Спосіб одержання бактеріального препарату для стимуляцї росту рослин

Реферат: Спосіб одержання бактеріального препарату для стимуляції росту рослин передбачає нарощування бактеріального консорціуму, який містить лактобацили виду Lactobacillus salivarius і молочнокислі стрептококи виду Streptococcus thermophilus, у живильному середовищі, що містить мінеральні сполуки. Крім цього, як бактеріальний консорціум використовують мультивидовий симбіоз, який з лактобацил додатково містить види Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum і Lactobacillus gasseri, з молочнокислих стрептококів вид Lactococcus lactis, а також містить біфідобактерії видів Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis і Bifidobacterium breve, пропіоновокислі бактерії видів Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii і Propionibacterium acidipropionici, оцтовокислі бактерії виду Acetobacter aceti, штам стрептоміцетів Actinoplanes sp. 1MB Ac-5032, а як джерело мінеральних сполук використовують водний гель бентоніту для нарощування біомаси в кількості 40-60 %. UA 93657 U (12) UA 93657 U UA 93657 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології й може бути використана для одержання бактеріальних препаратів, які застосовуються для стимуляції росту рослин. Широке застосування в сільському господарстві хімічних сполук привело до ряду негативних наслідків. Накопичення хімікатів у ґрунті обумовлює різке погіршення його родючості й вимагає внесення все більших доз мінеральних добрив для забезпечення продуктивності сільськогосподарських культур. Забруднення продуктів харчування нітратами, нітритами, пестицидами, гербіцидами й іншими токсичними речовинами, що використовуються в рослинництві, негативно позначається на здоров'ї населення й призводить до розвитку багатьох захворювань. У зв'язку з погіршенням родючості ґрунтів і якості рослинної продукції відбувається поступовий перехід від масивного використання хімічних добрив і засобів захисту рослин до широкого впровадження в рослинництво бактеріальних препаратів. Це сприяє поліпшенню живлення рослин, стимуляції їх росту, захисту від фітопатогенних мікроорганізмів і підтримці природних біоценозів ґрунту, які впливають на його родючість і, як наслідок, на врожайність рослин. Відомий бактеріальний препарат на основі культури штаму Pseudomonas aureofaciens H16 використовується для стимуляції росту рослин (Патент РФ № 2001950, C12N 1/20, 1993). Штам, що використовують, виділений з ризоплану кореневищ пирію повзучого. Для одержання бактеріального препарату штам Pseudomonas aureofaciens H16 вирощують із аерацією на середовищі Альбіт-1, що містить відвар із проростків рослин, спиртовий екстракт проростків насіння, хлористий натрій, гідролізат казеїну й воду, протягом 24-30 годин при температурі 289 30 °C, до нагромадження клітин титром 2-4 × 10 /мл. Отриману суспензію використовують для обробки насіння. Недоліком відомого способу одержання бактеріального препарату є те, що штам, який використовують для його приготування, має низьку стимулюючу ефективність і високу вимогливість до складу живильного середовища й умов культивування. Відомо також спосіб одержання препарату, який використовують для стимуляції росту рослин і захисту їх від фітопатогенних мікроорганізмів на основі штаму бактерій Pseudomonas specias. Для одержання препарату штам вирощують протягом 16-18 годин при температурі 2810 31 °C до концентрації 5 × 10 кл/мл на середовищі LB, що містить, г/л: пептон - 10,0; дріжджовий екстракт - 5,0; натрій хлористий - 10,0 і воду, а отриману суспензію використовують для обробки насіння рослин (Патент РФ № 2130261, A01N 63/00, C12N 1/20, C12R 1/38, 1999). Препарат, одержаний на основі даного штаму, сприяє деякому стимулюванню росту рослин і перешкоджає розвитку фітопатогенних грибів родів Alternaria, Bepolaris, Fusarium. Недоліком способу є низька активність стимуляції росту рослин і вузький спектр антимікозної дії. Відомо