Спосіб визначення речовин дитерпенових глікозидів у листках стевії (stevia rebaudiana bertoni)

Реферат: Спосіб визначення речовин дитерпенових глікозидів у листках стевії (Stevia rebandiana Bertoni) полягає в отриманні екстракту шляхом екстрагування 1 г подрібненого до розміру часток листка стевії 0,7-1,2 мм 20 мл 95 % спиртом етиловим у киплячій водяній бані з оберненим холодильником протягом 15 хв., його охолодженні, нанесенні по 0,01 мл екстракту та 1 % розчину стандартного зразка глікозиду в метанолі на стартову лінію пластинки для тонкошарової хроматографії мікропіпеткою або шприцом, сушінні на повітрі пластинки протягом 10 хв., хроматографуванні висхідним способом у камері з системою розчинників хлороформметанол-вода як 60-30-6, сушінні пластинки на повітрі протягом 30 хв., обприскуванні пластинки 50 % розчином сірчаної кислоти, сушінні у сушильній шафі при температурі 100 °С протягом 15 хв., індентифікуванні плям та розрахунку глікозидів. Екстрагування подрібненого листка стевії здійснюють очищеною водою при температурі 75-80 °С протягом 50-65 хвилин. UA 92898 U (12) UA 92898 U UA 92898 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до харчової та фармацевтичної промисловостей, а саме до виробництва натурального замінника цукру з листків стевії та інших продуктів їх перероблення. Відомий спосіб визначення речовин дитерпенових глікозидів у листках стевії {Stevia rebaudiana Bertoni), який полягає в отриманні екстракту шляхом екстрагування 1 г подрібненого до розміру часток листка стевії 0,7-1,2 мм 20 мл 95 % спиртом етиловим у киплячій водяній бані з оберненим холодильником протягом 15 хв., його охолодженні, нанесенні по 0,01 мл екстракту та 1 % розчину стандартного зразка глікозиду в метанолі на стартову лінію пластинки для тонкошарової хроматографії мікропіпеткою або шприцом, сушінні на повітрі пластинки протягом 10 хв., хроматографуванні висхідним способом у камері з системою розчинників хлороформметанол-вода як 60-30-6, сушінні пластинки на повітрі протягом 30 хв., обприскуванні пластинки 50 % розчином сірчаної кислоти, сушінні у сушильній шафі при температурі 100 °С протягом 15 хв., індентифікуванні плям та розрахунку глікозидів [Контроль содержания стевиозида в растительном сырье методами ВЭЖХ и ТСХ / С.А.Кедрик, С.В.Федоров, Η.А.Януль, Л.В.Прохорова, Е.В.Смирнова, А.В.Панов // Химико-фармацевтический журнал. Т.37, №10, 2003. с. 19-22]. Недоліком даного способу є складність та застосування значної кількості шкідливих дорогих реактивів таких як метанол, 50 % розчин сірчаної кислоти, тощо. В основу корисної моделі поставлено задачу створення ефективного способу визначення речовин дитерпенових глікозидів у листках стевії. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення речовин дитерпенових глікозидів у листках стевії (Stevia rebaudiana Bertoni), який полягає в отриманні екстракту шляхом екстрагування 1 г подрібненого до розміру часток листка стевії 0,7-1,2 мм 20 мл 95 % спиртом етиловим у киплячій водяній бані з оберненим холодильником протягом 15 хв., його охолодженні, нанесенні по 0,01 мл екстракту та 1 % розчину стандартного зразка глікозиду в метанолі на стартову лінію пластинки для тонкошарової хроматографії мікропіпеткою або шприцом, сушінні на повітрі пластинки протягом 10 хв., хроматографуванні висхідним способом у камері з системою розчинників хлороформ-метанол-вода як 60-30-6, сушінні пластинки на повітрі протягом 30 хв., обприскуванні пластинки 50 % розчином сірчаної кислоти, сушінні у сушильній шафі при температурі 100 °С протягом 15 хв., індентифікуванні плям та розрахунку глікозидів. Згідно з корисною моделлю екстрагування подрібненого листка стевії здійснюють очищеною водою при температурі 75-80 °С протягом 50-65 хвилин; здійснюють підготовку до аналізу отриманого екстракту з листків стевії шляхом його пропускання через колонку, заповнену оксидом алюмінію, промивання колонки дистильованою водою, об'єднанні розчинів