Спосіб лікування захворювання, пов’язаного з порушенням метаболізму естрогену (варіанти)

1. Спосіб лікування захворювання, пов'язаного з порушенням метаболізму естрогену, при якому вводять лікарський засіб, що контролює вироблення естрогену, який як активний компонент містить сполуку кільцевої системи, яка включає груп у складного ефіру сульфамінової кислоти, причому вказана сполука є інгібітором ферменту, який має активність стероїдсульфатази (Е.С.3.1.6.2); за умови, що коли група складного ефіру сульфамінової кислоти сполуки замінена на сульфатн у гр уп у з утворенням сульфату і інкубована із ферментом стероїдсульфатазою (Е.С.3.1.6.2) при рН 7,4 і температурі 37°С, вона забезпечує значення Кm менше 50 мкМ. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що сполука кільцевої системи включає кільцеву систему та сульфаматну гр упу формули 2 (19) 1 3 70958 4 де R1 і R2 кожен незалежно вибирають із Н, алкілу, естрону, дегідроепіандростеронів, заміщених есталкенілу, циклоалкілу і арилу або разом вони явронів і заміщених дегідроепіандростеронів. ляють собою алкілен, що необов'язково містить 18. Спосіб за будь-яким з пп.13-17, який відрізняодин чи декілька гетероатомів чи груп у ланцюзі ється тим, що R1 і R2 незалежно вибирають з Н чи алкілену. С1-С10-алкілу. 14. Спосіб за п.12 або 13, який відрізняється тим, 19. Спосіб за будь-яким з пп.13-18, який відрізнящо сполука кільцевої системи являє собою сполується тим, що R1 і R2 незалежно вибирають з Н чи ку формули С1-С5-алкілу. 20. Спосіб за будь-яким з пп.13-19, який відрізняється тим, що R1 і R2 незалежно вибирають з Н чи метилу. , 21. Спосіб за будь-яким з пп.12-20, який відрізняв якій група поліциклу являє собою залишок поліється тим, що сполукою кільцевої системи є будьяка одна сполука з естрон-3-сульфамату, ecтpoнциклічного спирту, 3-N,N-диметилсульфамату, естрон-3-NR1 і R2 такі, як визначено у пункті 13. 15. Спосіб за п.14, який відрізняється тим, що монометилсульфамату. група поліциклу являє собою залишок стерину. 22. Спосіб за будь-яким з пп.13-21, який 16. Спосіб за п.15, який відрізняється тим, що відрізняє ться тим, що принаймні один з R1 і R2 є Н. стерин являє собою 3-стерин. 17. Спосіб за п.15 або 16, який відрізняється тим, що стерин вибирають із групи, яка складається із Даний винахід стосується нових сполук, які використовуються в якості інгібіторів стероїдсульфатази, та фармацевтичних сумішей, що їх містять. Відомо, що попередники стероїдів або прогормони, що мають сульфатн у груп у в 3-положенні стероїдного ядра, мають велике значення як проміжні продукти в метаболізмі стероїдів в організмі людини. Естронсульфат і дегідроепіан-дростеронсульфат (ДЕС) наприклад, відіграють, як відомо, важливу роль як проміжні продукти у виробленні естрогенів, таких як естрон і естрадіол, у тілі людини. Зокрема відомо, що естронсульфат, наприклад, являє собою один з основних циркулюючих попередників естрогену, особливо у жінок постклімактеричного періоду, а активність естронсульфатази при пухлинах грудей у 100-1000 разів більша, ніж інших ферментів, які беруть участь в утворенні естрогену. (James та співр. Steroids, 50. 