спосіб одержання біологічного препарату для підвищення врожайності сільськогосподарських культур і їх стійкості до різних захворювань, який передбачає двоступінчате вирощування штаму Bacillus mucilaginosus Вас-10 (ВКПМ В-8966) у живильному середовищі, при цьому першу ферментацію проводять на рідкому живильному середовищі Ешбі з додаванням NH4NO3 протягом 24-36 годин, а другу - на середовищі Сурмана з мелясою протягом 48-60 год., ферментацію проводять при температурі 29±1 °C при безперервному перемішуванні і аерації, а посівну культуру засівають із розрахунку 5-10 % від об'єму живильного середовища (Патент РФ № 2289621, C12N 1/20, A01N 63/00, C12R 1/07, 2005). Завдяки здатності штаму Bacillus mucilaginosus Вас-10 (ВКПМ В-8966) пригнічувати фітопатогенні мікроорганізми, а також трансформувативажкодоступний для рослин фосфор і калій, вдається одержувати препарат, що підвищує врожайність сільськогосподарських культур і їх стійкість до захворювань. Недоліком способу є висока трудомісткість технологічного процесу, обумовлена тривалістю процесу й використанням двостадійного інкубування штаму в різних живильних середовищах. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання регулятора росту рослин, що передбачає одержання рідкої культури консорціуму ВКПМ В-5974, що включає бактерії видів Lactobacillus salivarius, Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, вирощування його на знежиреному 10 %-му молоці до рН 3,8-4,0; введення сухих водоростей, сечовини, натрію бензоату кальцію пропіонату, аскорбінової кислоти, комплексонатів металів Mg, Mn, Mo, Co, Zn і Fe у вигляді калієвих або натрієвих солей і воду, при наступному співвідношенні компонентів: рідка культура консорціуму ВКПМ В-5974-30-35; сухі водорості 0,62,0; сечовина 0,5-0,7; натрію бензоат 0,20-0,25; кальцію пропіонат 0,20-0,25; аскорбінова кислота 0,25-0,30; комплексонати металів 0,07-0,10; вода - решта; рН регулятора 4,5-4,7 (Патент РФ № 2059727, C12N 1/20, 1992 - прототип). 1 UA 93657 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Біорегулятор, одержаний цим способом, підвищує енергію проростання насіння і збільшує їхню схожість, що веде до збільшення врожаю сільськогосподарських культур. Недоліком способу є його низька активність пригнічення фітопатогенних бактерій і грибів, а також висока трудомісткість, обумовлена введенням до складу препарату широкого комплексу додаткових інгредієнтів. Задачею корисної моделі є створення способу одержання бактеріального препарату, що має здатність ефективно стимулювати ріст рослин і захищати їх від фітопатогенних бактерій і грибів при невеликій трудомісткості способу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі одержання біологічного препарату для стимуляції росту рослин, що передбачає вирощування бактеріального консорціуму, що містить лактобацили виду Lactobacillus salivarius і молочнокислі стрептококи виду Streptococcus thermophilus, у живильному середовищі, яке містить мінеральні сполуки, як бактеріальний консорціум використовують мультивидовий симбіоз, який з лактобацил додатково містить штами видів Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactocobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum і Lactobacillus gasseri, з молочнокислих стрептококів - вид Lactococcus lactis, а також містить біфідобактерії видів Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Вifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis і Bifidobacterium breve, пропіоновокислі бактерії видів Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii і P. acidipropionici, оцтовокислі бактерії виду Acetobacter aceti, штам стрептоміцетів Actinoplanes sp. ІMB Ac-5032, а як джерело мінеральних сполук використовують водний гель бентоніту, який вносять у живильне середовище для нарощування біомаси в кількості 40-60 %. Визначальними відмінностями пропонованого консорціуму від прототипу є те, що за рахунок мультивидового складу й мутуалістичного