандартне поживне середовище Мурасіге-Скуга. У контрольних та дослідних рослин вимірювали висоту стебла та кількість листків на 7-10-й день досліджень. У мікроклонів з'являлись некротичні ділянки на листкових пластинках, а згодом усихали листки нижнього ярусу та верхівка стебла. Згідно з даними у таблиці 2 найбільше змінювалась за рахунок всихання висота стебла мікроклонів підщепної форми Таїровський 1, а рослини сортів Кречунел 2 та Добриня були пошкоджені менше. Таблиця 2 Висота стебла мікроклонів підщеп винограду на модифікованому поживному середовищі Варіант Контроль 0,10 % NaHCO3 0,15 % NaHCO3 5,0 % СаCO3 6,3 % СаCO3 7,5 % СаCO3 1,0 % Na2SO4 1,5 % Na2SO4 0,75 % NaCl 1,0 % NaCl 2,0 % NaCl Б.Р.Кречунел 2 Початкова Висота висота стебла через стебла, см 7 днів, см 6,85±0,42 8,00±0,42 5,65±0,15* 5,37±0,31* 6,25±0,28 5,29±0,29* 7,10±0,36 7,85±0,10 6,60±0,37 7,18±0,16 6,90±0,42 7,42±0,14 6,34±0,35 6,68±0,54* 5,75±0,38* 5,32±0,32* 6,45±0,31 7,68±0,41 6,62±0,26 6,80±0,25* 5,81±0,32 5,57±0,20* Добриня Початкова Висота висота стебла через стебла, см 7 днів, см 6,55±0,35 8,05±0,49 5,95±0,12 5,75±0,12* 5,93±0,18 4,76±0,53* 5,88±0,28 6,50±0,34* 6,65±0,19 7,30±0,28 6,18±0,14 6,68±0,42* 7,15±0,28 8,17±0,35 7,21±0,49 7,70±0,35 6,50±0,28 7,46±0,41 6,00±0,04 6,60±0,18* 6,65±0,49 6,50±0,42* Початкова Висота висота стебла через стебла, см 7 днів, см 6,48±0,22 7,82±0,06 6,65±0,21 5,93±0,14* 6,96±0,18 5,51±0,59* 6,08±0,31 6,69±0,35* 6,63±0,14 6,29±0,14* 6,60±0,12 6,18±0,20* 6,84±0,53 7,20±0,35 6,65±0,24 6,40±0,40* 6,21±0,53 7,52±0,31 6,10±0,35 6,54±0,30* 6,91±0,36 6,50±0,12* * - різниця з контролем достовірна. 20 Так, під впливом содового засолення 0,10 % NaHCO3 через 7 днів після пересаджування у підщеп Кречунел 2 та Добриня визначили зменшення висоти стебла відповідно на 5,0 % та 3,4 % порівняно з початковими значеннями, а у форми Таїровський 1 цей показник становив 10,8 %. У варіанті з вмістом соди 0,15 % спостерігали усихання пагонів на 15,4-20,8 %. 2 UA 80297 U 5 10 15 20 25 30 Збільшення кількості соди у поживному середовищі до 0,20 % призводило до загибелі більш ніж 60 % мікроклонів. Натомість на середовищі з "активним кальцієм" мікроклони розвивались краще. Наприклад, у варіанті з вмістом 5,0 % "активного кальцію" для рослин усіх сортів був характерний приріст стебла 10,0-10,6 %. У варіантах з 6,3-7,5 %-м вмістом солі у підщеп Кречунел 2 та Добриня відзначали зменшення показників приросту стебла майже удвічі порівняно з контролем. На відміну від підщеп Кречунел 2 та Добриня у рослин Таїровського 1 під час культивування на середовищі з 6,3-7,5 % "активного кальцію" спостерігали усихання стебла та листків на 5,16,4 % від початкової висоти стебла, різниця з контролем достовірна. На середовищі з 1,0 % Na2SO4 у підщеп Кречунел 2 та Таїровський 1 спостерігали значне сповільнення росту стебла та кількості листків мікроклонів, а у варіантах з кількістю солі 1,5 % спостерігали усихання стебла та листків на 3,8-7,5 % порівняно з початковими величинами. Однак у сорту Добриня сульфатне засолення не призводило до зменшення висоти стебла мікроклонів, навпаки у варіантах з вмістом солі Na2SO4 1,0-1,5 % приріст стебла рослин за тижневий термін складав відповідно від 14,3 % до 6,8 %. Кількість листків збільшувалась, однак на 20-й день спостерігали появу некротичних плям на пластинках листків нижнього ярусу, а згодом і їх усихання. Ріст мікроклонів на середовищі з 1,0 % NaCl значно сповільнювався, а підвищення концентрації солі до 2,0 % призводило до усихання верхівки приросту та листків. Найбільшим цей показник був у підщепної форми Таїровський 1-5,9 %, трохи меншим у сорту Кречунел 24,1 %, а у підщепи Добриня дорівнював 2,3 %. Таким чином, під впливом штучного засолення у рослин усіх досліджуваних підщеп винограду відзначили однотипні зміни росту та розвитку. На основі зміни росту стебла або ж його всихання під впливом стресу оцінили солестійкість підщеп винограду (Табл. 3). Зокрема визначили, що сорти Добриня та Кречунел 2 стійкі до засолення активним кальцієм, а підщепна форма Таїровський 1 має середню стійкість. Загалом, порівнюючи між собою реакцію підщеп на різні типи засолення - содове, сульфатне, хлоридне та засолення "активним кальцієм" - зробили висновок про високу стійкість підщеп Кречунел 2 і Добриня та про середню стійкість до засолення форми Таїровський 1. Результати досліджень стійкості підщеп Кречунел 2 та Добриня, отримані in vitro та у польових умовах, узгоджуються між собою. Таким чином, використання модифікованого поживного середовища дозволяє ефективно та швидко визначити солестійкість винограду за умови наявності у мікроклональному розмноженні досліджуваних сортів. Корисну модель можна успішно застосовувати для порівняльної оцінки стійкості сортів та селекційних форм винограду. 35 Таблиця 3 Оцінка стійкості підщеп винограду за ростовою реакцією в умовах in vitro Варіант засолення 0,15 % Na2CO3 0,10 % NaHCO3 7,50 % СаСО3 l, 50 % Na2SO4 2,00 % NaCl Висновок Б.Р. Кречунел 2 Стійкий Середньостійкий Стійкий Середньостійкий Стійкий Стійкий Добриня Стійкий Стійкий Стійкий Стійкий Стійкий Стійкий Таїровський 1 Середньостійкий Середньостійкий Середньостійкий Стійкий Середньостійкий Середньостійкий ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Поживне середовище для визначення солестійкості винограду, яке містить компоненти за складом Мурасіге-Скуга і включає сіль гідрокарбонат натрію, яке відрізняється тим, що додатково містить солі: хлорид натрію, карбонат кальцію, сульфат натрію, при наступному співвідношенні компонентів, %: NaCl 0,75-2,00; СаСО3 5,0-7,5; Na2SO4 1,0-1,5; NaHCO3 0,1-0,15. 3 UA 80297 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4