Штам в-99 гриба pleurotus ostreatus (jacq.: fr.) kummer для одержання плодових тіл харчового призначення

Реферат: UA 74131 U UA 74131 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до грибівництва і може бути використана у виробництві плодових тіл. Гриб Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kummer відомий як активний продуцент плодових тіл, має високу життєздатність та відносно просту технологію вирощування, що дозволяє отримувати продукт харчування альтернативний білкам рослинного і тваринного походження [1, 2, 3, 4, 5]. На даний час промислове культивування гриба P. ostreatus складає 16,3 % і займає третє місце від загального світового виробництва [6]. Завдяки тому, що плодові тіла гриба мають гарні органолептичні властивості, містять велику кількість білків (до 30-40 %), незамінних амінокислот, вуглеводів, ліпідів, вітамінів та інші органічні сполуки, його використання стає все більш актуальним [7, 8]. Одним з основних напрямів сучасного грибівництва є підвищення врожайності плодових тіл від впровадження нових штамів гриба P. ostreatus. Відбір культур гриба P. ostreatus за показниками продуктивності і товарній якості плодових тіл дозволить істотно підвищити ефективність промислового грибівництва й водночас зменшити економічні витрати на виробництво однієї одиниці продукції. Для цього необхідно проведення науково-дослідних робіт з використанням стандартних методик, а саме: поверхневого культивування на рідкому живильному середовищі, електрофоретичного дослідження позаклітинних білків культуральної рідини, інтенсивного культивування на твердому вуглецевому субстраті в поліпропіленових пакетах, визначення лінійних показників плодового тіла. Такий підхід дозволяє дослідити нові штами гриба P. ostreatus з високими морфофізіологічними та біологічними показниками з метою подальшого використання найбільш високопродуктивних штамів у промисловому грибівництві [9, 10, 11, 12]. Найбільш близьким за технічною суттю і досягнутому результату є штам Дон 21.3 соматичних структур їстівного базидіоміцету P. ostreatus - продуцент плодових тіл харчового призначення та основа одержання посівного міцелію, який має урожайність 3,6 кг з одного грибного блока [12]. Недоліками цього штаму є низькі морфофізіологічні та біологічні показники, а саме: накопичення біомаси на рідкому живильному середовищі, урожайності за інтенсивного культивування на лушпинні соняшника, лінійних характеристик та маси плодового тіла, а також більш тривале повне обростання субстрату від моменту посіву міцелію. В основу корисної моделі поставлено задачу пошуку високопродуктивного штаму, у якого за культивування досягаються високі морфофізіологічні та біологічні показники. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що штам В-99 P. ostreatus, який було виділено з плодових тіл, зібраних з горіха волоського, згідно з корисною моделлю, має найбільші морфофізіологічні показники на рідкому живильному середовищі Чапека (глюкоза, 30 г/л) та продуктивність (кг/блок) на твердому субстраті порівняно з прототипом Дон 21.3. Штам, що його пропонують, зберігається в колекції чистих культур кафедри фізіології рослин біологічного факультету Донецького національного університету. Приклад конкретного виконання. Всі дослідження штаму В-99 проводили стандартними загальноприйнятими методами поверхневого і інтенсивного культивувань [1, 13, 14, 15]. Досліди на рідкому живильному середовищі (середовище Чапека з глюкозою і Суслове) проведено в умовах поверхневої культури в колбах Ерленмейєра ємністю 250 мл, в які наливали 50 мл живильного середовища, з подальшою стерилізацією в автоклавах АГ-1 з температурою 121 °C під тиском 1 атм протягом години. Інокуляцію проведено шматочками міцелію штаму В-99, попередньо вирощеного на стандартному сусло-агаровому середовищі (4° по Баллінгу) в пробірках (20×2 см) протягом 7 діб. Час культивування складав 30 діб у термостаті з температурою 26 °C, за який гриб P. ostreatus, за попередніми спостереженнями, використовував весь вуглець живильного середовища. Для визначення біомаси міцелій штаму В-99 відокремлювали від культуральної рідини (КР), промивали в проточній воді, поміщали в металеві бюкси і висушували до постійної ваги в сушильній шафі з температурою 105 °C згідно з методикою, І.