Похідні пептидів, фармацевтична композиція,спосіб стимулювання секреції гормону росту з гіпофізу

1 Производные пептидов общей формулы І A-B-D-E-(F)P, где р принимает значение 0 или 1, А представляет собой имидазолил-Сі-Сє-алкановую кислоту, имидазолил-Сі-Сб-алкеновую кислоту, амино-Сі-Сб-алкановую кислоту, амино-Сі-Сє-алкеновую кислоту, L- или D-a-аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из H-His, Н-АІа, H-DАІа, Н-р-аланина, Н-аминомасляной кислоты, саркозина и Gly, В представляет собой D-Trp, D-2Nal или D-Phe, С представляет собой Ala, Ser или Gly, D представляет собой Trp, Phe, р-(2-тиенил)-аланин или N-арал кил глицин, Е, когда р равно 1, представляет собой D-Phe или, когда р равно 0, Е представляет собой - NH-CH(CH2-R3)-CO-R4 или NH-CH(CH2-R3)-CH2-R4, где R3 представляет собой фенил, a R4 представляет собой пиперазино-, морфолино-, пиперидиногруппу, -ОН или -N(R5)R6, где каждый из R5 и R6 независимо представляет собой водород или низший алкил, F, когда р равно 1, представляет собой NH КОМПОЗИЦІЯ,СПОСІБ СТИМУЛЮВАННЯ СЕКРЕЦІЇ 1П 7 CH(R )-(CH2)v-R )-, где v равно 0 или целому числу от 1 до 8, и R представляет собой имидазолил-, пиперазино-, морфолино-, пиперидиногруппу или -N(R8)R9, где каждый из R8 и R9 независимо представляет собой водород, низший алкил или продукт перегруппировки Амадори из аминогруппы и гексапиранозы или гексапиранозилгексапиранозы формулы 1П 11 и R представляет собой -Н, -СООН, CO-R , СН2R11 или СН2-ОН, где R11 представляет собой пиперазино-, морфолино-, пиперидиногруппу или N(R12)-R13, г Д е каждый из R12 и R13 независимо является водородом или низшим алкилом, с условием, что между А и В, В и С, С и D, D и Е присутствует по меньшей мере одна амидная связь, или, когда р равно 1, Е и F замещены аминометиленовой группой, или, когда р равно 0, Е представляет собой -NH-CH(CH2-R )-CH2-R4, или, когда р равно 1, R10 представляет собой CH2-R11, или их фармацевтически приемлемая соль 2 Производное пептидов по п 1, отличающееся тем, что р имеет значение 1 3 Производное пептидов по п 1, отличающееся тем, что А представляет собой His, D-Ala или имидазолилпропионовую кислоту 4 Производное пептидов по п 1, отличающееся тем, что В представляет собой D-Trp или D-2Nal 5 Производное пептидов по п 1, отличающееся тем, что С представляет собой Ala 6 Производное пептидов по п 1, отличающееся тем, что D представляет собой N-бензилглицин или Тгр 7 Производное пептидов по п 1, отличающееся тем, что Е представляет собой D-Phe 8 Производное пептидов по п 1, отличающееся тем, что v равно 6, a R7 равно -NH 2 9 Производное пептидов по п 1, отличающееся О (О ю 45962 АІаУ(СН2МН)Тгр-О-Ргіе-І\ІН)-6-аминогексанол, 3-((3-(4-имидазолил)пропионил)-О-ТгрАІаУ(СН2МН)Тгр-О-Ргіе-МН)пропиламин, H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-Phe4J(CH2NH)LysNH2, H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-Phe4J(CH2NH2) 11 Фармацевтическая композиция, содержащая активный компонент вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, отличающаяся тем, что в качестве активного компонента она содержит фармакологически эффективное количество производного пептидов общей формулы I или его фармацевтически приемлемой соли 12 Фармацевтическая композиция по п 11, отличающаяся тем, что она представляет собой унифицированную лекарственную форму, которая содержит от около 10 до около 200 мг производного пептидов общей формулы I или его фармацевтически приемлемой соли 13 Фармацевтическая композиция для стимулирования секреции гормона роста из гипофиза, содержащая активный компонент вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, отличающаяся тем, что в качестве активного компонента она содержит фармакологически эффективное количество производного пептидов общей формулы I или его фармацевтически приемлемой соли 14 Способ стимулирования секреции гормона роста из гипофиза, включающий введение пациенту, МИН, нуждающемуся в стимулировании, активного сое(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-qbeHHnnдинения, отличающийся тем, что в качестве актиропиламин, вного соединения вводят эффективное количестH-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-Phe4J(CH2NH)Lysво производного пептидов общей формулы I или NH2, его фармацевтически приемлемой соли (23)-((3-(4-имидазолил)пропионил)У(СН2І\ІН)О15 Способ по п 14, отличающийся тем, что эфPhe-Ala-Trp-D-Phe-NH)-6-aMHHoreKcaHon, фективное количество соединения общей форму(23)-((3-(4-имидазолил)пропионил)-Олы I или его фармацевтически приемлемой соли РпеЧЧСН2І\ІН)АІа-Тгр-О-Рпе-І\ІН)-6-аминогексанол, или эфира находится в интервале приблизитель(23)-((3-(4-имидазолил)пропионил)-О-Рпено от 0,0001 до 100 мг/кг массы тела в день, предАІаЧЧСН2І\ІН)Тгр-О-Рпе-І\ІН)-6-аминогексанол, почтительно приблизительно от 0,001 до 50 мг/кг (23)-((3-(4-имидазолил)пропионил)-О-Рпе-АІамассы тела в день ТгрЧЧСН2МН)О-Ргіе-І\ІН)-6-аминогексанол, 16 Производное пептидов по п I, отличающееся (2S)-(2R)-((3-(4-HMHfla3onHn)nponHOHHn)-D-Phe-Alaтем, что оно или его фармацевтически приемлеТгр-І\ІН)-3-фенилпропиламино)-6-аминогексанол, мая соль представляют собой активный компо3-((3-(4-имидазолил)пропионил)-О-Тгр-АІанент для получения фармацевтической композиУ(СН2МН)Тгр-О-Рпе-МН)пропиламин, ции для стимулирования секреции гормона роста (23)-((3-(4-имидазолил)пропионил)-О-Рпе-АІа-Тгриз гипофиза О-РИе^(СН2МН)-6-аминогексанол, (23)-((3-(4-имидазолил)пропионил)-О-Тгр-О тем, что R представляет собой -CONbb, -СН2ОН 10 Производное пептидов по любому из пп 1-9, отличающееся тем, что оно выбрано из группы, состоящей из