Фармацевтична композиція (варіанти)

1. Фармацевтична композиція, яка містить фармацевтично прийнятний носій або розріджувач і активнодіючу сполук у формули 2 (19) 1 3 70957 4 естрону, дегідроепіандростеронів, заміщених естронів і заміщених дегідроепіандростеронів. 15. Фармацевтична композиція за будь-яким з пун, ктів 12-14, в якій кожен з R 1 і R2 незалежно вибив якій кожен з R1 і R2 незалежно вибирані із Н, алраний із Н, алкілу і циклоалкілу, але де принаймні кілу, алкенілу, циклоалкілу і арилу і де принаймні один з R1 і R2 означає водень. один з R1 і R2 означає Н, 16. Фармацевтична композиція за будь-яким з пунполіцикл складається принаймні з трьох кілець, ктів 12-14, в якій кожен з R 1 і R2 незалежно вибипринаймні два з яких сконденсовані, раний із Н або алкілу, але де принаймні один з R1 і сполука є інгібітором ферменту, який має стероїдR2 означає водень. сульфатазну активність (Е.С.3.1.6.2) і дана сполу17. Фармацевтична композиція за будь-яким з пунка в умовах заміщення складно-ефірної групи суктів 12-14, в якій кожен з R 1 і R2 незалежно вибильфамінової кислоти на сульфатну груп у з раний із Н або С 1-С10алкілу, але де принаймні утворенням відповідної сульфатної сполуки і інкуодин з R1 і R2 означає водень. бування стероїдсульфатазним ферментом 18. Фармацевтична композиція за будь-яким з пун(Е.С.3.1.6.2) при рН7,4 і 37°С забезпечує його інгіктів 12-14, в якій кожен з R 1 і R2 незалежно вибибування із значенням Km менше ніж 50мкМ, і де раний із Н або С1-С5алкілу, але де принаймні один сполука присутня в кількості, яка забезпечує 100з R1 і R2 означає водень. 500мг сполуки на одноразову дозу. 19. Фармацевтична композиція за будь-яким з пун27. Фармацевтична композиція за пунктом 26, в ктів 12-14, в якій кожен з R 1 і R2 незалежно вибиякій кожен з R1 і R2 незалежно вибираний із Н, алраний із Н або метилу, але де принаймні один з R1 кілу і циклоалкілу, але де принаймні один з R1 і R2 і R2 означає водень. означає водень. 20. Фармацевтична композиція за будь-яким з пун28. Фармацевтична композиція за пунктом 26, в ктів 12-14, в якій R1 означає Н і R2 означає Н. якій кожен з R1 і R2 незалежно вибираний із Н і 21. Фармацевтична композиція за будь-яким з пуналкілу, але де принаймні один з R1 і R2 означає ктів 12-20, в якій активнодіюча сполука є однією з водень. естрон-3-сульфамату, естрон-3-N,N29. Фармацевтична композиція за пунктом 26, в диметилсульфамату, естрон-3-Nякій кожен з R1 і R2 незалежно вибираний із Н або монометилсульфамату. С1-С10алкілу, але де принаймні один з R1 і R2 озна22. Фармацевтична композиція за будь-яким з пунчає водень. ктів 12-21, в якій сульфаматна група приєднана до 30. Фармацевтична композиція за пунктом 26, в стероїдної кільцевої структури. якій кожен з R1 і R2 незалежно вибираний із Н або 23. Фармацевтична композиція за пунктом 12, в С1-С5алкілу, але де принаймні один з R1 і R2 ознаякій активнодіюча сполука є сполукою формули чає водень. 31. Фармацевтична композиція за пунктом 26, в якій кожен з R1 і R2 незалежно вибираний із Н або метилу, але де принаймні один з R 1 і R2 означає , водень. в якій група поліцикл являє собою залишок стери32. Фармацевтична композиція за пунктом 26, в ну, R1 і R2 мають значення, вказані в пункті 12. якій R1 означає Н і R2 означає Н. 24. Фармацевтична композиція за пунктом 23, в 33. Фармацевтична композиція за будь-яким з пунякій стерин є 3-стерином. 