Інгібітори стероїдсульфатази

1. Очищена сполука формули 3 70956 4 13. Очищена сполука за будь-яким з п. 9-12, в якій O R1 і R2 незалежно вибрані з Н або С 1-С5-алкілу; R1 причому принаймні один з R1 і R2 є Н. поліцикл 14. Очищена сполука за будь-яким з пп. 9-13, в N S O якій R1 і R2 незалежно вибрані з Н або метилу; R2 причому принаймні один з R1 і R2 є Н. 15. Очищена сполука за будь-яким з пп. 9-14, в O якій R1 є Н та R2 є Н. , 16. Очищена сполука за будь-яким з пп. 9-15, в в якій групою поліциклу є залишок 3-стерину і в якій сполукою є естрон-3-сульфамат або естрон-3якій R1 та R2 є Н. N-монометилсульфамат. 23. Естрон-3-сульфамат. 17. Очищена сполука за п. 9, що є сполукою фор24. Естрон-3-N-монометилсульфамат. мули 25. Естрон-3-N,N-диметилсульфамат. Даний винахід стосується нових сполук, які використовуються в якості інгібіторів стероїдсульфатази, та фармацевтичних сумішей, що їх містять. Відомо, що попередники стероїдів або прогормони, що мають сульфатну гр уп у в 3положенні стероїдного ядра, мають велике значення як проміжні продукти в метаболізмі стероїдів в організмі людини. Естронсульфат і дегідроепіандростерон-сульфат (ДЕС) наприклад, відіграють, як відомо, важливу роль як проміжні продукти у виробленні естрогенів, таких як естрон і естрадіол, у тілі людини. Зокрема відомо, що естронсульфат, наприклад, являє собою один з основних циркулюючих попередників естрогену, особливо у жінок постклімактеричного періоду, а активність естронсульфатази при пухлинах грудей у 100-1000 разів більша, ніж інших ферментів, які беруть участь в утворенні естрогену. (James та співр. Steroids, 50. 269-279(1987)). Інші естрогени, наприклад, естрон і естрадіол, особливо при їх перевиробленні, також показані при різних захворюваннях наприклад, при раку грудей, див. Breast Cancer Treatment and Prognosis: R.A. Stoll, стор. 156-172. Blackwell Scientific Publications (1986) і контроль за виробленням естрогенів є специфічною метою багатьох напрямків протиракової терапії, у тому числі хіміотерапії і хірургічного підходу, наприклад, оваріектомії (видалення яєчників) і адреналектомії (резекції надниркової залози). Що стосується ендокринної терапії, всі зусилля спрямовані поки що тільки на концентрування інгібіторів ароматази, тобто сполук, здатних інгібувати активність ароматази, активність якої, як показує схема метаболізму естрогену (фіг.1), полягає у перетворенні андрогенів, наприклад, андростендіону і тестостерону на естерон та естрадіол, відповідно. Найбільш близькою до пропонованого винаходу є очищена сполука, що описана у опублікованій Міжнародній заявці WO91/13083. Відповідно з Міжнародною заявкою WO91/13083 пропонувалося впливати на іншу ділянку метаболічного шляху естрогену, або, скоріше, на дві різні ділянки, іншими словами на перетворення сульфату ДЕС і естрон-сульфату на ДЕС і естрон, відповідно, під впливом активності стероїд-сульфатази при використанні 3-моноалкілтіофосфонат-стероїдефірів як інгібітору стероїд-сульфатази, зокрема естрон-3-монометилтіофосфонату. Недолік описаного винаходу полягає у обмеженні можливості інгібування активності стероїдсульфатази in vitro та in vi vo. У основу пропонованого винаходу поставлено задачу створення нових сполук, здатних інгібувати активність стероїд-сульфатази in vitro та in vi vo. Поставлена задача вирішується у пропонованому винаході - очищеній сполуці, що включає кільцеву систему і сульфаматну груп у формули де кожен R1 і R2 незалежно вибирають з Н, алкілу, алкенілу, циклоалкілу й арилу, причому принаймні один з R1 і R2 є Н, і кільцева система включає принаймні, три кільця, принаймні два з яких спряжені, і сполука є інгібітором ферменту, що має активність стероїдсульфатази (Е.