H-His4J(CH2NH)D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2, H-His-D-Trp4J(CH2NH)Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2, H-His-D-Trp-Ala4J(CH2NH)Trp-D-Phe-l_ys-NH2, H-His-D-Trp-Ala-Trp4J(CH2NH)D-Phe-l_ys-NH2, H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)l_ys-NH2, H-D-Ala-D-2Nal-Ala4J(CH2NH)Trp-D-Phe-Lys-NH2, H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)Lys-NH2, (3-(4-имидазолил)пропионил)-О-2МаІ-АІа-Тгр-ОPhe4J(CH2NH)Lys-OH, (3-(4-имидазолил)пропионил)-О-2МаІ-АІа-Тгр-ОPhe4J(CH2NH)Lys-NH2, (3-(4-имидазолил)акрилоил)-О-2МаІ-АІа-Тгр-ОPhe4J(CH2NH)Lys-NH2, H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)Lys-NH2, (2R)-(H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-4>eHHnnponiinaмин, (2S)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala4J(CH2NH)Trp-D-Phe-NH)6-аминогексанол, H-D-Ala-D-2Nal-Ala4J(CH2NH)Trp-D-Phe-NH2, 4-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala4J(CH2NH)Trp-D-Phe-NH)6yтиламин, (2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-qbeHHnnponHламин, ((2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3^eHHnnponnламино)гексиламин, (2R)-(H-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3^eHHnnponnna Настоящее изобретение относится к новым производным пептидов, содержащим их композициям и их применению для лечения медицинских нарушений, являющихся результатом дефицита гормона роста Гормон роста является гормоном, который стимулирует рост всех способных расти тканей Кроме того, известно, что гормон роста обладает рядом действий на метаболические процессы, например, стимуляцию синтеза белков и мобилизацию свободных жирных кислот, и вызывает пере ключение в энергетическом метаболизме из метаболизма углеводов в метаболизм жирных кислот Дефицит гормона роста может приводить к ряду тяжелых медицинских нарушений, например карликовости Гормон роста секретируется из гипофиза Секреция происходит под строгим контролем ряда гормонов и нейромедиаторов непосредственно или косвенно Секрецию гормона роста можно стимулировать гормоном, высвобождающим гормон роста (GHRH), и ингибировать соматостатином В 45962 1П 7 обоих случаях гормоны секретируются из гипотает собой -NH-CH (R ) - (CH2)v -R )- где v является ламуса, но их действие связано гласным образом 0 или целым числом от 1 до 8 и 7 через специфические рецепторы, локализованные R представляет собой имидазолил, пиперазив гипофизе Описаны также другие соединения, но, морфолино, пиперидиногруппу или П-(р8)-р9, 8 9 которые стимулируют секрецию гормона роста из где каждый из R и R независимо представляет гипофиза Например, аргинин 1 -3,4-дигидроксисобой водород или низший алкил, или продукт пефенилаланин (1,-Дола), глюкагон, вазопрессин, регруппировки Амадори из аминогруппы и гексапиРАСАР (пептид, активирующий аденилилциклазу ранозы или гексапиранозилгексапиранозы формугипофиза), агонисты мускариновых рецепторов и лы синтетических пептид, CHRP (пептид, высвобождающий гормон роста) высвобождают эндогенный гормон роста путем непосредственного действия на гипофиз или путем воздействия на высвобождение СВД1Н и/или соматостатина из гипоталамуса В заболеваниях или состояниях, где желателен повышенный уровень гормона роста, природа белка гормона роста делает невозможным любые пути введения кроме парентерального введения Кроме того, другие непосредственно действующие природные усиливающие секрецию средства, например GHRH и РАСАР, являются более длинными пептидами, по этой причине пероральное введение их невозможно Применение более коротких пептидов для повышения уровня гормона роста у млекопитающих ранее описано, например в ЕР 18 072, ЕР 83 864, WO 89/07110, WO 89/1711, WO 89/10933, WO 88/9780, WO 83/02272, WO 91/18016, WO 92/01711 и WO 93/04081 Строение пептидов или производных пептидов, высвобождающих гормон роста, важно для их активности по высвобождению гормона роста, а также их биологической доступности Поэтому целью настоящего изобретения является предложение пептидов со свойствами высвобождения гормона роста, которые обладают улучшенными свойствами по сравнению с известными пептидами этого типа Краткое изложение существа изобретения Настоящее изобретение относится к соединению общей формулы 1 A-B-C-D-E-(F)p где р принимает значения 0 или 1, А представляет собой имидазолил -Сі є-алкановую кислоту, имидазолил-Сі є-алкеновую кислоту, амино -Сі 6-алкановую кислоту или амино -Сі 6-алкеновую кислоту или L - или D-a - аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из H-His, HАІа, H-D-АІа, Н-(р-аланина), H-Aib, саркозина и Gly, В представляет собой D-Trp, D-2Nal или DPhe, С представляет собой Ala, Ser или Gly, D представляет собой Trp, Phe, р -(2-тиенил) аланин или - аралкилглицин, Е, когда р равно 1, представляет собой, DPhe, или, когда р равно 2, Е представляет собой NH-CH(CH2-R )-CO-R4 или -NH-CH(CH2-R3)-CH2R4, где R представляет собой фенил, и R4 представляет собой пиперазино, морфолино, пиперидиногруппу, -ОН или -N(R5)P, где каждый из R5 и R6 независимо представляет собой водород или низший алкил, Р, когда р принимает значение 1, представля 1П 11 и R представляет собой -Н, -СООН, -CO-R , CH2-R11 или -СН2-ОН, где R11 представляет собой пиперазино-, морфолино-, пиперидиногруппу или N(R1 )-R13, где каждый из R12 и В1 независимо является водородом или низшим алкилом, с условием, что по меньшей мере, одна амидная связь между А и р , В и С, C H D , D H E ИЛИ, когда р является 1, Е и Р замешена аминометиленовой, или что, когда р является О, Е представляет собой -NHCH(CH2-R3)-CH2-R4, или что, когда р является 1, R10 представляет собой CH2-R11, или фармацевтически приемлемой соли этого соединения Полагают, что производные пептидов формулы 1 обладают повышенной устойчивостью к протеолитической деградации ферментами желудочно-кишечного тракта или плазмы