Ізомерна суміш 2-(1-аміноетил) норборнану та її фармацевтично прийнятні солі, що виявляють антивірусну, імуностимулюючу та інгібіруючу ферменти дію

Изобретение относится к органической химии, конкретно к изомерной смеси 2-(1-аминоэтил)норборнана, которая содержит от 10 до 40% экзо-изомера и от 90 до 60% эндо-изомера, ее фармацевтически приемлемым солям общей формулы обладающим антигерпетическим, антигриппозным, иммуностимулирующим, интерфероногенным, противовоспалительным, анальгезирующим действием и ингибирующим тимидинкиназу и ДНК-полимеразу, что предполагает возможность их применения в медицинской практике в качестве лекарственных средств. Заявляемые соединения в литературе не описаны. Известно, что 2-(1-аминоэтил)норборнан описан как соединение, проявляющее антигриппозные свойства (а.с. №563696). Описанное соединение выбрано нами в качестве структурного аналога. Недостатком упомянутого авторского свидетельства является то, что авторы не обнаружили, что при избранном ими способе получения целевой продукт, 2-{1-амино-этил)норборнан, состоит из двух геометрических изомеров: экзо- и эндо-изомера. В связи с этим, не была изучена зависимость уровня антигриппозной активности и токсичности от изомерного состава, не была проведена работа по синтезу такой смеси изомеров, которая обладала бы оптимальной физиологической активностью. Кроме этого, в авторском свидетельстве не описаны фармацевтически приемлемые соли (кроме хлористоводородной соли) и не приведены другие полезные свойства, которые указаны выше, для синтезированного соединения. Авторское свидетельство 686296 защищает способ получения 2-{1-аминоэтил)норборнана, состоящий из меньшего количества стадий, чем приведено в а.с. 563696, однако и в этом источнике ничего не говорится об изомерном составе целевого продукта. В патенте США 3444302 (С 07 С 87/40, А 61 К 27/00, НКИ 424-325, заявлен 16.08.66, опубликован 13.05.69) описано получение 2-эндо- и 2-экзо-(1-аминоэтил)норборнана, проявляющие антигриппозную активность. К недостаткам этого патента относится отсутствие информации о синтезе и свойствах смесей экзо- и эндо-изомеров. Кроме этого, предложенный метод синтеза многостадиен (включает 11 стадий, что требует большой затраты времени на синтез. Задачей изобретения является синтез новых смесей изомеров 2-(1-аминоэтил)норборнана, обладающих широким спектром физиологического, действия, включающего антигерпетическую, антигриппозную, иммуностимулирующую, интерфероногенную, противовоспалительную, анальгетическую активность и ингибирующих тимидинкиназу и ДНК-полимеразу. Поставленная задача достигается синтезом новых соединений, содержащих от 10 до 40% экзо- и от 90 до 60% эндо-изомера общей формулы Исходную смесь экзо- и эндо-изомеров 2-{1-аминоэтил)норборнана получают взаимодействием циклопентадиена с метилвинилкетоном, оксимированием полученного 2-ацетилнорборн-5-ена и гидрированием оксима 2-ацетилнорборн-5-ена. При нейтрализации смеси изомеров 2-(1аминоэтил)норборнана получают соответствующие соли. Получение исходного 2-(1-аминоэтил)норборнана и его фармацевтически приемлемых солей проводят в условиях, которые обеспечивают содержание в продуктах массовой доли экзоизомера от 10 до 40%, а эндоизомера - от 90 до 60%, что обеспечивает оптимальную физиологическую активность. Выход смеси изомеров 2-(1-аминоэтил)норборнана составляет от 48 до 52 %, а его фармацевтически приемлемых солей - от 54 до 85%. Изобретение иллюстрируется следующим образом. Пример 1. Синтез фармацевтически приемлемых солей 1-11. Исходную смесь изомеров 2-(1-амино-этил)норборнана получают по следующей схеме: Взаимодействие циклопентадиена с метил винилкетоном при температуре (10±2)°С приводит к 2ацетилнорборн-5-ену с содержанием экзо-изомера от 30 до 37% и эндо-изомера - от 70 до 63%. Повышение температуры реакции приводит к заметному повышению массовой доли экзо-изомера. К 30,8 г (35,8 мл, 0,44 моль) метилвинил-кетона приливают при размешивании 27,3 г (32,8 мл, 0,42 моль)свежеперегнанного циклопентадиена. После окончания экзотермической реакции выдерживают реакционную смесь 1 ч при температуре от 15 до 20°С и используют без дальнейшей очистки. Выход 2ацетилнорборн-5-ена 58,1 г (96%), содержание основного вещества (87±3)%. К смеси 58,1 г (0,43 моль) 2-ацетилнор-борн-5-ена, 30,8 г (0,45 моль) гидроксиламина солянокислого и 90 мл воды приливают при размешивании 40,9 г (28,2 мл, 0,45 моль) 40% раствора едкого натра. Прибавление ведут с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы была (50±5)°С. Выдерживают еще 3 ч при этой же температуре, отделяют оксим 2-ацетилнорборн-5-ена и используют его без дальнейшей очистки. Содержание оксима составляет 89%. Растворяют 15,1 г оксима 2-ацетилнор-борн-5-ена (0,1 моль) в 150 мл изопропанола, помещают в автоклав, прибавляют 5 г скелетного никеля и гидрируют при размешивании и давлении водорода от 10 до 20 атм и температуре от 80 до 100°С до прекращения поглощения водорода. Охлаждают, отделяют от катализатора, отгоняют растворитель, а остаток перегоняют при остаточном давлении 15-20мм рт.