Похідні піридазино[4,5-в]хінолін-5-оксиду, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція

Нові хімічні сполуки, що є піридофталазин-діонами, які містять їх фармацевтичні композиції і їх використання при неврологічних порушеннях, зв'язаних із ексцитотоксичністю й дисфункцією глутаматергічної нейротрансміссії. Глутамат є, мабуть, основним стимулюючим медіатором у центральній нервовій системі, але, крім того, можливо, утягується в багато патологічних і ексцитотоксичних процесів. І, як такий, представляє великий інтерес при одержанні антагоністів глутамату для терапевтичного застосування (див., Danysz et al., 1995 для огляду). Глутамат активує три основних типи іонотропного (іонотропічного) рецептора, а саме, a-аміно-3гідрокси-5-метил-4-ізоксазолпропіонову кислоту (АМРА), каінат і N-метил-D-аспартат (NMD A) і деякі типи метаботропічних рецепторів. Антагонізм NMDA рецепторів потенційно має широку область терапевтичного застосування. Функціональне інгібування NMDA рецепторів може бути досягнуте через вплив на різні ділянки розпізнавання, такі як ділянка первинного медіатору, нечутлива до стрихніну ділянка гліцину (гліцинв), ділянка поліаміну і ділянка фенциклідину, локалізована усередині катіонного каналу. Десенсибілізація рецептора може представляти фізіологічний процес, що служить механізмом ендогенного регулювання для запобігання довгострокової нейротоксичної активації глутамат-рецепторів, але допускає їхню тимчасову фізіологічну активацію. У випадку NMDA рецептора спільним агоністом гліцину є ендогенний ліганд, що інгібує таку десенсибілізацію шляхом активації ділянки гліцинув. Цікаво, що ішемія підвищує не тільки концентрацію позаклітинного глутамату, але також концентрацію гліцину і, хоча цей останній ефект є менш явним, він у дійсності зберігається багато довше. Отже, деякі повні гліцинв-антагоністи можуть відновлювати нормальну синаптичну передачу в таких умовах шля хом підвищення NMDA рецепторної десенсибілізації до її фізіологічного рівня. У дійсності, на підставі загального введення лабораторним тваринам, було висун уте припущення, що гліцинв-антагоністи можуть давати більше терапевтичне вікно, чим агенти, що діють на інші ділянки розпізнавання NMDA рецепторного комплексу. На жаль, погані фармакокінетичні властивості більшості гліцин в-антагоністів, до самого останнього часу, виключали чітку перевірку цього припущення після загального введення. Однак, повідомляється, що деякі гліцинв-антагоністи мають дуже гарні терапевтичні індекси після загального введення в моделях гіпералгезії у якості транквілізаторів (анксіолітиків). Заявниками отриманий ряд трициклічних "піридо-фталазин-діонів". Сполуки класу І стр уктурно відносяться до патентованих гліцин в-антагоністів Zeneca (ICI, ЕРА 0 516 297 AI, 02.12.92). Клас II сполук складають N-оксид-похідні цих сполук, і вони не описані і не висунуті у якості можливих сполук у патенті Zeneca. Сполуки класу II також є сильними антагоністами гліцинув in vitro (у лабораторній судині) і виявляють значно велику in vivo (у живому організмі) загальну засвоюваність і/або проникнення через гематоенцефалічний бар'єр, чим сполуки класу І. Крім того, сольові похідні цих сполук одержують, приміром, додаванням холіну і 4-тетраметиламонію (4-NH3), додатково поліпшуючи біоприйнятність. Нові сполуки за даним винаходом мають прогнозоване використання при лікуванні наступних хвороб. 1. Гостра ексцитотоксичність, така як ішемія під час раптового приступу, травма, гіпоксія, гіпоглікемія і печінкова енцефалопатія (гепатаргія). 2. Хронічні нейродегенеративні захворювання, такі як хвороба Альцгеймера, васкулярне слабоумство, хвороба Паркінсона, хвороба Huntington’, розсіяний склероз, бічний аміотрофічний склероз, СНІДнейродегенерація, олівопонтоцеребелярна дистрофія, синдром Tourette’, мотонейронна хвороба, мітохондріальна дисфункція, синдром Корсакова і хвороба Крейтцфельда-Якоба. 