вследствие замещения амидной связи (-CONH-) аминометиленовой (-CH2NH-) или путем введения N- аралкилглицина, Предполагается, что повышенная устойчивость к протеолитической деградации производных пептидов настоящего изобретения повышает их биологическую доступность по сравнению с биологической доступностью пептидов, предложенных в предшествующей литературе В настоящем контексте термин "низший алкил" предназначен для обозначения алкила с 1 - 6 атомами углерода, конкретно, метила, этила, пропила, изопропила, бутила, пентила или гексила Подробное описание изобретения В предпочтительном варианте соединения формулы 1, р является 1 В другом предпочтительном варианте соединения формулы 1 А представляет собой His, D -Ala или имидазолилпропионовую кислоту В предпочтительно представляет собой -Trp p или D-2NA1 С предпочтительно представляет собой Ala D в значении N-аралкилглицин предпочтительно представляет собой N-бензилглицин D предпочтительно представляет собой Trp E предпочтительно представляет собой Phe В пределах значения P,v предпочтительно является числом 3 - 6, и R7 предпочтительно является -ПН2 Р10 предпочтительно представляет собой-CONH2,-CH2OH Примерами конкретных соединений изобретения являются 8 45962 Аминометиленовую связь в качестве замеще(CH2NH)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-1 ys-NH2 ния амидной связи можно ввести в соответствии H-His-D-Trp4J(CH2NH)-Ala-Trp-D-Phe-1ys-NH2 со способом, описанным Y H-His-D-Trp-Ala4J(CH2NH)-Trp-D-Phe-1ys-NH2 5 H-His-D-Trp-Ala-Trp4J(CH NH)-D-Phe-1ys-NH2 Sasaki and DH Coy, Peptides 8(1) 1987, pp H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)-1ys-NH2 119-121 Производные пептидов, содержащие моH-D-Ala-D-2Na1 4J(CH2NH)-Trp-D-Phe-1 ys-NH2 но- или дигексапиранозолзамещенную аминогрупH-D-Ala-D-2Na1-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)-1ys-NH2 пу, можно получить перегруппировкой Амадори (3-(4-имидазолил) nponnoHHn)-D-2Na1-Ala-Trp-Dпри помощи способа, описанного R Albert et al , Phe4J(CH2NH)-1ys-0H life Sciences 53 1993, pp 517-525 примерами подходящими моно- или дигексапираноз являются (3-(4-имидазолил) nponnoHHn)-D-2Na1-Ala-Trp-Dглюкоза, галактоза, мальтоза, лактоза или целлоPhe4J(CN2NH)-1ys-NH2 биоза Производные, применяемые в качестве ис(3-(4-имидазолил) aKpHnonn)-D-2Na1-Ala-Trp-Dходных соединений синтеза, можно получить комPhe4J(CH2NH)-1ys-NH2 мерческим путем, и в них, если требуется, можно H-D-Ala-Phe-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)-1ys-NH2 ввести подходящие защитные группы Фармацев(2R)-(H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-cpeHHnnpoHnaтически приемлемые соли соединений формулы 1 мин с кислотами включают соли, полученные реакцией (2S)-(H-D-Ala-D-2Na1-Ala4J(CH2NH)-Trp-D-The-NH)пептида с неорганическими или органическими ки6-аминогексанол слотами, например, соляной, бромистоводородH-D-Ala-D-2Na1-Ala4J(CH2NH)-Trp-D-Phe-NH2 ной, серной, уксусной, фосфорной, молочной, ма4-(H-D-Ala-D-2Na1-Ala4J(CN2NH)-Trp-D-Phe-nh)6yлеиновой, фталевой, лимонной, глутаровой, глютиламин коновой, метансульфокислотой, салициловой, ян(2R)-(H-D-Ala-D-2Na1-Trp-NH)-3^eHHnnponHnaMHH тарной, винной, толуолсульфокислотой, трифто((2R)-H-D-Ala-D-2Na1-Ala-Trp-NH)-3^eHHnnponHруксусной, сульфаминовой и фумаровой кислотой ламино) гексилами В другой особенности настоящее изобретение (2R)-(H-D-2Na1-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3^eHHnnponnотносится к фармацевтической композиции, соделамин ржащей в качестве активного компонента соеди(2R-)-H-D-Ala-D-2Na1-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3^eHHnnнение общей формулы 1 или его фармацевтичесропиламин ки приемлемую соль вместе с фармацевтически H-Aib-D-2Na1-Ala-N-Bzl-Gly-D-Phe4J(CH2NH)-1ysприемлемым носителем или разбавителем NH2 Фармацевтические композиции, содержащие (2Э)-((3-(4-ими дазол ил) пропионил) YfCbbNHJ-Dсоединение настоящего изобретения , можно поPhe-Ala-Trp-D-Phe-NH)-6-aMHHoreKcaHon лучить обычными методиками, например, как опи(2S)-((3(4-ими дазол ил) пропионил) -Dсано в Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985 Phe4J(CH2NH)-Ala-Trp-D-Phe-NH) -6-аминогексаКомпозиции могут быть в обычных лекарственных нол формах, например, в форме капсул, таблеток, аэ(2S)-((3- (4-ими дазол ил) пропионил) -D-Pheрозолей, растворов, суспензий или местных аппА1а^(СН2МН)-Тгр-О-РИе-МН)-6-аминогексанол ликаций (2S)-((3- (4-ими дазол ил) пропионил) -D-Phe-AlaТгрФ(СН2МН)-Рпе-МН)-6-аминогексаноп Применяемый фармацевтический носитель (2s)-(2R)-) (3-(4-ими дазол ил) пропионил) -D-Pheили разбавитель может быть обычным твердым Ala-Trp-NH) -3-фенилпропиламино)-6-аминогексаили жидким носителем Примеры твердый носитенол лей включают лактозу, terra alba сахарозу, циклодекстрин, тальк, желатин, агар, пектин, аравийс3-((3-(4-ими дазол ил) пропионил) -Dкую камедь, стеарат магния, стеариновую кислоту TrpAlaYfCbbNHJ-Trp-D-Phe-NH) пропиламин или низшие алкиловые эфиры целлюлозы Приме(2Э)-((3-(4-ими дазол ил) пропионил) -D-Phe-Alaрами жидких носителей являются сироп, арахисоТгр-0-РпеФ(СН2МН)ВН)-6-аминогексаноп вое масло, оливковое масло, фосфолипиды, жир(2S)-((3-(4-HMH дазол ил) пропионил) -D-Trpные кислоты, амиды жирных кислот, полиоксиэтиА1а^(СН2МН)-Тгр-О-РИе-МН)-6-аминогексанол лен и вода 3-((3-(4-ими дазол ил) пропионил) -D-Trp-AlaYfCbhNHJ-Trp-D-Phe-NH) пропиламин Подобным образом носитель или разбавитель H-D-Ala-D-2Na1-Ala-N-Bzl-Gly-D-Phe4J(CH2NH)может включать любой известный в настоящей 1ys-NH2 области материал, постепенно высвобождающий H-Aib-D-2Na1-Ala-N-Bzl-Gly-D-Phe4J(CH2NH2) активный компонент, например, глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, возможно в смеси с Применяемая аббревиатура