з наступним пропусканням через другу колонку, наповнену сорбентом для осадження речовин дитерпенових глікозидів, вимиванні речовин дитерпенових глікозидів з сорбенту другої колонки 280-310 мл 94-96%-го спирту етилового і 50-100 мл дистильованої води, уварюванні зразка на ротаційному випарнику та його змиванні 8-15 мл 94-96% спиртом етиловим; на пластинку з алюмінієвою основою для тонкошарової хроматографії наносять стандартний розчин глікозиду в етанолі та ставлять у камеру заповнену сумішшю бутанол-етилацетат-ізопропіловий спиртвода у співвідношенні як 18-25-55-65-7-10-15-20; обсушена пластинка обприскується 10-15 %-м розчином сірчаної кислоти з наступним її сушінням при температурі 80-85 °С протягом 3-5 хвилин. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованим методом та очікуваними результатами полягає у наступному. Род Stevia нараховує 154 види, проте лише два з них мають вміст речовин дитерпенових глікозидів і найбільше їх саме в наземній частині Stevia rebaudiana Bertoni. їх кількість змінюється залежно від сорту та умов вирощування від 10 до 20 % в перерахунку на сухі речовини. Речовини дитерпенових глікозидів стевії є похідними кауренової кислоти, гідроксильована похідна якої відома як стевіол. Стевіол є попередником в біосинтезі дитерпенових глікозидів. За структурою дитерпенові глікозиди представлені молекулами моно-, ди- і трицукрів, етерифіцированими з стевіолом у положеннях С13 і С19. З 11 речовин дитерпенових глікозидів найбільш вивченими є стевіозид та ребаудіозид А. Вміст стевіозиду у листках сушених становить 8-15 %. Листки завдяки вмісту речовин дитерпенових глукозидів мають ступінь солодкуватості в 1015 разів вище за цукор, екстракт з листків - у 30-40 разів, стевіозид - у 200-300 разів. На відміну від цукру речовини дитерпенових глікозидів мають низьку калорийність та не підвищують рівень глюкози в крові. Визначення кількісного та якісного вмісту речовин дитерпенових глікозидів має важливе значення. Відомі методи визначення речовин дитерпенових глукозидів: капілярний електрофорез, газорідинна хроматорафія, тонкошарова хроматографія, газова хроматографія, 1 UA 92898 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ІК-спектрометрія та вискоефективна рідинна хроматографія. Найбльш поширеними у практиці є високоефективна рідинна хроматографія та тонкошарова хроматографія. Значне значення в контролі вмісту та кількісного складу речовин дитерпенових глікозидів у продукту набуває застосування простого та універсального методу їх визначення. Відомо, що за температури 100 °С розкладається 5 % стевіозиду, із збільшенням температури нагрівання збільшується й ступінь розкладання стевіозиду. Нами вивчено структурні перетворення, що відбуваються в листку стевії під час збільшення температури. За нашими дослідженнями процесу сушіння листків стевії методом диференціальної скануючої калориметрії встановлено, що плавлення речовин у листку стевії після повного вилучення вологи починається при температурі 96 °С. це свідчить про унеможливлення застосування температури, вищої за 96 °С для якісного визначення речовин дитерпенових глікозидів. Як екстрагент для отримання екстракту з листка стевії зазвичай використовують: очищену воду, метанол, етанол, діетиловий ефір та ацетонітрил. Застосування таких розчинників як метанол, етанол, діетиловий ефір та ацетонітрил не тільки здорожчує процес але й призводить до ускладнення, які пов'язані з переходом в екстракт жирових речовин та пігментів. Вміст таких речовин унеможлювлює повне очищення зразка для визначення речовин дитерпенових глікозидів. Застосування як екстрагенту очищеної води дозволяє максимально знизити вміст супутніх домішок. Для отримання чистого зразка дитерпенових глікозидів здійснювали його підготовку до аналізу за рахунок видалення супутніх речовин. Очищення речовин дитерпенових глікозидів здійснювали з використанням сорбентів, таких як оксид алюмінію та властивого для дитерпенових