Нова фармацевтична композиція, застосовна для вакцин

1. Фармацевтична композиція, яка містить щонайменше суміш щонайменше одного масла, щонайменше однієї поверхнево-активної речовини і водної фази, що сама по собі містить щонайменше одну активну речовину, де вказана фармацевтична композиція знаходиться не у формі емульсії, а у формі масляного ізотропу. 2. Композиція за п. 1, в якій в'язкість є прийнятною для введення шляхом ін'єкції. 3. Композиція за будь-яким з пп. 1, 2, в якій активна речовина являє собою біологічну активну речовину, зокрема живий, ослаблений або інактивований антиген. 4. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, яка являє собою вакцину. 5. Композиція за п. 4, в якій активна речовина являє собою антиген. 6. Композиція за п. 5, в якій антиген є вірусного, бактеріального, паразитарного або пухлинного походження. 7. Композиція за будь-яким з пп. 5 або 6, в якій антиген є природнім або рекомбінантним. 8. Композиція за будь-яким з пп. 5-7, в якій антиген складається з мікроорганізму, необов'язково інактивованого, якщо прийнятно, або частинок вказаного мікроорганізму. 9. Композиція за будь-яким з пп. 1-8, в якій вміст масла складає від 10 % до 90 % (мас.) по відношенню до маси всієї композиції. 10. Композиція за будь-яким з пп. 1-9, в якій вміст масла складає від 40 % до 75 % (мас.) по відношенню до маси всієї композиції. 2 (19) 1 3 91203 4 24. Композиція за п. 23, в якій поверхнево-активна вище додаткові речовини, якщо прийнятно, і суміш речовина являє собою неіонну поверхневонагрівають при температурі від 30 до 60 °С; активну речовину. - під час другої стадії, яка може бути проведена 25. Композиція за п. 24, в якій поверхнево-активну одночасно з першою, поверхнево-активну(і) речоречовину вибирають з полісорбатів, ефірів сорбіту, вину(и) змішують з маслом і суміш нагрівають при зокрема ефірів сорбіту і жирних кислот, поліоксіетемпературі від 30 до 60 °С; тиленових похідних касторової олії, поліоксіетиле- під час третьої стадії водну фазу вміщують в манових похідних стеаринової кислоти, співполімерів сляну фазу, використовуючи гомогенізатор; і етиленоксиду і пропіленоксиду або полоксамерів, - під час кінцевої стадії одержаний масляний ізотефірів сахарози і жирних кислот, ефірів гліколю і роп охолоджують до температури навколишнього жирних кислот, моно, ді-, триефірів жирних кислот середовища і стерилізують. 29. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що і гліцерину, ефірів поліетилен-гліколей і жирних кислот та ефірів сахарози і жирних кислот. температура нагрівання на початковій і/або другій 26. Композиція за будь-яким з пп. 1-25, в якій застадії знаходиться у межах від 35 до 45 °С. стосовують суміш поверхнево-активних речовин. 30. Застосування масляного ізотропу для одер27. Композиція за будь-яким з пп. 1-26, в якій її жання лікарського засобу. в'язкість при температурі навколишнього середо31. Застосування за п. 30, в якому лікарський засіб вища складає від 5 до 150 мПа·с і переважно від 5 є вакциною. до 100 мПа·с. 32. Застосування за п. 30, в якому лікарський засіб 28. Спосіб одержання композиції за будь-яким з містить антиген як активний інгредієнт. пп. 1-27, який відрізняється тим, що: 33. Застосування за п. 30, в якому лікарській засіб - під час початкової стадії антиген розчиняють або є фармацевтичною композицією за будь-яким з пп. диспергують у водній фазі, в яку включені описані 1-27. Даний винахід стосується галузі фармацевтичних композицій, зокрема галузі вакцин. Більш точно, винахід стосується фармацевтичної композиції, застосовної як вакцина (або вакцинна композиція). Винахід також стосується способу одержання вказаної вакцинної композицій за винаходом. В галузі вакцин, є добре відомим, що ефективність вакцинної композиції досягається по суті завдяки суміші антигену, який використовують з допоміжною речовиною. Допоміжні речовини для вакцин використовували протягом багатьох років і визначали як композиції, які, при поєднанні з антигеном, продукують імунну відповідь більшу, ніж відповідь одного антигену. Імуногенна потужність вакцини без допоміжної речовини є слабкою, як правило, особливо тоді, коли залучений інактивований вірус або коли антиген являє собою просто пептид або протеїн і сам по собі не індукує захисну реакцію. Проводили широкі дослідження для того, щоб одержати задовільні допоміжні речовини, які, в ідеальному випадку, повинні володіти наступними властивостями: - вони індукують значну імунну відповідь, особливо при мінімальній дозі антигену; - вони індукують імунну відповідь змішаного типу (гуморальну і клітинну) для