Аналоги гормону, що вивільнюють гормон росту людини, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування

1. Аналоги гормону, що вивільнюють гормон росту, що мають амінокислотну послідовність формули (І): Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-R11-R12Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R20-R21-Leu-Leu-GlnAsp-lle-Nle-Asp-R 29-NH2, (І) в якій: R11 є h Arg, Gab або Gap; 2 (19) 1 3 79440 4 5. Спосіб одержання пептидів - аналогів гормону, 9. Спосіб за пунктом 5, де синтезований пептид що вивільнюють гормон росту, що мають амінокиочищають за допомогою високоефективної рідинслотну послідовність формули (І): ної хроматографії. Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-R11-R1210. Фармацевтична композиція, що містить активVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R20-R21-Leu-Leu-Glnну речовину, один або більшу кількість носіїв і/або Asp-lle-Nle-Asp-R 29-NH2, (І) один або більшу кількість ексципієнтів, де активв якій: ною речовиною є принаймні один з аналогів горR11 є h Arg, Gab або Gap; мону, що вивільнюють гормон росту, який має аміR12 є hArg, Orn, Gab або Gap; нокислотну послідовність формули (І): R20 є h Arg, Gab або Gap; Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-R11-R1221 R є hArg, Orn, Gab або Gap; Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R20-R21-Leu-Leu-Gln29 R є D-Arg, hArg, Gab або Gap; Asp-lle-Nle-Asp-R 29-NH2, (І) і їх фармацевтично прийнятних солей, що передв якій: бачає використання твердофазного синтезу, що R11 є h Arg, Gab або Gap; включає введення придатних похідних лізину, 2,4R12 є hArg, Orn, Gab або Gap; діаміномасляної кислоти або 2,3R20 є h Arg, Gab або Gap; діамінопропіонової кислоти в прийнятні положення R21 є hArg, Orn, Gab або Gap; ланцюга пептиду, приєднаного до полімерного R29 є D-Arg, hArg, Gab або Gap; носія, зняття захисту з аміногруп бічного ланцюга і або його фармацевтично прийнятна сіль. взаємодію вільних аміногруп з гуанідинувальним 11. Спосіб лікування розладів, викликаних дефіциагентом, видалення всіх т-бутилоксикарбонільних том гормону росту у людини, що включає введензахисних груп, що залишились, і відщеплення синня пацієнту, що потребує такого лікування, тератезованого пептиду від носія, з наступним очипевтично ефективної дози пептиду - аналога hGHщенням і, необов'язково, перетворенням пептиду у RH, що має амінокислотну послідовність формули фармацевтично прийнятну сіль. (І): 6. Спосіб за пунктом 5, де як полімерний носій виDat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-R11-R12користовують МБГА-смолу. Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R20-R21-Leu-Leu-Gln7. Спосіб за пунктом 5 або 6, де N,N'-біс(третAsp-lle-Nle-Asp-R 29-NH2, (І) бутилоксикарбоніл)-S-метилізосечовину викорисв якій: товують як гуанідинувальний агент в присутності R11 є h Arg, Gab або Gap; 4-(диметиламіно)піридину. R12 є hArg, Orn, Gab або Gap; 8. Спосіб за пунктом 5 або 6, де синтезований пепR20 є h Arg, Gab або Gap; тид відщеплюють від носія, використовуючи фтоR21 є hArg, Orn, Gab або Gap; рид водню. R29 є D-Arg, hArg, Gab або Gap; або його фармацевтично прийнятної солі. Представлений винахід стосується нових пептидів - аналогів гормону, що вивільнює гормон росту людини, способу одержання нових пептидів і їх терапевтичного застосування. Вивільнення і синтез гормону росту людини (GH, соматотропін) знаходиться під постійним контролем з боку двох взаємно антагоністичних гіпоталамічних гормонів - гормону, що інгібує вивільнення гормону росту (GІH, соматостатин) і гормону, що вивільнює гормон росту. Терапія, що ґрунтується на призначенні гормону, що вивільнює гормон росту людини (hGH-RH), може застосовуватись для більшості пацієнтів з недостатнім рівнем GH. Було встановлено, що його Nтермінальний аналог hGH-RH(1-29)-NH2, який є вкороченим фрагментом, зберігає повну біологічну активність ендогенного hGH-RH, який містить 44 амінокислотні залишки. hGH-RH(1-29)-NH 2 можна одержати за допомогою синтезу; синтетичний GHRH(1-29)-NH 2 під назвою ацетат сермореліну стверджений для використання при лікуванні дітей маленького зросту і також досліджується можливість його використання при лікуванні розладів нейросекреції, як ад'ювант для гонадотропінвикликаної овуляції у безплідних жінок і для лікування СНІД-залежних катаболітичних розладів. Однак, описується, що hGH-RH(1-29)-NH2 є відносно нестійкими до ферментної деградації. Основними метаболітами, що спостерігаються, є характеристичними для розщеплення зв'язку між Arg11-Lys 12l і Lys 12-VaІ 13, що викликається трипсинподібними ферментами [L.A. Frohman, T.R. Downs, E.P. Heimer, A.M. Felix J. Clin. Invest. 