25. Фармацевтична композиція за пунктом 12, в ктів 26-32, в якій активнодіюча сполука є однією з естрон-3-сульфамату, естрон-3-N,Nякій активнодіюча сполука є сполукою формули диметилсульфамату, естрон-3-Nмонометилсульфамату. 34. Фармацевтична композиція за будь-яким з пун, ктів 26-33, в якій сульфаматна група приєднана до в якій група поліцикл є залишком 3-стерину, R1 і R2 циклічної кільцевої системи. означають Н. 26. Фармацевтична композиція, яка містить фармацевтично прийнятний носій або розріджувач і активнодіючу сполук у формули Даний винахід стосується нових сполук, які використовуються в якості інгібіторів стероїдсульфатази, та фармацевтичних сумішей, що їх містять. Відомо, що попередники стероїдів або прогормони, що мають сульфатн у груп у в 3-положенні стероїдного ядра, мають велике значення як проміжні продукти в метаболізмі стероїдів в організмі людини. Естронсульфат і дегідроепіан-дростеронсульфат (ДЕС) наприклад, відіграють, як відомо, важливу роль як проміжні продукти у виробленні естрогенів, таких як естрон і естрадіол, у тілі лю 5 70957 6 дини. Зокрема відомо, що естронсульфат, напризабезпечує значення Кm менше 50мкМ. клад, являє собою один з основних циркулюючих Поставлена задача вирішується і другим варіпопередників естрогену, особливо у жінок посткліантом пропонованої Фармацевтичної композиції, мактеричного періоду, а активність естронщо включає фармацевтично прийнятний носій або сульфатази при пухлинах грудей у 100-1000 разів розріджувач і сполуку, що включає стероїдну кільбільша, ніж інших ферментів, які беруть участь в цеву структур у та сульфаматну гр уп у формули утворенні естрогену. (James та співр. Steroids, 50. 269-279 (1987)). Інші естрогени, наприклад, естрон і естрадіол, особливо при їх перевиробленні, також показані при різних захворюваннях наприклад, при раку грудей, див. Breast Cancer Treatment and Prognosis: R.A.Stoll, стор.156-172. Blackwell Scientific де R1 і R2 кожен незалежно вибирають з Н, алPublications (1986) і контроль за виробленням есткілу, алкенілу, циклоалкілу й арилу, і принаймні рогенів є специфічною метою багатьох напрямків один з R1 і R2 являє собою Н, і сполука є інгібітопротиракової терапії, у тому числі хіміотерапії і ром ферменту, що має активність стероїдсульфахірургічного підходу, наприклад, оваріектомії (витази (Е.С.3.1.6.2) за умови, що, коли сульфаматна далення яєчників) і адреналектомії (резекції надгрупа сполуки заміщена сульфатною групою для ниркової залози). Що стосується ендокринної теутворення сульфату та інкубована з ферментом рапії, всі зусилля спрямовані поки що тільки на стероїдсульфатазою (Е.С.3.1.6.2) при рН7,4 і темконцентрування інгібіторів ароматази, тобто спопературі 37°С, вона забезпечує значення Кm, менлук, здатних інгібувати активність ароматази, акше 50мкМ. тивність якої, як показує схема метаболізму естроПоставлена задача вирішується і третім варіагену (фіг. 1), полягає у перетворенні андрогенів, нтом пропонованої фармацевтичної композиції, наприклад, андростендіону і тестостерону на есщо включає фармацевтично прийнятний носій чи терон та естрадіол, відповідно. розріджувач, і сполуку, що включає кільцеву струкНайбільш близьким до пропонованого винахотуру та сульфаматну груп у формули ду є фармацевтична композиція, про яку йдеться у публікації до Міжнародної заявки WO91/13083. Відповідно до зазначеної публікації пропонувалося впливати на іншу ділянку метаболічного шляху естрогену, або, скоріше, на дві різні ділянки, іншими словами на перетворення сульфату ДЕС і естрон-сульфату на ДЕС і естрон, відповідно, під де R1 і R2 кожен незалежно вибирають з Н, алвпливом активності стероїд-сульфатази при викокілу, алкенілу, циклоалкілу й арилу, де принаймні ристанні 3-моноалкілтіофосфонат-стероїд-ефірів один з R1 і R2 є Н, і сполука є інгібітором ферменяк інгібітору стероїд-сульфатази, зокрема естронту, що має активність стероїдсульфатази 3-монометилтіофосфонату. (Е.