того, щоб сприяти і встановити анамнестичну реакцію; - вони відмінно переносяться і є нетоксичними; - вони, за можливості, складаються з ексципієнтів, які звичайно використовують у фармацевтичній галузі, більш конкретно, тих з лікарських засобів, які ін'єктуються; - їх легко вводити, за допомогою шприца, наприклад, і, якщо можливо, завантажувати безпосередньо в готові до застосування шприци; - їх легко поєднувати з різними антигенами, для того, щоб дозволити стандартизацію виробництва різних вакцин; - їх легко виготовляти у промисловому масштабі, використовуючи технологію виготовлення, якою легко оволодіти. З попереднього рівня техніки відома множина допоміжних речовин різних типів і походження. Галун (алюмінію фосфат і гідроксид) являє собою допоміжну речовину, застосування якої є дуже поширеним у людських і ветеринарних вакцинах. Є відомими і використовуваними для дослідження інші допоміжні речовини, такі як ад'ювант Фрейнда, який складається з суміші мінерального масла і ослабленої мікобактерії. Ця допоміжна речовина є надзвичайно ефективною і продукує виразні імунні відповіді. Слабка переносимість, однак, обмежує її застосування в дослідженні на лабораторних тваринах. Композиції допоміжних речовин для вакцин розкрито у різних патентах. Патент США №4788056 розкриває комбіновану вакцину проти герпесу і Е. соlі, призначену для вакцинації домашньої худоби. Цей патент згадує різні можливі допоміжні речовини, включаючи емульсії масло у воді або емульсії вода у маслі, які основуються на конкретних маслах, таких як Miglyol (середньоланцюгові тригліцериди), або поверхнево-активних речовинах, таких як полісорбат, однак, без вказування на будь-яке точну формулу допоміжної речовини. Залучені, однак, звичайні емульсії, в яких дисперсна фаза існує у формі крапель. До того ж, не дається вказівка у відношенні впливу допоміжної речовини на імуногенну потужність вакцини. Патент США №5688761 описує склад мікроемульсії "масло у воді", яка перетворюється в масло у водній системі шляхом додавання рідини на водній основі, що закінчується вивільненням протеїну, який міститься у водній фазі. Перевага мікроемульсій полягає у їх спонтанному утворенні і їх фізичній стабільності. Масла, які використовують ці співавтори, являють собою масла, що добре 5 91203 6 переносяться при введенні ін'єктуванням, такі як антигену, в той же час зберігаючи задовільну імунсередньоланцюгові моно- і тригліцериди. їх емульну відповідь. гують водною фазою за допомогою застосування Особливо бажаним є мати такі композиції, які звичайних поверхнево-активних речовин, відомих доступні, коли антиген є таким, що дорого коштує, кваліфікованим фахівцям в даній галузі, таких як або його важко виробити у великій достатній кільефіри сорбіту або полісорбати. їх розбавлення кості або, коли залучені простий пептид або антибіологічними рідинами протягом їх ін'єктування гени, які одержують за допомогою синтезу або приводить до зміни фаз і, таким чином, до вивільрекомбінації. нення біологічного агента, включеного у водну Несподіваним і непередбачуваним чином, вифазу. Конкретні приклади складів показують збінахідники в даний момент відкрили, що фармацельшення активності біологічних агентів, включених втична композиція у формі масляного ізотропу, що в описаний склад. Однак, приклади, які забезпескладається щонайменше з потрійної суміші вочуються, не стосуються галузі вакцин. да/поверхнево-активна(і) речовина(и)/водна фаза, Патент США №5744137 описує застосування згадана водна фаза містить антигенну речовину, немінеральних масел у вакцинах, в доповнення до була здатна мати значно більшу імуногенну потувакцин у формі емульсій "вода в маслі", які містять жність, ніж потрійна композиція з попереднього суміш щонайменше двох поверхнево-активних рівня техніки у формі емульсії, у неізотропній форечовин, які вибирають з етоксильованої касторормі. До того ж, композиція в ізотропній формі може вої олії, пропіленгліколь лаурату, пропіленгліколь мати в'язкість, придатну для введення шляхом каприлату та ізостерил дигліцерил сукцинату. Виін'єкції. брані масла являють собою олії або тваринного Термін "ізотроп" використовуватиметься надаабо рослинного походження для того, щоб обмелі, щоб позначити масляний ізотроп відповідно до жити, настільки, наскільки можливо, реакцію ткаданого винаходу, тобто потрійну суміш маснини, пов'язану із введенням мінеральних масел, ла/поверхнево-активної(их) речовин(и)/водної фаякі погано переносяться. зи відповідно до даного винаходу. Також, "ізотроп, Патент США №5961960 описує допоміжну реякий містить антигенну речовину", означатиме