ст., собирая фракцию, кипящую от 30 до 120°С. Нейтрализуют дистиллат 5%-ной хлористоводородной кислотой, экстрагируют углеводородом, отделяют водный слой и упаривают его досуха. Вы ход 9,23 г (52%), содержание экзо-изомера от 31 до 35%, эндо-изомера - от 69 до 65%. После кристаллизации из воды выход 6,3 г (68,5% на исходный амин), температура плавления 275-278°С, содержание экзо-изомера от 21 до 30%, эндо-изомера - от 79 до 70%. При кристаллизации из изопропанола выход 6,5 г (69,1% на исходный амин), температура плавления 275-278°С, содержание экзо-изомера от 25 до 40%, эндо-изомера - от 75 до 60%. Для получения фармацевтически приемлемых солей 2-11 расчетные количества 2-(1 аминоэтил)норборнана (соотношение экзо:эндо 31:69) и соответствующей кислоты растворяют в спирте, кипятят 10 мин, охлаждают льдом и отделяют осадок. Данные о полученных соединениях приведены в таблице 1. Для получения полимерной соли (11) к суспензии 8 г сополимера N-винилпирролидон - акриловая кислота (соотношение звеньев 1:1,67, n=50-300) в 30 мл спирта приливают за 2 ч при размешивании раствор 2 г 2-{1аминоэтил) норборнана в 20 мл спирта. Размешивают 4 ч до образования раствора. Полученный раствор при размешивании за 1 ч приливают к 150 мл ацетона. Фильтруют и промывают осадок на фильтре ацетоном. Выход 7,7 г (77%). ИК-спектр (n, см -1, КВг): 1300(амид III), 1500 (амид II), 1680 (амид I), 1670, 1730 (СО в СООН), 1450, 2930 (СН, СН2), 2770 (N+N3). Найдено, % - N 7,64, 7,62, что соответствует массовой доле 2-(1аминоэтил)норборнана 19,5%. Характеристическая вязкость составляет от 0,14 до 0,33 пуаз, что отвечает молекулярной массе от 15000 до 90000. Пример 2. Антигерпетическая активность соединения 11. Влияние соединения 11 на репродукцию вируса герпеса проводили в перевиваемой культуре клеток Нер2, Тестирование репродукции вируса осуществляли с помощью моноклональных антител к вирусу герпеса и по модифицированному ИФА. Результаты приведены в таблице 2. Как видно из таблицы 2, препарат 11, в состав которого входит 2-(1-аминоэтил)нор-борнан с содержанием изомеров экзо:эндо 31:69 почти полностью угнетает репродукцию вируса герпеса. Изменение этого соотношения уменьшает активность, что более заметно при увеличении доли экзо-изомера. Пример 3. Влияние препаратов 1-11 на репродукцию вируса гриппа. Для определения влияния препаратов на репродукцию вируса гриппа использовали культуру СПЭВ (перевиваемая линия почки свиньи). Тестирование репродукции вируса гриппа осуществляли иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител. Результаты представлены в таблице 3. В результате проведенных исследований было показано, что соединения 1-5,9 и 11 снижают титр вируса гриппа на 3 Ig ID 50, а остальные - на 2 Ig ID 50. Влияние изомерного состава 2-(1-аминоэтил)норборнана на уровень антигриппозной активности исследовано на примере хлористоводородной соли 1. Как и в случае герпеса, оптимальным является соотношение изомеров экзо:эндо 30-40:70-60. Пример 4. Влияние соединений 1 и 11 на первичный иммунный ответ. Изучение гуморального иммунного ответа проведено на белых беспородных мышах. В качестве тимусзависимого антигена служили эритроциты барана (ЭБ). Иммунизацию проводили внутрибрюшинным введением оптимальной дозы ЭБ (108 клеток) в объеме 0,2 мл на 20 г массы животного. Оценку реакции проводили по титрам циркулирующи х антител (гемолизины и гемагглютинины) на 7 сутки после иммунизации на микропанелях по стандартным методам. Наряду с этим, у животных регистрировали массу тела, селезенки и тимуса. Весь цифровой материал подвергали статистической обработке. Данные приведены в таблице 5. В таблице 6 приведены данные, касающиеся формирования первичного иммунного ответа при введении белым крысам бактериального антигена (гретой брюшнотифозной вакцины) с последующим введением соединений 1 и 11. Как видно из приведенных в таблицах 5 и 6 данных, соединения 1 и 11 оказывают выраженное стимулирующее действие на процесс выработки антител. Иммуностимулирующее действие соединения 1 в зависимости от изомерного состава было