С.3.1.6.2) за умови, що, коли сульфаматна груНедолік описаного рішення полягає у обмежепа сполуки заміщена сульфатною групою для ній ефективності відомої фармацевтичної компоутворення сульфату та інкубована з ферментом зиції при лікуванні естроген-залежних пухлин. стероїдсульфатазою (Е.С.3.1.6.2) при рН7,4 і темУ основу пропонованого винаходу поставлено пературі 37°С, вона забезпечує значення Кm мензадачу створення фармацевтичної композиції, ше 50мкМ, сполука присутня в кількості, що забезефективної при лікуванні естроген-залежних пухпечує 100-500мг сполуки на стандартну дозу. лин, створенні фармацевтичної композиції, ефекОсобливістю другого варіанту пропонованої тивної при лікуванні раку грудей. Фармацевтичної композиції є й те, що стероїдна Поставлена задача вирішується першим варікільцева структура є залишком 3-стерину. антом пропонованої Фармацевтичної композиції, Особливістю другого варіанту пропонованої що включає фармацевтично прийнятний носій або Фармацевтичної композиції є й те, що стерин вирозріджувач і сполуку, що включає кільцеву сисбирають з групи, яка складається з естрону, дегідтему та сульфаматну гр упу формули роепіандростеронів, заміщених естронів і заміщених дегідроепіандростеронів. Особливістю варіантів пропонованої Фармацевтичної композиції є й те, що R1 і R2 незалежно вибирають з Η чи C1-C10 алкілу, при цьому принаймні, один з R1 і R2 є Н. де R1 і R2 кожен незалежно вибирають з Н, алОсобливістю варіантів пропонованої Фармакілу, алкенілу, циклоалкілу й арилу, де, принаймні, цевтичної композиції є й те, що R1 і R2 незалежно один з R1 і R2 являє собою Н, і кільцева система вибрані з Η або С 1-С5 алкілу, при цьому принаймні містить принаймні 3 кільця, принаймні два з який один з R1 і R2 є Н. спряжені, сполука є інгібітором ферменту, що має Особливістю варіантів пропонованої Фармаактивність стероїдсульфатази (Е.С.3.1.6.2) за умоцевтичної композиції є й те, що R1 і R2 незалежно ви, що, коли сульфаматна група сполуки заміщена вибрані з Η чи метилу, при цьому принаймні один з сульфатною гр упою для утворення сульфату та R1 і R2 є Н. інкубована з ферментом стероїдсульфатазою Особливістю варіантів пропонованої Фарма(Е.С.3.1.6.2) при рН7,4 і температурі 37°С, вона 7 70957 8 цевтичної композиції є й те, що R 1 є Η та R2 є Н. поліциклічної структури являє собою залишок полі Особливістю варіантів пропонованої Фармациклічного спирту, сульфат якого являє собою цевтичної композиції є й те, що сполукою є одна з субстрат для ферментів, які мають активність стеестрон-3-сульфамату, естрон-3-N,Nроїд-сульфатази (ЕС 3.1.6.2.) . диметилсульфамату, естрон-3-NЩо стосується спиртів, сульфати яких є субмонометилсульфамату. стратом для ферментів, які мають активність стеОсобливістю варіантів пропонованої Фармароїд-сульфатази, то йдеться про поліциклічні цевтичної композиції є й те, що сульфатна гр упа спирти, сульфати яких, тобто похідні формули приєднана до кільцевої системи або стероїдної кільцевої структури. Особливістю першого варіанту пропонованої Фармацевтичної композиції є й те, що