човину для вакцини, присутню у формі субмікроекомпозицію відповідно до даного винаходу, в якій мульсії "масло у воді", яка містить емульгатор антигенна речовина включена у водну фазу мас(включений фосфоліпід), неіонну поверхневоляного ізотропу відповідно до даного винаходу. активну речовину і масло. Висока вартість фосфоМасляний ізотроп означає суміш масла, води і ліпідів, однак, обмежує застосування цього винаповерхнево-активних речовин, пропорції яких реходу. гулюються таким чином, щоб одержаний препарат Заявка США на видачу патенту 2003011977 був прозорим, чистим і мав низький рівень в'язкосописує композицію, яка складається з двофазних ті. Таким чином ця композиція може бути введена ліпідних пухирців, що дозволяє покращити імунну шляхом ін'єкції. Цей тип композиції відповідає розвідповідь, індуковану антигеном. чиненню води в маслі, або більш конкретно води в Заявка США на видачу патенту 20030175309 міцелі, безпосередньо будучи в маслі (масляний описує і допоміжну речовину, яка містить лецитин, ізотроп). масло і амфіфільну поверхнево-активну речовину, Дійсно, в процесі формування ізотропу утвоздатну до утворення вакцини у формі стійкої емурюються молекулярні агрегати поверхневольсії "масло у воді", яка робить можливим мініміактивної речовини, відомі як міцели, в яких активзувати місцеві реакції у тварини, якій її ін'єктують. на речовина включена більш менш глибоко. Міжнародна заявка WO 99/61003 описує сисІзотропи є добре відомими і всю необхідну інтему доставки активних речовин, які містять запас формацію можна знайти серед іншого у Galenica, лікарського засобу у дуже компактній твердій фо1983, Vol. 5, chapter 5, page 195-219. Зокрема, ця рмі з ізотропною структурою у твердому стані. Ця робота представляє потрійні діаграми восистема є придатною для доставки активних речода/масло/поверхнево-активна речовина, напривин шляхом інгаляції. Активна речовина надходить клад діаграма вода/масло парафіну/Брідж-96 на у формі ліпосом, ліпосом, які згодом ущільнюютьсторінці 203, що дозволяє визначити відповідні ся для того, щоб утворити описану тверду систему концентрації цих сполук, для яких одержують ізотдоставки. ропну систему. Європейська заявка на видачу патенту Більш конкретно, композиція в ізотропній фо0398287 описує фармацевтичну композицію у формі являє собою безперервну трьохвимірну струкрмі ізотропного розчину, який складається з однієї туру, також відому як однофазна структура. або декількох активних речовин і середовища, яке Емульсії для їх частини утворюються з систезатверджується при температурі між 20°С і 80°С ми двох рідин, які не змішуються, одна з яких є (особливо при температурі навколишнього серетонко подрібненою на краплі або пухирці, в іншій. довища) і є розчинним у воді. Дисперсна фаза відома як внутрішня або перериФакт залишається фактом - в галузі вакцин вчаста фаза і дисперсійна фаза відома як зовнішпостійно існує потреба у нових допоміжних речоня або безперервна фаза. Емульсія являє собою, винах, які володіють властивостями, перераховатаким чином, дисперсію рідина-рідина, яка має ними вище. Зокрема, залишається потреба забездвофазну структуру. печити допоміжні речовини, які дозволяють значно Композиція в ізотропній формі відрізняється збільшити імуногенну потужність антигену. Перевід емульсії відсутністю організації типу пухирців і вага таких допоміжних речовин полягає, фактично, наявністю міцел. в тому, що вони дозволяють введення низьких доз 7 91203 8 "Організація типу пухирців" являє собою, в або пептиди, полінуклеотиди, або синтетичні або контексті даного винаходу, структуру, яка являє продуковані тенетною інженерією, зокрема), або собою стінку, що містить або складається з комподійсно оснований на розчинних у воді або тих, що нентів типу поверхнево-активних речовин, вказана диспергуються у воді, антигенах. стінка включає масу, що містить або складається з Переважно, антигенна фаза, яка складається з гідрофільної внутрішньої фази, коли зовнішня фамолекул, що виділяються вказаним мікроорганізза є гідрофобною, і навпаки. мом, використовуватиметься відповідно до даного Результати, представлені нижче і одержані на винаходу, або компоненти бактеріальної стінки лабораторних тваринах протягом випробувань з або компоненти цитоплазми. ізотропом, який містить антигенну речовину відпоКількість активної речовини і/або антигену в відно до даного винаходу, показали, що можливо композиції відповідно до даного винаходу являє досягти з таким ізотропом надзвичайно значного собою функцію бажаного ефекту і самої природи збільшення імуногенної активності антигену у поактивної