269-279 (1987)). Інші естрогени, наприклад, естрон і естрадіол, особливо при їх перевиробленні, також показані при різних захворюваннях наприклад, при раку грудей, див. Breast Cancer Treatment and Prognosis: R.A. Stoll, стор.156-172. Blackwell Scientific Publications (1986) і контроль за виробленням естрогенів є специфічною метою багатьох напрямків протиракової терапії, у тому числі хіміотерапії і хірургічного підходу, наприклад, оваріектомії (видалення яєчників) і адреналектомії (резекції надниркової залози). Що стосується ендокринної терапії, всі зусилля спрямовані поки що тільки на концентрування інгібіторів ароматази, тобто сполук, здатних інгібувати активність ароматази, активність якої, як показує схема метаболізму естрогену (фіг.1), полягає у перетворенні андрогенів, наприклад, андростендіону і тестостерону на естерон та естрадіол, відповідно. Найбільш близьким до пропонованих винаходів є застосування сполук для виробництва ліків, наведене У публікації до Міжнародної заявки WO91/13 083. В зазначеній публікації пропонувалося впливати на іншу ділянку метаболічного шляху естрогену, або, скоріше, на дві різні ділянки, іншими словами на перетворення сульфату ДЕС і естрон-сульфату на ДЕС і естрон, відповідно, під впливом активності стероїд-сульфатази при використанні 3-моноалкілтіофосфонат-стероїд-ефірів як інгібітору стероїд-сульфатази, зокрема естрон3-монометилтіофосфонату. Недолік описаного рішення полягає у обмеженні можливостей використання сполук для контролю вироблення естрогену, а також таких, що впливають на метаболічний шлях естрогену. У основу пропонованихвинаходів поставлено задачі створення умов для виготовлення сполук, які б могли застосовуватись для контролю вироблення естрогену, а також таких, що впливають на метаболічний шлях естрогену. Поставлена задача вирішується у першому варіанті застосування сполуки кільцевої системи для виробництва ліків, що контролюють вироблення естрогену, де сполука кільцевої системи включає групу складного ефіру сульфамінової кислоти; і зазначена сполука є інгібітором ферменту, що має активність стероїдсульфатази (Е.С.3.1.6.2) за умови, що, коли група складного ефіру сульфамінової кислоти сполуки заміщена сульфатною гр упою для утворення сульфату та інкубована з ферментом стероїдсульфатазою (Е.С.3.1.6.2) при рН7,4 і температурі 37°С, вона забезпечує значення Кm менше 50мкм. Поставлена задача вирішується і у другому варіанті застосування сполуки кільцевої системи для виробництва ліків, що впливають на метаболічний шлях естрогену, де сполука кільцевої системи включає групу складного ефіру сульфамінової кислоти; і зазначена сполука є інгібітором ферменту, що має активність стероїдсульфатази (Е.С.3.1.6.2) за умови, що, коли група складного 5 70958 6 ефіру сульфамінової кислоти сполуки заміщена 6. І, нарешті, метою винаходу є розробка спосульфатною гр упою для утворення сульфату та собу лікування раку грудей в ссавців, зокрема, у інкубована з ферментом стероїдсульфатазою жінок. (Е.