О. Дудки зі співавторами [15]. Електрофоретичне дослідження водорозчинних білків здійснювали в паралельних пластинках поліакриламідного гелю за методом В.І. Сафонова і М.П. Сафонової (1977) [16]. Білкові компоненти характеризували на підставі їх відносної електрофоретичної рухливості (ВЕР), яку розраховували за формулою В.І. Сафонова і М.П. Сафонової [16]: BEP=R/R1, де R - відстань від старту до середини зони білка, мм; R1 - відстань від старту до фінішу барвника, мм. Інтенсивне культивування проведено на твердому субстраті, лушпинні соняшника в поліпропіленових пакетах розміром 50×100 см за методикою [13, 15]. Для одержання маточного (посівного) міцелію штаму В-99 до зерна ячменю додавали воду в співвідношенні 1:1,5 і варили 1 UA 74131 U 5 10 15 20 25 30 35 живильну суміш протягом 15-20 хв. на слабкому вогні. Після варіння воду зливали, зерно висушували "поверхнево" і додавали до нього гіпс і крейду в кількості 1,2 % і 0,3 %, відповідно, від загальної ваги приготовленого середовища. Оброблене зерно, засипали в літрові молочні пляшки на 2/3 від їхнього обсягу, закривали бавовняними пробками і стерилізували в автоклаві з температурою 121 °C під тиском 1 атм протягом 1,5 години. Потім субстрат охолоджували до температури посіву (нижче 30 °C). Посів проводили стерильним міцелієм штаму В-99, який попередньо вирощували у пробірках на агаризованому суслі. Перед посадкою пробірки нагрівали над полум'ям газового пальника. При підігріванні міцелій легко відділявся від поверхні пробірки і через повернений отвір пробірки вносився в пляшку із приготовленим середовищем. Інокульоване зерно залишали для заростання в термостаті з температурою 22-25 °C і відносною вологістю повітря 60 %. Для одержання посадкового субстрату використовували лушпиння соняшника, яке попередньо замочували в гарячій водопровідній воді (95 °C) у ваговому співвідношенні 1:5 (субстрат - вода) з наступним охолодженням до 25 °C. Зволожений і термічно оброблений субстрат розфасовували в прозорі поліпропіленові пакети розміром 50×100 см. На другому етапі пророслий посівний міцелій вносили в підготовлений посадочний субстрат у пакети у ваговому співвідношенні 1:20 (міцелій - субстрат), що відповідало 5 % від загальної ваги вологого субстрату. Отримані таким чином інокульовані блоки перфорували і залишали в темному, добре провітрюваному приміщенні з температурою повітря 18 °C і вологістю 60-65 % для заростання. Для їх висвітлення використовували лампи накалювання з інтенсивністю 4002 600 люкс/годину на 1 м . Знімання плодових тіл проводили на сьому добу після появи примордіїв. Час культивування складав шість тижнів. Загальну урожайність плодових тіл оцінювали за двома хвилями плодоношення. Урожайність (кг/блок) розраховували за відношенням маси свіжих плодових тіл до маси вологого субстрату (грибного блока). Лінійні показники плодового тіла (діаметр шапинки і ніжки) визначали вимірюваннями за допомогою лінійки у двох перпендикулярних напрямах під кутом 90°. Довжину ніжки плодового тіла вимірювали лінійкою від найбільш широкого місця біля шапинки до місця поєднання зі зростком [15, 16, 18, 19]. Обліковою ділянкою був кожний мішок (грибной блок вагою 20 кг). Повторність дослідів триразова. Оцінку статистичної вірогідності отриманих даних проводили за допомогою дисперсійного аналізу та порівняння середніх за методом Данета [20]. Результати досліджень штаму В-99 доводять, що