изучено на белых крысах при иммунизации гретой брюшнотифозной вакциной с последующим введением исследуемой смеси по 30 мг/кг один раз в день в течение 7 дней. Данные представлены в таблице 7. Как видно из таблицы 7, определенное усиление стимулирующего влияния на процесс выработки антител наблюдается при соотношении изомеров экзо:эндо 60:40 -20:80. Увеличение массовой доли как экзо, так и эндо-изомера отрицательно сказывается на иммуностимулирующем действии. Пример 5. Интерферониндуцирующее действие соединений 1 и 11. Исследуемые соединения в дозе 200 мкг/мл добавляют к 1 млн лейкоцитов доноров и культивируют при 37°С в течение 24 ч. Затем сливают надосадочную жидкость, доводят величину рН до 2,0 и оставляют на 4872 ч при температуре 4°С. Уровень интерферона в культуральной среде определяют по общепринятой методике подавления ЦПД вируса везикулярного стоматита в культуре перевиваемых клеток Л41 (лимфоидные клетки человека). Результаты представлены в таблице 8. Изменения изомерного состава соединения 1 не влияют на интерферониндуцирующие свойства. Пример 6. Противовоспалительная и анальгезирующая активность соединений 1 и 11. Противовоспалительная активность соединений 1 и 11 изучалась на модели каррагенинового отека. Анальгезирующая активность определялась по способности соединений повышать порог болевой чувствительности в тесте "горячей пластинки" Данные приведены в таблице 9. Как видна из таблицы 9, исследованные соединения умеренно тормозят развитие каррагенинового отека и заметно повышают порог болевой чувствительности у мышей в тесте "горячей пластинки". Изомерный состав соединения 1 практически не влияет на уровень ингибиции отека, но существенно воздействует уровень анальгезирующей активности (таблица 10). Как видно из таблицы, анальгезирующая активность экзо-изомера выше, чем эндо-изомера. По мере возрастания массовой доли эндо-изомера активность уменьшается и практически не изменяется при переходе от смеси состава экзо:эндо 40:60 к эндо-изомеру. Судя по клинической картине, анальгезирующая активность соединений 1 и 11 в тесте "горячей пластинки" может быть результатом психотропного действия, а не специфического влияния на процессы ноцицепции. Следовательно, снижение анальгезирующей активности по мере снижения содержания в смеси экзо-изомера можно отнести к положительному качеству. Пример 7. Ингибиция тимидинкиназной активности соединениями 1 и 11. Тимидинкиназную активность определяли по модифицированному методу. В состав реакционной смеси входили 2-14С-тимидин, АТФ, МgСІ2, дитиэтрептол, трис-НСІ и ферментный препарат тимидин-киназа или лизат клеток, зараженных вирусом герпеса. Величина рН составляла 3,0. Инкубировали при 37°С и каждый образец помещали на разделяющий ДЕАЕ-фильтр. Один из фильтров подвергали дважды этанольной экстракции, а второй оставляли необработанным. Фильтры высушивали и тестировали на сцинцилляционном счетчике Beckman LS-B000. Соединение 1 в дозе 40 мкг/мл ингибирует тимидинкиназу на 84-88%, а соединение 11 в той же дозе - на 90-93%. Тимидин-киназная активность соединения 1 не зависит от изомерного состава. Пример 8. Соединения 1 и 11 как ингибиторы ДНК-полимеразы. Тестирование на ДНК-полимеразную активность проводили в системе, содержащей в качестве субстратов дезокситрифосфатнуклеотиды (dAΤΦ, dСТФ, dГΤΦ, dΤΓ Φ), один из которых (ТГФ) включал меченный тритием тимидин. В качестве затравки синтеза нуклеиновой кислоты использовали матрицу активированную ДНК тимуса теленка. Ферментным препаратом служили ДНК-полимераза E.coli и синезеленых водорослей. Указанная смесь служила контролем, а в опытные образцы вносили предполагаемые ингибиторы нуклеинового синтеза. Выдерживали 45 мин при 40°С помещали на мембранные фильтры GF/C, промывали на фильтре смесью пирофосфата с водой, трижды спиртом, сушили при 50°С в течение 30 мин, а затем помещали в сцинтиллятор Ж-8 и измеряли в системе Beckman LS-7800. Данные в таблице 11. Как видно из данных таблицы 11, соединение 11 является активным ингибитором ДНК-полимеразы. Ингибирующая активность соединения 1 не изменяется при изменении изомерного состава. Пример. Острая токсичность соединения 1-11. Остр ую токсичность веществ исследовали при однократном внутрижелудочном введении соединений белым беспородным мышам. Наблюдение за животными (общее состояние, динамика массы тела, гибель) осуществляли в течение 21 дня. Данные приведены в таблице 12. Как видно из таблицы 12, токсичность соединения 1 заметно зависит от изомерного состава и достигает минимума при соотношении изомеров экзо:эндо 30-40:70:60.