глікозидів сорбенту. Оксид алюмінію полярний адсорбент з гетерогенною поверхнею, який містить активні ОН-групи та виявляє помітно виражені протоноакцепторні властивості. Його використовують для розділення ароматичних вуглеводородів, алкалоїдів, хлорвуглеводородів, стероїдів тощо. Як другий сорбент використовують будь-який сорбент із вмістом функціональних груп, що адсорбують дитерпенові глікозиди. Для відокремлення дитерпенових глікозидів з поверхні сорбентів використали дистильовану воду, а з другого сорбенту 96 % спирт етиловий з дистильованою водою для повного їх вилучення з поверхні сорбенту. При визначенні дитерпенових глікозидів було використано 4 види систем:бутанол:етилацетат:ізопропіловий спирт:вода у співвідношенні як 30:60:10:20; бутанол:етилацетат:ізопропіловий спирт: вода у співвідношенні як 30:40:5: 30; бутанол:етилацетат:ізопропіловий спирт:вода у співвідношенні як 20:60:10:20; бутанолетилацетат-ізопропіловий спирт-вода у співвідношенні як 10:60:6:18. Для проявлення дитерпенових глікозидів використовували 10, 15, 20 і 30 % розчини сірчаної кислоти. Найкращі результати, за якими вирізняються чіткі плями властиві для певного дитерпенового глікозиду, отриманого при використанні системи бутанол:етилацетат:ізопропіловий спирт:вода у співвідношенні як 20:60:10:20 та при оприскуванні 10 і 15 % розчином сірчаної кислоти. У перших двох випадках щодо використання системи розчинів плями глікозидів не виявлено на пластинці. Температура сушіння при цьому становить 75-80 °С, за якої достатньо 3-5 хв. для повного проявлення плям на пластинці із нанесеними стандартним та досліджуваними зразками. Підвищення температури сприяє згоранню зразків, що знижує точність експерименту. Спосіб визначення речовин дитерпенових глікозидів. Листки стевії подрібнюють до розміру фракції 0,7-1,2 мм. У колбу на 250 мл вносять 1 г подрібненого листка стевії та додають 100 мл дистильованої води, закривають щільно кришкою, ставлять на водяну баню та нагрівають при температурі 80 °С протягом одного часу. Отриманий зразок охолоджують та пропускають через колонку місткістю 100 мл на половину заповнену оксидом алюмінію. Після повного проходження зразком сорбенту здійснюють промивання окису алюмінію 20 мл дистильованої води. Зразок направляють на другий ступінь очищення шляхом пропускання через колонку, наповнену сорбентом для осадження речовин дитерпенових глікозидів. По завершенні проходження зразка здійснюють вимивання речовин дитерпенових глікозидів шляхом пропускання через колонку 300 мл 96 %-го спирту етилового та 50-100 мл дистильованої води. Отриманий очищений зразок уварюють на ротаційному випарнику. Змивають зразок з колби ротаційного випарника 10 мл 96 %-го спирту етилового. На пластинку з алюмінієвою основою «Fertigplatten Kieselgel 60» (виробництво фірми «Merck», Німеччина) наносять капіляром або шприцом 1 % стандартний розчин глікозиду в 96 %-му спирті етиловому та досліджуваний очищений зразок. У камеру вносять суміш бутанолетилацетат-ізопропіловий спирт-вода у співвідношенні як 18-25-55-65-7-10-15-20, щільно закривають кришкою камеру та залишають зразок для прогонки на 1,5-2 години. Після чого пластинка обсушується та обприскується за допомогою пульвізатора 10-15 %-м розчином 2 UA 92898 U 5 10 15 20 25 30 сірчаної кислоти. Проявлення зразку здійснюють у сушильній шафі обладнаною повітродувкою при температурі 80-85 °С протягом 3-5 хвилин. Приклад 1. У колбу на 250 мл вносять 1 г подрібненого до 1 мм листка стевії та 100 мл. дистильованої води. Колбу закривають щільно кришкою з фольги та ставлять у водяну баню. Екстрагування проводять при температурі 1 80 °С протягом 60 хвилин. Отриманий зразок охолоджують. Очищений зразок пропускають через колонку місткістю 100 мл на половину заповнену оксидом алюмінію. Після повного проходження зразком сорбенту здійснюють промивання оксиду алюмінію 20 мл дистильованої води. Об’єднують зразок та дистильовану воду, що використали для вимивання