воском D-2Nal D-2-нафтилаланин Если твердый носитель применяют для пероN-Bzl N-бензилглицин рального введения препарат можно таблетироH-Aib Н-аминоизомасляная кислота вать, помещать в виде порошка или шариков в Соединения формулы 1 можно получить обытвердые желатиновые капсулы или препарат мочными способами синтеза пептидов в растворе жет быть в форме пастилки или лепешки Количеили твердой фазе Например, твердофазный синство твердого носителя будет широко изменяться, тез можно проводить по существу, как описано но обычно оно будет от около 25 мг до около 1 г Stewart and Yong, Solid Phase Peptid Synthesis 2nd Ed, Rockford, Illinois, USA 1976 Синтез пептидов в Типичная таблетка, которую можно получить растворе можно, например, проводить способом, обычными техниками таблетирования, может соописанным Bodansky etal, Peptide Synthesis, 2nd держать Ed, New York, New York, 1976 45962 10 Сердцевина формулы 1 или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для АІСГИВНЬІЙ компонент (в виде свободного стимулирования секреции гормона роста из гипосоединения или его соли) 100 мг физа Коллоидный диоксид кремния (Aerosil) 1,5мг Целлюлозу, микрокристаллическую Тем, кто является специалистом настоящей области, хорошо известно, что современное и воз(Avicel) 70 мг можное применение гормона роста для людей раМодифицированную целлюлозную смолу знообразно и многочисленно Предполагается, что (Ac-Di-Sol) 7,5мг соединения формулы 1 можно вводить для целей Стеарат магния стимулирования секреции гормона роста из гипоОболочка физа, и они в таком случае могли бы иметь дейстНРМС (около) 9мг вия или применения, аналогичные тем, которые Mywacett 9-40 Т (около) 0,9мг имеет сам гормон роста Применения гормона роАцилированный моноглицерид, применяемые ста можно суммировать следующим образом стив качестве пластификатора для пленочной оболомулирование секреции гормона роста у пожилых чки пациентов, предотвращение катаболических побоБели применяют жидкий носитель, препарат чных эффектов глюкокорикоидов, лечение остеоможет быть в форме сиропа, эмульсии, мягкой жепороза, стимулирование иммунной системы, усколатиновой капсулы или стерильной инъецируемой рение заживления ран, ускорение заживления пежидкости, например, водной или неводной жидкой релома костей, лечение задержки роста, лечение суспензии или раствора почечной недостаточности или недостаточности, Для назального введения в виде аэрозоля являющейся результатом задержки роста, лечепрепарат может содержать соединение формулы ние физиологического маленького роста, включая 1, растворенное или суспендированное в жидком дефицит гормона роста у детей и маленький рост, носителе, в частности водном носителе Носитель связанный с хроническим заболеванием, лечение может содержать добавки, такие как солюбилизиожирения и задержки роста, связанной с ожиренирующие агенты, например пропиленгликоль, повеем, лечение задержки роста, связанной с синдрорхностно-активные вещества, например соли желмом Прадера-Вилли и синдромом Tamer's, ускоречных кислот или полиоксиэтилированные высшие ние выздоровления и уменьшение госпитализации спирты, средства, повышающие поглощение, наобожженных пациентов, лечение внутриутробной пример лецитин (фосфатидилхолин) или циклодезадержки роста, скелетной десплазии, гиперкортикстрин, или консерванты, например парабены золизма и синдрома Кушинга, индуцирование Обычно соединения настоящего изобретения пульсирующей секреции гормона роста, восполнеготовят в виде унифицированной лекарственной ние гормона роста у пациентов со стрессовым соформы, содержащей 0,0001-100 мг активного комстоянием, лечение остеохондродисплазии, синдпонента вместе с фармацевтически приемлемым рома Нунана, шизофрении депрессий, болезни носителем в каждой унифицированной дозе Альцгеймера, замедленного заживления раны и Подходящая доза соединений в соответствии психосоциальной депривации, лечение легочной с настоящим изобретением составляет 1 - 500 дисфункции и зависимости от искусственной венмг/день, например около 100 мг на дозу, при вветиляции легких, ослабление белковых катаболидении пациентам, например людям, в качестве леческих реакций после "большой" операции, снижекарственного средства ние кахексии и белковой потери вследствие хроПоказано, что соединения общей формулы 1 нического заболевания, например, рака или СПИобладают способностью высвобождать эндогенДа, лечение гиперинсулинемии, включая гиперпный гормон роста in vivo, Следовательно, эти соелазию панкреатических островков, адъювантное динения можно применять для лечения состояний, лечение для индуцироваяия овуляции, стимулиродля которых требуется повышенный уровень горвание развития тимуса и предупреждения связанмона роста в плазме крови, например, у имеющих ного с возрастом снижения Функции тимуса, лечедефицит гормона роста людей или пожилых пациние пациентов с иммунодепрессией, укрепление ентов или домашнего скота повышения подвижности мышц, поддерживание толщины кожи, метаболического гомеостаза, почеТаким образом, в конкретной особенности начного гомеостаза у ослабленных пожилых людей, стоящее изобретение относится к фармацевтичесстимулирование остеобластов, костной коррекции кой композиции для стимулирования секреции гои роста хрящей, стимулирование иммунной систермона роста из гипофиза, причем данная композимы у домашних животных и лечение нарушения ция содержит в качестве активного компонента соиз-за старения у домашних животных, стимулятоединение общей формулы 1 или его фармацевтира роста у скота и стимулирование роста шерсти у чески приемлемую соль вместе с фармацевтичесовец ки приемлемым носителем или разбавителем В следующей особенности настоящее изобретение относится к способу