Асоціація грибів trichoderma harzianum для одержання біоорганічного добрива

Реферат: Винахід належить до асоціації грибів-деструкторів целюлози Т. harzianum 128, що депонована у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України 6 жовтня 2015 року з присвоєнням реєстраційного номеру Т. harzianum ІMB К-14, яка UA 114247 C2 (12) UA 114247 C2 призначена для виробництва біоорганічного добрива шляхом компостування органічної речовини. UA 114247 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікробіологічних засобів покращення розкладання органічних решток і призначений для виробництва біоорганічного добрива шляхом компостування органічної речовини. Відомо про значну кількість грибів-деструкторів органічних решток, які здійснюють їх мінералізацію за рахунок комплексу целюлозолітичних ферментів [1, 2]. До активних грибівдеструкторів належать представники родів Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Geotrichum, Chaetomium та інші [3, 4, 5]. Останнім часом мікроорганізми-деструктори целюлози, у т.ч. й представники роду Trichoderma, використовуються в процесах компостування органічної речовини [6, 7, 8, 9]. Найбільш близьким аналогом винаходу є штам Trichoderma harzianum F-2455, депонований у колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України [10]. Однак зазначений штам характеризується відносно невисокою целюлозолітичною активністю і невисоким рівнем розвитку в компостованих субстратах на основі пташиного посліду, що суттєво обмежує його використання у процесах утилізації відходів галузі птахівництва. У зв'язку з цим завданням винаходу є отримання штамів мікроміцетів-біодеструкторів целюлози, спроможних при застосуванні їх у технологіях компостування пташиного посліду приживатися в субстраті, що дозволить пришвидшити процес отримання високоякісних біоорганічних добрив, збагачених агрономічно цінними мікроорганізмами. Поставлене завдання вирішується шляхом виділення з напівперепрілої пшеничної соломи нової активної асоціації грибів-деструкторів целюлози Trichoderma harzianum 128 (Rifai), яка приживається в компостованому субстраті і може бути використана в технологіях біокомпостування органічної речовини. Асоціацію ідентифіковано за визначником Александрової А.В. [11]. Асоціацію грибів Т. harzianum 128 депоновано у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України (вул. Академіка Заболотного, 154, м. Київ) 6 жовтня 2015 року з присвоєнням реєстраційного номеру Т. harzianum IMB К-14. Асоціація також зберігається в Національній колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва Національної академії аграрних наук України за № 268. Морфолого-культуральні властивості асоціації. 1) Асоціація складається з двох штамів: Т. harzianum 128/1 та Т. harzianum 128/2. Активний ріст асоціації спостерігається вже на другий день. Міцелій спочатку білий, потім зеленішає. На 4-5 день ріст стає інтенсивнішим і чашка Петрі заростає на 100 %, забарвлення стає жовтішим. Т. harzianum 128/1 розвивається на початку інтенсивніше за Т. harzianum 128/2 і росте більше по краю чашки, а Т. harzianum 128/2 росте переважно в центрі чашки і на 4-5 день за рівнем інтенсивності росту наближається до Т. harzianum 128/1. Отже, на 4-5 день їх співвідношення становить приблизно 1:1. Штамова різниця полягає в швидкості росту штамів, тобто в швидкості засвоювання субстрату, та деякій відмінності в забарвленні колоній. 