сполукою є сполука формули при витримуванні зі стероїд-сульфатазою ЕС 3.1.6.2 при рН7,4 та температурі 37° дають значення Кm менше 50мкмолей. Активність заявлених сполук як інгібіторів активності стероїд-сульфатази ілюструється такими малюнками: де R1 і R2 мають значення, визначені в пункті 1 Фіг.1 подає схему метаболічних шляхів, ферОсобливістю першого варіанту пропонованої ментів і стероїдних проміжних продуктів, що беФармацевтичної композиції є й те, що групу поліруть участь у виробленні естродіолу in vi vo. циклу представляє залишок стерину. На фіг.2 подано гістограму залежної від дози Особливістю другого варіанту пропонованої інгібуючої дії естрон-3-сульфамату на активність Фармацевтичної композиції є й те, що сполукою є стероїд-сульфатази у клітинах MCF-7 in vitro. сполука формули На фіг.3 подано залежну від дози інгібуючу дію естрон-3-N,N-диметилсульфамату на активність стероїд-сульфатази у клітинах MCF людини in vitro. На фіг.4 подано порівняння кривих реагування для естрон-3-сульфамату та естрон-3-N,Nдиметилсульфамату на активність стероїдде групою поліциклу є залишок стерину, де сульфатази у MCF-клітинах людини in vitro. значення R1 і R2 визначені вище (у пункті 2 форНа фіг.5 подано залежну від дози інгібуючу дію мули винаходу). естрон-3-сульфамату разом з ІС 50-значенням Особливістю варіанту пропонованої Фармаце(концентрація, необхідна для 50% інгібування) на втичної композиції є й те, що стерином є 3-стерин. активність стероїд-сульфатази у плацентарних Особливістю другого варіанту пропонованої мікросомах. Фармацевтичної композиції є й те, що сполукою є Одним з аспектів винаходу є нові сполуки ефісполука формули ру сульфамінової кислоти і поліциклічних спиртів. Як поліциклічні спирти маються на увазі такі спирти, сульфати яких є субстратом для ферментів, що мають активність стероїд-сульфатази, а також їх N-алкіл, N-циклоалкіл, N-алкеніл і N-арилпохідні. Ці сполуки відповідають наведеній вище формулі І. де групою поліциклу є залишок 3-стерину, де Більш прийнятним є, якщо поліциклічна група R1 і R2 є Н. містить, включаючи всі замісники, максимум блиЦей винахід ґрунтується на відкритті нових зько 40, звичайно ж не більше 30 замісників. Більш сполук, що мають інгібуючу активність стероїдприйнятними поліциклами можна вважати стероїсульфатази, у ряді випадків винятково високий дні циклічні структури, так званий циклопентанорівень активності, Ці сполуки є ефірами сульфаміфенантреновий скелет. Більш прийнятним є, якщо нової кислоти і поліциклічних спиртів, сульфат сульфаміл- або заміщена сульфамід-група знахояких являє собою субстрат для ферментів, які мадиться у цьому скелеті в 3-положенні, тобто ють активність стероїд-сульфатази (EC 3.1.6.2), Nйдеться про сполуки формули II: алкіл- і N-арил-похідні цих ефірів сульфамінової кислоти та їх фармацевтично прийнятних солей. Сполуки формули (І). в якій R1 і R2 кожен незалежно один від одного являє собою Н, алкіл, циклоалкіл, алкеніл та арил або разом вони являють собою алкілен, який необов'язково містить один чи кілька гетеро-атомів або груп у ланцюзі алкілену, і гр упа -O в якій R1 і R2 мають наведені вище значення, а циклічна система ABCD являє собою заміщене чи незаміщене, насичене чи ненасичене стероїдне ядро, більш прийнятно естрон або дегідроепіандростерон. Інші прийнятні системи стероїдних кілець яв 9 70957 10 ляють собою: заміщені естрони, а саме: 2-ОН-естрон, 2-метокси-естрон, 4-ОН-естрон, 6α-ОН-естрон, 7α-ОН-естрон, 