3. Інші хвороби, зв'язані з тривалими відновлюваними змінами у центральній нервовій системі, такі як хронічний біль, толерантність до лікарського засобу, лікарська залежність і звикання до надмірного уживання лікарських засобів (наприклад, до опіатів, кокаїну, бензодіазепінів і алкоголю) і пізня дискінезія. 4. Епілепсія (поширені і парціальні комплексні епілептичні припадки), шізофренія, острах, депресія, гострий біль, м'язова еластичність і шум у вуха х. Задача винаходу полягає у одержанні нових і більш ефективних сполук піридо-фталазин-діону, їхніх фармацевтичних композицій і розробці способу лікування ними неврологічних порушень, зв'язаних із ексцитотоксичністю і дисфункцією глутаматергічної нейротрансміссії. Подальша задача винаходу полягає у одержанні таких нових сполук, композицій і способу, що відповідають вищевказаним теоретичним вимогам. Додаткові задачі будуть виявлені нижче, а інші задачі винаходу очевидні для будь-якого фахівця у відповідній області. Отже, винахід включає наступні аспекти, серед іншого, окремо або в комбінації: Сполуку, яку вибирають із тих піридил-фталазин-діонів, що мають наступну формулу: де R1 і R2 вибирають із групи, що включає водень, галоген і метокси, або де R 1 і R2 разом утворюють метилендіокси, і її фармацевтично прийнятні солі; таку сполука, сіль якої вибирають із її солі з холіном або 4тетраметиламонієм; таку сполука, яку вибирають із групи, що включає: 4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b] хінолін-5-оксид, 8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b] хінолін-5-оксид, 8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-bІхінолін-5-оксид, 8-фтор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 7,8-дихлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 7-бром-8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] -хінолін-5-оксид і 7-хлор-8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксид і фармацевтично прийнятну сіль будь-якої з перерахованих ви ще сполук; і таку сполуку, яку вибирають із групи, що включає: сіль 4-гідрокси-1-оксо-1,2- дигідропіридазино[4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну, сіль 8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну, сіль 8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну, сіль 8-фтор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну, сіль7,8-дихлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну, сіль 7-бром-8-хлор~4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну і сіль7-хлор-8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну. Крім того, фармацевтична композиція, що містить у якості активного інгредієнта таку сполуку в ефективній гліцинв-антагоністичній кількості; така фармацевтична композиція, що містить у якості активного інгредієнта таку сполуку, в е фективній гліцин в-антагоністичній кількості, у формі солі холіну; така фармацевтична композиція, що містить у якості активного інгредієнта сполуку, в ефективній гліцин в-антагоністичній кількості, яку вибирають із групи, що включає: 4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 8-фтор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 7,8-дихлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 7-бром-8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] -хінолін-5-оксид і 7-хлор-8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b] хінолін-5- оксид або фармацевтично прийнятну сіль будь-якої з перерахованих вище сполук; і така фармацевтична композиція, що містить у якості активного інгредієнта сполуку, в ефективному гліцин в-антагоністичній кількості, яку вибирають із групи, що включає: сіль 4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид-холіну, сіль 8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид-холіну, сіль 8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид-холіну, сіль 8-фтор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] -хінолін-5-оксид-холіну, сіль 7,8-дихлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну, сіль 7-бром-8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b] -хінолін-5-оксид-холіну й сіль 