речовини або антигену, який використорівнянні з імуногенною активністю, якої досягають вується. Кваліфікований в даній галузі фахівець з антигеном в поєднанні зі звичайною допоміжною зможе випробувати останнє як функцію активної речовиною. речовини або антигену, що використовується. До того ж, ці випробування показали, що ізотКількісне співвідношення кожної зі складових роп перевершив препарати, які складаються зі ізотропу регулюється так, щоб ціле утворювало звичайної води в масляних емульсіях. масляний ізотроп. Винахід, таким чином, є результатом цього віБільш конкретно, концентрація поверхневодкриття. активної речовини може бути більшою, ніж критичПерший об'єкт винаходу, таким чином, являє на концентрація міцел (CMC). При концентрації, собою фармацевтичну композицію, яка містить нижчій ніж CMC, значна частина поверхневощонайменше суміш щонайменше одного масла, активної речовини знаходиться у мономерній фощонайменше однієї поверхнево-активної речовини рмі; з іншого боку, при концентрації вище CMC, є і водної фази, що сама по собі містить щонайменвідчутна наявність міцел. ше одну активну речовину, де вказана фармацевЗначення CMC може бути визначене різними тична композиція знаходиться у формі масляного методами, наприклад кондуктометрією або спектізотропу. Ця композиція знаходиться в ізотропній рофотометрією, зокрема як описано у Dominguez формі і, таким чином, не є у формі емульсії. et al., "Journal of Chemical Education", 1997, 1227Зокрема, композиція має в'язкість, придатну 1231. Взагалі, CMC відповідає раптовій зміні у для введення шляхом ін'єкції. правилах коливань параметра, який вимірюється, Відповідно до даного винаходу, активна речонаприклад, електропровідності або поглинання. вина може бути будь-якого типу біологічної активТаким чином, композиції відповідно до даного ної речовини, такої як живий, ослаблений або інаквинаходу можуть включати вміст поверхневотивований антиген. Живий антиген означає: активної речовини, більший ніж або такий, що добактерію або вірус, ослаблений емпірично або рівнює, критичній концентрації міцел. Ця критична генетично, протеїновий (або глікоконцентрація міцел залежить від декількох параліпопротеїновий) антиген, який виражається in vivo метрів, включаючи природу компонентів, присутніх вектором (рекомбінантна бактерія або вірус). Інаку композиції, і їх вміст. тивований антиген означає бактерію або вірус, Таким чином, композиція відповідно до даного інактивований або фізичними способами або хімівинаходу буде містити щонайменше високу концечними способами або бактеріальним або вірусним нтрацію поверхнево-активної речовини і невелику екстрактом, або протеїн, поліпептид або пептид, кількість води. який одержують генетичною рекомбінацією або Відповідно до даного винаходу, композиція хімічним синтезом, або щонайменше in vivo генеможе містити від 10% до 90% масла, переважно ратор сполук, які містять послідовність амінокисвід 40% до 75% за вагою, по відношенню до ваги лот. всієї композиції. В особливості, біологічно активна речовина Знову відповідно до даного винаходу, кількість може бути інертною. води в композиції буде складати від 0,5% до 20%, Відповідно до окремого втілення винаходу, переважно від 3% до 9% за вагою, по відношенню фармацевтична композиція являє собою вакцину. до ваги всієї композиції. У цій формі активна речовина являє собою антиНарешті, відповідно до даного винаходу, кільген в даному випадку. Згаданий антиген може бути кість поверхнево-активної речовини в композиції будь-якого походження і у будь-якій формі, яка може складати від 1% до 60%, переважно від 16% звичайно використовується в галузі вакцинації. до 45% за вагою, по відношенню до ваги всієї комАнтиген може, наприклад, бути вірусного, бактеріпозиції. ального, паразитарного або навіть пухлинного Відповідно до даного винаходу, співвідношенпоходження. ня кількості води до кількості масла не повинно Антиген може бути природнім або рекомбінанбути менше ніж 1 (кількість масла дорівнює кількотним. сті води) і переважно не повинно бути менше ніж 5 Він може складатись з мікроорганізму (вірус, (кількість масла щонайменше в 5 разів більше, ніж бактерія або паразити), ослабленого або інактивокількість води). ваного, якщо прийнятно, або частинок, особливо Відповідно до даного винаходу в композиції безклітинних частинок, згаданого мікроорганізму можуть бути використані багато які з масел. Од(очищені антигени, нативні білки або глікопротеїни нак, вказане масло повинно бути сумісним з фар 9 91203 10 мацевтичним застосуванням, зокрема введенням речовину(и) відповідно до композиції суміші, яку