Спосіб одержання бактеріального препарату з пробіотичними властивостями

Винахід відноситься до біотехнології і може бути використаний у виробництві бактеріальних препаратів із пробіотичними властивостями. Останніми роками значно підвищився інтерес до пробіотичних властивостей грибкових культур, що представляють собою природні міцні симбіози фізіологічно корисних мікроорганізмів. Серед грибкових культур особливе місце приділяється кефірному грибку, який протягом багатьох років широко використовується у виробництві кисломолочних продуктів. Відомо спосіб одержання кефірної грибкової культури, що передбачає звільнення строми кефірного грибка від поверхневої мікрофлори багаторазовим промиванням дріжджовим культуральним середовищем з наступним культивуванням промитої строми в молоці, ферментованому симбіозом молочнокислих та оцтовокислих бактерій з додаванням в окремих випадках пропіоновокислих бактерій (Авт.свід. СРСР №1821963, А23С9/127, 1990). Недоліком способу є висока концентрація в препараті живих клітин дріжджів, що можуть сприяти розвитку мікозів у дітей і осіб, що страждають імунною недостатністю. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання препарату молочнокислих культур, що передбачає сквашування знежиреного молока, що містить 16-18% сухи х речовин і 0,6-0,8% лимоннокислого натрію, консорціумом молочнокислих культур виду Lactobacillus acidophilus з наступним збагаченням препарату біомасою кефірних грибків, прогрітою при температурі 74-82°С протягом 15-20 хвилин, яку вносять у кількості 100-200мл в 1 літр біомаси (Патент Російської Федерації №2001580, А23С9/12, С12N1/20, 1993). Введення до складу бактеріального препарату мікробних полісахаридів, що містяться в кефірному грибку, сприяє підвищенню біологічної активності бактеріального препарату, однак, використання в його складі тільки одного виду фізіологічної мікрофлори обмежує пробіотичну ефективність. У препараті міститься невисока концентрація клітин молочнокислих бактерій, що також негативно позначається на його лікувальнопрофілактичних властивостя х. Крім того, прогрівання біомаси кефірного грибка при високій температурі приводить до інактивації фізіологічно корисних метаболітів грибкової мікрофлори, зокрема вітамінів і ферментів. Завданням винаходу є створення способу одержання бактеріального препарату з пробіотичними властивостями, в якому шляхом використання як бактеріальної основи мультиштамового пробіотичного симбіозу, що містить лактобацили, лактококи, стрептококи, біфідобактерії і пропіоновокислі бактерії, а як середовище культивування містить автолізат суміші кефірних грибків, «чайного» гриба та пивних дріжджів, забезпечується збільшення концентрації пробіотичних клітин і мікробних полісахаридів, а також підвищення біологічної активності препарату. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі одержання бактеріального препарату з пробіотичними властивостями, що передбачає приготування накопичувального поживного середовища, заквашування культурою, що містить молочнокислі бактерії виду Lactobacillus acidophilus, сквашування і введення до складу препарату біомаси кефірних грибків, відповідно до винаходу біомасу кефірних грибків попередньо змішують з біомасою «чайного» гриба і пивних дріжджів, отриману суміш піддають автолізу, після чого використовують як накопичувальне поживне середовище, а до складу закваскової культури додатково вводять лактобацили видів Lactobacillus casei, L. plantarum і L. fermentum, а також лактококи, стрептококи, пропіоновокислі та біфідобактерії. При цьому автоліз грибкової біомаси проводять при температурі 40-43°С протягом 3-4 діб, а в складі бактеріального препарату з лактококів використовують штами виду Lactococcus lactis, зі стрептококів Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, з біфідобактерій - Bifidobacterium bifidum, B. longum, В. brevis, В. infantis, В. adolescentis, з пропіоновокислих бактерій -Propiombacterium freudenreichii ssp. shermanii. Пропонований спосіб передбачає використання