стимулирования секреДля указанных выше показаний дозировка буции гормона роста из гипофиза, причем данный дет изменяться в зависимости от применяемого способ предусматривает введение субъекту, нужсоединения формулы 1, способа введения и желадающемуся в этом, эффективного количества соеемой терапии Однако, обычно пациентам и живодинения общей формулы 1 или его фармацевтитным вводят дозу между 0 0001 и 100 мг/кг массы чески приемлемой соли тела ежедневно для достижения эффективной секреции эндогенного гормона роста Обычно лекарЕще в одной особенности настоящее изобрественные формы, пригодные для перорального тение относится к применению соединения общей 11 45962 12 или назального введения содержит от около В первый день экспериментов клетки промы0,0001 мг до около 100 мг, предпочтительно от вают два раза указанной выше средой, содержаоколо 0,001 мг до около 50 мг соединений формущей 25 мМ НЕРЕ S, рН 7,4 Секрецию гормона ролы 1 в смеси с фармацевтически приемлемым носта инициируют путем добавления среды, содерсителем или разбавителем жащей 25 мМ НЕРЕ S и испытываемое соединение Инкубирование проводят в течение 15 мин Соединения формулы 1 можно вводить в форпри 27°С После инкубирования гормон роста, секме фармацевтически приемлемой соли с кислотой ретированный в среду, измеряют стандартным раили в тех случаях, когда целесообразно, соли щедиоиммуноанализом (РИА) лочного металла или щелочноземельного металла или (низший алкил)аммония Считают, что таСоединения формулы 1 можно оценить на их кие соли обладают приблизительно такой же стевлияние на секрецию гормона роста у анестезиропенью активности, как и свободные основания ванных пентобарбиталом самок крыс, как описано ранее (Bercuetal , Endocrinology 1991, 129, 2592Фармацевтическая композиция изобретения 2598) Коротко, половозрелых самцов крыс может содержать соединение формулы 1 в сочеSprague Dawley анестезируют 50 мг/кг пентобартании с одним или несколькими соединениями битала внутрибрюшинно После достижения пообладающими другой активностью, например, анлной анестезии крысам имплантируют трахотомитибиотической или другими фармакологически акческую трубку, катетеры в сонную артерию и яретивными материалами Им может быть другое мную вену После 15 минутного восстановления усиливающее секрецию средство, например нормального состояния крыс, отбирают пробу кроGHRP (1 или 6) или CHRH или его аналоги, гормон ви во время О Внутренно вводят средства, усилироста или его аналог, или соматомедины, напривающее секрецию гормона роста из гипофиза, и мер 1GP-1 или 1GP2 пробы артериальной крови помещают на лед на Способ введения может быть выбран тот, с 15 мин и затем центрифугируют 2 мин при скоропомощью которого переносится активное соединести вращения 12000 х С Сыворотку декантируют ние в подходящее или желаемое место действия, и количество гормона роста определяют стандартнапример, пероральным, назальным или парентеным РИА Изобретение далее иллюстрируется ральным путем Предпочтителен пероральный следующими примерами, которые не ограничивапуть Кроме фармацевтического применения соеют объема изобретения динений формулы 1 можно использовать in vivo в способах исследования регуляции секреции горВ тексте описания применяют следующую абмона роста бревиатуру Аббревиатура для аминокислотных остатков Соединения формулы 1 могут быть пригодны in vivo в способах оценки способности гипофиза 2Nal секретировать гормон роста Например, пробы сыCH воротки крови, взятые до и после введения этих -NH соединений людям, можно анализировать на горн,с мон роста Сравнение содержания гормона роста о в каждой пробе сыворотки позволит непосредственно определить способность гипофиза пациенАббревиатура, применяемая для замещения тов секретировать гормон роста пептидной связи, Соединения формулы 1 можно вводить имеющим коммерческое значение животным для увеличения скорости степени их роста и для повышения Ф(СЬШН) надоя молока 2 Фармакологические методы Соединения формулы 1 можно оценить in vitro на их эффективность и активность для секреции гормона роста в первичных соматотрофных клетАббревиатура, применяемая для защитных ках крыс групп Первичные сомототрофные клетки крыс можCI-2FmocВосно получить , как описано ранее (Chen et al, Endocrinology 1991, 129, 3337 - 3342 и Chen et al, сн. о Endocrinology 1989, 124, 2791-2798) Кратко, крыс убивают декапитацией Быстро удаляют гипофиз Гипофиз ферментируют 0,2% коллагеназы и 0,2% гуалуринаэы в сбалансированном солевом растворе Хэнка Клетки ресуспендируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содеAaccржащей 0,37% ІЧаНСОз 10% лошадиной сыворотки, 2,5% фетальной телячьей сыворотки, 1% не являющихся незаменимыми аминокислот, 1% глитамина и 1% пенициллина/стрептомицина, и доводят содержание из до 1,5x105 клеток/мл Один ил этой суспензии помещают в каждую лунку планшетов из 24 лунок и оставляют на 2 - 3 дня до проведения экспериментов по секреции J? ни. 13 45962 14 Пример 1 при помощи 4 М H-His-D-Trp4J(CH2NH)-Ala-Trp-D-Phe-1ys-NH2 H2SO4 сушки неочищенный пептид растворяли в 5 Пептид на смоле формулы H-Ala-Trp-D-Pheмл 70% CH3CN/0,18 ТРА в Н2О и разбавляли во1us -смола синтезировали в соответствии с Fmocдой до достижения 50 мл 20 мл этого раствора стратегией на синтезаторе пептидов Applied разбавляли до 90 мл и вводили в колонку/ котоBiosystems 431 А в количестве 0,25 м моля с испорую затем элюировали при градиенте 21%-31% льзованием поставляемых производителем протоCH3CN в 0,05 М (NH4)2SO4 pH 2,5 и скорости 10 колов FastMoc UV которые применяют медииромл/мин в течение 47 мин при 40°С Содержащие ванные НВТ 2-(1Н-бенэотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетпептид фракции собирали и разбавляли 3 