характеру взаємозв'язків він має більш високу здатність стимулювати ріст рослин, не вимогливий до складу живильного середовища, здатний фіксувати атмосферний азот. Крім цього консорціум відрізняється здатністю активно пригнічувати ріст фітопатогенних грибів і бактерій, що володіють високою патогенністю щодо рослин. Введення до складу симбіозу додаткових видів лактобацил і молочнокислих стрептококів, а також біфідобактерій, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій сприяє збільшенню антагоністичної активності препарату щодо широкого спектра фітопатогенних мікроорганізмів, а також забезпеченню рослин цінними, стимулюючими ріст сполуками. Введення до складу бактеріального препарату штаму Actinoplanes sp. 1MB Ac-5032 наділяє препарат здатністю інгібувати широкий спектр фітопатогенних грибів. При одержанні бактеріального препарату, згідно із пропонованим способом, для нарощування біомаси клітин мультивидового симбіозу використовують живильне середовище, що містить гель бентоніту. Бентоніт - це природний глинистий матеріал, який належить до класу алюмосилікатів, має високі вологоутримуючі, іонообмінні й адсорбційні властивості. Гель бентоніту, що використовується у пропонованому способі, є натрієвою формою дрібнодисперсної фракції бентоніту, яку одержують із природного бентоніту шляхом його глибокого очищення від забруднюючих мінералів і мікроорганізмів з наступним переведенням у форму гелю. Гель бентоніту в складі живильного середовища виконує функцію іммобілізуючого агенту для бактеріальних клітин, а також є джерелом широкого спектра мінеральних сполук, цінних для рослини і її фізіологічних мікробних симбіонтів.Дрібнодисперсні частки бентоніту зв'язуються з поверхневими структурами бактеріальних клітин і покривають їх захисним шаром, захищаючи від впливу інгібуючих факторів. Це поліпшує умови для проявлення бактеріями препарату своєї активності й продовжує строк зберігання препарату. Завдяки здатності активно зв'язувати воду, набухати й здійснювати іонообмін, гель бентоніту поліпшує структуру ґрунту й умови для розвитку рослин. Бентоніт є природним полімінеральним комплексом, що забезпечує рослини життєво необхідними мінералами. При готуванні живильного середовища його змішують із 5 %-м гелем бентоніту. При цьому концентрація гелю бентоніту в середовищі становить 40-60 %. Дане співвідношення є найбільш оптимальним. Зміна співвідношення у бік зменшення в живильному середовищі частки гелю бентоніту приводить до погіршення зберігання препарату й зниження стимулюючої активності щодо рослин. Збільшення кількості гелю бентоніту недоцільно, оскільки це не сприяє поліпшенню якості препарату, але приводить до зниження концентрації в ньому бактеріальних клітин і його активності. 2 UA 93657 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використання способу дозволяє підвищити польову схожість насіння, попередити розвиток збудників хвороб рослин, сприяє формуванню здоровіших, міцних сходів і скорочує час їх появи, що, в кінцевому результаті, сприяє підвищенню врожайності сільськогосподарських культур. Спосіб здійснюють таким чином. У стерильне живильне середовище вносять 3-5 % інокуляту симбіозу біфідобактерій, молочнокислих, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій і 5-10 % штаму Actinoplanes sp. ІMB Ас-5032. Інкубування проводять при температурі 32-34 °C протягом 24-30 годин. Одержаний препарат фасують у ємності об'ємом 10-20 л і зберігають при температурі від 4 °C до 25 °C. Препарат зберігає свою активність до 12 місяців. Бактеріальний препарат, отриманий пропонованим способом, використовують для підвищення врожайності сільськогосподарських рослин. Із цією метою проводять обробку посівного матеріалу або використовують двоетапну обробку, що передбачає додатковий полив сходів рослин. Корисна модель пояснюється прикладами. Приклад 1. Одержання бактеріального препарату для збільшення врожайності зернових культур. Для приготування живильного