1989, 83, 1533-1540]. Нещодавно було встановлено, що при деградації трипсином аналогу hGH-RH(1-29)-NH2 відбувається гідроліз пептидних зв'язків при карбоксильній групі всіх основних амінокислотних залишків, включаючи С-термінальний амідний зв'язок, в той час як у аналогу, який відрізняється тільки наявністю Оrn залишків замість Lys, гідролізують тільки зв'язки сусідні з Arg залишками [Е. Witkowska, A. Orfowska, В. Sagan, Μ. Smoluch, J. Izdebski J. Peptide Sci. 2000, 6 (Suppl.), 189; E. Witkowska, A. Ortowska, B. Sagan, M. Smoluch, J. Izdebski J. Peptide Sci, 2001, 7, 166-172]. Це відкриття узгоджується з надзвичайно високою in vivo активністю аналогів, що містять Оrn в положеннях 12 і 21 [J. Izdebski, J. Pinski, J.E. Horwath, G. Halmos, K. Groot, A.V. Serially, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 4872-4876]. Були здійснені спроби подолати проблему нестабільності hGH-RH(1-29)-NH 2, inter alia шляхом 5 79440 6 заміни Arg в положенні 29 амінокислотної послідосіб лікування розладу обумовленого дефіцитом вності на Agm (4-гуанідилбутиламін) [Bajusz et at., гормону росту людини, що включає введення паin Peptides 1982, Blaha.and Melon, Eds.; W. De цієнтові, що потребує лікування, терапевтично Gruyter, Berlin-New York, pp.643-647], або шляхом ефективної дози пептиду - аналогу hGH-RH форзаміни Туr в положенні 1 на Dat (дезамінотірозин) і мули (І), де R11 , R12 , R20 , R21 і R29 с такими як опиLys в положенні 12 на D-Lys, Arg або Оrn [Міжнасано вище. родні заявки № WO 94/11396 і WO 94/11397]. Нові пептиди - аналоги гормону, що вивільнює Однак, результати цих спроб є незадовільнигормон росту, мають амінокислотну послідовність ми і все ще існує потреба в аналогах, що поєднуформули (І): ють підвищену здатність вивільнювати гормон росту із висоткою стійкістю до ферментної Dat-AІa-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10деградації, які б дозволили зменшити дози лікарR11-R12-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R20-R21- (І) ського засобу і/або зменшити кількість введень. Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-R29-NH2 Винахідниками було встановлено, що введення певних амінокислот у аналог гормону, що вивів якій: льнює гормон росту людини, не тільки призводить R11 є h Arg, Gab абс Gap; до аналогів з вищою біологічною активністю - краR12 є hArg, Orn, Gab або Gap; щою здатністю вивільнювати гормон росту, але R20 є h Arg, Gab або Gap; також мають корисний вплив на стійкість пептидів R21 є hArg, Orn, Gab або Gaр: до ферментів. Певними амінокислотами є D-Arg в R29 є D-Arg, hArg, Gab або Gap. положенні 29, і амінокислоти, що містять гуанідиПереважними пептидами цього винаходу є: нові групи в їх бічному ланцюзі, в положеннях за(1) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10йнятих в природному пептиді Lys і Arg. hArg-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg20-hArgНові пептиди - аналоги гормону, що вивільнює Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-hArg29-NH2; гормон росту, згідно з винаходом мають амінокис(2) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10лотну послідовність формули (l): hArg-Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg20-OrnLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-hArg29-NHa; 10 Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr (3) Gat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr1011 12 20 21 R -R -Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R -R - (І) Gab-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-GabLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-R29-NH2 Leu-Leu-Gin-Asp-lle-Nle-Asp-Gab-NH2; (4) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10в якій: hArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-GabR11 e h Arg, Gab або Gap; Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gab-NH2: R12 є hArg, Orn, Gab або Gap; (5) Dai-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr1020 R є h Arg, Gab або Gap; Gab-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArgR21 є hArg, Orn, Gab