С.3.1.6.2), причому, коли сульфаматну груп у сполуки заміщають сульфатною гр упою для утворення сульфату та інкубують з ферментом стероїдсульфатазою (Е.С.3.1.6.2) при рН7,4 і температурі 37°С, вона забезпечує значення Кm менше 50мкМ. Поставлена задача вирішується також і у др угому варіанті пропонованої очищеної сполуки, що включає стероїдну кільцеву стр уктур у і сульфаматну гр упу формули де кожен R1 і R2 незалежно вибирають з Н, алкілу, алкенілу, циклоалкілу й арилу, причому принаймні один з R1 і R2 є Н, і сполука є інгібітором ферменту, що має активність стероїдсульфатази (Е.С.3.1.6.2), причому, коли сульфаматну групу сполуки заміщають сульфатною групою для утворення сульфату та інкубують з ферментом стероїдсульфатазою (Е.С.3.1.6.2) при рН7,4 і температурі 37°С, вона забезпечує значення Km менше 50мкМ. 5 70956 Особливістю другого варіанту очищеної сполуки є те, що стероїдна кільцева структура є залишком 3-стерину. Особливістю другого варіанту очищеної сполуки є те, що стерин вибирають з групи, що складається з естрону, дегідроепіандростеронів, заміщених естронів, заміщених дегідроепіандростеронів. Особливістю варіантів очищеної сполуки є й те, що R1 і R2 незалежно вибирають з Η або С 1-С10 алкілу, причому принаймні один з R1 і R2 є Н. Особливістю варіантів очищеної сполуки є те, що R1 і R2 незалежно вибирають з Η або С 1-С5 алкілу, причому принаймні один з R1 і R2 є Н. Особливістю варіантів очищеної сполуки є те, що R1 і R2 незалежно вибирають з Η або метилу, причому, принаймні, один з R1 і R2 є Н. Особливістю варіантів очищеної сполуки є те, що R1 є Η та R2 є Н. Особливістю варіантів очищеної сполуки є те, що сполукою є одна вибрана з естрон-3сульфамату, естрон-3-N,N-диметилсульфамату, естрон-3-N-монометилсульфамату. Особливістю варіантів очищеної сполуки є те, що сульфаматна група приєднана до кільцевої системи чи стероїдної кільцевої структури. Особливістю першого варіанту очищеної сполуки є те, що вона є сполукою формули де R1 і R2, як вони визначені вище (в п ункті 1). Особливістю першого варіанту очищеної сполуки є те, що гр упа поліциклу являє собою залишок стерину. Особливістю другого варіанту очищеної сполуки є те, що зазначена сполука є сполукою формули де група поліциклу являє собою залишок стерину і R1 та R2 , як вони визначені вище (в п ункті 2). Особливістю другого варіанту очищеної сполуки є те, що стерин являє собою 3-стерин. Особливістю др угого варіанту очищеної сполуки є те, що зазначена сполука є сполука формули де група поліциклу являє собою залишок 3стерину і R1 та R2 є Н. Особливістю пропонованого винаходу є естрон 3-сульфамат. Особливістю пропонованого винаходу естрон-3-Nметилсульфамат. Особливістю пропонованого винаходу є естрон-3-N-диметилсульфамат. 6 Цей винахід ґрунтується на відкритті нових сполук, що мають інгібуючу активність стероїдсульфатази, у ряді випадків винятково високий рівень активності. Ці сполуки є ефірами сульфамінової кислоти і поліциклічних спиртів, сульфат яких являє собою субстрат для ферментів, які мають активність стероїд-сульфатази (ЕС 3.1.6.2), Nалкіл- і N-арил-похідні цих ефірів сульфамінової кислоти та їх фармацевтично прийнятних солей. Сполуки формули (І). в якій R1 і R2 кожен незалежно один від одного являє собою Н, алкіл, циклоалкіл, алкеніл