7-хлор-8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну. Далі, спосіб боротьби з неврологічними порушеннями, зв'язаними з ексцитотоксичністю й дисфункцією глутаматергічної нейротрансміссії у живої тварини, що включає стадію введення потребуючій лікування живій тварині такої сполуки або фармацевтичної композиції, в ефективній гліцин в-антагоністичній кількості, такий спосіб, де сполука існує у формі солі холіну; такий спосіб, де сполуку вибирають із групи, що включає: 4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]-хінолін-5-оксид, 8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 8-фтор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 7,8-дихлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид, 7-бром-8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино-[4,5-b]хінолін-5-оксид і 7-хлор-8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид або фармацевтично прийнятну сіль будь-якої з перерахованих вище сполук; і такий спосіб боротьби з неврологічними порушеннями, зв'язаними з ексцитотоксичністю і дисфункцією глутаматергічної нейротрансміссії у живої тварини, який включає стадію введення потребуючій лікування живій тварині сполуки, в ефективній гліцин вантагоністичній кількості, яку вибирають із групи, що включає: сіль 4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b]хінолін-5-оксид-холіну, сіль 8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид-холіну, сіль 8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b]хінолін-5-оксид-холіну, сіль 8-фтор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] -хінолін-5-оксид-холіну, сіль 7, 8-дихлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-b] -хінолін-5-оксид-холіну, сіль 7-бром-8-хлор-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] -хінолін-5-оксид-холіну й сіль 7-хлор-8-бром-4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксид-холіну. Мається на увазі, що наступне обговорення, приклади й фармакологія приведені з метою ілюстрації даного винаходу, а не в порядку обмеження. Основна структура трициклічних "піридо-фталазин-діонів" класу І і класу II; R1 /R2 = Н і/або галоген R1 /R2 = Н і/або 0-СН3 R1 /R2 = Н і/або метилендіокси Хімія Основний спосіб одержання диметил-хінолін-2,3-дикарбоксилат-1-оксидів (3) Охолоджений розчин (крижана лазня) 2-нітробензальдегіду 1 (25мМ) і натрію (27мМ) у безводному метанолі (40мл) обробляють протягом 30 хвилин розчином диметил(діетоксифосфініл) сукцинату 2 (30мМ, отриманий як описано Linke et al., Lieb. Ann. Chem., 1980(4), 542) у безводному метанолі (10мл). Отриманий темний розчин перемішують при 0-5°С протягом 1,5 год., розчинник упарюють при зниженому тиску і залишок розподіляється між етилацетатом і водою. Етилацетат суша ть над сульфатом натрію і потім упарюють при зниженому тиску. Залишок перекристалізовують з ізопропанолу, одержуючи зазначений у заголовку диметилхінолін-2,3-дикарбоксилат-1 -оксид 3 у виді не зовсім білого (або ясно-жовтого) порошку. Фізичні властивості і 1Н-ЯМР-спектральні дані для сполук 3 приведені в таблицях 1 і 2. а. 5-Бром-4-хлор-2-нітробензальдегід (1f) До суміші сірчаної кислоти (40мл) і нітрату натрію (2,66г, 31,3мМ) при 0-5°С добавляють 3-бром-4хлорбензальдегід (6,25г, 28,5мМ). Отриману суміш перемішують при кімнатній температурі протягом 7 годин і розбавляють крижаною водою (300мл). Осаджені тверді продукти відфільтровують, промивають водою і сушать, одержуючи порошок. Перекристалізація цієї сполуки із суміші ізопропанолу і води (2:1) дає зазначений у заголовку 2-нітробензальдегід 1f (3,6г, 51,5%) у виді ясно-жовтого порошку, т.пл. 81-82°С. Аналіз для C7H3BrClNO3: Розраховано (%): С 31,79 Н 1,14 N 5,30 Знайдено (%): С 31,55 Н 0,98 N 5,09 1 Н-ЯМР (СОСІ 3), d: 8,22 (с, 1Н), 8,23 (с, 1Н), 10,39 (с, 1Н). b. 4-Бром-5 -хлор-2-нітробензальдегід (1g) Використовуючи спосіб (а), за тим виключенням, що виходять із 4-бром-3-хлорбензальдегіду (2,97г, 13,5мМ) одержують зазначену в заголовку сполуку 1д (1,9г, 53,0%) у виді ясно-жовтого порошку, т.