шляхом ін'єкції парентеральним шляхом. він бажає виробити. Масло може бути вибране з: Відповідно до даного винаходу, водна фаза - мінеральних масел, таких як і без обмеженможе містити, в доповнення до розчинного у воді ня, парафінове масло, вазелінове масло, або того, що диспергується у воді, антигену і води, - немінеральних масел, таких як риб'ячий жир, інші речовини, такі як солі, призначені, щоб ускласинтетичні ліпіди, рослинні олії (такі як, без обмеднити антиген для затримання його вивільнення і, ження, соєва олія, оливкова олія, кукурудзяна таким чином, збільшити тривалість його дії. Можна олія, арахісова олія, бавовняна олія, соняшникова згадати алюмосилікат або фосфат кальцію як приолія, кунжутна олія, касторова олія і мигдалева клади цього типу солей. олія), середньо- і довголанцюгові тригліцериди Водна фаза може також необов'язково містити (такі як тригліцериди каприлової/капринової кислонеспецифічні імуногенні речовини, відомі фахівцю, ти, такі як ті, що продаються компанією такі як ліпополісахариди, або цитозан. Також, вона Stearineries Dubois, або ті, які продаються під наможе містити полімери, неіонні полімери (такі як полоксамер, наприклад), синтетичну глину (таку як йменуваннями Miglyol 810 , 812 і 818 компанією Dynamit Nobel), терпенові масла, такі як скваLaponite , Chimilab Essor, наприклад), цитокіни, лан і сквален і або антиоксиданти, такі як вітамін Е, визнані за їх - їх сумішей. імуностимулюючу потужність. Відповідно до даного винаходу, переважно виВідповідно до даного винаходу, композиція користовувати таке масло, як сквален або перемає в'язкість від 5 до 150 мПа.с і переважно від 5 важно масло з сімейства тригліцеридів, і дуже педо 100 мПа.с. реважно - середньоланцюгові тригліцериди типу В'язкість композиції вимірюється при темпераMygliol 810. турі навколишнього середовища, переважно при Відповідно до даного винаходу, можливо ви25°С, використовуючи віскозиметр типу роторкористовувати суміш масел. статор, такий як віскозиметр марки Rheo, позначеПоверхнево-активні речовини, придатні для ний HAAK-VT500, відповідно до інструкцій виробзастосування відповідно до даного винаходу, моника. жуть бути аніонними, катіонними, неіонними або Композиція відповідно до даного винаходу амфотерними. може бути одержана будь-яким діючим способом, Переважним класом, завдяки своїй високій відомим фахівцю в даній галузі техніки. Наприбезпечності, зокрема під час ін'єкції, є неіонні поклад, композиція відповідно до даного винаходу верхнево-активні речовини. Переважно серед може бути одержана відповідно до наступного останніх, всі ті, які придатні для застосування діючого способу: шляхом ін'єкції, можуть бути використані окремо - під час початкової стадії антиген розчиняють або в суміші. Як приклад можна згадати і не маючи або диспергують у водній фазі, в яку необов'язкона увазі будь-якого обмеження полісорбати, ефіри во включені описані вище додаткові речовини, і сорбіту, зокрема ефіри сорбіту і жирних кислот, суміш нагрівають, на водній бані, наприклад, при поліоксіетиленові похідні касторової олії, поліоксітемпературі від 30 до 60°С, переважно від 35 до етиленові похідні стеаринової кислоти, співполі45°С; мери етиленоксиду і пропіленоксиду або полокса- під час другої стадії, яка може бути супутмери, ефіри сахарози і жирних кислот, ефіри ньою, поверхнево-активну(і) речовину(и) змішують гліколю і жирних кислот, моно, ді-, три ефіри жирз маслом і суміш нагрівають, на водній бані, наних кислот і гліцерину, ефіри поліетилен гліколей і приклад, при температурі від 30 до 60°С, переважирних кислот та ефіри сахарози і жирних кислот. жно від 35 до 45°С; Переважно відповідно до даного винаходу ви- під час третьої стадії водну фазу вміщують в користовують полісорбати і ефіри сорбіту, зокрема масляну фазу, використовуючи гомогенізатор (таефіри сорбіту і жирних кислот. кий як гомогенізатор Rayneri 33300). Ці прилади Відповідно до даного винаходу, можливо вишироко використовують, зокрема при одержанні користовувати суміш двох або більше поверхневоемульсій, і фахівець в даній галузі техніки, таким активних речовин. Ці поверхнево-активні речовини чином, не матиме будь-яких ускладнень при приможуть мати однаковий або різний HLB (гідрофіготуванні суміші відповідно до даного винаходу; і льно-ліпофільний баланс, який являє собою хара- під час кінцевої стадії одержаний масляний ктеристику поверхнево-активних речовин, пов'язаізотроп охолоджують до температури навколишну зі структурою їх молекули). нього середовища і стерилізують. Для застосуванПереважно, поверхнево-активні речовини маня в цій методиці