та арил або разом вони являють собою алкілен, який необов'язково містить один чи кілька гетеро-атомів або груп у ланцюзі алкілену, і гр упа -Ополіциклічної структури являє собою залишок поліциклічного спирту, сульфат якого являє собою субстрат для ферментів, які мають активність стероїд-сульфатази (EC 3.1.6.2.). Що стосується спиртів, сульфати яких є субстратом для ферментів, які мають активність стероїд-сульфатази, то йдеться про поліциклічні спирти, сульфати яких, тобто похідні формули при витримуванні зі стероїд-сульфатазою EC 3.1.6.2 при рН 7,4 та температурі 37° дають значення Кm менше 50мкмолей. Активність заявлених сполук як інгібіторів активності стероїд-сульфатази ілюструється такими малюнками: Фіг.1 подає схему метаболічних шляхів, ферментів і стероїдних проміжних продуктів, що беруть участь у виробленні естродіолу in vi vo. На Фіг.2 подано гістограму залежної від дози інгібуючої дії естрон-3-сульфамату на активність стероїд-сульфатази у клітинах MCF-7 in vitro. На Фіг.3 подано залежну від дози інгібуючу дію естрон-3-N,N-диметилсульфамату на активність стероїд-сульфатази у клітинах MCF людини in vitro. На Фіг.4 подано порівняння кривих реагування для естрон-3-сульфамату та естрон-3-N,Nдиметилсульфамату на активність стероїдсульфатази у MCF- клітинах людини in vitro. На Фіг.5 подано залежну від дози інгібуючу дію естрон-3-сульфамату разом з ІС 50- значенням (концентрація, необхідна для 50% інгібування) на активність стероїд-сульфатази у плацентарних мікросомах. Одним з аспектів винаходу є нові сполуки ефіру сульфамінової кислоти і поліциклічних спиртів. Як поліциклічні спирти маються на увазі такі спирти, сульфати яких є субстратом для ферментів, що мають активність стероїд-сульфатази, а також їх N-алкіл, N-циклоалкіл, N-алкеніл і N-арилпохідні. Ці сполуки відповідають наведеній вище формулі І. 7 70956 8 Більш прийнятним є, якщо поліциклічна група пара-). Якщо R1 і R2 являють собою циклоалкіл, містить, включаючи всі замісники, максимум близвичайно це - циклопропіл, циклопентил, циклогезько 40, звичайно ж не більше 30 замісників. Більш ксил тощо. З'єднані разом R1 і R2 являють собою прийнятними поліциклами можна вважати стероїгруп у алкілену, за умови, що кільце складається з дні циклічні структури, так званий циклопентано4-6 С-атомів, які необов'язково розриваються одфенантреновий скелет. Більш прийнятним є, якщо ним чи кількома гетеро-атомами чи групами, насульфаміл- або заміщена сульфаміл-група знахоприклад, -О- або -NH- з одержанням 5-, 6- чи 7диться у цьому скелеті в 3-положенні, тобто членного гетероциклу наприклад, морфоліну, пійдеться про сполуки формули II: ролідину чи піперидину. Під алкільними, циклоалкільними, алкенільними й арильними групами слід мати на увазі групи, що містять в якості замісників у ни х одну чи кілька груп, які не справляють впливу на інгібуючу активність сульфатази в сполуках, що розглядаються. Замісниками, що не заважають, можна вважав якій R1 і R2 мають наведені вище значення, а ти гідрокси, аміно, гало, алкокси, арил і алкіл. циклічна система ABCD являє собою заміщене чи Більш прийнятними є сполуки формул III та IV. незаміщене, насичене чи ненасичене стероїдне ядро, більш прийнятно естрон або дегідроепіандростерон. Інші прийнятні системи стероїдних кілець являють собою: заміщені естрони, а саме: 2-ОНестрон, 2-метокси-естрон, 4-ОН-естрон, 6б-ОНестрон, 7б-ОН-естрон, 16б-ОН-естрон, 16в-ОНестрон, естрадіоли і заміщені естрадіоли, а саме: 2-ОН-17в-естрадіол, 