пл. 95-98°С. Аналіз для C7H3BrCINO3: Розраховано (%): С 31,79 Н 1,14 N 5,30 Знайдено (%): С 31,60 Н 1,01 N 5,11 1 Н-ЯМР (CDCI3), d: 8,02 (с, 1Н), 8,43 (с, 1Н), 10,39 (с,1Н). Основний спосіб одержання диметил -хінолін-2,3 -дикарбоксилатів (7) Розчин N-оксиду 3 (10мМ) і трихлориду фосфору (30мМ) у безводному хлороформі (100мл) нагрівають до температури кипіння зі зворотним холодильником протягом 7 год. Розчинник видаляють при зниженому тиску і залишок розподіляється між етилацетатом і водою. Органічний шар сушать над сульфатом натрію і потім упарюють при зниженому тиску. Залишок перекристалізовують з ізопропанолу, одержуючи зазначений у заголовку диметил хінолін-2,3-дикарбоксилат 7 у виді не зовсім білого (або ясно-жовтого) порошку. Фізичні властивості і 1Н-ЯМР-спектральні дані для сполук 7 приведені в таблицях 3 і 4. Основний спосіб одержання 4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4, 5-b] хінолін-5-оксидів (5) До розчину, що перемішується, (або суспензії) диметил хінолін-2,3-дикарбоксилат-1-оксид 3 (5мМ) у киплячому етанолі (25мл) в атмосфері аргону добавляють гідразин-гідрат (15мМ) і суміш нагрівають до температури кипіння зі зворотним холодильником протягом 3 год., за цей час утворюється темний осад. Після охолодження до кімнатної температури реакційну суміш відфільтровують, і зібрані тверді продукти промивають етанолом і діетиловим ефіром і сушать, одержуючи сіль гідразину 4. Цю речовину перемішують при 70 - 110°С 3 год. в оцтовій кислоті (15мл) і, після охолодження до кімнатної температури, суміш розбавляють водою (45мл) і потім фільтрують, щоб зібрати тверді продукти. Зібрані тверді продукти промивають етанолом і сушать, одержуючи темно-жовту тверду речовину. Декілька перекристалізацій цього продукту з диметилформаміду дають зазначений у заголовку піридазино[4,5-b]хінолін-5-оксид 5 у виді жовтогарячого порошку. Фізичні властивості і 1Н-ЯМР-спектральні дані для сполук 5 приведені в таблицях 5 і 6. Основний спосіб одержання 1,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідропіридазино[4,5-b] -хінолінів (9) До розчину, що перемішується, (або суспензії) диметил хінолін-2,3-дикарбоксилату 7 (5мМ) у киплячому етанолі (25мл) добавляють гідразин-гідрат (30мМ) і суміш нагрівають до температури кипіння зі зворотним холодильником протягом 8 год., за цей час утворюється осад. Після охолодження до кімнатної температури реакційну суміш відфільтровують і зібрані тверді продукти промивають етанолом і діетиловим ефіром і сушать, одержуючи сіль гідразину 8. Цю речовину перемішують при 70-100°С 3 год. в оцтовій кислоті (15мл) і, після охолодження до кімнатної температури, суміш розбавляють водою (45мл) і потім фільтрують, щоб зібрати тверді продукти. Зібрані тверді продукти промивають етанолом і діетиловим ефіром і сушать, одержуючи зазначений у заголовку піридазино[4,5-b] хінолін 9 у виді жовтого порошку. Фізичні властивості і 1Н-ЯМР-спектральні дані для сполук 9 приведені в таблицях 7 і 8. Основний спосіб одержання солей 4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b]хінолін-5-оксид-холіну (6) і солей 1,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідропіридазино [4,5-b]хінолін-холіну (10) До суспензії, що перемішується, піридазино [4,5-b] -хіноліну 9 або N-оксиду 5 (10мМ) у метанолі (50мл) добавляють гідроксид холіну (10,5мМ, 45 ваг. % розчин у метанолі). Отриманий розчин концентрують, використовуючи роторний випарник, і твердий залишок перекристалізовують з етанолу, одержуючи зазначену у заголовку сіль холіну 10 або 6 у виді гігроскопічного жовтогарячого (або червоного) порошку. Фізичні властивості і 1Н-ЯМР-спектральні дані для сполук 6 і 10 приведені в таблицях 9,10 і 11, 12, відповідно. Таблиця 1 Отримані диметил хінолін-2,3- дикарбоксилат-1-оксиди 3 Спол. R1 R2 3а H H 3b H СІ 3с H Br 3d H F 3е СІ СІ 3f СІ Br 3g Br СІ Елементарний аналіз, Розрахов ано (%) Знайдено (%) С Н N С Н N Формула (mw) C13H11NO5 (261.2) C13H10CINO5 (295.7) C13H10BrNO5 (340.2) C13H10FNO5 (279.2) C13H9Cl2NO5 (330.1) C13H9BrClNO5 (374.6) C13H9BrClNO5 (374.6) т.