2) Колонії штаму Т. harzianum 128/1 швидкорослі, активний ріст відмічається на другий день. Радіус колоній на сусло-агарі на 3 добу становить 43,5-50,0 мм (за температури 26 °C), 27,735,0 мм (за температури 35 °C). Міцелій безбарвний, сланкий, ватоподібний. Спороношення з'являється на 3-4 день росту. Колір зелено-малахітовий. Зворотня сторона колоній має жовтий відтінок. Пігмент у середовище не виділяється. Конідієносці безбарвні, гладенькі, злегка звивисті 4,0-8,0 мкм у діаметрі. Деревоподібно розгалужені, через рівні проміжки, гілочки розташовані по дві- три, іноді по одній, прямі чи дещо зігнуті, розходяться під прямим кутом до конідієносця. Фіаліди розташовані на гілочках мутовками по 2-6, рідко по одній. Ампулоподібні до яйцеподібних, широкі та короткі, роздуті в середині 3,5-7,5 × 2,5-4,0 мкм, термінальні пляшкоподібні можуть бути більш витягнуті - до 10,0 мкм. Шийка витягнута вузька 0,5-2,0 мкм у довжину. Конідії зелені, зібрані в голівки, округлі, яйцеподібні до коротко еліптичних, дрібні 2,03,5 × 1,5-2,7 мкм, гладенькі. 3) Колонії штаму Т. harzianum 128/2 помірнорослі, активний ріст відмічається на третій день. Радіус колоній на сусло-агарі на 3 добу становить 34,8-40,0 мм (за температури 26 °C), 22,728,0 мм (за температури 35 °C). Міцелій безбарвний, сланкий, ватоподібний. Спороношення з'являється на 3-5 день росту. Колір жовто-зелений. Зворотна сторона колоній має жовтий відтінок. Пігмент у середовище не виділяється. Конідієносці безбарвні, гладенькі, злегка звивисті 4,0-8,0 мкм у діаметрі. Деревоподібно розгалужені, через рівні проміжки, гілочки розташовані по дві- три, іноді по одній, прямі чи дещо зігнуті, розходяться під прямим кутом до конідієносця. Фіаліди розташовані на гілочках мутовками по 2-6, рідко по одній. Ампулоподібні до яйцеподібних, широкі та короткі, роздуті в середині 3,5-7,5 × 2,5-4,0 мкм, термінальні 1 UA 114247 C2 5 10 15 20 25 пляшкоподібні можуть бути більш витягнуті - до 10,0 мкм. Шийка витягнута вузька 0,5-2,0 мкм у довжину. Конідії зелені, зібрані в голівки, округлі, яйцеподібні до коротко еліптичних, дрібні 2,03,5 × 1,5-2,7 мкм, гладенькі. Фізіолого-біохімічні властивості асоціації. Аероби. Асоціація добре засвоює глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, крохмаль, маніт. Желатину розріджує, молоко не коагулює. Засвоює амонійну і нітратну форму азоту. Засвоює різноманітні фосфорні сполуки та однозаміщений фосфорнокислий калій. Оптимальна температура для росту і біосинтезу целюлаз і геміцелюлаз становить +26-27 °C. Оптимальний рН поживних середовищ для росту і біосинтезу ферментів 5,0-5,5. Асоціація не патогенна щодо теплокровних тварин, резистентна до антибіотиків (пеніциліну, стрептоміцину). При довгостроковому зберіганні культуру зберігають на скошеному сусло-агарі 3-4° за Балінгом, рН 6,4-7,0 в холодильнику при + 4-6 °C, пересівають через 10-12 місяців. У сублімаційно-висушеному стані зберігають при температурі + 3 - + 4 °C упродовж декількох років. Культивують поверхнево на сусло-агарі 3-4° за Балінгом при рН 6,4-7,0 і температурі + 2627 °C. Винахід ілюструється наступним чином. Приклад 1. В лабораторних умовах визначали целюлозолітичну активність нововиділених штамів мікроміцетів у порівнянні з відомим штамом Trichoderma harzianum F-2455. До рідкого середовища Чапека, що містило пшеничну солому як єдине джерело вуглецю, вносили суспензії мікроміцетів, посудини (колби) експонували в термостаті за температури 26 °C протягом 21 доби. По закінченню строку експозиції рештки соломи відділяли від середовища шляхом фільтрування, висушували до постійної маси і за різницею між початковою і кінцевою масами визначали ступінь розкладу соломи. Як свідчать результати досліду (табл. 1), найбільшою активністю серед досліджених мікроміцетів володіє асоціація Т. harzianum 128. Таблиця 1 