придатні різні способи, описані в тимуть різний HLB для того, щоб наблизитись до літературі, такі як стерилізація теплом, іонізуючим критичного HLB масляної фази, яка використовувипромінюванням або фільтруванням, наприклад. ється. Критичний HLB являє собою функцію конПереважним способом є стерилізація фільтруванцентрації емульгаторів і хімічної природи поверхням. нево-активних речовин. Відповідно до іншого способу реалізації, також Особа, кваліфікована в даній галузі техніки, не можливо використовувати вихідні матеріали, які є матиме труднощів у знаходженні в "Handbook of самі по собі стерильними, і проводити все виробexcipients", (Raymond С. Rowe, Paul J. Sheskey, ництво у чистій кімнаті, для того, щоб уникнути Paul J. Weller- 4th Edition, 2003) наприклад, HLB необхідності застосовувати заключну операцію поверхнево-активних речовин і, таким чином, змостерилізації. же вибрати прийнятну(і) поверхнево-активну(і) 11 91203 12 Наступні приклади надані як ілюстрація винаВодну фазу додають краплями до масляної ходу і не обмежують його жодним чином. Можливі фази, гомогенізуючи турбінним змішувачем й інші втілення, застосовуючи ідентичний спосіб (Rayneri 33300) зі швидкістю обертання 500 об./хв. реалізації. Протягом змішування обидві хімічні склянки Приклад 1: композиція антигенної фази підтримують при 40°С. У трьох прикладах, викладених нижче, викориЯк тільки одержують суміш, її вилучають з востовують однакову водну фазу, яка містить антидної бані і дають їй охолонути при температурі ген. Вона включає безклітинну антигенну фазу, яка навколишнього середовища. складається з антигенів, які виділяються з культуЦільовий титр протеїну MRP готового продукту ри бактеріального штаму Streptococcus suis. Ця складає 1,6. Цільовий титр являє собою титр відбактерія відповідальна за суворий і надзвичайно носно посилального антигену, який має теоретичшироко поширений розлад у поросят. ний і випадковий титр 1. (1,6 означає, що вакцина Інфекція характеризується нервовими розламає титр в 1,6 разів більший, ніж посилання, яке дами (відсутність моторної координації, тремтіння і використовується). конвульсії) і пов'язаними розладами. Також повіПриклад 3: композиція 2 домлялось про випадки зараження крові, в доповОдержують наступну композицію. Кількості нення до ураження легень. Можлива передача представлені в грамах: людині (робітники бойні, ветеринари). Використовують тільки безклітинний супернаПергідросквален 73,0 тант культури. Залучають суміш протеїнів, один з Сорбітану олеат (Span 80) 8,4 яких використовують як маркер активності: MRP Етоксильованого сорбітану олеат (Tween 9,6 (протеїн вивільнений з Мурамідази), титр якого 80) може бути визначений за допомогою ELISA (тверАнтигенна водна фаза (одержано у прик9,0 дофазний імуноферментний аналіз). Анти-MRP ладі 1) моноклональне антитіло фіксують в ямках мікротитрувального планшету. Після фази насичення, Спосіб одержання суміші є таким же, як і опияка дає можливість уникнути неспецифічної адсосаний у прикладі 2. рбції, вакцину (яка містить антиген, який досліЦільовий титр протеїну MRP готового продукту джують) розбавляють і перемішують в кожну ямку. складає 1,6. Після промивання, додають моноклональне антиПриклад 4: композиція 3 тіло, направлене проти протеїну MRP і приєднане Одержують наступну композицію. Кількості до ензиму. Реакція з субстратом/хромогеном енпредставлені в грамах: зиму робить можливим одержання кольорової реакції, яку вимірюють, використовуючи зчитуваль51,50 Тригліцериди (Miglyol 810 ) ний планшет. Інтенсивність забарвлювання прямо 25,05 Полісорбат 80 (Tween 80 ) пропорційна кількості антигену у вакцині. 14,95 Сорбітану олеат (Span 80 ) Як тільки титр цього первинного розчину був Антигенна водна фаза (одержано у прикодержаний, кваліфікований в даній галузі фахівець 8,50 ладі 1) не матиме ускладнень у регулюванні розбавленням (виключно концентруванням) титру розчину, Miglyol 810 , Tween 80 і Span 80 переміякий він використовуватиме в одержанні вакцин. шують у хімічній склянці. Цю суміш стерилізують Відповідно до даного винаходу, аліквоту перза допомогою нагрівання при 120°С протягом 30 винного розчину, що містить бажану кількість антихвилин і потім дають охолонути при температурі генів, розбавляють до необхідної і достатньої кільнавколишнього середовища. кості буфера, який звичайно використовують в Водну фазу, яка містить антиген, стерилізують галузі вакцин, такого як фосфатний буфер, наприфільтруванням над синтетичною мембраною з клад. пористістю 0,22 мкм. Масляну фазу, яку одержуПриклад 2: композиція 1 ють вище, нагрівають паралельно і окремо