пл. (С°) Вихід (%) 59.77 4.24 5.36 59.84 4.11 5.31 175-176 61.5 52.81 3.41 4.74 52.80 3.32 4.78 126-127 49.0 45.89 2.96 4.11 45.57 2.75 4.00 168-170 72.0 55.86 3.60 5.01 55.19 3.38 4.95 194-196 49.0 47.30 2.75 4.24 47.18 2.62 4.14 183-186 41.0 41.69 2.42 3.74 41.39 2.13 3.65 171-173 60.0 41.69 2.42 3.74 41.68 2.25 3.75 206-208 62.5 Таблиця 2 1 Н-ЯМР (СDСІ3)-спектральні дані для сполук 3 d (м.д.), J (Гц) 3.98(s, 3H), 4.11, (s, 3H), 7.66-8,05 (m. 3H), 8.43 (s, 1H), 8.75 (dd, J1 = 8.5, J2 - 2.0, 1H) 3.98 (s, 3H), 4.11 (s, 3H), 7.71 (dd, J1 =8.5, J2 = 2.5, 1H), 7.91 (d, J =8.5, 1H), 8.38 (s, 1H). 8.74 (d, J =2.5, 1H) 3.91 (s, 3H), 4.07 (s, 3H), 7.13 (dd, J1 =9.5, J2 = 2.0, 1H), 7.44 (d, J = 2.0, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.58 (d, J =9.5, 1H) 3.98 (s, 3H), 4.11 (s, 3H), 7.48-7.72 (m, 2H), 8.31 (s, 1H), 8.73 (dd, J1 = 10.0, J2 = 5.0, 1H) 3.97 (s, 3H), 4.10 (s, 3H), 8.08(s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.83 (s, 1H) 3.97 (s, 3H), 4.09 (s, 3H), 8.26 (s, 2H), 8.82 (s, 1H) 3.97 (s, 3H), 4.09 (s, 3H), 8.06 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), (02 9s, 1H) Спол. 3а 3b 3с 3d 3e 3f 3g Таблиця 3 Отримані диметил-хінолін-2,3-дикарбоксилати 7 Спол. R1 R2 Формула (mw) 7а H H C13H11NO4 Елементарний аналіз Розрахов ано (%) Знайдено (%) С Н N С Н N 63.67 4.52 5.71 63.48 4.52 5.63 т.пл.(С°) Вихід (%) 104-106 88.0 7b H СІ 7c Н Br 7d H F 7e Cl Cl 7f СІ Br 7g Br Cl (245.2) C13H10CINO4 (279.7) C13H10BrNO4 (324.1) C13H10FNO4 (263.2) C13H9Cl2NO4 (314.1) C13H9BrClNO4 (348.6) C13H9BrClNO4 (348.6) 55.83 3.60 5.01 55.74 3.59 5.00 152-154 90.0 48.17 3.11 4.32 48.09 3.05 4.26 155-157 81.5 59.32 3.83 5.32 59.23 3.79 5.26 119-121 85.0 49.71 2.89 4.46 49.56 2.85 4.41 113-115 96.0 43.55 2.53 3.91 43.60 2.48 3.88 128-130 95.0 43.55 2.53 3.91 43.47 2.51 3.87 142-144 67.0 Таблиця 4 1 Н-ЯМР (CDCl3)- спектральні дані для сполук 7 d (м.д.), J (Гц) 3.98 (s, 3H), 4.06 (s, 3H), 7.58 - 8.00 (m, 3H), 8.21 (dd, J1 = 9.5, J2 = 2.0, 1H), 8.77 (m, 2H), 8.77 (s, 1H) 3.97 (s, 3H), 4.06 (s, 3H), 7.76 (dd, J1= 9.5. J2 = 2.0. 1H), 7.90 (d, J = 2.0, 1H), 8.67 (s, 1H) 3.97 (s, 3H), 4.07 (s, 3H), 7.90 (dd, J1= 9.5. J2 = 2.0, 1H), 8.09 (m, 2H), 8.66 (s, 1H) 3.98 (s, 3H), 4.07 (s. 3H),7.49-7.72 (m, 2H), 8.20 (dd, J1 = 10, J2 = 5.0. 1H), 8.69 (s, 1H) 3.97 (s. 3H), 4.04 (s. 3H), 8.02 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.64 (s, 1H) 3.98 (s, 3H), 4.06 (s, 3H), 8.24 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.68 (s, 1H) 3.96 (s, 3H), 4.04 (s, 3H), 8.03 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.62 (s, 1H) Спол. 7а 7b 7с 7d 7e 7f 7g Таблиця 5 Отримані 5,4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино [4,5-b] хінолін-5-оксиди 5 Mrz2/ Спол. R1 R2 499 5а H H 502 5b H СІ 514 5с H Br 516 5d H F 518 5e СІ СІ 551 5f СІ Br 568 5g Br СІ Формула (mw) C11H7N3O3 (229.2) C11H6CIN3O3 (263.6) C11H6BrN3O3 (308.1) C11H6FN3O3 (247.2) C11H5Cl2N3O3 (398.1) C11H5BrClN3O3 (342.5) C11H5BrClN3O3 (342.5) Елементарний аналіз Розрахов ано (%) Знайдено (%) С Н N С H N Т.ПЛ. Вихід(%)) 57.65 3.08 18.33 57.56 2.93 18.22 >300 44.5 50.11 2.29 15.94 49.34 2.29 15.40 >300 88.0 42.88 1.96 13.63 42.57 1.91 13.49 >300 78.0 55.44 2.44 16.99 53.44 2.35 16.90 297-298 37.0 44.32 1.69 14.10 44.17 1.91 14.34 >300 16.0 38.57 1.47 12.27 37.93 1.33 11.94 >300 15.0 38.57 1.47 12.27 38.17 1.31 12.00 >300 17.0 Таблиця 6 1 Спол. 5a 5b 5с 5d 5e 5f 5g Н -ЯМР (ДМСО-d6) -спектральні дані для сполук 5 d (м.д.), J (Гц) ароматичні протони (і ОСН3) 7.88-8.28 (m, 2H), 8.46-8.79 (m, 2H), 9.07 (s, 1H) 8.07 (dd, J1 = 9.0, J2 = 2.5, 1H),8.59 (d, J = 9.0, 1H), 8.69 (d, J = 2.5, 1H),9.11 (s, 1H) 8.27 (dd, J1 - 9.0, J2 = 2.0, 1H), 8.60 (d, J = 9.0, 1H), 8.82 (d, J = 2.0, 1H), 9.00 (s, 1H) 8.07 (ddd, J1 = 9.5, J2 = 8.5, J3 = 2.5, 1H), 8.36 (dd, J1 = 9.5, J2 = 2.5, 1H), 8.75 (dd, J1 = 9.5, J2 = 5.0, 1H), 9.02 (s, 1H) 8.83 (s, 1H), 8.