середовища в 60 л кукурудзяного екстракту вносять 40 л 5 %го гелю бентоніту. Середовище стерилізують при температурі 121 °C протягом 30 хвилин, охолоджують до температури 32 °C і інокулюють 3 % культури симбіозу біфідобактерій, молочнокислих, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій, що складається із наступних штамів: Bifidobacterium bifidum IMB В-7113; Bifidobacterium longum IMB В-7150; Bifidobacterium adolescentis IMB В-7148; Bifidobacterium infantis IMB B-7147; Bifidobacterium breve IMB B-7132; Lactobacillus fermentum IMB B-7133; Lactobacillus salivarius IMB B-7134; Lactobacillus helveticus IMB B-7115; Lactobacillus acidophilus ВКПМ B-5863; Lactobacillus casei ВКПМ B-5724; Lactobacillus brevis IMB B-7114; Lactobacillus plantarum IMB B-7116; Lactobacillus gasseri IMB B7135; Lactococcus lactis ВКПМ В-5725; Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ В-5388; Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii ВКПМ B-4544; P. acidipropionici ВКПМ В-5800 і Acetobacter aceti ВКПМ В-5495. Додатково вносять 10 % штаму Actinoplanes sp. IMB Ас-5032. Інкубування проводять при температурі 32 °C протягом 24 годин. Готовий препарат містить 9 1,0 × 10 /мл життєздатних бактеріальних клітин. Препарат фасують у стерильні ємності місткістю 10 л і направляють споживачеві. Для підвищення врожайності зернових культур проводять бактеризацію насіння шляхом їх зволоження препаратом. Обробку насіння проводять із розрахунку 2 л препарату на 1 т насіння. Оброблене насіння витримують протягом 12 год. і висівають у підготовлений ґрунт. Приклад 2. Одержання бактеріального препарату для збільшення врожайності картоплі. Для приготування живильного середовища в 80 л гідролізованого молока вносять 120 л 5 %го гелю бентоніту. Середовище стерилізують при температурі 121 °C протягом 35 хвилин, охолоджують до температури 33 °C і інокулюють 5 % культури симбіозу біфідобактерій, молочнокислих, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій, що складається із наступних штамів: Bifidobacterium bifidum IMB В-7113; Bifidobacterium longum IMB В-7150; Bifidobacterium adolescentis IMB В-7148; Bifidobacterium infantis IMB B-7147; Bifidobacterium breve IMB B-7132; Lactobacillus fermentum IMB B-7133; Lactobacillus salivarius IMB B-7134; Lactobacillus helveticus IMB B-7115; Lactobacillus acidophilus ВКПМ B-5863; Lactobacillus casei ВКПМ B-5724; Lactobacillus brevis IMB B-7114; Lactobacillus plantarum IMB B-7116; Lactobacillus gasseri IMB B7135; Lactococcus lactis ВКПМ В-5725; Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ В-5388; Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii ВКПМ B-4544; P. acidipropionici ВКПМ B-5800 і Acetobacter aceti ВКПМ В - 5495. Додатково вносять 5 % штаму Actinoplanes sp. 1MB Ас-5032. Інкубування проводять при температурі 33 °C протягом 30 годин. Готовий препарат містить 1,8 9 × 10 /мл життєздатних бактеріальних клітин. Препарат фасують у стерильні ємності місткістю 15 л і направляють споживачеві. Для підвищення врожайності картоплі проводять бактеризацію бульби. Із цією метою їх рівномірно змочують препаратом з розрахунку 3 л препарату на 1 т бульби. Оброблені бульби висаджують у підготовлений ґрунт. Після появи паростків роблять другий етап обробки. Кількість препарату, що використовують, становить 1 л на 1 га. Приклад 3. Одержання бактеріального препарату для збільшення врожайності бобових рослин. Для приготування живильного середовища 100 л молочної сироватки змішують із 100 л 5 %го гелю бентоніту. Середовище стерилізують при температурі 121 °C протягом 32 хвилин, охолоджують до температури 34 °C і інокулюють 4 % культури симбіозу біфідобактерій, молочнокислих, пропіоновокислих і оцтовокислих бактерій, що складається із наступних штамів: 3 UA 93657 U 5 10 Bifidobacterium bifidum IMB В-7113; Bifidobacterium longum IMB В-7150; Bifidobacterium adolescentis IMB В-7148; Bifidobacterium infantis IMB B-7147; Bifidobacterium breve IMB