як поживне накопичувальне середовище автолізата суміші кефірних грибків, строми «чайного» гриба і біомаси пивних дріжджів. Оскільки спектр і кількість біологічно активних речовин, що містяться в кефірних грибках, «чайному» грибі і пивних дріжджах різні, їхня концентрація в суміші значно підвищується. Автолізована змішана грибкова біомаса містить високу концентрацію бактеріальних полісахаридів, протеїнів, глікопептидів, низькомолекулярних фрагментів білка, вільних амінокислот, вітамінів, компонентів клітинних стінок, мінеральних та інших речовин. Ці компоненти є могутнім стимулятором пробіотичної мікрофлори, а також значно розширюють спектр біотерапевтичних активностей самого мультипробіотичного препарату. Режими автолізу, що використовуються, забезпечують повну інактивацію клітин дріжджів при збереженні близько 10% фізіологічно корисних живих клітин лактобацил та оцтовокислих бактерій, що сприяють більш активному накопиченню клітинної біомаси при одержанні бактеріального препарату. Крім того, спосіб передбачає введення до складу бактеріального препарату додаткових видів лактобацил, а також лактококів, стрептококів, пропіоновокислих та біфідобактерій у вигляді міцного симбіозу, що дозволяє розширити спектр пробіотичних активностей препарату. У таблиці 1 приведені окремі властивості бактеріального препарату, одержаного шляхом культивування багатоштамового симбіозу в накопичувальному поживному середовищі, що одержаний запропонованим і відомим способами. Як випливає з даних таблиці, розроблена біотехнологія дозволяє збільшити на порядок і більш концентрацію живих клітин пробіотичних мікроорганізмів, вміст у препараті мікробних полісахаридів і вітамінів. Автоліз грибкових культур проводять при температурі 40-43°С протягом 3-4 діб. Даний режим є найбільш оптимальним. При зниженні температури нижче 40°С автоліз сповільнюється і відбувається руйнування біологічно активних компонентів грибкових культур. Підвищення температури понад 43°С приводить до деградації полісахаридів та інактивації ферментів, що бер уть участь у процесі автолізу. Спосіб здійснюють таким чином. Строми кефірних грибків і «чайного» гриба, звільнені в асептичних умовах від середовища культивування, подрібнюють і змішують у рівних співвідношеннях. Потім до приготовленої суміші додають біомасу пивних дріжджів з розрахунку одержання в готовій суміші 107-108КУО/г клітин пивних дріжджів. Отриманий у такий спосіб грибковий субстрат витримують при температурі 40-43°С протягом 3-4 діб до повного автолізу клітин дріжджів. Готовий автолізат інокулюють 3-5% симбіозу лактобацил, лактококів, стрептококів, пропіоновокислих та біфідобактерій і культивують при температурі 34-37°С протягом 10-12 годин. Винахід пояснюється прикладами. Приклад 1. Кефірні грибки та «чайний» гриб в асептичних умовах звільняють від культурального середовища, подрібнюють і змішують у співвідношенні 1:1. Пивні дріжджі нарощують на молочній сироватці, що містить 5% сахарози, протягом 24год. при температурі 25°С, до концентрації клітин у середовищі 5,0х108КУО/мл. Попередньо отриману суміш подрібнених грибкових тіл змішують у співвідношенні 1:2 з культурою пивних дріжджів. Приготовлену суміш витримують при температурі 40°С протягом 4 діб для повного автолізу дріжджових клітин. У приготовлений грибковий автолізат вносять 3% інокуляту, що містить культури лактобацил, лактококів, стрептококів, пропіоновокислих і біфідобактерій. Для одержання інокулята в 3л стерильного знежиреного молока вносять наступні кількості культур штамів, %: L. acidophilus ВКПМ У-5 863 0,1 L. casei ВКПМ У-3960 0,3 L. plantarum ВКПМ У-5494 0,2 L. fermentum ВКПМ У-5798 0,4 L. lactis ВКПМ У-5387 0,2 S. salivarius ssp. thermophilus ВКПМ 0,2 У-2405 В. bifidum ВКПМ У-5797 0,2 В. longum ВКПМ У-4557 0,4 В. breve в/в 21 0,3 В. infantis bin-47 0,3 В. adolescentis ba-18 0,1 P. freudenreichii ssp. shermami 0,3 ВКПМ У-4545 Інокульоване молоко ретельно перемішують і витримують при температурі 34°С протягом 12год. Приготовлений інокулят