Інтенсивність розкладу соломи мікроорганізмами Мікроорганізми 1 Контроль Trichoderma harzianum F-2455 Trichoderma sp. 26 Trichoderma sp. 124 Trichoderma sp. 140 Продовження таблиці 1 1 Trichoderma sp. 158 Trichoderma sp. 130 Trichoderma sp. 127 Trichoderma sp. 147 Trichoderma sp. 122 Асоціація Т. harzianum 128 Т. harzianum 128/1 Т. harzianum 128/2 30 35 2 1,033 1,014 1,057 1,061 1,026 3 0,898 0,801 0,898 0,901 0,800 Ступінь розкладання соломи, % 4 13 21 15 15 22 2 1,063 1,032 1,011 1,044 1,085 1,043 1,055 1,074 3 0,903 0,804 0,899 0,803 0,868 0,698 0,759 0,794 4 15 22 11 23 20 33 28 26 Маса соломи до Маса соломи після ферментації, г ферментації, г Приклад 2. У лабораторних умовах досліджували здатність асоціації Т. harzianum 128 забезпечувати розкладання фільтрувального паперу і пшеничної соломи впродовж 21 доби на рідкому середовищі Чапека, де вони виступали єдиним джерелом вуглецю. Розклад фільтрувального паперу і пшеничної соломи становив 40 та 33 % відповідно. Це свідчить про те, що асоціація є активним деструктором органічних решток, у т. ч. пшеничної соломи. Слід відмітити, що штами, які входять до складу асоціації, проявляють меншу деструктивну здатність у випадку, коли використовуються окремо (табл. 2), а за їх одночасного застосування спостерігається синергізм у забезпеченні процесів мінералізації. 2 UA 114247 C2 Таблиця 2 Синергізм асоціації Т. harzianum 128 при розкладанні фільтрувального паперу та пшеничної соломи впродовж 21 доби на рідкому середовищі Чапека Розкладання соломи, % Варіанти досліду Т. harzianum 128/1 + Т. harzianum 128/2 Т. harzianum 128/1 Т. harzianum 128/2 5 33 28 26 Розкладання фільтрувального паперу, % 40 34 29 Штами мікроміцетів, що входять до складу асоціації Т. harzianum 128, проявляють рістстимулювальну активність, причому їх поєднання в асоціації сприяє прояву більшої активності. Так, замочування насіння кукурудзи в розбавлених культуральних рідинах окремих штамів та асоціації забезпечує стимулювання росту проростків навіть при розбавленні у 100 разів (табл. 3). Таблиця 3 Рістстимулювальна активність культуральної рідини асоціації Т. harzianum 128 та її складових Варіанти досліду Довжина проростків кукурудзи, см Замочування насіння в 1,69 дистильованій воді, контроль Замочування насіння в культуральних рідинах, розбавлених у 100 разів Асоціація Т. harzianum 128 2,37 Т. harzianum 128/1 2,07 Т. harzianum 128/2 1,92 HIP05 0,24 10 15 20 25 30 35 Можливість застосування винаходу у технологіях компостування пташиного посліду з метою пришвидшення процесу отримання високоякісних біоорганічних добрив, збагачених агрономічно цінними мікроорганізмами, підтверджується наступними прикладами. Приклад 3. У лабораторії ґрунтової мікробіології Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН в умовах модельного досліду досліджували компостування курячого посліду за інтродукції Т. harzianum 128. Оскільки курячий послід має вузьке співвідношення вуглецю до азоту, що складає 9,6:1, компостування передбачало попереднє встановлення у субстраті оптимального співвідношення С:N на рівні 20:1. Його оптимізацію здійснювали шляхом змішування посліду з торфом і соломою, як джерелами вуглецю. Культуру селекціонованої авторами активної сапрофітної асоціації Т. harzianum 128 вносили на другий місяць компостування субстрату. Суспензію асоціації Т. harzianum 128 отримували шляхом вирощування мікроміцетів у пробірках на скошеному сусло-агарі з подальшим змиванням водою. Суспензію вносили у кількості 128 тис. КУО/г сухого субстрату. Облік чисельності Т. harzianum 128 здійснювали чашковим методом на сусло-агарі [12]. Результати