С.3.1.6.2) при рН7,4 і температурі 37°С, вона Цей винахід ґрунтується на відкритті нових забезпечує значення Кm менше 50мкм. сполук, що мають інгібуючу активність стероїдОсобливістю пропонованих рішень є те, що сульфатази, у ряді випадків винятково високий сполука кільцевої системи включає кільцеву сисрівень активності. Ці сполуки є ефірами сульфамітему та сульфаматну гр упу формули нової кислоти і поліциклічних спиртів, сульфат яких являє собою субстрат для ферментів, які мають активність стероїд-сульфатази (EC 3.1.6.2), Nалкіл- і N-арил-похідні цих ефірів сульфамінової кислоти та їх фармацевтично прийнятних солей. Сполуки формули (І). де R1 і R2 кожен незалежно вибирають з Н, алкілу, алкенілу, циклоалкілу й арилу, або разом вони являють собою алкілен, що необов'язково містить один чи кілька гетероатомів чи груп у ланцюзі алкілену. Особливістю пропонованих рішень є те, що сполука є сполукою формули в якій R1 і R2 такі, як визначено у п.3. Особливістю пропонованих рішень є те, що група поліциклу являє собою залишок поліциклічного спирту. Особливістю пропонованих рішень є те, що група поліциклу являє собою залишок стерину. Особливістю пропонованих рішень є те, що стерин являє собою 3-стерин. Особливістю пропонованих рішень є те, що стерин вибирають з групи, яка складається з естрону, дегідроепіандростеронів, заміщених естронів і заміщених дегідроепіандростеронів. Особливістю пропонованих рішень є те, що R1 і R2 незалежно вибирають з Η чи C1-C10 алкілу. Особливістю пропонованих рішень є те, що R1 і R2 незалежно вибирають з Η чи С 1-С5 алкілу. Особливістю пропонованих рішень є те, що R1 і R2 незалежно вибирають з Η або метилу. Особливістю пропонованих рішень є те, що сполукою є будь-яка одна сполука з естрон-3сульфамату, естрон-3-Ν,Ν-диметилсульфамату, естрон-3-N-монометилсульфамату. Особливістю пропонованих рішень є те, що принаймні, один з R1 і R2 є Н. 1. Ме та даного винаходу полягає у створенні нових сполук, здатних інгібувати активність стероїд-сульфа тази in vitro та in vivo. 2. Ме тою цього винаходу є також створення нових сполук, що мають високу активність як інгібітори стероїд-сульфатази in vitro та in vi vo. 3. Крім того, метою винаходу є створення фармацевтичної композиції, ефективної при лікуванні естроген-залежних пухлин. 4. Ме та винаходу також полягає у створенні фармацевтичної композиції, ефективної при лікуванні раку грудей. 5. Далі, метою винаходу також є розробка способу лікування естрогензалежних пухлин у ссавців, зокрема, у людини. (І) в якій R1 і R2 кожен незалежно один від одного являє собою Н, алкіл, циклоалкіл, алкеніл та арил або разом вони являють собою алкілен, який необов'язково містить один чи кілька гетеро-атомів або груп у ланцюзі алкілену, і гр упа -Oполіциклічної структури являє собою залишок поліциклічного спирту, сульфат якого являє собою субстрат для ферментів, які мають активність стероїд-сульфатази (EC 3.1.6.2.). Що стосується спиртів, сульфати яких є субстратом для ферментів, які мають активність стероїд-сульфатази, то йдеться про поліциклічні спирти, сульфати яких, тобто похідні формули при витримуванні зі стероїд-сульфатазою ЕС 3.1.6.2 при рН7,4 та температурі 37° дають значення Кm менше 50мкмолей. Активність заявлених сполук як інгібіторів активності стероїд-сульфатази ілюструється такими малюнками: Фіг.1 подає схему метаболічних шляхів, ферментів і стероїдних проміжних продуктів, що беруть участь у виробленні естродіолу in vi vo. На фіг.2 подано гістограму залежної від дози інгібуючої дії естрон-3-сульфамату на активність стероїд-сульфатази у клітинах MCF-7 in vitro. На фіг.3 подано залежну від дози інгібуючу дію естрон-3-N,N-диметилсульфамату на