вносять у 100л грибкового автолізата. У суміші встановлюють рН7,4 за допомогою 20%го стерильного розчину гідроокису натрію. Культивування проводять при температурі 34°С протягом 12 годин з підтримкою рН накопичувального середовища на рівні 7,0. У готовому препараті міститься 5,5x1010/г живих клітин біфідобактерій, 1,2x1010/г - лактобацил, 2,0х109/г лактококів, 1,2х109/г - стрептококів, 1,1х1011/г - пропіоновокислих бактерій, 3,51 % мікробних полісахаридів. Препарат має високу адгезивну та вітаміносинтезуючу здатність, активно пригнічує ріст широкого спектра патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів (табл.1). Приклад 2. Кефірні грибки та «чайний» гриб в асептичних умовах звільняють від культурального середовища, подрібнюють і змішують у співвідношенні 1:1. Пивні дріжджі нарощують на молочній сироватці, що містить 5% сахарози, протягом 48год. при температурі 27°С, до концентрації клітин у середовищі 7,4х10КУО/мл. Попередньо отриману суміш подрібнених грибкових тіл змішують у співвідношенні 1:1 з культурою пивних дріжджів. Приготовлену суміш витримують при температурі 43°С протягом 3 діб до повного автолізу дріжджових клітин. У приготовлений грибковий автолізат вносять 5% інокулята, що містить культури лактобацил, лактококів, стрептококів, пропіоновокислих та біфідобактерій. Для одержання інокулята віл стерильного знежиреного молока вносять наступні кількості культур штамів, %: L. acidophilus ВКПМ У-5254 0,1 L. acidophilus ВКПМ У-5863 0,1 L. casei ВКПМ У-4542 0,3 L. plantarum ВКПМ У-6496 0,2 L. fermentum ВКПМ У-5798 0,4 L. lactis ВКПМ У-4305 0,2 S. salivarius ssp. thermophilus ВКПМ 0,2 У-3386 В. bifidum ВКПМ У-5799 0,2 В. longum ВКПМ У-4635 0,4 В. breve в/в 34 0,3 B. infantis 18bin 0,3 В. adolescentisba-18 0,1 P. freudenreichii ssp. shermanii 0,3 ВКПМ У-4544 Інокульоване молоко ретельно перемішують і витримують при температурі 36°С протягом 10год. Приготовлений інокулят вносять у 20л грибкового автолізата. У суміші встановлюють рН7,2 за допомогою 20%-го стерильного розчину гідроокису натрію. Культивування проводять при температурі 34°С протягом 10 годин з підтримкою рН накопичувального середовища на рівні 6,8. Готовий бакпрепарат містить в одному грамі 3,7х1010 активних клітин біфідобактерій, 1,0х1010 - лактобацил, 1,8х109 - лактококів, 1,1х109 - стрептококів, 1,3х1011 - пропіоновокислих бактерій, 3,47 % мікробних полісахаридів. Препарат має високу адгезивну, ві таміносинтезуючу та антагоністичну активність (табл.). Використання пропонованого способу дозволяє одержувати бактеріальні препарати з підвищеними пробіотичними активностями, обумовленими значним збільшенням концентрації живих клітин фізіологічно активної мікрофлори і її метаболітів, зокрема полісахаридів, вітамінів, антимікробних компонентів. Таблиця 1 Властивості бактеріального препарату, одержаного з використанням накопичувального середовища, приготовленого на основі автолізата грибкових культур і на основі молока. Показники Концентрація клітин, IgKYO/г: Bifidobacterium Lactobacillus Бакпрепарат на основі Бакпрепарат на основі молока з автолізата грибкових вмістом 16-18% сухи х речовин і 0,6культур (приклади 1,2) 0,8 % цитрату натрію (за прототипом) 9,6±0,32 9,2±0,41 8,5±0,46 8,2±0,33 Lactococcus Streptococcus Propionibacterium Концентрація полісахаридів, % Концентрація вітамінів, мкг/кг: В1 В2 В12 Термін зберігання без зміни властивостей, міс. Індекс адгезивності, % Антагоністична активність (зона інгібування росту тест-к ультур), мм: E. coli 0111 S. aureus 209 P. mirabilis 403 P. vulgaris 52 К. pneumoniae 5055 С. albicans 1b S. sonnei 115 P. aeruginosa 9027 E. cloaceae 16 С. freundii 22 fr S. typhimurium 7st 8,9±0,28 8,4±0,30 10,1±0,50 3,35±0,24 8,0±0,19 7,8±0,18 9,1±0,36 2,07±0,87 1050±48,8 1240±32,6 1110±39,4 3,5±0,5 810±35,6 784±29,9 859±47,0 2,5±0,5 7,8±0,33 5,4±0,21 8,0±0,2 9,2±0,3 6,6±0,1 7,0±0,3 6,5±0,2 6,6±0,3 5,9±0,1 6,7±0,2 7,4±0,3 6,9±0,4 8,0±0,3 5,5±0,5 6,1±0,2 4,8±0,4 4,4±0,3 5,0±0,3 4,7±0,1 4,1±0,4 3,9±0,2 4,7±0,5 4,5±0,2 5,0±0,1