або Gap; Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nie-Asp-D-Arg-NH 2; R29 є D-Arg, hArg, Gab або Gap. (6) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Pha-Thr-Asn-Ser-Tyr10Нові пептиди є сильними і селективними стиhArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArgмуляторами вивільнення гормону росту і вони маLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-D-Arg-NH 2; ють високу резистентність до дії ферментів. (7) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10Нові пептиди або їх фармацевтично прийнятна Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gap-GapLeuсіль можуть бути введенні пацієнтові індивідуальLeu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gap-NH2; но або як активний інгредієнт фармацевтичних (8) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10композицій. Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-GapТаким чином, представлений винахід також Leu-Leu-Gln-Asp-lIe-Nie-Asp-Gap-NH2. стосується фармацевтичної композиції, що місПептидами особливо переважними з огляду на тить, принаймні, один з нових аналогів гормону, біологічну активність і стійкість до дії ферментів що вивільнює гормон росту, який має амінокислотравлення є: тну послідовність формули (І): Dat-Ala-Asp-Ala-lІе-Рhе-Тhr-Asn-Ser-Туr10-hArghArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg20-h Arg-Leu10 Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-hArg29-NH2, i 11 12 20 21 R -R -Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R -R - (I) Dat-Aia-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-h Arg29 Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-R -NHa Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg 20-Orn-LeuLeu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-hArg29-NH2. в якій: Нові пептиди корисні для попередження і теR11 є h Arg, Gab або Gap; рапії розладів обумовлених дією гормону, що виR12 є hArg, Orn, Gab абс Gap; вільнює гормон росту людини, і тому вони можуть R20 є h Arg, Gab або Gap; бути використані для лікування маленького зросту R21 є hArg, Orn, Gab або Gap; у ді тей вікозалежних розладів, для збільшення R29 є D-Arg, nArg, Gah або Gap. лінійної ваги тіла і вмісту мінеральних речовин в або його фармацевтично прийнятну сіль і, кістках, при загоєнні ран, для лікування опіків шкіпринаймні, один носій і/або екціпієнт. ри і переломів кісток, як не стероїдний анаболік Нові пептиди є корисними для попередження і при слабкості обумовленій хронічним захворюванлікування розладів обумовлених дефіцитом hGHням, а також в діагностиці. RH. Згідно з способом представленого винаходу, Представлений винахід також забезпечує спопри лікуванні розладів обумовлених дією гормону, 7 79440 8 що вивільнює гормон росту людини, пацієнтові, що Для зручності пацієнта і для тoго щоб досягти потребує такого лікування вводять терапевтично прийнятних характеристик вивільнення речовини, ефективну кількість пептиду - аналогу hGH-RH, щопохідне пептиду зазвичай вводять у вигляді рецемає амінокислотну послідовність (І). птур для ін'єкції з контрольованим вивільненням і Рівні дозування і режим залежите від виду запролонгованою дією, таких як кристалічні полімерхворювання, віку пацієнта, ваги і стану, і можуть ні мікрокапсули, що містять активну речовину. Інбути визначте спеціалістом, виходячи з відомих шим прикладом часозалежної рецептури є імплантерапевтичних і профілактичних способів лікувантат на основі полімеру одержаний шляхом ня дефіциту гормону, що вивільнює гормон росту розчинення біодефадуємого полімеру і пептидів людини. При лікуванні захворювань цього виду, цього винаходу у водозмішуваному розчиннику з придатна одиниця дозування аналогу hGH-RH утворенням рідкої композиції. Коли ін'єктуєтьcя, зазвичай становить від 0,01 до 2мкг на кілограм полімер утворює депо, з якої активна речовина ваги тіла на дозу. Придатна добова дога може повільно вивільнюється. бути введена пацієнтові у вигляді однієї або декіФармацевтичними формами придатними для лькох одиничних доз на день, за винятком форм з введення пероральним шляхом є таблетки, пігулконтрольованим вивільненням, таких як депо або ки, порошки, гранули, .