2-метокси-17в-естрадіол, 4ОН-17в-естрадіол, 6б-ОН-17в-естрадіол, 7б-ОН17в-естрадіол, 16б-ОН-17б-естрадіол, 16б-ОН17б-естрадіол, 16в-ОН-17в-естрадіол, 17бестрадіол, 17в-естрадіол, 17б-етиніл-17вестрадіол, естріоли і заміщені естріоли, а саме: естріол, 2-ОН-естріол, 2-метокси-естріол, 4-ОНестріол, 6б-ОН-естріол, 7б-ОН-естріол, заміщені дегідроепіандростерони, а саме: 6б-ОНв яких R1 і R2 являють собою С 1-5-алкіл, тобто дегідроепіандростерон, 7б-ОНестрон-3-сульфамат і дегідроепіандростерон-3дегідроепіандростерон, 16б-ОНсульфамат та їх N-(С1-5)-алкіл-похідні, особливо дегідроепіандростерон, 16в-ОНдиметил-похідні R1=R2=CH3. дегідроепіандростерон. Ефіри сульфамінової кислоти, що пропонуЦиклічна стероїдна система ABCD може місються винаходом, одержують шляхом реакції потити різні замісники, що не заважають. ліциклічного спирту, наприклад, естрону чи дегідЗокрема, циклічна система ABCD може містироепіандростерону з сульфамілхлоридом ти один чи кілька гідрокси, алкіл, особливо нижчий R1R2NSO2CI, тобто згідно з схемою, поданою на алкіл-(С1-6)-замісників, наприклад, метил, етил, нстор. Error! Bookmark not defined. пропіл, ізопропіл, н-бутил, втор.-бутил, трет.бутил, н-пентил, та інши х ізомерів пентилу, а також н-гексил і інші ізомери гексилу, алкокси, особливо нижчі (С1-6)-алкокси-замісники, наприклад метокси, етокси, пропокси тощо, алкініл, наприклад, етиніл чи галоген, наприклад, фтор. Прийнятні нестероїдні циклічні системи включають: діетилстильбоестрол, стильбоестрол та Відповідно до зазначеної схеми реакцію проінші циклічні системи, за умови, що сульфати маводять у такий спосіб: ють Кm-значення менше 50мкмолей зі стероїдНітрат натрію і сульфамілхлорид додають при сульфатазою ЕС 3.1.6.2. перемішуванні в розчин естрону в безводному Якщо подані винаходом заміщені, N-заміщені диметилформаміді при 0°С. Далі реакцію провосполуки містять один чи два N-алкіл, N-алкеніл, Nдять при нагріванні до кімнатної температури ще циклоалкіл або N-арил-замісники, більш прийнятпротягом 24 годин. Реакційну суміш виливають у ним є, якщо вони чи кожен з них містить максимум холодний насичений розчин бікарбонату натрію і 10 С-атомів. У випадку, якщо R1 і/або R2 алкіл, водяну фазу, що утворилася, екстрагують ди хлобільш прийнятно вибирати такі значення, при яких рметаном. Об'єднаний органічний екстракт сушать R1 і R2 кожен незалежно один від одного вибиранад безводним сульфатом магнію. Після фільтрується з числа нижчих алкільних груп з 1-5 Свання та подальшого випарювання розчинника у атомами, тобто з числа метилу, етилу, пропілу вакуумі і співвипарювання з толуолом одержують тощо. Більш прийнятним є, якщо R1 і R2 обидва необроблений залишок, який далі очищають за являють собою метил. У випадку, якщо R 1 і/або R2 допомогою флеш-хроматографії. - арил, звичайно - феніл і толіл (-PhCH3, о-, м-, У разі необхідності функціональні групи в по 9 70956 10 ліциклічному спирті (стеролі) можуть бути захи щед. J=10,44Гц), 7,33 (шир.д.1Н. J=8,42Гц). ні у відомий спосіб з подальшим видаленням зад 13С (67,8 МГц. CD3OD): 14,53 (кв. С18-Ме), хисної гр упи чи гр уп наприкінці реакції. 22,80 (т), 27,24 (т), 27,73 (т); 30,68 (т); 33,05 (т), Для фармацевтичного застосування інгібітори 37,01 (т), 39,76 (д), 45,73 (с.