активність стероїд-сульфатази у клітинах MCF людини in vitro. На фіг.4 подано порівняння кривих реагування для естрон-3-сульфамату та естрон-3-N,Nдиметилсульфамату на активність стероїдсульфатази у MCF-клітинах людини in vitro. На фіг.5 подано залежну від дози інгібуючу дію естрон-3-сульфамату разом з ІС 50-значенням (концентрація, необхідна для 50% інгібування) на активність стероїд-сульфатази у плацентарних мікросомах. Одним з аспектів винаходу є нові сполуки ефіру сульфамінової кислоти і поліциклічних спиртів. Як поліциклічні спирти маються на увазі такі спирти, сульфати яких є субстратом для ферментів, що мають активність стероїд-сульфатази, а також 7 70958 8 їх N-алкіл, N-циклоалкіл, N-алкеніл і N-арилатомами, тобто з числа метилу, етилу, пропілу похідні. Ці сполуки відповідають наведеній вище тощо. Більш прийнятним є, якщо R1 і R2 обидва формулі І. являють собою метил. У випадку, якщо R 1 і/або R2Більш прийнятним є, якщо поліциклічна група арил, звичайно -феніл і толіл (-PhCH 3, о-, м-, парамістить, включаючи всі замісники, максимум бли). Якщо R1 і R2 являють собою циклоалкіл, звичайзько 40, звичайно ж не більше 30 замісників. Більш но це - циклопропіл, циклопентил, циклогексил прийнятними поліциклами можна вважати стероїтощо. З'єднані разом R1 і R2 являють собою групу дні циклічні структури, так званий циклопентаноалкілену, за умови, що кільце складається з 4-6 Сфенантреновий скелет. Більш прийнятним є, якщо атомів, які необов'язково розриваються одним чи сульфаміл- або заміщена сульфаміл-група знахокількома гетеро-атомами чи групами, наприклад, диться у цьому скелеті в 3-положенні, тобто O- або -NH- з одержанням 5-, 6- чи 7-членного йдеться про сполуки формули II: гетероциклу наприклад, морфоліну, піролідину чи піперидину. Під алкільними, циклоалкільними, алкенільними й арильними групами слід мати на увазі групи, що містять в якості замісників у них одну чи кілька груп, які не справляють впливу на інгібуючу активність сульфатази в сполуках, що розглядаються. Замісниками, що не заважають, можна вважав якій R1 і R2 мають наведені вище значення, а ти гідрокси, аміно, гало, алкокси, арил і алкіл. циклічна система ABCD являє собою заміщене чи незаміщене, насичене чи ненасичене стероїдне Більш прийнятними є сполуки формул III та IV. ядро, більш прийнятно естрон або дегідроепіандростерон. Інші прийнятні системи стероїдних кілець являють собою: заміщені естрони, а саме: 2-ОН-естрон, 2-метокси-естрон, 4-ОН-естрон, 6α-ОН-естрон, 7α-ОН-естрон, 16α-ОН-естрон, 16βОН-естрон, естрадіоли і заміщені естрадіоли, а саме: 2-ОН-17β-естрадіол, 2-метокси-17β-естрадіол, 4-ΟΗ-17β-естрадіол, 6α-ОН-17β-естрадіол, 7α-ОН17β-естрадіол, 16α-ОН-17α-естрадіол, 16α-ОН17α-естрадіол, 16β-ОН-17β-естрадіол, 17αестрадіол, 17β-естрадіол, 17α-етиніл-17βестрадіол, естріоли і заміщені естріоли, а саме: естріол, 2-ОН-естріол, 2-метокси-естріол, 4ОН-естріол, 6α-ОН-естріол, 7α-OН-естріол, заміщені дегідроепіандростерони, а саме: 6α-ОНдегідроепіандростерон, 7α-ОНв яких R1 i R2 являють собою C1-5-алкіл, тобто естдегідроепіандростерон, 16α-ОНрон-3-сульфамат і дегідроепіандростерон-3дегідроепіандростерон, 16β-ΟΗсульфамат та їх N-(С1-5)-алкіл-похідні, особливо дегідроепіандростерон. диметил-похідні R1=R2=CH3. Циклічна стероїдна система ABCD може місЕфіри сульфамінової кислоти, що пропонутити різні замісники, що не заважають. Зокрема, ються винаходом, одержують шляхом реакції поциклічна система ABCD може містити один чи кіліциклічного спирту, наприклад, естрону чи дегідлька гідрокси, алкіл, особливо нижчий алкіл- (С1-6)роепіандростерону з сульфамілхлоридом замісників, наприклад, метил, етил, н-пропіл, ізоR1R2NSO2Cl, тобто згідно з схемою, поданою на пропіл, н-бутил, втор.