драже або капсули, що місімплантати. Форми з контрольованим вивільнентять фармацевтично прийнятні тверді носії, такі як ням вводяться через кожні 15 днів або 30 днів, або кукурудзяний крохмаль, лактоза, цукроза, сорбіт, один раз на три місяці. водний силікат мамію, стеаринова кислота, стеаПетити представленого винаходу корисно рат магнію, гідрофосфат кальцію або камеді. Табвводити пацієнтові у будь-якій придатній фармалетки або гранули можуть мати покриття або бути цевтичній формі, будь-яким придатним шляхом, оброблені іншим чином для одержання одиниці таким як внутрішньовенний, підшкірний, внутрідозування, що гарантує переважний час вивільшньом’язовий, пероральний, інтраназальний або нення. Для формування таких захисних шарів або пульмонарна інгаляція. покриттів може бути використаний ряд різних реНові пептиди можуть бути введені окремо або, човин, включаючи полімерні кислоти і суміші полінеобов'язково, в комбінації з іншими терапевтичмерних кислот з іншими речовинами, такими як ними агентами, що використовуються при лікуваншелак, цетиловий спирт або ацетатцелюлози. ні розладів обумовлених дефіцитом гормону, що Фармацевтична рецептура, що містить пептид вивільнює гормон росту людини, при умові, що як активну речовину, також може зустрічатись у вони не спричиняють негативного впливу на дію придатних для введення як аерозолі або порошки один одного. Такі сполуки можуть бути введенні для інгаляції. Типова аерозольна рецептура, окрім одночасно як одна рецептура, або у вигляді окреводного розчину активної речовини, може містити мих рецептур або одна після одної, у відповідності буфери, ізотонічні речовини, консерванти і, необоіз інтервалами, що визначає спеціаліст. Лікарю в'язково, інші екціпієнти, що роблять можливим відомо, які лікарські засоби і комбінації вибрати. введення активної речовини за допомогою дозоФармацевтичні агенти представленого винаваного розпилювача або крапельниці. ходу містять, принаймні, одну активну речовину, Нові пептиди представленого винаходу мояка є пептидом - аналогом hGH-RH, що має аміножуть бути одержані середнім спеціалістом в цій кислотну послідовність формули І, або її фармагалузі, що знає методики хімічного синтезу, такі як цевтично прийнятну сіль і, принаймні, один носій класичний синтез у розчині або твердофазний і/або екціпіент. синтез. Фармацевтичні рецептури представленого виВ способі синтезу у розчині, придатно захищенаходу можуть бути одержані у вигляді різних фані термінальні Νa-амінопохідні амінокислот з зармацевтичних форм, добре відомих спеціалісту в хи щеними бічними ланцюгами (якщо присутні реацій галузі, таких як, наприклад з [Remmington's кційні бічні ланцюги) або фрагменти пептиду Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing конденсують з прийнятно захищеними карбоксиCompany, 1990]. льними похідними амінокислот або фрагменти Фармацевтичними рецептурами придатними пептидів, a-амінофункцію зазвичай захищають у для ін'єктування і вливання є стерильні водні, воформі карбамату, такого як кислотонестійка третдо-органічні і неводні розчини, суспензії, сухі речобутоксикарбонільна група (Вос), бензилоксикарбовини і таблетки для одержання розчину і імплантанльна група (Z, CBz) або їх заміщені аналоги, або ти. Носії, що використовуються для одержання у формі 9-флуоренілметоксикарбонільної (Fmос) суспензій, гарантують рівномірне розподілення захисної групи, які є не стійкими в основному сеактивного інгредієнту в рідкій фазі і ними є полісоредовищі. Карбоксильні групи можуть бути за хирбати, лецитин, ПЄГ-співполімери поліпропіленгліщені яκ естер, наприклад, метиловий естер, який є колю, пептизатори, такі як фосфорани, поліфоснестабільним в присутності нуклеофільних основ, форани і цитрати водорозчинних полімерів, таких трет-бутиловий естер, який є нестабільним в кисяк карбоксиметилцелюлоза, метилцелюлоза, полілому середовищі або бензиловий естер, який є вінілпіролідон, камеді або желатин. Рецептури для нестабільним за гідрогенолітичних умов. Карбокін’єктування можуть містити фармацевтично присильні групи в захи щеній структурі активуються за йнятні носії або екціпієнти, такі як регулятори рН, допомогою азиду, змішаного ангідриду, активовабуфери тоніки і консерванти. Сухі речовини виконого естеру, з використанням фосфонієвої або ристовуються для одержання розчинів або непідyронієвої кислоти або шляхом використання карготовлених суспензій шляхом розведення придатбодіімідного способу, використовуючи сполуки, які ним розчинником. каталізують реакцію, що викликає рацемізацію, 9 79440 