16α-ОН-естрон, 16βΟΗ-естрон, естрадіоли і заміщені естрадіоли, а саме: 2-OН-17β-естрадіол, 2-метокси-17β-естрадіол, 4-ΟΗ-17β-естрадіол,6α-OН-17β-естрадіол, 7α-ОН17β-естрадіол, 16α-ОН-17α-естрадіол, 16α-ОН17α-естрадіол, 16β-OH-17β-ecтpaдioл, 17αестрадіол, 17β-ecтpaдioл, 17α-етиніл-17βестрадіол, естріоли і заміщені естріоли, а саме: естріол, 2-ОН-естріол, 2-метокси-естріол, 4ОН-естріол, 6α-ОН-естріол, 7α-ОН-естріол, заміщені дегідроепіандростерони, а саме: 6α-ОНв яких R1 і R2 являють собою C1-5-алкіл, тобто дегідроепіандростерон, 7α-ОНестрон-3-сульфамат і дегідроепіандростерон-3дегідроепіандростерон, 16α-ОНсульфамат та їх N-(С1-5) -алкіл-похідні, особливо дегідроепіандростерон, 16β-ΟΗдиметил-похідні R1=R2=CH3. дегідроепіандростерон. Ефіри сульфамінової кислоти, що пропонуЦиклічна стероїдна система ABCD може місються винаходом, одержують шляхом реакції потити різні замісники, що не заважають. Зокрема, ліциклічного спирту, наприклад, естрону чи дегідциклічна система ABCD може містити один чи кіроепіандростерону з сульфамілхлоридом лька гідрокси, алкіл, особливо нижчий алкіл- (С1-6) R1R2NSO2Cl, тобто згідно з схемою, поданою на -замісників, наприклад, метил, етил, н-пропіл, ізостор. Error! Bookmark not defined. пропіл, н-бутил, втор.-бутил, трет.-бутил, н-пентил, та інших ізомерів пентилу, а також н-гексил і інші ізомери гексилу, алкокси, особливо нижчі (С1-6) алкокси-замісники, наприклад метокси, етокси, пропокси тощо, алкініл, наприклад, етиніл чи галоген, наприклад, фтор. Прийнятні нестероїдні циклічні системи включають: діетилстильбоестрол, стильбоестрол та інші циклічні системи, за умови, що сульфати маВідповідно до зазначеної схеми реакцію проють Кm-значення менше 50мкмолей зі стероїдсульфатазою EC 3.1.6.2. водять у такий спосіб: Якщо подані винаходом заміщені, N-заміщені Нітрат натрію і сульфамілхлорид додають при перемішуванні в розчин естрону в безводному сполуки містять один чи два N-алкіл, N-алкеніл, Nдиметилформаміді при 0°С. Далі реакцію провоциклоалкіл або N-арил-замісники, більш прийнятдять при нагріванні до кімнатної температури ще ним є, якщо вони чи кожен з них містить максимум 10 С-атомів. У випадку, якщо R1 і/або R2 алкіл, протягом 24 годин. Реакційну суміш виливають у більш прийнятно вибирати такі значення, при яких холодний насичений розчин бікарбонату натрію і водяну фазу, що утворилася, екстрагують ди хлоR1 і R2 кожен незалежно один від одного вибирарметаном. Об'єднаний органічний екстракт сушать ється з числа нижчих алкільних груп з 1-5 Снад безводним сульфатом магнію. Після фільтруатомами, тобто з числа метилу, етилу, пропілу тощо. Більш прийнятним є, якщо R1 і R2 обидва вання та подальшого випарювання розчинника у являють собою метил. У випадку, якщо R 1 і/або R2вакуумі і співвипарювання з толуолом одержують необроблений залишок, який далі очищають за арил, звичайно -феніл і толіл (-PhCH 3, о-, м-, парадопомогою флеш-хроматографії. ). Якщо R1 і R2 являють собою циклоалкіл, звичайУ разі необхідності функціональні групи в поно це - циклопропіл, циклопентил, циклогексил тощо. З'єднані разом R1 і R2 являють собою групу ліциклічному спирті (стеролі) можуть бути захи щеалкілену, за умови, що кільце складається з 4-6 Сні у відомий спосіб з подальшим видаленням захисної гр упи чи гр уп наприкінці реакції. атомів, які необов'язково розриваються одним чи Для фармацевтичного застосування інгібітори кількома гетеро-атомами чи групами, наприклад, стероїд-сульфатази, що