С18), 51,86 (д), 120,76 стероїд-сульфатази, що пропонуються цим вина(д), 123,54 (д), 127,89 (д), 139,83 (с), 150,27 (с), ходом, можуть бути приготовлені відповідно до 273,87 (с, С=0). відомих випробуваних традиційних фармацевтичm/z /%/:349/9/ /m+/, 270(100), 233(26), 185(43), них методик з використанням традиційних фарма172(31), 159(21), 146(36), 91(33), 69(37); 57(73), цевтичних носіїв, наповнювачів, розріджувачів 43(56), 29(24). тощо, які звичайно рекомендуються для парентеДані мікроаналізу: рального застосування. Середня ефективна доза залежно від індивідуальної активності сполук, що С Η Ν розглядаються у цьому винаході, і в розрахунку на Розраховано: 61,87% 6,63% 4,01% середню вагу тіла пацієнта (70кг) коливається в Знайдено: 61,90% 6,58% 3,95% межах від 100 до 800мг/день. Звичайна доза для Приклад 2 більш прийнятних і більш активних сполук складає Одержання естрон-3-N-метилсульфамату від 200 до 800мг/день, більш прийнятно 200Повторюють методику, описану в прикладі 1, 500мг/день, ще більш прийнятно від 200 до але замість сульфамоїл хлориду бер уть таку ж 250мг/день. Ліки можна приймати у вигляді однокількість метилсульфамоїлхлориду. При аналізі кратної дози, дробної дози або ж багаторазових одержують такі результати: дрібних доз протягом кількох днів. Для орального д 1Н (270МГц. CDCI3):0,91 (с.3Н,С18-Ме), 1,28застосування лікарські засоби можуть бути приго1,68 (м,6Н), 1,93-2,60 (серія від м.7Н), 2,90-2,95 товлені у вигляді таблеток, капсул, чи розчинів (М.2Н), 2,94 (д.3Н; J=5,13Гц.Ме N-) 4,68-4,71 (шир. суспензій, які містять від 100 до 500мг сполуки на м.змінюваний, 1H-NH), 7,02-7,07 (м.2Н), 7,26-7,32 стандартну дозу. Більш прийнятним є, якщо для (м.1Н). m/z /%/: 364(М+Н)+ парентерального застосування сполуки будуть Приклад 3 приготовлені при використанні придатних для паОдержання естрон-3-N,N-диметилсульфамату рентерального введення носіїв, і якщо однократна Повторюють методику, описану в прикладі 1, денна доза міститиме від 200 до 800мг, більш приале замість сульфамоїлхлориду беруть таку ж йнятно від 200-500, ще більш прийнятно від 200 до кількість Ν,Ν-диметил-сульфамоїлхлориду. 250мг зазначених сполук. Однак такі ефективні При аналізі одержують такі результати: денні дози досить сильно залежатимуть від активд 1Н (270 МГц. CDCI3):0,92(c.3H.C 18-Me), 1,39ності, притаманній активному інгредієнту, і знач1,75 (м.5Н), 1,95-2,60, (серія від м, ною мірою повинні визначатися вагою тіла пацієн6H/.2.82/c,3H,MeN-/, 2,96-3,00(м.4Н), 2,98(с.3Н, та, що завжди повинно враховуватись лікуючим МеH 7,04 (шир.д.2Н.и=7,69Гц), 7,29 (шир.д.ІH-J лікарем. =7,88Гц) Для так званого "часткового" застосування, m/z /%/:377(М/+ розглядається питання, що запропоновані винахоДані мікроаналізу: дом інгібітори стероїд-сульфатази можуть використовуватись для комбінованого лікування, або в С Η Ν поєднанні з іншим інгібітором сульфатази, або Розраховано: 63,63% 7,21% 3,71% наприклад, у комбінації з інгібітором ароматази, Знайдено: 63,50% 7,23% 3,60% зокрема, з 4-гідроксіандростендіоном (4-ОНА). Приклад 4 Більш докладно предмет винаходу ілюстр уІнгібування стероїд-сульфатазної активності в ється наведеними нижче прикладами і результаМСF7-клітинах під дією естрон-3-сульфамату. тами проведених випробувань. Під стероїд-сульфатазою слід розуміти стериПриклад 1 льну сульфатазу ЕС 3.1.6.2. Стероїд-сульфатазну Одержання естрон-3-сульфамату активність вимірюють in vitro, використовуючи для Гідрид натрію (60% дисперсія, 2 екв.) і сульцієї мети інтактні MCF-7 ракові клітини грудей люфамоїлхлорид (2 екв.) додають при перемішуванні дини. Гормонзалежну лінію клітин широко викорив розчин естрону (1 екв) у безводному диметилстовують для регуляції росту ракових кліток грудей