10 таку як N-гідроксисукцинімід, 1стання. гідроксибензогриазол, 1-гідрокси-7Нові пептиди можуть бути виділені з реакційазабензотриазол або 3-гідрокси-4-оксо-3,4ної суміші у формі фармацевтично прийнятних дигідро-1,2,3-бензотриазин. Способи конденсусолей з різними неорганічними і органічними кисвання і захисні групи, що зазвичай використовулотами і основами. Нові пептиди можуть утворюються в хімії пептидів, описані в [Peptides: Analysis, вати фармацевтичні прийнятні солі з неорганічниSynthesis, Biology, Vol 3, Ε. Gross, J. Melennofer, ми кислотами, такі як: хлорводнева кислота, Eds (Academic Press, New York, 1981) і Protective бромводнева кислота, сірчана кислота, азотна Groups in Organic Synthesis, Second Edition (WiІеу, кислота, фосфорна кислота або органічні кислоти, New York, 1991)]. такі як оцтова, пропіонова, малеїнова, фумарова, В твердофазному синтезі пептидів (ГФСП) замалонова, бурштинова, винна, лимона, аскорбінопропонованому [Merrifield (J. Am. Сhem. Soc. 85 ва, яблучна, щавлева, корична, манделова, бен(1963), 2149)] використовують нерозчинний в реазойна, метансульфонова, етансульфонова, пкційному середовищі полімерний носій, що містить толуолсульфонова кислота і інші кислоти. функціональну групу, до якої може бути приєднана Солі також можна одержати з допомогою реаперша амінокислота. Полімерна матриця викорискції карбоксильної групи пептиду з лужними метатовується як перманентна С-термінальна захисна лами, гідроксидами і алкоксидами лужних металів, група. Синтез розпочинають з приєднання першої також як і з органічними основами, такими як триметиламін, діетиламін, етаноламіе, піперидин, Νa-захищеної амінокислоти до лінкерної групи. холін і їм подібні. Після зняття захисту з аміногрупи додають іншу Солі можна одержати за допомогою відомих активовану захищену амінокислоту. Ланцюгове методів, шляхом взаємодії речовини з вільною подовження здійснюють шляхом послідовних стадій зняття захисту і конденсування. В кінці кінців, ocовою або кислотою з од ним або більшою кількістю еквівалентів придатної основи або кислоти, Ν-термінальний вільний пептид відщеплюють від відповідно, в розіиннику або в середовищі, в якому смоли з супровідним зняттям захисту функціонасіль не розчиняється. льних груп бічних ланцюгів. Нерозчинний носій Солі оцтової кислоти нових пептидів - аналогів легко відфільтровується з розчину пептиду. Полімерами придатними як носій є, наприклад, целюhGH-RH є переважними втіленнями представленого винаходу. лоза, полі вініловий cпирт, поліметакрилати, співВизначення біологічної активності полімер хлорметильованийдивинілбензолДля того щоб визначити біологічну активність полістерол, 4-метилбенгідриламінова смола нових пептидів представленого винаходу, дослі(МБГА смола), бензгідриламінова смола (БГА) і їм подібні. Синтез пептидів на полімерному носії проджували їх вплив на рівень в плазмі у щурів гормону росту і інших гіпофізарних гормонів і порівводять в розчинниках, які розчиняють амінокислонювали з впливом hGH-RH(1-29)NH 2, як речовини тні похідні, що використовуються, і є нейтральнипорівняння. ми за умов проведення реакції. Переважними є Досліджуваними матеріалами були: hGHрозчинники, які додатково добре набухають, такі як диметилформамід, дихлорметан, Ν-метил-2RH(1-29)NH2 одержували від Sigma Chemical Co., і пептиди - аналоги hGH-RH синтезовані за спосопіролідон, ацетонітрил, диметилсульфоксид і їх бом представленого винаходу. суміші. Після відщеплення амінокислоти від поліСамиць щурів Вістар (240-260г) розміщали в мерного носія, очищають, наприклад використоконтрольованому світловому режимі з 14г світла, вуючи високоефективну рідинну хроматографію. Нові пептиди - аналоги GH-RH представленого 10г темноти і забезпечували вільний доступ до їжі і води. Тварин випадково розбивали на експеримевинаходу, що містять гуанідинову гр упу в бічних нтальні групи, яким вводили салін (0,9% NaCI; ланцюгах амінокислот переважно одержують ви0,3мл), hGH-RH(1-29)NH 2 в дозі 50 або 150мкг/кг користовуючи твердофазний синтез, шляхом ввеваги тіла, і пептиди представленого винаходу в дення придатних похідних лізину, 2,4діаміномасляної кислоти або 2,3дозі 1 або 3мкг/кг ваги тіла. Щури одержували підшкірну (пш.) ін'єкцію пептиду порівняння або кождіамінопропіонової кислоти в прийняті положення ного з нових тестованих аналогів, розчинених в ланцюга пептиду