пропонуються цим винаO- або -NH- з одержанням 5-, 6- чи 7-членного гетероциклу наприклад, морфоліну, піролідину чи ходом, можуть бути приготовлені відповідно до піперидину. відомих випробуваних традиційних фармацевтичних методик з використанням традиційних фармаПід алкільними, циклоалкільними, алкенільницевтичних носіїв, наповнювачів, розріджувачів ми й арильними групами слід мати на увазі групи, тощо, які звичайно рекомендуються для парентещо містять в якості замісників у них одну чи кілька груп, які не справляють впливу на інгібуючу активрального застосування. Середня ефективна доза ність сульфатази в сполуках, що розглядаються. залежно від індивідуальної активності сполук, що розглядаються у цьому винаході, і в розрахунку на Замісниками, що не заважають, можна вважасередню вагу тіла пацієнта (70кг) коливається в ти гідрокси, аміно, гало, алкокси, арил і алкіл. межах від 100 до 800мг/день. Звичайна доза для Більш прийнятними є сполуки формул III та IV. більш прийнятних і більш активних сполук складає від 200 до 800мг/день, більш прийнятно 200500мг/день, ще більш прийнятно від 200 до 11 70957 12 250мг/день. Ліки можна приймати у вигляді одноδ 1Н (270МГц. CDCl3): 0,91 (с.3Н, С18-Ме) , кратної дози, дрібної дози або ж багаторазових 1,28-1,68 (м,6Н) , 1,93-2,60 (серія від м.7Н), 2,90дрібних доз протягом кількох днів. Для орального 2,95 (м.2Н), 2,94 (д.3Н; J=5,13Гц.Me Ν-) 4,68-4,71 застосування лікарські засоби можуть бути приго(шир. м.змінюваний, 1Η-NH), 7,02-7,07 (м.2Н), товлені у вигляді таблеток, капсул, чи розчинів 7,26-7,32 (м.1Н). суспензій, які містять від 100 до 500мг сполуки на m/z /%/: 364(М+Н)+ стандартну дозу. Більш прийнятним є, якщо для Приклад 3 парентерального застосування сполуки будуть Одержання естрон-3-Ν,Ν-диметилсульфамату приготовлені при використанні придатних для паПовторюють методику, описану в прикладі 1, рентерального введення носіїв, і якщо однократна але замість сульфамоїлхлориду беруть таку ж денна доза міститиме від 200 до 800мг, більш прикількість Ν,Ν-диметил-сульфамоїлхлориду. йнятно від 200-500, ще більш прийнятно від 200 до При аналізі одержують такі результати: 250мг зазначених сполук. Однак такі ефективні δ 1Н (270МГц. CDCl3): 0,92 (с.3Н.С18-Ме), 1,39денні дози досить сильно залежатимуть від актив1,75 (м.5Н), 1,95-2,60, (серія від ності, притаманній активному інгредієнту, і значм,6Н/.2.82/с,3H,MeN-/, 2,96-3,00(м.4Н), 2,98(с.3Н, ною мірою повинні визначатися вагою тіла пацієнMeN-/, 7,04 (шир.д.2Н.J=7,69Гц), 7,29 та, що завжди повинно враховуватись лікуючим (шир.д.1Н.J=7,88Гц) лікарем. m/z/%/:377(M/+ Для так званого "часткового" застосування, Дані мікроаналізу: розглядається питання, що запропоновані винахоС Η Ν дом інгібітори стероїд-сульфатази можуть викориРозраховано: 63,63% 7,21% 3,71% стовуватись для комбінованого лікування, або в Знайдено: 63,50% 7,23% 3,60% поєднанні з іншим інгібітором сульфатази, або Приклад 4 наприклад, у комбінації з інгібітором ароматази, Інгібування стероїд-сульфатазної активності в зокрема, з 4-гідроксіандростендіоном (4-ОНА), MCF7-клітинах під дією естрон-3-сульфамату Більш докладно предмет винаходу ілюстр уПід стероїд-сульфатазою слід розуміти стериється наведеними нижче прикладами і результальну сульфа тазу ЕС 3.1.6.2. тами проведених випробувань. Стероїд-сульфатазну активність вимірюють in Приклад 1 vitro, використовуючи для цієї мети інтактні MCF-7 Одержання естрон-3-сульфамату ракові клітини