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H) 8.80 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 9.01 (s, 1H) 8.90 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 9.04 (s, 1H) NH, OH (обмінюв ані) 10.65 (br.s, 1H). 12.00 (br.s, 1H) 12.05 (br.s, 1H), 14.60 (br.s, 1H) 11.00(br.s, 1H), 12.00(br.s, 1H) 10.92 (br.s, 1H), 12.00 (br.s, 1H) 11.25 (br.s, 1H), 12.05 (br.s, 1H) 12.06 (br.s, 1H), 14.28 (br. s, 1H) 12.13 (br.s, 1H). 14.32 (br.s, 1H) Таблиця 7 Отримані 1,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідропіридазино[4,5-b]хіноліни 9 Mrz2/ Спол. R1 R2 585 9а H H 501 9b H Cl Формула (mw) C11H7N3O2 (213.2) C11H6CIN3O2 Елементарний аналіз Розрахов ано (%) Знайдено (%) С H N С H Т.ПЛ. Вихід (%) N 61.97 3.31 19.71 61.43 3.45 19.16 >300 86.0 53.35 2.44 16.97 32.89 2.28 16.68 >300 88.5 503 9с H Br 519 9d H F 515 9е Cl Cl 539 9f Cl Br 538 9g Br Cl (247.6) C11H6BrN3O2 (292.1) C11H6FN3O2 (231.2) C11H5Cl2N3O2 (282.1) C11H5BrClN3O2 (326.5) C11H5BrClN3O2 (326.5) 45.23 2.07 14.39 44.74 2.11 14.09 >300 82.0 57.14 2.60 18.18 56.73 2.47 17.99 >300 84.0 46.84 1.79 14.90 46.44 1.70 14.87 >300 82.5 40.46 1.54 12.87 40.16 1.42 12.88 >300 69.5 40.46 1.54 12.87 40.23 1.40 12.98 >300 88.0 Таблиця 8 1 Спол. 9а 9b 9с 9d 9е 9f 9g Н-ЯМР (ДМСО-d6) - спектральні дані для сполук 9 d (м.д.), J (Гц) ароматні протони 7.76-8.16 (m, 2H), 8.22-8.47 (m, 2H), 9.30 (s, 1H) 8.02 (dd, J1 = 9.0, J2 = 2.5, 1H), 8.28 (d, J = 9.0, 1H), 8.52 (d, J = 2.5, 1H). 9.26 (s. 1H) 8.16 (m, 2H). 8.60(br. s, 1H), 9.25(s, 1H) 7.93 (ddd, J1 = 9.5, J,2(H,F) = 9.0, J3 = 2.5, 1H), 8.18 (dd, J1(H,F) = 9.5, J2 = 2.5, 1H), 8.36 (dd J1= 9.5, J2(H,F) = 5.5. 1H), 9.24 (s, 1H) 8.47 (s, 1H), 8.67 (s,1H), 9.22 (s, 1H) 8.52 (s, 1H),8.91 (s, 1H), 9.28 (s, 1H) 8.68 (s, 1H), 8.71 (s, 1H), 9.26 (s, 1H) NH (обмінюв ані) 11.60 (br. s,2H) 11.60 (br. s, 2 H) 11.55 (br. s, 2 H) 11.90 (br. s, 2 H) 11.60 (br. s, 2 H) 11.65 (br. s, 2 H) 11.70 (br. s, 2 H) Таблиця 9 Отримані солі 4-гідрокси-1-оксо-1,2-дигідропіридазино[4,5-Ь]хінолін-5-оксид-холіну 6 Елементарний аналіз Знайдено(%) Mrz2/ Спол. R1 R2 Формула (mw) Розрахов ано для 6хН2О* Т.ПЛ.(С°) Вихід (%) N Н N С H 54.84 6.32 15.99 54.76 6.32 15.86 179-180 52.5 49.93 5.50 14.55 49.31 5.47 14.24 185-188 87.5 44.75 4.92 13.04 44.85 4.93 12.86 191-193 71.5 51.19 5.63 14.92 51.74 5.73 14.95 201-203 27.0 С 577 6а H H 576 6b H Cl 570 6с H Br 571 6d H F 574 6е 6f 6g CI CI Br CI Br Сl C16H20N4O4 (332.4) C16H19CIN4O4 (336.8) C16H19BrN4O4 (411.4) C16H19FN4O4 (366.4) * х=1.0 (a.b.с) 0.5 (d) Таблиця 10 1 Спол. 6а 6b 6с 6d Н-ЯМР (CD3OD) - спектральні дані для солей холіну 6 d (м.д.), J (Гц) протони холіну 3.20 (s, 9H), 3.47 (m, 2Н), 3.98 (m, 2Н) 3.22 (s, 9H), 3.50 (m, 2H), 4.01 (m, 2H) 3.20 (s, 9H), 3.48 (m, 2H), 3.99 (m, 2H) 3.22 (s, 9H), 3.51 (m, 2Н), 4.02 (m, 2H) ароматичні протони 7.69 - 8.00 (m. 2H), 8.18 (d, J = 8.0, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.76 (d, J = 8.5, 1H) 7.88 (dd, J1 = 9.0, J2 = 2.5, 1H), 8.27 (d, J = 2.5, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.76 (d, J = 9.0, 1H) 7.99 (dd, J1 = 9.5, J2 = 2.0, 1H), 8.41 (d, J = 2.0, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.64 (d, J = 9.5, 1H) 7.64 - 7.98 (m, 2H), 8.62 (s, 1H), 8.87 (dd, J1 = 10.0, J2 = 5.0, 1H) 6е 6f 6g Таблиця 11 Отримані солі 1,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідропіридазино[4.5-b]хінолін-холіну 10 Mrz2/ Спол. R1 R2 604 10a H H 596 10b H CI 586 10с H Br 572 10d H F 574 10e CI СІ 598 10f CI Br 597 10g Br СІ Формула (mw) C16H20N4O3 (316.36) C16H19CIN4O3 (350.8) C16H19BrN4O3 (395.3) C16H19FN4O3 (334.4) C16H18Cl2 N4O3 (385.3) C16H18BrClN4O3, (429.7) C16H18BrClN4O3, (429.7) Елементарний аналіз Розрахов ано для Знайдено (%) 10xH2O* С Н N С Н N Т.