объемараметилуронигексафторофосфат) связывания (соми воды и пропускали через патрон Sep-Pac C18 единения) в NMP (Н-метилпирролидоне) и УФ(Waters part # 51910) который уравновешивали удаления Fmос-защитной группы В качестве исхо0,1%-ной ТРА Патрон затем элюировали 70%дной для синтеза смолы применяли 470 мг 4-(2',4'ным СНзСІЧ, содержащим 0,1% ТРА, и очищенный диметоксифенил-Ртос-аминометил) феноксисмопептид выделяли лиофилизацией после разбавлелы (Novabiochem AG Switzerland, cat 01-64-0013), ния элюата водой Выход был 6,55 мг имеющей замещение 0,53 ммоля/г ПрименяемыПолученный конечный продукт характеризовами защищенными производными аминокислот были аминокислотным анализом (содержание пептили F-moc-1y (Boc)-OH, -Fmoc-D-Phe-OH, Fmoc-Trpда и аминокислотный состав ), аналитической RPОН или Fmoc-Ala-OH ЖХВР (время удерживания) и PDMS (плазменная десорбционная масс-спектрометрия) (молекулярИзостер -СНгІЧН-пептидной связи вводили в ная масса) Результаты аминокислотного анализа соответствии с Sasaki, Y and Coy, D H , Peptides и PDMS были в согласии с предполагаемым стро8(1) 119-121, (1987) ением в пределах экспериментальной ошибки меFmoc-D-Trp- альдегид получали из 399 мг соотодики (PDMS ±0,9 атомной единицы массы, амитветствующего П,О-диметилгидроксамата в соотнокислотный анализ ±10%) ветствии с Fehrenti, A and Castro, В , SYNTESIS 676-678 1983 Неочищенный альдегид растворяАнализ РР-ЖХВР проводили с применением ли в 8 мл 1%-ной уксусной кислоты в ДМФ (ДимеУФ-детектора при 214 нм и колонки 4,6 мм х 250 тилфомамид) и разделяли на две порции Первую мм, Vydae- 218ТР54, с С18-диоксидом кремния, 5 порцию добавляли в перемешиваемую суспензию мк, (The Separations Group, Hespena, USA) Элюи400 мг (приблизительно 0,2 ммоля) H-Ala-Trp-Dрование проводили со скоростью 1 мл/мин при Phe-1ys (Вое) -смолы в 8 мл 1%-ной уксусной кис42°С Применяли два различных условия элюиролоты в ДМФ при комнатной температуре Затем 40 вания мг ПаСПВНз (чистота 85%), растворенного в 1 мл А1 Уравновешивание колонки 5%-ный CH3NH ДМФ добавляли в течение 60 мин и перемешивав буфере, содержащем 0,1 М (NH^SG^ pH котоние продолжали еще 60 мин После этого смолу рого устанавливали 2,5 при помощи концентрировыделяли и промывали 1%-ной уксусной кислотой ванной N2SO4,H элюирование с градиентом 5%в ДМФ на фильтровальной воронке Смолу снова 60% СНзСІЧ в том же буфере в течение 50 мин суспендировали в 5 мл 1%-ной уксусной кислоты в В1 Уравновешивание колонки 5% ДМФ и в суспензию добавляли вторую порцию CH3CN/0,1% TPA/H2O и элюирование с градиенFmoc-Ala-альдегид а Снова добавляли 40 мг том от 5% CH3CN/0,1% TFA/H2O до 60% ПаСПВНз (чистота 85%), растворенного в 1 мл СНзС1Ч/0,1% ТРА/Н20 втечение 50 минут ДМФ/ при комнатной температуре в течение 60 Время удерживания с использованием усломин и смесь перемешивали в течение 18 час вий элюирования А1 и В1 было 22,02 мин и 23,08 мин соответственно После стадии восстановительного алкилирования продукт пептид-смола выделяли и промываПример 2 ли 1%-ной уксусной кислотой в ДМФ на фильтроH-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)-1ys-NH2 вальной во ронке и удлинение цепи завершали с Продукт П-1у (2-CI-Z) -смола синтезировали из использованием синтезатора пептидов в соответс660 мг смолы 4-метил-ВНА (Bissendorf B10твии с описанными выше методиками, применяя chemicals, Hahnover, Germany,cat # RMLS 50), защищенное аминокислотное производное Fmokимеющей замещение 0,72 ммоля/г и BOC-ly (CI-) His(Trp)-OH ОН в соответствии с ВОС- стратегией на синтезаторе пептидов Applied Biosystems 43OA в количесПептид отщепляли от 240 мл продукта пептидтве 0,5 ммоля с использованием поставляемых смола путем перемешивания в течение 240 мин производителем протоколов отдельных связывапри комнатной температуре со смесью 3 мл ТРА ний (соединений), которые применяют отдельные (трифторуксусной кислоты), 225 мг фенола, 75 связывания с предварительно полученными симмкл этандитиола, 150 мкл тиоанизола и 150 мкл метричными ангидридами в ДМФ Протоколы моНгО Смесь после расщепления фильтровали, и дифицировали для достижения времени связывафильтрат концентрировали до образования масла ния 60 мин Изостер связи -СНгІЧН-пептид вводис применением струи азота Неочищенный пептид ли с использованием методики, аналогичной опиосаждали из этого масла 45 мл диэтилового эфисанной в примере 1 Применяли 1,675 мг H-1ys ра и промывали 3 раза 45 мл диэтилового эфира (CI-Z) -смолы и BOC-D-Phe - альдегид, полученНеочищенный пептид очищали полупрепараный из 616 мг соответствующего П,О-диметилгидтивной ЖХВР на колонке 25 мм х 250 мм, заполроксамата ненной С-18-диоксидом кремния, 7 мк Колонку уравновешивали 21%-ным раствором СНзСІЧ в 0,05 М (NH4)2SO4 pH которого устанавливал 2,5 После этой стадии восстановительного алкилирования смолу выделяли и промывали 1%-ной 15 45962 16 уксусной кислотой в дМФ на фильтровальной воПосле сушки формильные группы утриптофаронке и удлинение цепи завершали с использовановых остатков отщепляли путем растворения и нием синтезатора пептидов в соответствии с опиперемешивания пептида в 64 мл 6 М гидрохлорисанными выше методиками с применением защида гуанидиния, содержащего 4 мл этаноламина, щенных аминокислотных производных Воспри 0°С в течение 5 мин После этого смесь нейтTrp(For)OH, Boc-Ala-OH, Boc-D-Trp(For)-OH и Восрализовали добавлением 4 мл уксусной кислоты и His(Bom)-OH затем разбавляли 140 мл НгО Пептид отщепляли от 391 мг продукта пептидНеочищенный пептид очищали полупрепарасмола перемешиванием его в течение 75 мин со тивной ЖХВР непосредственным введением реаксмесью 5 мл HP и 500 мкл м-крезола HP испаряционной смеси в колонку с применением методили при 0°С струей азота Пептид осаждали из