-бутил, трет.-бутил, н-пентил, стор. Error! Bookmark not defined. та інших ізомерів пентилу, а також н-гексил і інші ізомери гексилу, алкокси, особливо нижчі (C1-6)алкокси-замісники, наприклад метокси, етокси, пропокси тощо, алкініл, наприклад, етиніл чи галоген, наприклад, фтор. Прийнятні нестероїдні циклічні системи включають: діетилстильбоестрол, стильбоестрол та інші циклічні системи, за умови, що сульфати мають Кm-значення менше 50мкмолей зі стероїдестрон сульфатазоюEC 3.1.6.2. Відповідно до зазначеної схеми реакцію проЯкщо подані винаходом заміщені, N-заміщені водять у такий спосіб: сполуки містять один чи два N-алкіл, N-алкеніл, NНітрат натрію і сульфамілхлорид додають при циклоалкіл або N-арил-замісники, більш прийнятперемішуванні в розчин естрону в безводному ним є, якщо вони чи кожен з них містить максимум диметилформаміді при 0°С. Далі реакцію прово10 С-атомів. У випадку, якщо R1 і/або R2 алкіл, дять при нагріванні до кімнатної температури ще більш прийнятно вибирати такі значення, при яких протягом 24 годин. Реакційну суміш виливають у R1 і R2 кожен незалежно один від одного вибирахолодний насичений розчин бікарбонату натрію і ється з числа нижчих алкільних груп з 1-5 С 9 70958 10 водяну фазу, що утворилася, екстрагують ди хлосульфатом магнію. Після фільтрування з подальрметаном. Об'єднаний органічний екстракт сушать шим випарюванням розчинника у вакуумі і співвинад безводним сульфатом магнію. Після фільтрупарюванням з толуолом одержують необроблений вання та подальшого випарювання розчинника у продукт, який потім очищають за допомогою вакуумі і співвипарювання з толуолом одержують флеш-хроматографії. Аналіз дає такі результати: δ 1 необроблений залишок, який далі очищають за Η/270МГц. CD3OD/: 0,91 (с.3Н.С18-Ме), 1,40-2,55 допомогою флеш-хроматографії. (серії від м, 13Н), 2,90-2,92 (м.2Н), 7,04 У разі необхідності функціональні групи в по(шир.д.J=10,44Гц), 7,33 (шир.д.1Н. J=8,42Гц). ліциклічному спирті (стеролі) можуть бути захи щеδ 13С (67,8МГц. CD3OD): 14,53 (кв.С18-Ме), ні у відомий спосіб з подальшим видаленням за22,80 (т), 27,24 (т), 27,73 (т); 30,68 (т); 33,05 (т), хисної гр упи чи гр уп наприкінці реакції. 37,01 (т, 39,76 (д), 45,73 (c.C18), 51,86 (д), 120,76 Для фармацевтичного застосування інгібітори (д) , 123,54 (д) , 127,89 (д), 139,83 (с), 150,27 (с), стероїд-сульфатази, що пропонуються цим вина273,87 (с,С=0). ходом, можуть бути приготовлені відповідно до m/z/%/: 349/9/ /m+/, 270(100), 233(26), 185(43), відомих випробуваних традиційних фармацевтич172(31), 159(21), 146(36), 91(33), 69(37); 57(73), них методик з використанням традиційних фарма43(56), 29(24). цевтичних носіїв, наповнювачів, розріджувачів Дані мікроаналізу: тощо, які звичайно рекомендуються для парентеС Η Ν рального застосування. Середня ефективна доза Розраховано: 