формаміді при 0°С. Потім реакцію проводять при людини. Вона відрізняється яскраво вираженою нагріванні до кімнатної температури, продовжуючи стероїд-сульфатазною активністю (Maclndoe та перемішування, ще протягом 24 годин. співр. Endocrinology, 123.1281-1287/1988/. Purohit Реакційну суміш виливають у холодний насита Reed. Int. J. Cancer 50.901-905 (1992)) і може чений розчин бікарбонату натрію, і водну фазу, що бути отримана в США з Американської колекції утворилася, екстрагують дихлорметаном. Об'єдклітинних культур, а у Великобританії, наприклад, наний органічний екстракт сушать над безводним з Королівського фонду ракових досліджень. Клітисульфатом магнію. Після фільтрування з подальни обробляють у мінімальному ессенціальному шим випарюванням розчинника у вакуумі і співвисередовищі (Flow Laboratories, Irwine, Шотландія), парюванням з толуолом одержують необроблений що містить 20ммолей HEPES ,5% сироватки новопродукт, який потім очищають за допомогою народжених великої рогатої худоби, 2ммолей глюфлеш-хроматографії. таміну, амінокислоти і 0,075% бікарбонату натрію. Аналіз дає такі результати: До 30 посудин із зразками клітинних культур д 1Н/270МГц. CD3OD/:0,91 (с.3Н.С18-Ме), 1,40(25см 2) засівають приблизно 2´105 клітин на кожну 2,55 (серії від м, 13Н), 2,90-2,92 (м.2Н), 7,04 (шир. посудину, використовуючи назване вище середо 11 70956 12 вище. Клітини вирощують до 80% злить, середожаного 3Н-значення (з поправкою на об'єм вище змінюють кожен третій день. середовища та використовуваної органічної фази, Інтактні моношари клітин MCF-7 у трьох варіадоданої для виділення 14С-естрону) і питомої акти2 нтах по 25см клітинної культури у кожній посудині вності субстрату. Кожна серія експериментів вклюпромивають збалансованим сольовим розчином чає інкубацію мікросом, одержаних з сульфатазаЕрла (EBS9, з ICN Flow, High Wycombe, Великопозитивної плаценти людини (позитивний контбританія) і витримують протягом 3-4 годин при роль) і посудин без клітин (для визначення очевидності неферментативного гідролізу субстрату). 37°С з 5пмолями (7´105 число розпадів на хвилиКількість клітинних ядер у кожній посудині визнану) (6,7-3Н)-естрон-3-сульфату) питома активність чають за допомогою лічильника Култера після об60кюрі/ммоль з Ядерної спілки Нова Англія, Босробки моношарів клітин запоніном. Одну посудину тон, Масачусетс, США) у мінімальному середовив кожній серії використовують для оцінки стану щі, що не містить сироватки (2,5мл), разом з естрон-3-сульфаматом (11 концентрацій: 0; 1фМ; оболонки клітини і її життєздатності, використовуючи для цього ексклюзивний метод трипрану0,01nM; 0,1пМ; 0,01нМ; 0,1нМ; 1н М; 0,01мкМ; блакитного. (H.J. Phillips (1973). Тканинні культури 0,1мкМ; 1мкМ). По закінченні витримування кожну та їх застосування (D.F.Kruse і М.К. Patterson), посудину охолоджують, і середовище піпеткою стор.406-408. Axademic Press, Нью-Йорк). вводять в окремі трубки, що містять (14С/естрон) Дані для естрон-3-сульфамату наведені у таб7´103 розпадів/на хв. Питома активність лиці 1 і на фігурах 2 і 4. Результати оцінки стероїд97кюрі/ммоль отримана з Емерсгеймського Міжнасульфатазної активності виражають у середніх родного радіохімічного центра Amersham, Великозначеннях ±1 стандартне відхилення від загальнобританія). Суміш струшують протягом 30 секунд з го продукту (естрон+естрадіол), що утворюється толуолом (5мл). Експерименти показують, що > впродовж інкубаційного періоду (20 годин), розра90% (14С) естрону і 90% 14С-естрону і