оски, аналогичной описанной в примере 1 Выход тавшегося масла вместе со смолой 50 мл диэтибыл 20,6 мг лового эфира и промывали 2 раза 50 мл диэтилоКонечный продукт хара ктеризовали, как опивого эфира и экстрагировали из смолы 2 х 2 мл сано в примере 1 Анализ РР-ЖХВР в условиях AI ТРА и осаждали из объединенного экстракта в и BI дал время удерживания продукта 21,28 мин и ТРА 50 мл диэтилового эфира и промывали 2 раза 23,17 мин соответственно 50 мл диэтилового эфира Примеры 3-5 Пример 7 8 3 4 5 Пептид H-D-Ala-D-2Na1 -Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)-1 ys-NH2 H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)-1ys-NH2 Приложение H-His4J(CH2NH)-DTrp-Ala-Trp-D-Phe-1ys-Nh2 Hhis-D-trp-Ala-Trp4J(CH2NH)-Dphe-1ys-NH2 H-His-D-Trp-Ala4J(CH2NH)-Trp-D-Phe-1ys-NH2 Пример 6 (2R)-H-D-Ala-D-2Na1 -AlaTrp-NH) -3-фенилпропиламин Fmoc-Phe-альдегид получали из 385 мг соответствующего Н,О-диметилгидроксамата в соответствии с (Ferentz J -A and Castro.B , SYNTHESIS 676678, 1983) Неочищенный альдегид растворяли в 20 мл 1%-ной уксусной кислоты в ДМФ и разделяли на две порции С 580 мг 4-(2'-4'-диметоксифенил-Ртосаминометил) феноксисмолы (Novabiochem AG Switzerland, cat, # 01-64-0013), имеющей замещение 0,43 ммоля была снята защита обработкой 20%-ным пиперидином в ДМФ в течение 20 мин и последующей промывкой ДМФ и 1%-ной уксусной кислотой в ДМФ Первую порцию Fmoc-D-Phe-альдегида и 58 мг ПаСПВНз (чистота 85%), растворенного в 1 мл ДМФ, добавляли в освобожденную от защитной группы смолу, и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 75 мин После этого смолу отделяли на фильтровальной воронке и промывали 1%-ной уксусной кислотой в ДМФ Вторую порцию Fmoc-D-phe- альде Получение способом аналогичным примером №1 1 1 Пептид 7 8 H-D-Ala-D-2Na1 -Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)-1 ys-NH2 H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)-1ys-NH2 Приложение 3-(4-имидазолил) пропионил -D-2Na1-Ala-Trp-DPhe4J(CH2NH)-1ys-NH2 3-(4-имидазолил) акрилоил -D-2Na1-Ala-Trp-DPhe4J(CH2NH)-1ys-NH2 10 27,02 23,30 20,42 18,97 18,87 2 1 2 26,00 22,02 22,9 21,3 21,08 гида вместе с 58 мг ПаСІЧВНз (чистота 85%) , растворенного в 1 мл ДМФ, добавляли в смолу, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 час, смолу отделяли на фильтровальной воронке и промывали 1%-ной уксусной кислотой в ДМФ, ДМФ, смесью ДХМ/метанол (6 4) и ДХМ (дихлорметан) С применением этой смолы удлинение цепи завершали, используя синтезатор пептидов в соответствии с методикой, описанной в примере 1, и защищенные аминокислотные производные Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-D2Na1-OH и Fmoc-D-Ala-Ala-OH Пептид отщепляли от 600 мг полученного продукта пептидсмола Полученный неочищенный пептид растворяли в 50 мл Н20 и 25 мл раствора очищали полупрепаративной ЖХВР и характеризовали с применением методик, аналогичных описанным в примере 1 Выход был 10,9 мг Анализ продукта RP-ЖХВР в условиях А1 и В2 дал время удерживания 27,98 мин и 29 45 мин соответственно Примеры 7-12 Пример 9 Время удерживания RPЖХВР Условия А1 Условия В1 (пр1) (пр1) Получен Время удерживания RPспособом ЖХВР аналогичного в Условия А1 Условия В1 примере№1 (прю1) (пр1) 1 26,00 27,02 1 22,02 24,30 1 26,33 27,70 1 26,93 28,15 11 12 Пример 13 (2S) - ((3- (4-имидазолил) пропионил) DTrpАІаУ(СН2І\ІН)-Тгр-О-Ргіе-МН)-6-аминогексанол Продую" пептида и смолы 3-(1-Ас1ос-4-имидазолил) пропионил- Trp-Ala^fCbbNbO-Trp-D-Phe1ys-(Boc) -смола Sasrm (Adoc является аббревиатурой 1-адамантилоксикарбонила) синтезировали в количестве 1 ммоля по методике, аналогичной описанной в примере 1, за исключением того, что применяли 1020 мг смолы Sasrm (смола 2-метокси-4-алкоксибензилово-го спирта) (Bachem, Bubendorf, Switzerland cat # D-1295) со способностью замещения 0,87 ммоля/г и что протокол, применяемый для взаимодействия первого аминокислотного остатка со смолой был поставляемым изготовителем протоколом катализируемого 4-диметиламинопиридином взаимодействия предварительно полученного симметричного ангидрида и последующей защиты остаточных гидроксигрупп на смоле бензойным ангидридом Защищенный пептид, (2S) ~((3- (i-Adoc-4-имидазолил) пропионил) -Trp-Ala^fCbbNHJ-Trp-DPhe-NH) -6- (Вос-амино) гексанол, отщепляли от 1800 мг 3-(1^ос-4-имидазолил)пропионил) -DTrp-Ala4J(CH2NH)-Trp-D-Phe-1 ys (Вое) -смолы Sasrm путем перемешивания этого продукта в течение 24 час при комнатной температуре со смесью 10,8 мл ТГФ (тетрагидрофурана), 1,8 мл этанола, 211 мг liBr и 92 мг NaBH Затем по каплям добавляли 2 мл Н2О и 2 мл уксусной кислоты Шарики смолы удаляли фильтрованием и промывали 25 мл этанола Фильтрат концентрировали в вакууме и полученное масло разбавляли 50 мл Нр20 и лиофилизовали Полученный порошок подвергали расщеплению при помощи ТРА как описано в примере 1 1/5 часть полученного неочищенного пептида очищали, как описано в примере 1 Выход был 28,54 мг Конечный продукт характеризовали, как описано в примере 1 Время удерживания его в условиях А1 было 20,4 мин Пример 14 15 (2R)-H-D-2Na1-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3фенилпропиламин (2R)-(H-D-Ala-D-2Na1-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3фенилпропиламин (H-D-Ala-D-2Na1 -N-Bzl-Gly-D-Phe4J(CH2NH)-1 ys-NH2 (2R)-(H-Aib-D-2Na1-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3фенилпропиламин Представленные соединения имеют следующее строение изобретения 26,08 1 23,62 25,07 Пептид, 3-((-3-(1-Adoc-4-HMHfla3onnn) пропионил)-) D-Trp-Ala4J(CH2NH)-Trp-D-Phe-NH)-nponnnaмин, отщепляли от 1000 мг (3-(1-Аоос-4-имидазолил) пропионил)- D-Trp-AlaYJCbbNHJ-Trp-D-Phe смолы Sasrm путем перемешивания этого продукта в течение 20 час при комнатной температуре с 10 мл 