і водну Наступна таблиця представляє композицію віфазу одержують відповідно до прикладу 1 у водній дповідно до даного винаходу, яку одержують. Кібані при 40°С. лькості представлені в грамах. Як тільки 2 фази мають однакову температуру, водну фазу додають краплями до масляної фази, 51,50 Тригліцериди (Miglyol 810 ) гомогенізуючи турбінним змішувачем (Rayneri 14,95 Полісорбат 80 (Tween 80 ) 33300) зі швидкістю обертання 500 об./хв. 25,05 Сорбітану олеат (Span 80 ) Протягом змішування обидві хімічні склянки Антигеннаводна фаза (одержано у прик8,50 підтримують при температурі навколишнього селаді 1) редовища. Як тільки одержують суміш, її вилучають з воMiglyol 810 , Tween 80 і Span 80 перемішудної бані і дають їй охолонути при температурі ють у хімічній склянці. Масляну фазу, яку одержунавколишнього середовища. ють, нагрівають на водній бані при 40°С. Цільовий титр протеїну MRP готового продукту Паралельно і окремо, також нагрівають водну складає 1,6. фазу на водній бані при 40°С. Приклад 5: порівняння імуногенної активності композиції відповідно до даного винаходу з імуно 13 91203 14 генною активністю складів відповідно до попередІншу допоміжну речовину, Montanide ISA 763 нього рівня техніки VG, яка продається компанією SEPPIC (Париж, Активність композиції 1 прикладу 2 порівнюють Франція), готову для використання, використовуз активністю інших композицій попереднього рівня ють в цьому третьому посилальному складі. Кільтехніки, які містять допоміжну речовину або допокості представлені в грамах. міжні речовини, які описані в літературі і відомі кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцю. Водна фаза, яка містить антиген (прик30,00 Таким чином, 4 інші склади (контролі) одержулад 1) ють відповідно до наступних композицій і діючих Montanide ISA 763 VG 70,00 способів: Контрольний склад 1: звичайна емульсія типу Водну фазу, яку одержують у прикладі 1, філь"масло у воді": трують над 0,22 мкм поліамідним фільтром і доДля цієї емульсії використовують однакові екпоміжну речовину - над ПТФЕ фільтром з пористісципієнти, які описують для масляного ізотропу у стю 0,22 мкм, все асептично збирають. прикладі 2, у різних пропорціях для того, щоб одеДопоміжну речовину переміщують в хімічну ржати дуже тонкодисперсну емульсію, для критичсклянку, перемішуючи при швидкості обертання ного рівня HLB 11. Кількості представлені в гра800 об./хв., використовуючи гомогенізатор Rayneri мах. T33300. Антигенну водну фазу включають в єдиний Середньоланцюгові тригліцериди (Miglyol процес, перемішуючи при швидкості обертання 20,0 810 ) 1200 об./хв., який підтримують протягом 30 хвилин. 9,4 Полісорбат 80 (Tween 80 ) Контрольний склад 4: комерційна допоміжна 5,6 Сорбітану олеат (Span 80 ) речовина типу "вода в маслі" (Montanide ISA 563 Антигенна водна фаза (одержано у прик65,0 VG, SEPPIC) ладі 1) Іншу допоміжну речовину, Montanide ISA 563 VG, яка продається компанією SEPPIC (Париж, Спосіб, який використовують, являє собою наФранція), готову для використання, використовуступне: ють в цьому четвертому посилальному складі. Антигенну фазу, яку одержують у прикладі 1, Кількості представлені в грамах. стерилізують фільтруванням над синтетичною мембраною з пористістю 0,22 мкм. Miglyol , Tween 80 і Span 80 перемішують у хімічній склянці і суміш стерилізують за допомогою нагрівання при 120°С протягом 30 хвилин і потім дають охолонути при температурі навколишнього середовища. Водну фазу (антигенну фазу) і масляну фазу окремо нагрівають у водній бані. Як тільки 2 фази мають однакову температуру, водну фазу додають до масляної фази при перемішуванні при 3000 об./хв. Після додавання водної фази, перемішування продовжують протягом 30 хвилин. Контрольний склад 2: комерційна допоміжна речовина типу "масло у воді" (Montanide IMS, SEPPIC) У другому посилальному одержанні використовують допоміжну речовину, Montanide IMS, яка продається компанією SEPPIC (Париж, Франція), готову для використання. Кількості представлені в грамах. Водна фаза, яка містить антиген (прик50,00 лад 1) Montanide IMS 50,00 Водну фазу, яку одержують у прикладі 1, і допоміжну речовину змішують при перемішуванні протягом 20 секунд, використовуючи гомогенізатор Rayneri T33300 зі швидкістю обертання 150 об./хв. Все стерилізують фільтруванням над синтетичною мембраною з пористістю 0,22 мкм. Контрольний склад 3: комерційна допоміжна речовина типу масло/вода (Montanide ISA 763 VG, SEPPIC) Водна фаза, яка містить антиген Montanide ISA 563 VG 50,00 50,00 Водну частину складу фільтрують над 0,22 мкм поліамідного фільтра і допоміжну речовину над ПТФЕ фільтром з