досліджень свідчать про можливість успішної інтродукції Т. harzianum 128 до компостованої суміші. Так, чисельність інтродукованих мікроміцетів на сьомий місяць компостування сягає 9744 тис. КУО/г сухого компосту. Цей період співпадає з часом закінчення компостування органічного субстрату, причому у варіанті без додатково внесення мікроорганізмів на даний час ще не відмічалося повне достигання компосту. Отже, інтродукція асоціації Т. harzianum 128 забезпечує інтенсивний розвиток мікроміцетів у компостованому субстраті і збагачення отриманого компосту мікроорганізмами, активними щодо розкладу органічної речовини та продукування фізіологічно активних речовин. Приклад 4. Дослідження впливу асоціації Т. harzianum 128 на швидкість мінералізації органічної речовини проводили, відділяючи від компосту рештки соломи, які висушували до постійної маси і за різницею між початковою і кінцевою масами в одиниці об'єму визначали 3 UA 114247 C2 5 ступінь розкладу соломи. Інтенсивність розкладу соломи у компостованому субстраті визначали щомісячно. Результати досліджень наведено в табл. 4. Отримані результати свідчать, що інтенсивність розкладу соломи в компостованому субстраті, починаючи з третього місяця (часу, коли інтенсивно починає розвиватися інтродукована асоціація), перевищує контрольні показники у 2,1 рази. Застосування компонентів асоціації окремо також сприяє інтенсифікації процесу мінералізації, проте в меншій мірі, ніж це має місце за використання асоціації. Наприкінці 7-го місяця компостування субстрат з інтродукованою асоціацією грибів характеризувався розкладом органічної речовини на 98,1 %. В інших варіантах, і особливо контрольному, мінералізація соломи не була завершеною. 10 Таблиця 4 Інтенсивність розкладу соломи у компості за інтродукції мікроорганізмів, % Варіанти досліду Без інтродукції мікроорганізмів, контроль Асоціація Т. harzianum 128 Т. harzianum 128/1 Т. harzianum 128/2 15 20 II 5,1 11,6 5,1 5,1 5,1 24,5 21,4 20,8 Місяці IV III V VI VII 22,4 34,8 42,7 54,3 57,3 49,6 47,5 71,2 65,3 52,9 83,5 74,4 66,8 98,1 84,7 76,6 Отже, інтродукція асоціації Т. harzianum 128 до компостованого субстрату на основі пташиного посліду забезпечує суттєве скорочення терміну компостування, що вигідно як з екологічної, так і з економічної точок зору. Приклад 5. Дослідження проводили за умов, описаних у вищенаведених прикладах. Перед початком компостування визначали вміст вуглецю у субстраті. Після закінчення компостування вміст вуглецю визначали поваріантно. Як свідчать отримані результати, за інтродукції асоціації Т. harzianum 128 до субстрату на основі пташиного посліду вміст вуглецю у готовому компості був найвищим (табл. 5). Це свідчить, що за даних умов втрати вуглецю з компостованого субстрату були найнижчими, що важливо з точки зору цінності компосту. Втрати вуглецю з компосту в контрольному варіанті були найбільшими. Таблиця 5 Вміст вуглецю у компості (%) залежно від умов компостування Варіанти досліду Без інтродукції мікроорганізмів, контроль Асоціація Т. harzianum 128 Т. harzianum 128/1 Т. harzianum 128/2 25 Початковий субстрат Готовий компост 47,2 38,3 47,2 47,2 47,2 42,7 40,5 39,9 Паралельно визначали вміст азоту в початковому субстраті та готових компостах. Отримані результати свідчать, що втрати сполук цього елементу за інтродукції асоціації Т. harzianum 128 є найменшими серед досліджуваних варіантів досліду (табл. 6). Таблиця 6 Вміст азоту в компості (%) залежно від умов компостування Варіанти досліду Без інтродукції мікроорганізмів, контроль Асоціація Т. harzianum 128 Т. harzianum 128/1 Т. harzianum 128/2 Початковий субстрат