61,87% 6,63% 4,01% залежно від індивідуальної активності сполук, що Знайдено: 61,90% 6,58% 3,95% розглядаються у цьому винаході, і в розрахунку на Приклад 2 середню вагу тіла пацієнта (70кг) коливається в Одержання естрон-3-Ν-метилсульфамату межах від 100 до 800мг/день. Звичайна доза для Повторюють методику, описану в прикладі 1, більш прийнятних і більш активних сполук складає але замість сульфамоїл хлориду бер уть таку ж від 200 до 800мг/день, більш прийнятно 200кількість метилсульфамоїлхлориду. При аналізі 500мг/день, ще більш прийнятно від 200 до одержують такі результати: 250мг/день. Ліки можна приймати у вигляді одноδ 1Н (270МГц. CDCl3): 0,91 (с.3Н, С18-Ме) , кратної дози, дрібної дози або ж багаторазових 1,28-1,68 (м,6Н), 1,93-2,60 (серія від м.7Н), 2,90дрібних доз протягом кількох днів. Для орального 2,95 (м.2Н), 2,94 (д.3Н; J=5,13Гц.Me Ν-) 4,68-4,71 застосування лікарські засоби можуть бути приго(шир. м.змінюваний, 1Н-NН), 7,02-7,07 (м.2Н), товлені у вигляді таблеток, капсул, чи розчинів 7,26-7,32 (м.1Н). m/z/%/: 364(M+H)+ суспензій, які містять від 100 до 500мг сполуки на Приклад 3 стандартну дозу. Більш прийнятним є, якщо для Одержання естрон-3-N,N-диметилсульфамату парентерального застосування сполуки будуть Повторюють методику, описану в прикладі 1, приготовлені при використанні придатних для паале замість сульфамоїлхлориду беруть таку ж рентерального введення носіїв, і якщо однократна кількість Ν,Ν-диметил-сульфамоїлхлориду. денна доза міститиме від 200 до 800мг, більш приПри аналізі одержують такі результати: йнятно від 200-500, ще більш прийнятно від 200 до δ 1Н (270МГц. CDCl3): 0,92 (с.3Н.С18-Ме), 1,39250мг зазначених сполук. Однак такі ефективні 1,75 (м.5Н), 1,95-2,60, (серія від денні дози досить сильно залежатимуть від активм,6Н/.2.82/с,3H,MeN-/, 2,96-3,00(м.4Н), 2,98(с.3Н, ності, притаманній активному інгредієнту, і значMeN-/, 7,04 (шир.д.2Н.J=7,69Гц), 7,29 ною мірою повинні визначатися вагою тіла пацієн(шир.д.1Н.J=7,88Гц) та, що завжди повинно враховуватись лікуючим m/z/%/: 377(M/+ лікарем. Дані мікроаналізу: Для так званого "часткового" застосування, С Η Ν розглядається питання, що запропоновані винахоРозраховано: 63,63% 7,21% 3,71% дом інгібітори стероїд-сульфатази можуть викориЗнайдено: 63,50% 7,23% 3,60% стовуватись для комбінованого лікування, або в Приклад 4 поєднанні з іншим інгібітором сульфатази, або Інгібування стероїд-сульфатазної активності в наприклад, у комбінації з інгібітором ароматази, MCF7-клітинах під дією естрон-3-сульфамату зокрема, з 4-гідроксіандростендіоном (4-ОНА). Під стероїд-сульфатазою слід розуміти стериБільш докладно предмет винаходу ілюстр ульну сульфа тазу ЕС 3.1.6.2. ється наведеними нижче прикладами і результаСтероїд-сульфатазну активність вимірюють in тами проведених випробувань. vitro, використовуючи для цієї мети інтактні MCF-7 Приклад 1 ракові клітини грудей людини. Гормонзалежну ліОдержання естрон-3-сульфамату нію клітин широко використовують для регуляції Гідрид натрію (60% дисперсія, 2екв.) і сульросту ракових кліток грудей людини. Вона відрізфамоїлхлорид (2екв.) додають при перемішуванні няється яскраво вираженою стероїдв розчин естрону (1екв.) у безводному диметилсудьфатазною активністю (Maclndoe та співр. Enформаміді при 0°С. Потім