пористістю 0,22 мкм, все асептично збирають. Допоміжну речовину переносять в хімічну склянку, перемішуючи при швидкості обертання 800 об./ха., використовуючи гомогенізатор Rayneri T33300. Антигенну водну фазу включають в єдиний процес, перемішуючи при швидкості обертання 1200 об./хв., який підтримують протягом 15 хвилин. Контрольний склад 5: Допоміжна речовина LH відповідно до заявки на видачу патенту WO 01/40240 Іншу допоміжну речовину, LH, експериментальну допоміжну речовину компанії COVACCINE (Леліштадт, Нідерланди), готову для використання, використовують в цьому останньому посилальному складі. Кількості представлені в мілілітрах. Водна фаза, яка містить антиген (прик25,00 лад 1) Солоний буфер (PBS) 25,00 LH 50,00 Водну допоміжну речовину LH стерилізують постачальником і одержують як таку. Асептично, водну антигенну фазу і сольовий буфер змішують магнітною мішалкою при перемішуванні протягом від 5 до 10 хв. і допоміжну речовину LH згодом додають дуже повільно ("по крап 15 91203 16 лях") до суміші антигенного фазово-сольового ру (у ВП), який відповідає середньому титрів мибуфера. Перемішування підтримують при 10 хв. шей, які складають групу. Порівняння MRP титрів: Переносимість оцінюють відповідно до трьох Титри протеїну MRP, які вимірюють як описано критеріїв: ступінь смертності, активність тварини і вище, посилальних складів складають приблизно поява волосяного покриву. Також перевіряють 4 в одиницях ВП (Відносна потужність: вимірюванаявність на місці ін'єкції. льний пристрій за допомогою програмного забезРезультати печення підрахування відносної потужності, версія - імуногенна потужність 3.0, Департамент сільського господарства США). Вказані значення є відносними: вказане знаТитр композиції відповідно до даного винаходу чення представляє імуногенну потужність компоскладає 1,01. зиції відповідно до даного винаходу з посиланням Дійсно, беручи до уваги невелику кількість вона імуногенну потужність посилання №5, яке слуди, присутню в композиції відповідно до даного жить як посилання для оцінки потужності імуновинаходу, неможливо включити стільки ж антигегенної потужності кожного посилання, яке досліну, як у посилальних складах, окрім як для збільджується. шення його концентрації у водній фазі, що могло б вплинути на вимірювання імунної відповіді. А В с D Ε F І ще, незважаючи на цю помітно нижчу конце26,8 0,60 0,33 15,33 8,53 1 нтрацію і несподівано результати, які описуються нижче, демонструють явно більшу імуногенну акА: Композиція 1 відповідно до даного винаходу тивність допоміжної речовини відповідно до даноВ: контроль 1 го винаходу. С: контроль 2 Протокол порівняльних досліджень імуногенD: контроль 3 ної активності і переносимості контрольних компоЕ: контроль 4 зицій і композицій відповідно до даного винаходу: F: контроль 5 Порівняння переносимості та імуногенної активності проводять на мишах. Ці результати показують, що композиція 1 Імуногенну активність композиції складу 1 від(формула А), яка містить в 4 і 6 разів менше антиповідно до даного винаходу у прикладі 2 порівнюгену, ніж посилання 1 і 4, індукує імунологічну відють з активністю контрольних композицій відповідповідь в 2-80 разів більше ніж та, що індукується но до наступного експериментального протоколу. цими контролями. Одержували мишей BALB/C (постачальник: - переносимість у тварин Charles River) вагою 18-22 грамів, з інтервалом у 2 тижні, яким давали 2 ін'єкції по 250 мкл внутрішА В С D Ε F ньочеревинним шляхом. Зразок крові забирали ++ + + ± ± ++ через один тиждень після відкликання, після розтину мишей. З сереологічної точки зору, рівень ++: Відмінна (немає ознак) анти-Streptococcus suis антитіла оцінюють за до+: Хороша (немає опухання, ніяких залишків помогою способу ELISA. продуктів, можливо скуйовджений волосяний Ямки мікропланшету розташовують на одній покрив) лінії з антигеном (безклітинний супернатант куль±: Погана (опухання, наявність залишків протури) і згодом насичують. Сироватки мишей, які дуктів, скуйовджений волосяний покрив) одержали вакцину, розбавляють і розміщують на планшет. Додають позначене антимишаче антитіЦі результати показують, що формула (комполо (кон'юговане з ензимом). Відкладають субзиція 1), точно подібно до посилального складу F страт/хромоген ензиму і вимірюють реакцію заба(композиція 5), відмінно переноситься як на локарвлення. Імуногенну активність кожної композиції льному, так і на системному рівні, і значно краще згодом визначають за допомогою середнього титпереноситься, ніж 4 контрольні склади. Комп’ютерна верстка О. Гапоненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601