приєднаного до полімерного но0,3мл саліну. сія, зняття захисту з аміногруп бічного ланцюга і В день експерименту, щурів анестезіювали за взаємодії вільних амногруп з гуанідинувальним агентом, видалення всіх т-бутилоксикарбонільних допомогою внутрішньочеревної ін'єкції кетаміну (120мг/кг) і шийну вену канюлювали для відбору захисних груп, що залишились, і відчеплення синкрові. Через тридцять хвилин, пш вводили сполутезованого пептиду від носія, з наступним очики, що досліджуються. Щурам контрольної групи щенням і, необоз’язково, перетворенням пептиду у ін'єктували тільки салін. Кров (приблизно 0,6мл) фармацевтично прийнятну сіль Реакцію гуанідинування проводять, використвідбирали з шийної вени на 1 хвилині (зразок "0") до, і 15- і 30-хвилинах після пш введення тестуєвуючи надлишок гуанідинувального агенту, такого мих сполук. Еквівалентний об'єм гепаринізованого як Ν,Ν'-біс(трет-бутилоксикарбоніл)-Sсаліну (10Ul/мл) вводили до кожного видаленому метилізотіосечовина, в присутності промотору зразку. В кінці експерименту, тварин умертвляли реакції, такого як 4-(диметиламіно)піридин. Синтезовані пептиди очищають, переважно за шляхом анестезіювання надмірною дозою кетаміну. Зразки крові центрифугували і відокремлювали допомогою високоефективної рідинної зразки, плазми (приблизно 0,3мл) і зберігали при xроматографії, для досягнення високого ступеня 20°С, до дослідження за допомогою RIA методів. чистоти придатного для фармацевтичного викори 11 79440 12 Визначали концентрації в плазмі гормону росІндивідуальні відміни у рівнях гормонів усувату, пролактину, лютеінізуючий гормон, фолікулосли шляхом коригування рівня гормону, розраховутимулюючий гормон і тіротропін (GH, PRL, LH, ючи сітьову концентрацію гормону для кожного FSH і TSH) для 0,05мл аліквот зразків плазми, вищура. Цю сітьову концентрацію для кожного горкористовуючи набори, що поставляються Biotrak мону розраховували як різницю між концентрацією (Amersham Life Science, England). Чутливість для на 15 хвилині після введення сполуки і концентращурів GH, PRL, LH, FSH і TSH була 0,16, 0,08, цією гормону до введення сполуки (D15-0), і різни0,08,0,09 і 0,05нг/пробірку, відповідно. цю між концентрацією гормону на 15 хвилині і 30 Статистичний аналіз результатів проводили хвилині після введення сполуки (D15-30). використовуючи Statsoft Statistica PL для Windows. Вплив сполук на вивільнення GH визначали Спочатку, всі групи даних досліджували на нормашляхом порівняння значення сітьової концентрації льність за допомогою теста Колмогоров-Смірнов і GH (D15-0) після ін'єктування hGH-RH-(1-29)NH 2 в теста Шапір-Вілка. Визначали статистичні відміндозах 50,0мкг і 150,0мкг на кг ваги тіла, і 1,0мкг і ності між групами за допомогою одностороннього 3,0мкг для аналогів, на кг ваги тіла. Результати ANOVA. Багатократні дослідження інтервалу Дундля вибраної сполуки (1) представлені в Таблицях кана використовувались для проведення наступ1 і 2. Значні відміни між оброблюваними групами них порівнянь. Однак, коли знаходили розбіжності визначали за допомогою модифікованого Лілліеіз значною гетерогенністю, проводили порівняння тором тесту Кр ускал-Валліса. між групами за допомогою непараметричного аналізу розходжень Крускал-Валліса на Ранкс. Таблиця 1 Дія підшкірного введення hGH-RH пептидів і їх аналогів на вивільнення GH у самиць щурів. Сполука Салін hGH-RH(1-29)-NH 2 Сполука 1 Доза [мкг/кг] Кількість щурів 50 50 150 1 3 11 11 11 9 9 Кількість GH в плазмі в різний час після введення [нг/кг] 0хв 21,4±2,9 24,5±2,7 27,1±3,2 23,1±2,0 28,3±4,1 15хв 19,8±3,9 79,1±7,9* 163±18" 99,1±16** 130±16** 30хв 17,8±2,7 39,0±5,9* 103±15** 42,5±9,2* 58,4±8,9** Результати виражали як значення ± СПЗ (стандартна похибка значення) * Ρ99 8 Me = норлейцин 60 >99 Оrn = орнітин 30 0 Еталон* Phe = фенілаланін 60 0 Ser = серии Thr = треонін * Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgТуг = тірозин Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuVal = валін Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Ser-Arg-NH 2 (hGH-RH(1Всі послідовності пептидів приведені в даному 29)-NH 2) описі, в прикладах і в пунктах формули написані за стандартними правилами згідно з якими послідовРезультати приведені в Таблиці 3 вказують, ність починається з N-термінальної амінокислоти і що всі досліджені нові аналоги hGH-RH мають закінчується С-термінальною амінокислотою. Амінабагато більшу стійкість до дигерування трипсинокислоти знаходяться в L конфігурації, якщо не ном порівняно з стандартом, hGH-RH(1-29)-NH2. вказано інше. Таким чином, через 30 хвилин, зе умов що забезПредставлений винахід зараз описується з попечують повне дигерування пептиду, інші пептиди силанням на наступні специфічні необмежуючі залишаються або незмінними [пептид (1), (2) і (8)], 15 79440 16 приклади. 