1,3-диаминопропана Отработанную смолу фильтровали и экстрагировали 5 мл ДМФ Объединенные фильтрат и экстракт медленно добавляли в 240 мш 1 М соляной кислоты при перемешивании Смесь затем разбавляли 500 мл Н2О и фильтровали Неочищенный продукт очищали полупрепаративной ЖХВР в 9 пробегах (последовательных операциях) путем непосредственного введения в колонку 9x1/9 этого фильтрата с использованием методики, аналогичной описанной в примере 1 Выход был 73,53 мг Конечный продукт характеризовали, как описано в примере 1 Вроемя удерживания его в условиях А1 и В1 было 21,5 мин и 22,7 мин соответственно Примеры 15 - 1 8 Пепцтид 17 18 18 25,33 3-( (3-(4-Ими дазол ил)пропионил)-О-ТгрAla4J(CH2NH)-Trp-D-Phe-NH)-nponnnaMHH Продукт пептида и смолы, 3-(1-Adoc-4-HMHfla3олил) пропионил) -D-Trp-AlaYfCb^NHJ-Trp-D-Pheсмола синтезировали в количестве 1 ммоля по методике, аналогичной описанной в примере 1, за исключением того, что применяли 1000 мг смолы Sasrm (смола 2-метокси-4-алкоксибензилового спирта) Bachem,Bubendorf, Switzerland cat# -1295) со способностью замещения 0,87 ммоля/г и что протокол, применяемый для взаимодействий первого аминокислотного остатка со смолой был поставляемым изготовителем протокол катализируемого 4-диметиламинопиридном взаимодействия предварительно полученного симметричного ангидрида и последующей защиты остаточных гидроксигрупп на смоле бензойным ангидридом Пример 16 6 17 45962 (2S)-(H-D-Ala-D-2NA1-Ala-Trp-D-Phe-NH)-6аминогексиламин H-D-Ala-D-1 Na1 -Ala4J(CH2NH)-Trp-Dphe-1 ys-NH2 Получен способом аналогичним в примере № 6 Время удерживания RPЖХВР Условия А1 Условия (пр1) В1(пр1) 29,6 31,2 6 29,4 31 ?1 2 6 30,4 28,1 31,7 29,2 3-((3-(4-Имидазолил) пропионил) АІаЧЧСН2І\ІН)-Тгр-Орпе-І\ІН)-пропиламин -D-Trp 19 20 45962 37°С и атмосфере 95% 02 и вращении 70 оборотов в мин Фрагменты промывали 3 раза путем седиментации в буфере выделения и аспирировали в отдельные клетки при помощи пипетики Пастера После диспергировали клетки фильтровали через найлоновый фильтр (160 мкм) для удаления непереваренной ткани Клетки промывали 3 раза буфером выделения, дополненным ингибитором трипсина (0,75 мг/мл) и снова суспендировали в культуральной среде (MEM, дополненный 25 мМ HEPES, 4 мМ глутамина, 0,75% бикарбоната натрия, 2,5% PC (фетальная телячья сыворотка), 3% конской сыворотки, 10% крысиной сыворотки, 1 (2R)-((2R) -( (3-(4-Имидазолил) пропионил)-ОнМ Тз и 40 мкг/л дексаметазона) до плотности Рпе-АІа-Тгр-г\ІН)-3-фенилпропиламино)-65 2x10 клеток/мл Клетки засевали в титрационных аминогеесанол микропланшетах, 200 мкл/лунку, и культивировали в течение 3 дней при 37°С и 8% СО 2 H-Aib-D-2Na1-Ala-N-Bzl-Gly-D-Phe4J(CH2NH2) Н.С Пример 19 Для изучения влияния различных средств, усиливающих секрецию гормона роста, был разработан анализ in vitro с применением клеток гипофиза крыс Смешанную клеточную культуру гипофиза выделяли из передней дозы гипофиза самцов крыс и культивированы в течение 3 дней После промывания клетки стимулировали в течение 15 мин и в супернатанте культуры измеряли количество секретированного гормона роста Выделение клеток гипофиза крыс проводили по модификации Sartor, 0 , et al , Endocrinology 116, 1985, pp 952-957 Гипофиз отделяли у самцов крыс Sprague Dawley массой 250 г после декапитации Нейропромежуточные доли удаляли и оставшуюся часть помещали в среду Грейса, дополненную 0 25% глюкозы, двумя не являющимися незаменимыми аминокислотам 1% В ЗА (буфер выделения) Железы делили на небольшие кусочки и переносили в пробирку, содержащую 3 мл буфера выделения + 11,5 мг трипсина и 1000 мкг ДНК-азы, и инкубировали в течение 35 мин при Соединение H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-1ys-NH2 H-D-Ala-D-2Na1 -Ala-Trp-D-Phe-1 ys-NH 2 После периода культивирования кьетки промывали два раза буфером стимулирования (НВ SS, дополненный 1% BSA, 0,25% D-глюкозы и 25 мМ HEPES) и преинкубировали в течение 1 часа Буфер затем удаляли и добавляли новый буфер стимулирования, содержащий соединение изобретения, и микропланшеты инкубировали 15 мин при 37°С и 5% С02 Буфер собирали и анализировали на содержание гормона роста крыс ( rGH) сцинтилляционным проксимальним анализом (SPA, по существу как описано в UZ 4 568 649, Hart and Greenwalt, Мое Immunol 16, 1979, pp 265269, или Underfnend et al , Proc Natl Acad Sei, USA, 82, 1985, pp 8672-8676) Анализ СН проводили в Opti - планшетах (планшеты с 96 лунками), пригодными для непосредственного подсчета в Packards Top Cont (счетчик р -сцинтилляции) Протокол анализа 40 мкл буфера 10 мкл пробы (инкубированный буфер стимуляции) 50 мкл 1251-rGH 50 мкл кроличьего ант-rGH 50 мкл SPA-реагента (антикроличьи антитела, соединенные с флуомикросферами) Планшеты герметизировали и помещали на планшетный шейкер на 30 мин, затем проводили инкубирование в течение 10 час, осаждение при 10 - 15°С и подсчет В SPA rGH, связанный с кроличьими антителами (первичными антителами) против GH (первичные антитела), реагирует со вторичными антителами,связанными с флуомикросферами (SPA Туре 11 РИА, доступный от Amersham) Любой радиомеченый rGH, который связан с первичными антителами, будет иммобилизован на флуомикросферах, которые будут затем продуцировать свет Измерения в счетчике р -сцинтилляции делают возможным подсчет количества радиомеченого ЛСН Количество радиомеченого rGH связанного с флуомикросферами, снижается с повышением содержания rGH в пробе EC 50 (нМ) 2,0 1,8 tmax (% GHRP-6) 100 85 21 45962 H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe4J(CH2NH)-1ys-NH2 H-D-Ala-D-2Na1 -Gly-Trp-D-Phe-1 ys-NH2 (23)-((3-(4-Имидазолил) пропионил)-О-Рпе-АІаЛїр-РпеУ(СН2І\ІН))-6-аминогексанол ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 22 0,5 0,8 5 100 75 80