ПЛ. Вихід (%)) 54.26 7.59 14.06 54.23 7.39 14.25 102-110 82.0 54.08 5.53 15.76 54.10 5.55 15.61 189-191 84.0 43.64 5.49 12.72 44.07 5.14 12.73 234-236 61.0 52.16 15.20 5.74 52.08 6.23 15.19 229-230 95.0 47.65 4.99 13.89 47.24 5.03 13.60 205-208 83.0 42.92 4.5 12.51 42.78 4.60 12.44 207-209 92.0 42.92 4.5 12.51 12.66 4.57 12.37 201-203 95.0 * x = 0.25 (d), 1.0 (d, e), 2.5 (c) Таблиця 12 1 С пол. 10а 10b 10с 10d 10с 10f 10g Н-ЯМР (CD3DO) - спектральні дані для солей холіну 10 d (м. д.), J (Гц) протони холіну 3.21 (s, 9H), 3.51 (m, 2H), 4.01 (m, 2H) 3.25 (s, 9H), 3.52 (m, 2H), 4.02 (m, 2H) 3.22 (s, 9H), 3.47 (m, 2H), 3.97 (m, 2H) 3.20 (s, 9H), 3.49 (m, 2H), 3.98 (m, 2H) 3.22 (s, 9H), 3.51 (m, 2H), 4.02 (m, 2H) 3.22 (s, 9H), 3.50 (m, 2H), 4.00 (m, 2H) 3.22 (s, 9H), 3.50 (m, 2H), 4.02 (m, 2H) ароматичні протони 7.64 - 8.57 (m, 4H), 9.17 (s, 1H) 7.89 (dd, J1 = 9.0, J2 = 2.5, 1H), 8.23 (d, J = 2.5, 1H), 8.34 (d, J = 9.0, 1H), 9.13 (s, 1H) 7.99 (dd, J1 = 9.0, J2 = 2.0, 1H), 8.26 (d, J = 9.0, 1H), 8.41 (d, J = 2.0. 1H), 9.09 (s, 1H) 7.64 - 7.81 (m, 2H), 8.39 (dd, J1 = 9.5, J2 = 5.0, 1H), 9.12 (s, 1H) 8.46 (s, 1H), 8.55 (s,1H), 9.14 (s, 1H) 8.53 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 9.13 (s, 1H) 8.43 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 9.13 (s, 1H) Фармакологія In vitro Вивчення рецепторного зв'язування Одержання мембран і визначення білка Препарування тканини здійснюють відповідно до Foster і Wong (1987). У самців Sprague-Dawley пацюків (200-250г) швидко видаляють головний мозок. Кору головного мозку розшаровують і гомогенізують у 20 об'ємах охолодженої льодом 0,32М сахарози, використовуючи стекло-тефлоновий гомогенізатор. Гомогенат центрифугують при 1000 об/хв. протягом 10 хв. Осад у пробірці після центрифугування відкидають і супернатант центрифугують при 20000 об/хв. протягом 20 хв. Осад, що утворився, у пробірці після центрифугування повторно суспендують у 20 об'ємах дистильованої води і центрифугують протягом 20 хв. при 8000 об/хв. Потім супернатант і світлий шар кров'яного згустку тричі центрифугують (48 000 об/хв. протягом 20 хв.) у присутності 5мМ Тріс-НСІ, pH 7,4. Усі стадії центрифугування виконують при 4°С. Після повторного суспендування в 5 об'ємах 5мМ Тріс-НСІ, pH 7,4 суспензію мембран швидко заморожують при 80°С до дня досліджень. У день досліджень мембрани розморожують і промивають чотири рази шляхом суспендування у 5мМ Тріс-НСІ, pH 7,4 і центрифугують при 48.000 об/хв. протягом 20 хв. Кінцевий осад у пробірці після центрифугування суспендують у буфері для дослідження. Кількість білка в кінцевому препараті визначають за способом Lowry (1951) із деякими модифікаціями (Hartfree, 1972). 50мкл зразків білка (у трьох примірниках) розбавляють до 1мл дистильованою водою й обробляють 0,9мл розчину, що містить 2г калій-натрієвого тартрату і 100г Nа2СО3 у 500мл 1н NaOH і 500мл води. Холосту пробу і стандарт (з альбуміном бичачої сироватки) підготовляють таким же способом. Пробірки поміщують у водяну лазню при 50°С на 10 хв. і прохолоджують до кімнатної температури. Добавляють 100мкл розчину, який містить 2г калій-натрієвого тартрату і 1г CuSO4 х 5 Н20 у 90мл води і 10мл 1н NaOH. Зразки залишають при кімнатній температурі, щонайменше, на 10 хв., потім швидко добавляють при перемішуванні 3мл реагенти Folin-Ciocalteu (1мл реагенту розбавляють 15мл води). Пробірки знову нагрівають при 50°С протягом 10 хв. і прохолоджують до кімнатної температури. Потім визначають абсорбцію в 1см кюветах при 650нм. Кінцева концентрація білка, використовувана для вивчень, знаходиться в межах 100-250мкг/мл. Інкубування в обох дослідженнях на зв'язування закінчують, використовуючи фільтруючу систему МіІІіроrе. Зразки, всі в потрійному екземплярі, промивають тричі при постійному вакуумі 2,5мл охолодженого льодом буфера для досліджень на фільтрах із скловолокна, які поставляються Schleicher & Schuell. Після поділу й промивання фільтри поміщають у сцинтиліруючу рідину, (5мл; Ultima Gold) і утримувану на фільтрах радіоактивність визначають, використовуючи звичайний рідкий сцинтиляційний зчитувач (Hewlett Packard, Liquid scintillation Analyser). "Загальне зв'язування" представляє абсолютну кількість радіоліганду, зв'язаного у відсутності яких-небудь добавок, тоді як "неспецифічне зв'язування" визначають у присутності високої концентрації