1´40хв.), з наступним промиванням ДХМ (3´1хв.), Приклади 50 % ДМФА/ДХМ (2´1 хв.) і ДХМ (2 ´1хв.). Загальна методика синтезу пептиду В. Відщеплення пептиду від смоли А. Утворення пептичного ланцюга Пептидильну смолу обробляли рідким фториДля захисту a-аміно функціональних груп видом водню (HF), в присутності анізолу. Реакцію користовували т-бутилоксикарбонільну (Вoс) групроводили протягом 1 при 0°С. Надалі, HF видапу; бічні ланцюги захищали наступними групами: ляли при пониженому тиску, залишок промивали Asp - цикпогексилом; Оrn - бензилоксикарбонілом; холодним діетиловим етером і екстрагували 50% Ser і Thr бензилом; Туr 2розчином оцтової кислоти, потім ліофілізували. бромбензилоксикарбонілом. Г. Очищення пептиду Для того щоб одержати аналоги, що містять Неочищені пептиди очищали за допомогою залишок hArg, залишки лізину у формі Bocвисокоефективної рідинної хроматографії, викориLys(Fmoc) похідного вводили в прийнятні полостовуючи систему Кна уера з колонкою Вертекс, ження в пептидному ланцюзі. Nucleosil-300 C18 (8´200мм, 5 мікрон). ВикористоДля того щоб одержати аналоги, що містять вували наступні системи розчинників: А, 0,1% роззалишки Gab і/або Gap, 2,4-залишки діаміномасчин ТФО у воді; Б, 80% розчин MeCN в А. Елююляної кислоти і залишки 2,3-діамінопропіонової вання проводили з градієнтом 20-55 % Б протягом кислоти вводили а прийнятні положення, у формі 30 хвилин, потім ізократично 55% Б протягом 30 Boc-Dab(Fmoc) і Boc-Dap(Fmoc) похідних, відповіхвилин, із швидкістю потоку 2мл/хвилину. Фракції дно. аналізували з колонки Вертекс, Nucleosil 100 С18 Для того щоб одержати аналоги, що містять (4´250мм, 5 мікрон), проганяли з градієнтом 25залишки Orn, Boc-Orn(Z) похідне вводили під час 70% протягом 30хв.; швидкість потоку: 1 мл/хв. синтезу прийнятних положень пептидного ланДетектування проводили при 220нм. Гомогенні цюга. фракції (один пік на хроматограмі) об'єднували, МБГА смолу (4-метилбензгідриламінова сморозводили водою і ліофілізували одержуючи хрола, Bachem California або Novabiochem, пр. матографічно чистий продукт. Структури пептидів 0,5мек./г), після розбухання в дихлорметані (ДХМ) визначали з ЕСІ-МС масспектру на спектрометрі протягом 30 хвилин, обробляли 5% діізопропілеFinnigan MAT 95S (Bremen, Germany). тиламіновим (ДІЕА) розчином ДХМ (1 ´1хв., Приклад 1 1´20хв.) і промивали ДХМ (6´1 хв.). Одержання Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-AsnЗахи щені пептидильні смоли синтезували виSer-Tyr-h Arg-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Alaкористовуючи стандартні методики на кожній стаhArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-hArg-NH 2 дії синтезу, згідно з наступним протоколом: [Сполука (1)] (а) Видалення Вос групи 55% розчином три3,1г МБГА смоли (4-метилбензгідриламінової фтороцтової кислоти (ТФО) в ДХМ (1´1хв., смоли, Novabiochem, 0,49мек./г), після приєднання придатнозахищених похідних амінокислот згідно з 1´20хв.); приведеною вище загальною методикою синтезу (б) Промивання ДХМ (3´1 хв.); пептиду (розділ А), одержували повністю захище(в) Промивання 30% розчином 1,4ну пелтидильну смолу: Dat-Ala-Asp(0cHex)-Ala-lleдіоксан/ДХМ (2´1 хв.); Phe-Thr(OBzl)-Asn-Ser(OBzl)-Tyr(2-Br-Z)-L ys(Fmoc)(г) Промивання ДХМ (3 ´1хв.); Lys(Fmoc)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Lys(Fmoc)(д) Нейтралізація 5 % ДІЕА/ДХМ (1´1 хв., Lys(Fmoc)-Leu-Leu-Gln-Asp(OcHex)-lle-Nle1´5хв.); Asp(OcHex)-Lys(Fmoc)-смола. (e) Промивання ДХМ (6´1 хв.); Наступна методика, згідно із згаданою вище (ж) Конденсування Вос-амінокислоти загальною методикою синтезу пептиду (розділ Б), (1,2ммоль) за допомогою карбодіімідного способу, після видалення всіх Fmoc захисних груп і вичерпвикористовуючи Ν,Ν'- діізопропілкарбодіімід (ДІК), ного гуанідинування, з наступним видаленням всіх 1,2ммоль, в ДХМ, час реакції: 2 години. У випадку Вос груп, одержували 9,53г пептидильної смоли Boc-GIn і Boc-Asn, N-гідроксибензотриазол (HOBt), Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-hArg-hArg1,2ммоль, додавали до реакційної суміші; Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln(з) Промивання ДХМ (6 ´1хв.). Аsр-ІІе-NІе-Аsр-hАrg-NН2-смола. Б. Введення гуанідинових груп Цю смолу піддавали дії рідкого фториду водДля того щоб видалити Fmoc груп у з Lys заню (200мл HF), в присутності анізолу (15мл), згідно лишку, захи щену пептидильну смолу обробляли з приведеною вище загальною методикою синтезу розчином 50% піперидин/ДМФА (1´10хв., 1´2г), пептиду (розділ В), що давало 4,5г неочищеного потім смолу промивали диметилформамідом пептиду 50% чистоти, ви ходячи з ВЕРХ аналізу. (ДМФА) (3´1 хв.), розчином 50% ДМФА/ДХМ Неочищений пептид (20мг зразка) очищали за (3´2хв.), розчином 50% метанол/ДХМ і ДХМ допомогою високоефективної рідинної хроматог(3´2хв.). Пептидильну смолу піддавали взаємодії з рафії, згідно з приведеною вище загальною метоΝ,Ν'-біс(трет-бутилоксикарбоніл)-Sдикою синтезу (розділ Г, вище). Це давало 4,3мг метилізотіосечовиною (п'ятикратним молярним вказаного в заголовку пептиду 92,3% чистоти (винадлишком) в присутності 4ходячи з ВЕРХ); масспектр: для C157H258N47O 43, (диметиламіно)піридину (70мг) в ДМФА, протягом Μ=3492,0; реєстрували m/z: 4 днів. Одержану пептидильну смолу промивали [М+2Н]2+: розраховано 1747,0, знайдено ДМФА (3´1 хв.), і ДХМ (3´1 хв.), Вос гр упи видаляли 1747,6; розчином 55% ТФО/ДХМ (1´1 хв., 1´20хв., [М+ЗН]3+: розраховано 1165,0, знайдено 17 79440 1165,4; [М+4Н]4+: розраховано 874,0, знайдено 874,0; [М+5Н]5+: розраховано 699,4, знайдено 699,4. Приклад 2 Одержання Сполук (2)-(8) Використовуючи придатно захищені амінокислоти в методиці повністю аналогічній приведеній вище, одержували наступні пептиди: (2) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10hArg-Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg20-OrnLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-hArg29-NHa; МС: для C153H251N43O43, Μ=3380,9; реєстрували m/z: [М+3Н]3+: розраховано 1128,0, знайдено 1127,9; [М+4Н]4+: розраховано 846,2, знайдено 846,2; [М+5Н]5+: розраховано 677,2, знайдено 676,9. (3) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10Gab-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-GabLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gab-NH2; МС: для C147H238N47O43, Μ=3351,8; реєстрували m/z: [М+3Н]3+: розраховано 1118,3, знайдено 1118,6; [М+4Н]4+: розраховано 839,0, знайдено 839,2; [М+5Н]5+: розраховано 671,4, знайдено 671,6. (4) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10hArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-GabLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gab-NH2; МС: для C149H242N47O43, Μ=3379,8; реєстрували m/z: [М+4Н]4+: розраховано 846,0, знайдено 846,3; [М+5Н]5+: розраховано 677,0, знайдено 677,2. (5) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10Gab-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArgLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-D-Arg-NH 2; МС·- для C154H253N47O43, Μ=3451,0; реєстрували m/z: [М+3Н]3+: розраховано 1151,3, знайдено 1152,0; [М+4Н]4+: розраховано 863,8, знайдено 863,8; [М+5Н]5+: розраховано 691,2, знайдено 691,6. (6) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10hArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArgLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-D-Arg-NH 2; MC: для С154Н253N47О43, М=3451,0; реєстрували m/z: [М+3Н]3+: розраховано 1151,3, знайдено 1151,4; [М+4Н]4+: розраховано 863,8, знайдено 863,6; [М+5Н]5+: розраховано 691,2, знайдено 691,3. (7) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gap-GapLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gap-NH2; MC: для C142H229N47O43, M=3282,7; реєстрували m/z: [М+3Н]3+: розраховано 1095,2, знайдено 1095,3; [М+4Н]4+: розраховано 821,7, знайдено 821,7; [М+5Н]5+: розраховано 657,5, знайдено 657,8. (8) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-GapLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gap-NH2; MC: для C145H235N47O43, M=3324,8; реєстрували m/z: [М+3Н]3+: розраховано 1109,3, знайдено 1109,6; [М+4Н]4+: розраховано 832,2, знайдено 832,2; [М+5Н]5+: розраховано 666,0, знайдено 666,0. 18 19 79440 20 21 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 79440 Підписне 22 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601