грудей людини. Гормонзалежну ліГідрид натрію (60% дисперсія, 2екв.) і сульнію клітин широко використовують для регуляції фамоїлхлорид (2екв.) додають при перемішуванні росту ракових кліток грудей людини. Вона відрізв розчин естрону (1екв.) у безводному диметилняється яскраво вираженою стероїдформаміді при 0°С. Потім реакцію проводять при сульфатазною активністю (Maclndoe та співр. Enнагріванні до кімнатної температури, продовжуючи docrinology, 123,1281-1287/1988/. Purohit та Reed. перемішування, ще протягом 24 годин. Int. J.Cancer 50.901-905 (1992)) і може бути отриРеакційну суміш виливають у холодний насимана в США з Американської колекції клітинних чений розчин бікарбонату натрію, і водну фазу, що культур, а у Великобританії, наприклад, з Королівутворилася, екстрагують дихлорметаном. Об'єдського фонду ракових досліджень. Клітини обробнаний органічний екстракт сушать над безводним ляють у мінімальному ессенціальному середовищі сульфатом магнію. Після фільтрування з подаль(Flow Laboratories, Irwine, Шотландія), що містить шим випарюванням розчинника у вакуумі і співви20ммолей HEPES ,5% сироватки новонароджених парюванням з толуолом одержують необроблений великої рогатої худоби, 2ммолей глютаміну, амінопродукт, який потім очищають за допомогою кислоти і 0,075% бікарбонату натрію. До 30 посуфлеш-хроматографії. Аналіз дає такі результати: δ дин із зразками клітинних культур (25см 2) засіва1 Н/270МГц. CD3OD/: 0,91 (с.3Н.С18-Ме) , 1,40-2,55 ють приблизно 2х105 клітин на кожну посудину, (серії від м, 13Н), 2,90-2,92 (м.2Н), 7,04 (шир.д. використовуючи назване вище середовище. КлітиJ=10,44Гц), 7,33 (шир.д. 1Н. J=8,42Гц). ни вирощують до 80% злить, середовище змінюδ 13С (67,8МГц. CD3OD): 14,53 (кв.С18-Ме), ють кожен третій день. 22,80 (т), 27,24 (т), 27,73 (т); 30,68 (т); 33,05 (т), Інтактні моношари клітин MCF-7 у трьох варіа37,01 (т), 39,76 (д), 45,73 (c.C18), 51,86 (д), 120,76 нтах по 25см 2 клітинної культури у кожній посудині (д), 123,54 (д), 127,89 (д), 139,83 (с), 150,27 (с), промивають збалансованим сольовим розчином 273,87 (с, с=0). Ерла (EBS9, з ICN Flow, High Wycombe, Великоm/z /%/:349/9/ /m+/, 270(100), 233(26), 185(43), британія) і витримують протягом 3-4 годин при 172(31), 159(21), 146(36), 91(33), 69(37); 57(73), 37°С з 5пмолями (7х105 число розпадів на хвили43(56), 29(24). ну) (6,7-3Н)-естрон-3-сульфату) питома активність Дані мікроаналізу: 60кюрі/ммоль з Ядерної спілки Нова Англія, БосС Η Ν тон, Масачусетс, США) у мінімальному середовиРозраховано: 61,87% 6,63% 4,01% щі, що не містить сироватки (2,5мл), разом з естЗнайдено: 61,90% 6,58% 3,95% рон-3-сульфаматом (11 концентрацій: 0; 1фΜ; Приклад 2 0,01nΜ; 0,1пМ; 0,01нМ; 0,1нМ; 1н М; 0,01мкМ; Одержання естрон-3-N-метилсульфамату 0,1мкМ; 1мкМ). По закінченні витримування кожну Повторюють методику, описану в прикладі 1, посудину охолоджують, і середовище піпеткою але замість сульфамоїл хлориду бер уть таку ж вводять в окремі трубки, що містять (14С/естрон) кількість метилсульфамоїлхлориду. При аналізі 7x103 розпадів/на хв. Питома активність одержують такі результати: 97кюрі/ммоль отримана з Емерсгеймського Міжна 13 70957 14 родного радіохімічного центра Amersham, Великоробки моношарів клітин запоніном. Одну посудину британія). Суміш струшують протягом 30 секунд з в кожній серії використовують для оцінки стану толуолом (5мл). Експерименти показують, що оболонки клітини і її життєздатності, використову>90% (14С) естрону і