він переважає прототип Дон 21.3 за морфофізіологічними показниками на рідкому живильному середовищі Чапека (глюкоза, 30 г/л) та продуктивністю (кг/блок) на твердому субстраті (табл. 1). Таблиця 1 Порівняльні дані показників штамів В-99 та Дон 21.3 Штам Дон 21.3 (прототип) В-99 40 45 50 Накопичення біомаси на середовищі Чапека з глюкозою, г/л 2,5±0,1 4,8±0,6 Урожайність за дві хвилі плодоношення, кг/блок 3,6±0,1 5,3±0,4 Так, штам В-99 на рідкому живильному середовищі Чапека з глюкозою (30 г/л) накопичував 4,8 г/л сухої біомаси, що в 1,9 разу більше ніж у штаму Дон 21.3 [13]. За інтенсивного культивування на твердому субстраті загальна урожайність за дві хвилі плодоношення штаму В-99 дорівнювала 5,3 кг з одного грибного блока, тоді як у прототипі Дон 21.3 цей показник в 1,5 разу нижче або 3,6 кг/блок [13]. Електрофоретичне дослідження показало, що ВЕР позаклітинних білків культуральної рідини (КР) залежить від фізіологічних особливостей штаму гриба (табл. 2). На електрофореграмі суслового живильного середовища у штамі В-99 виявлено білкові фракції з низькою, середньою і високою ВЕР, їх загальна кількість дорівнювала 9, тобто він продукував широкий спектр білків, які беруть участь в деструкції живильного середовища. Аналіз білкових фракцій показав, що одна з них відповідала повільнорухливим, п'ять середньорухливим і три - швидкорухливим білкам. Електрофореграма прототипу Дон 21.3 вказує на наявність 8 водорозчинних білків, з яких п'ять належать до повільнорухливих, а три - до середньорухливих білків. У штамі Дон 21.3 не 2 UA 74131 U 5 було виявлено швидкорухливої білкової фракції з високою ВЕР, що вказує на відмінність в якісному складі позаклітинних білків від штаму В-99. Наявність у штаму В-99 білкової фракції швидкорухливих білків з високою ВЕР може бути передумовою більш швидкого накопичення біомаси на рідкому живильному середовищі та обумовлює високу врожайність на твердому субстраті за інтенсивного культивування. Таблиця 2 Кількість білкових зон та ВЕР позаклітинних білків штамів В-99 і Дон 21.3, які вирощувалися на сусловому середовищі (час культивування - 30 діб) Номер білкової зони 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Загальна кількість 10 Штам В-99 0,19 0,36 0,40 0,49 0,51 0,60 0,66 0,72 0,81 9 Дон 21.3 (прототип) 0,09 0,11 0,20 0,27 0,28 0,37 0,45 0,55 8 Результатами досліджень (табл. 3) за методом інтенсивного культивування на твердому вуглецевому субстраті встановлено, що штам В-99 може утворювати плодові тіла без холодового шоку і додаткового впливу. Таблиця 3 Особливість отримання плодових тіл штамів В-99 і прототипу Дон 21.3 за інтенсивного культивування на твердому субстраті Повне обростання від моменту посіву, діб В-99 11±1 Дон 21.3 15-18+3 Штам 15 20 Характеристика плодового тіла довжина ніжки, маса, г діаметр шапинки, см см 17,9+2,3 7,1±0,3 2,9±0,3 13,6±0,1 6,3+0,1 2,3±0,3 діаметр ніжки, см 1,6+0,1 1,7±0,1 Повне обростання субстрату від моменту посіву у В-99 спостерігалось на 11 добу, тоді як у штамі Дон 21.3 повне обростання міцелієм субстрату від моменту посіву тривало 15-18 діб [13]. Видно (табл. 3), що у штаму В-99 діаметр шапинки на 10 % ширше, а маса плодового тіла в 1,4 разу більше ніж у прототипі Дон 21.3. За довжиною і діаметром ніжки плодові тіла досліджених штамів між собою майже не відрізнялись. Таким чином, за результатами досліджень було доведено, що за морфофізіологічними та біологічними показниками, а саме: накопиченням біомаси на рідкому живильному середовищі, електрофоретичним дослідженням, більш швидким повним обростанням субстрату від моменту посіву міцелію, урожайністю за інтенсивного культивування на лушпинні соняшника, лінійними показниками та масою плодового тіла штам В-99 переважає штам Дон 21.3 (прототип). За запропонованою корисною моделлю штам В-99 має, порівняно з прототипом штамом Дон 21.3, більш високі показники урожайності за умов інтенсивного культивування і може бути 3 UA 74131 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 використаний в промисловому грибівництві для одержання плодових тіл харчового призначення. Джерела інформації:, використані при складанні заявки: 1. Бисько Н.