дитерпенових глікозидів та направляють на другий ступінь очищення шляхом його пропускання через колонку, наповнену сорбентом для осадження речовин дитерпенових глікозидів. По завершенні проходження зразка здійснюють вимивання речовин дитерпенових глікозидів шляхом пропускання через колонку 300 мл 96%-го спирту етилового та 100 мл дистильованої води. Отриманий очищений зразок уварюють на ротаційному випарювачі. Змивають зразок 10 мл 96%-го спирту етилового. На пластинку з алюмінієвою основою «Fertigplatten Kieselgel 60» (виробництво фірми «Merck», Німеччина) наносять капіляром або шприцом 1% стандартний розчин глікозиду в 96%му спирті етиловому та досліджуваний очищений зразок. У камеру вносять суміш бутанол етилацетат - ізопропіловий спирт - вода у співвідношенні як 21 - 60 - 9 - 18, щільно закривають кришкою камеру та залишають зразок для прогонки на 1,5-2 години. Після чого пластинка обсушується та обприскується за допомогою пульвизатора 13и%-м розчином сірчаної кислоти. Проявлення зразку здійснюють у сушильній шафі обладнаною повітродувкою при температурі 85 °С протягом 3-5 хвилин. За отриманими результатами розраховують вміст окремих глікозидів у досліджуваному зразку за використаним стандартом. Висновок. Основною перевагою запропонованого методу тонкошарової хроматографії для визначення речовин дитерпенових глікозидів є виключення токсичного реактиву метанолу, зменшення у три рази використання дорогого реактиву хлороформ. Застосування ефективного екстрагування досліджуваного зразка листків стевії та його очищення дозволяє підвищити точність визначення вмісту дитерпенових глікозидів і окремих глікозидів таких як стевіозид, ребаудіозид А, ребаудіозид С, тощо. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 45 50 55 1. Спосіб визначення речовин дитерпенових глікозидів у листках стевії (Stevia rebandiana Bertoni), який полягає в отриманні екстракту шляхом екстрагування 1 г подрібненого до розміру часток листка стевії 0,7-1,2 мм 20 мл 95 % спиртом етиловим у киплячій водяній бані з оберненим холодильником протягом 15 хв., його охолодженні, нанесенні по 0,01 мл екстракту та 1 % розчину стандартного зразка глікозиду в метанолі на стартову лінію пластинки для тонкошарової хроматографії мікропіпеткою або шприцом, сушінні на повітрі пластинки протягом 10 хв., хроматографуванні висхідним способом у камері з системою розчинників хлороформметанол-вода як 60-30-6, сушінні пластинки на повітрі протягом 30 хв., обприскуванні пластинки 50 % розчином сірчаної кислоти, сушінні у сушильній шафі при температурі 100 °С протягом 15 хв., індентифікуванні плям та розрахунку глікозидів, який відрізняється тим, що екстрагування подрібненого листка стевії здійснюють очищеною водою при температурі 75-80 °С протягом 5065 хвилин. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що здійснюють підготовку до аналізу отриманого екстракту з листків стевії шляхом його пропускання через колонку, заповнену оксидом алюмінію, промивання колонки дистильованю водою, об'єднання розчинів з наступним пропусканням через другу колонку, наповнену сорбентом для осадження речовин дитерпенових глікозидів, вимивання речовин дитерпенових глікозидів з сорбенту другої колонки 280-310 мл 94-96 %-го спирту етилового і 50-100 мл дистильованої води, уварювання зразка на ротаційному випарнику та його змивання 8-15 мл 94-96 % спиртом етиловим. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на пластинку з алюмінієвою основою для тонкошарової хроматографії наносять стандартний розчин глікозиду в етанолі та ставлять у камеру, заповнену сумішшю бутанол-етилацетат-ізопропіловий спирт-вода у співвідношенні як 18...25 - 55...65 - 7...10 - 15...20. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що обсушена пластинка обприскується 10-15 %-м розчином сірчаної кислоти з наступним її сушінням при температурі 80-85 °С протягом 3-5 хвилин. 3 UA 92898 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4