Готовий компост 3,25 1,98 3,25 3,25 3,25 2,23 2,11 2,04 4 UA 114247 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Отже, інтродукція асоціації Т. harzianum 128 до компостованого субстрату сприяє акумулюванню вуглецю та азоту в компості, що підвищує його цінність. Таким чином, збагачення компостів на основі пташиного посліду асоціацією Т harzianum 128 є перспективним біотехнологічним прийомом, здатним забезпечити як прискорення утилізації відходів птахівництва, так і отримання компостів з покращеними якісними характеристиками. Джерела інформації: 1. Варнайте Р.Н., Раудонене В.З. Биодеградация растительных отходов микромицетами // Микол, и фитопатол. - 2003. - 37, № 2. - С. 49-52. 2. Lynd L.R., van Zyl W.H., McBride J.E., Laser M. Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: an update // Curr. Opinion in Biotechnol. - 2005. - 16, № 5. - P. 577-583. 3. Fadel M. Production physiology of cellulase and β-glucosidase enzymes of Aspergillus niger grown under solid-state fermentation conditions // J. Biol. Sci. - 2000. - 1, № 5. - P. 401-411. 4. Sid Ahmed A. Evalution of Trichoderma harzianum for controlling root rot caused by Phytophtora capsici in pepper plants / A. Sid Ahmed, С. Peres-Sanches, С. Egea, M.E. Candela // Plant Pathol. - 1999. - V. 48 № 1. - P. 58-65. 5. Gomes I., Shaheen M., Rahman S. R., Gomes D.J. Comparative studies on production of cell wall-degrading hydrolases by Trichoderma reesei and T. viride in submerged and solid-state cultivations // Bangladesh J. Microbiol. - 2006. - 23, № 2. - P. 149-155. 6. Пат. 2360893 Российская Федерация, МПК 2006.01 C05F3/00, C05F11/10. Биоорганическое удобрение / Мохов В.В., Фомичева Е.В.; заявители и патентообладатели: Мохов В.В., Фомичева Е.В. - № 2007144781/12; заявл. 03.12.2007; опубл. 10.07.2009, Бюл. № 11. 7. Пат. 2322427 Российская Федерация, МПК 2006.01 C12N1/20, C05F11/08. Способ биологической переработки птичьего помета / Кулагина Е.М., Егоров С.Ю., Азизов С.А., Барабанов В.П.; заявитель и патентообладатель: ООО "Байлык" - заявл. 14.07.2006; опубл. 20.04.2008, Бюл. № 11. 8. Пат. 2283294 Российская Федерация, МПК 2006.01 C05F11/00. Состав для производства органоминерального удобрения / Родненко Л.В., Салюков А.Н., Сапелкин ПП. , Симаненков С.И., Чёрных В.Н., Попов В.А., Путин Б.В., Коновалов Н.Д.; заявитель и патентообладатель: Акционерное общество "Принт" - заявл. 07.04.2004, опубл. 10.09.2006, Бюл. № 25. 9. Пат. 2266883 Российская Федерация МПК 2005.01 C12N1/20, C12N1/16, C12N1/14, C05F11/08. Способ получения компоста / Богомолов А.Г., Воробьева Г.И., Листов Е.Л., Стрельникова Т.Л.; заявитель и патентообладатель: ООО "ЭкоПолигон". - заявл. 08.05.2005, опубл. 11.10.2007, Бюл. № 33. 10. Каталог штаммов Украинской коллекции микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины. - Режим доступу до каталогу: http://www.imv.kiev.ua /images/doc/catalog/UCM_catalog.pdf. 11. Александрова А.В. Ключ для определения видов рода Trichoderma / А.В. Александрова, Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Биоразнообразие, систематика, экология. - 2006. - Т. 40, вып. 6. - С. 457-459. 12. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. - М.: Агропромиздат, 1987. - 239 с. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 Асоціація грибів Trichoderma harzianum, депонована у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології Національної академії наук України ім. Д.К. Заболотного з присвоєнням реєстраційного номеру Trichoderma harzianum ІMB К-14 і призначена для одержання біоорганічного добрива. 50 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5