А. Биология и культивирование грибов рода вешенка / Н.А. Бисько, И.А. Дудка. К.: Наукова думка, 1987.-148 с. 2. Цизь О.М. Вирощування їстівних грибів - перспективний напрямок сільського виробництва / О.М. Цизь // Наук. вісн. нац. агр. ун-ту.-2001. - Вип. 40. - С. 69-72. 3. Mandeel Q.A. Cultivation of oyster mushrooms (Pleurotus spp.) on various lignocellulosic wastes / Q.A. Mandeel, A.A. Al-Laith, S.A. Mohamed // World Journal of Microbiology & Biotechnology.-2005. - N 21. - P. 601-607. 4. Цизь О.М. Гриби - це вигідно / О.М. Цизь, О.В. Приліпка // Агросектор.-2007. - № 4. -С. 2223. 5. Цизь О.М. Вирощування гливи на присадибній ділянці / О.М. Цизь, А.Н. Кручек // Дім, сад, город. -2005. - № 5. - С 7-10. 6. Velazquez-Ceden M.A. Waste-reducing cultivation of Pleurotus ostreatus and Pleurotus pulmonarius on coffee pulp: changes in the production of some lignocellulolytic enzymes / M.A. Velazquez-Ceden, G. Mata, J.-M. Savoie // World Journal of Microbiology & Biotechnology.-2002.-18. - P. 201-207. 7. Элисашвили В.И. Биоконверсия растительного сырья высшими базидиомицетами / В.И. Элисашвили // Микол, и фитопатол.-1993. - Т. 27, вып. 6. - С. 83-94. 8. Matilla P. Contens of vitamins, mineral elements, and some phenolic compounds in cultivated mushrooms / P. Matilla, K. Konko, M. Eurola [and other] // J. agr. Food Chem.-2001. - Vol. 49, № 5. P. 2343-2348. 9. Бурова Л.Г. Загадочный мир грибов / Л.Г. Бурова. - М.: Наука, 1991.-97 с. 10. Афанасьева М.М. Подбор целлюлозо- и лигнинразрушающих грибов для применения в системе искусственного замкнутого экологического цикла / М.М. Афанасьева, Р.М. Кадыров // Микол. и фитопатол.-1980. - Т. 14, вып. 5. - С. 410-416. 11. Современные направления экспериментального исследования базидиомицетов / Н.В. Белова, Н.В. Псурцева, А.Я. Мнухина, И.А. Алехина // Микол. и фитопатол.-1997. - Т. 31, вып. 6. - С. 64-75. 12. Патент на корисну модель № 16658 Україна, МПК (2006) C12N 1/00, A01G 1/04. Штам Дон 21.3 соматичних структур їстівного базидіоміцету Pleurotus ostreatus (Jacq: Fr.) Kummer продуцент плодових тіл харчового призначення та основа одержання посівного міцелію / Н.П. Ткаченко, П.А. Сичов, І.І. Бандура, О.А. Тимофеев. - Заявка № u200602268; заявл. 02.03.2006; опубл. 15.08.2006, Бюл. № 8 (прототип). 13. Дудка И.А. Грибы: Справочник миколога и грибника / И.А. Дудка, С.П. Вассер. - К.: Наукова думка, 1987.-536 с. 14. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / А.С. Бухало. - К.: Наукова думка, 1988.-144 с. 15. Методы экспериментальной микологии / [И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А. Элланская]; под ред. В.И. Билай. - К.: Наукова думка, 1982.-550 с. 16. Сафонов В.И. Исследование белков и ферментов растений методом электрофореза в ПААГ / В.И. Сафонов, М.П. Сафонова // Биохим. методы в физиологии растений. - М.: Наука, 1977. - С. 113-136. 17. Горное грибоводство / [С.Ф. Негруцкий, Ю.А. Шапочник, П.А. Сычев и др.]; под ред. С.Ф. Негруцкого. - Донецк: РИП "Лебедь", 1995.-168 с. 18. Цилюрик А.В. Грибы лесных биоценозов: Атлас / А.В. Цилюрик, С.В. Шевченко. - К.: Выща шк. Головное изд-во, 1989.-255 с. 19. Билай В.И. Основы общей микологии / В.И. Билай. - К.: Выща шк. Головное изд-во, 1989.-392 с. 20. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999.-210 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Штам В-99 гриба Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kummer - продуцент плодових тіл харчового призначення. 4 UA 74131 U Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5