B-7132; Lactobacillus fermentum IMB B-7133; Lactobacillus salivarius IMB B-7134; Lactobacillus helveticus IMB B-7115; Lactobacillus acidophilus ВКПМ B-5863; Lactobacillus casei ВКПМ В-5724; Lactobacillus brevis IMB B-7114; Lactobacillus plantarum IMB B-7116; Lactobacillus gasseri IMB B7135; Lactococcus lactis ВКПМ В-5725; Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ВКПМ В-5388; Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii ВКПМ B-4544; P. acidipropionici ВКПМ B-5800 і Acetobacter aceti ВКПМ В - 5495. Додатково вносять 7 % штаму Actinoplanes sp. IMB Ас-5032. Інкубування проводять при температурі 34 °C протягом 26 годин. Готовий препарат містить 2,2 9 × 10 /мл життєздатних бактеріальних клітин. Препарат фасують у стерильні ємності об'ємом 20 л і направляють споживачеві. Таблиця Порівняльна характеристика бактеріальних препаратів, які одержані за прототипом й пропонованим способом Бактеріальний препарат за прототипом Показники Концентрація життєздатних бактеріальних клітин, 3 КУО/см Вплив препарату на врожайність зернових сільськогосподарських культур, збільшення врожаю, % Збільшення швидкості проростання насіння у порівнянні з контролем, % Вплив препарату на врожайність картоплі, збільшення врожаю, % Здатність до фіксації вільного азоту атмосфери Фосфатмобілізуюча здатність: накопичення фосфору в живильному середовищі з трикальційфосфатом (у перерахунку на P2 O5), мг/мол Антагоністична активність щодо фітопатогенних грибів, зона пригнічення росту тест-культури, мм Антагоністична активність щодо фітопатогенних бактерій, зона пригнічення росту тест-культури, мм Термін збереження активності при зберіганні, місяців 15 20 25 8 Бактеріальний препарат за пропонованим способом 9 1,2-1,8 × 10 1,0-2,2 × 10 13,0 28,6-32,4 124,2 215,3 36 45 + 21 39,8 3-11 20-28 0-8 18-24 9 12 Для підвищення врожайності бобових культур спочатку проводять бактеризацію насіння. Із цією метою його рівномірно змочують препаратом з розрахунку 2,5 л препарату на 1 т насіння. Оброблене насіння висівають у підготовлений ґрунт. Після появи паростків роблять другий етап обробки. Кількість препарату, що використовують, становить 800 мл на 1 га. У таблиці представлена порівняльна характеристика бактеріальних препаратів, які одержують пропонованим і відомим способом. Бактеріальний препарат, одержаний пропонованим способом, відрізняється від прототипу збільшеною в 10 разів концентрацією життєздатних бактеріальних клітин, поліпшеною збережездатністю, більш високим стимулюючим ефектом щодо росту рослин. Таким чином, пропонований спосіб дозволяє підвищити польову схожість насіння, попередити розвиток збудників хвороб рослин, сприяє формуванню здоровіших, міцних сходів і скорочує час їх появи, що веде до підвищення врожайності сільськогосподарських культур. 4 UA 93657 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб одержання бактеріального препарату для стимуляції росту рослин, що передбачає нарощування бактеріального консорціуму, який містить лактобацили виду Lactobacillus salivarius і молочнокислі стрептококи виду Streptococcus thermophilus, у живильному середовищі, що містить мінеральні сполуки, який відрізняється тим, що як бактеріальний консорціум використовують мультивидовий симбіоз, який з лактобацил додатково містить види Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum і Lactobacillus gasseri, з молочнокислих стрептококів вид Lactococcus lactis, а також містить біфідобактерії видів Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis і Bifidobacterium breve, пропіоновокислі бактерії видів Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii і Propionibacterium acidipropionici, оцтовокислі бактерії виду Acetobacter aceti, штам стрептоміцетів Actinoplanes sp. 1MB Ac-5032, а як джерело мінеральних сполук використовують водний гель бентоніту, який вносять у живильне середовище для нарощування біомаси в кількості 40-60 %. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5