реакцію проводять при docrinology, 123.1281-1287/1988/. Purohit та Reed. нагріванні до кімнатної температури, продовжуючи Int. J.Cancer 50.901-905 (1992)) і може бути отриперемішування, ще протягом 24 годин. мана в США з Американської колекції клітинних Реакційну суміш виливають у холодний насикультур, а у Великобританії, наприклад, з Королівчений розчин бікарбонату натрію, і водну фазу, що ського фонду ракових досліджень. Клітини обробутворилася, екстрагують дихлорметаном. Об'єдляють у мінімальному ессенціальному середовищі наний органічний екстракт сушать над безводним (Flow Laboratories, Irwine, Шотландія), що містить 11 70958 12 20ммолей HEPES, 5% сироватки новонароджених залишку, використовуючи для цього метод сцинвеликої рогатої худоби, 2ммолей глютаміну, амінотиляційної спектрометрії. Гідролізовану масу есткислоти і 0,075% бікарбонату натрію. До 30 посурон-3-сульфату розраховують, ви ходячи з одердин із зразками клітинних культур (25см 2) засіважаного 3Н-значення (з поправкою на об'єм 5 ють приблизно 2x10 клітин на кожну посудину, середовища та використовуваної органічної фази, використовуючи назване вище середовище. Клітидоданої для виділення 14С-естрону) і питомої актини вирощують до 80% злить, середовище змінювності субстрату. Кожна серія експериментів вклюють кожен третій день. чає інкубацію мікросом, одержаних з сульфатазаІнтактні моношари клітин MCF-7 у трьох варіапозитивної плаценти людини (позитивний контнтах по 25см 2 клітинної культури у кожній посудині роль) і посудин без клітин (для визначення очевипромивають збалансованим сольовим розчином дності неферментативного гідролізу субстрату). Ерла (EBS9, з ICN Flow, High Wycombe, ВеликоКількість клітинних ядер у кожній посудині визнабританія) і витримують протягом 3-4 годин при чають за допомогою лічильника Култера після об37°С з 5пмолями (7х105 число розпадів на хвилиробки моношарів клітин запоніном. Одну посудину ну) (6,7-3Н)-естрон-3-сульфату) питома активність в кожній серії використовують для оцінки стану 60 кюрі/ммоль з Ядерної спілки Нова Англія, Бособолонки клітини і її життєздатності, використовутон, Масачусетс, США) у мінімальному середовиючи для цього ексклюзивний метод трипранущі, що не містить сироватки (2,5мл), разом з естблакитного. (H.J.Phillips (1973). Тканинні культури рон-3-сульфаматом (11 концентрацій: 0; 1фΜ; та їх застосування (D.F.Kruse і М.K.Patterson), 0,01nΜ; 0,1пМ; 0,01нМ; 0,1нМ; 1н М; 0,01мкМ; стор.406-408. Axademic Press, Нью-Йорк). 0,1мкМ; 1мкМ). По закінченні витримування кожну Дані для естрон-3-сульфамату наведені у табпосудину охолоджують, і середовище піпеткою лиці 1 і на фігурах 2 і 4. Результати оцінки стероїдвводять в окремі трубки, що містять (14С/естрон) сульфатазної активності виражають у середніх 7х103 розпадів/на хв. Питома активність значеннях ±1 стандартне відхилення від загально97кюрі/ммоль отримана з Емерсгеймського Міжнаго продукту (естрон+естрадіол), що утворюється родного радіохімічного центра Amersham, Великовпродовж інкубаційного періоду (20 годин), розрабританія). Суміш струшують протягом 30 секунд з хованого для 106 клітин і для значень, що мають толуолом (5мл) . Експерименти показують, що статистичну значущість у відсотках зменшення >90% (14С) естрону і 90% 14С-естрону і