конкурента. Дослідження на [3H]5, 7 -DCKA- зв'язування Експерименти проводять способами, які представляють модифікацію попередніх (Canton et al., 1992; Yoneda et al., 1993). Мембрани суспендують і інкубують у 10мМ Тріс-НСІ, pH 7,4. Час інкубації – 45 хв. при 4°С. Неспецифічне зв'язування [3H]5,7-DCKA визначають, додаючи немічений гліцин при 0,1мМ. Стоп-розчин містить 10мМ Тріс-НСІ і 10мМ суль фату магнію, pH 7,4. Фільтрування виконують по можливості швидко. Експерименти по заміщенню виконують із фіксованою концентрацією [3H]5,7-DCKA, яка дорівнює 10нМ. Досліджені сполуки розбавляють водою або ДМСО і добавляють, щонайменше, у 5 різних концентраціях. Дослідження на зв'язування [3H]гліцину Дослідження, на зв'язування [3Н]гліцину виконують за способом, описаним Kessler і співробітниками (1989). Кортикальні мембрани пацюків одержують як описано вище і кінцеві осади у пробірці після центрифугування суспендують у 50мМ Трісацетат, pH 7,4. Щонайменше, 5 різних концентрацій досліджених сполук інкубують із 20нм [3Н]гліцину протягом 30 хв. при 4°С в присутності 100мкМ стрихніну. Всі сполуки розчиняють у воді або ДМСО, відповідно. Неспецифічне зв'язування визначають шляхом уведення 100мкМ гліцину у суміш, що інкубується. Інкубування обривають, розбавляючи зразки 2мл стоп-розчину (50мМ ТрісНСІ, включаючи 10мМ сульфату магнію, pH 7,4, охолоджений до 100мкМ (таблиця 14а). Цей профіль активності, хоча дуже слабкий, є характерним для конкурентних АМРА-рецепторних антагоністів, які переважно блокують максимально недесенсибілізований стан, стан низької спорідненості рецептора (див. Parsons et al., 1994). Таблиця 14 а Платов ий Максимальний Платов ий Mr z Максимальний Сполу ки NMDA АМРА і ІС 50 АМРА 2/ NMDA IC 50мкM ІС 50 мкМ мкМ ІС 50 мкМ 585 І 65/9 19,1 499 II 51,2 13,8 501 8-СІ-І 2,3 0,7 502 8-СІ-ІІ 0,8 0,3 25,0 150,0 503 8-Вr-І 1,7 0,6 514 8-Вr-ІІ 0,5 0,2 72,2 307,0 519 8-F-I 18,0 5,8 516 8-F-II 6,3 1,6 17,6 >100 515 7,8-ДиСІ-І 3,7 0,9 7,8-ДиСІ518 3,8 0,8 ІІ 539 7-СІ,8-Вr-l 5,3 0,7 7-СІ,8-Вr551 2,4 0,6 ІІ 538 7-Вr,8-СІ-І 93,9 2,5 7-Вr,8-СІ568 10,0 1,5 ІІ 554 8-0-СН 3-І 170 36,2 Таблиця 14 b Mr z 2/ Сполу ки Максимальний NMDA ІС 50 мкМ 569 576 586 570 572 571 575 578 8-CI-l (Хол.) 8-CI-ll (Хол.) 8-Br-l ( Хол.) 8-Br-ll ( Хол.) 8-F-l (Хо л.) 8-F-ll (Хо л.) 7-0-СН 3-І (Хо л.) 7-0-СН 3-ll ( Хол.) 2,0 1,1 2,2 0,6 12,4 4,9 94,0 101 Платов ий NMDA ІС 50 мкМ 0,5 0,5 0,6 0,1 3,5 1,0 14,5 7,7 Екситотоксичність in vitro Способи Виділення кортикальних нейронів здійснюють аналогічно способу, описаному для реєстраторів у вигляді дужки з наклеєного пластиру, за тим виключенням, що використовують зародки пацюків на 17-19 дні розвитку плоду. Нейрони висівають на пластину з 24 комірками (Greiner), при щільності 300000 клітин/ комірок, покритий полі-D-лізином 0,025мг/мл. Клітини вирощують у Dulbecco's модифікованому основному середовищі (DMEM, GIBCO), доповненому 10% термічно інактивованою навколоплідною серозною рідиною теляти (Gibco). Культури витримують при 37°С і 5% СО2. Середовище обновляють перший раз через один тиждень і потім кожні 3 дні, замінюючи половину середовища, свіжим середовищем. Для експериментів використовують культури, ви тримані 17 днів. Взаємодію з ЕАА здійснюють у МЕМ-N2-средовищі (Bottenstein 1979), яке не містить сироватку, але містить 0,5мМ NMDA/1 мкМ гліцину і лікарський засіб, який досліджується. Перед додаванням NMDA, клітини попередньо інкубують із лікарськими засобами і 1мкм гліцину протягом 15 хвилин. Через 24 години цитотоксичний ефект оцінюють морфологічно під фазово-контрастним мікроскопом і оцінюють кількісно біохімічно, міряючи витікання LDH. Активність LDH визначають у супернатанті через 24 години за способом Wroblewski і La Due (1995). 0,1мл супернатанту добавляють до 0,9мл натрійфосфатного буферу (рН=7,5), що містить піруват натрію (22,7мМ) і NADH (0,8мг/ 10мл) при кімнатній температурі. Перетворення пірувату в лактат реєстр ують при 340нм протягом 10 хвилин на спектрофотометрі Контрону. Результати Повні криві концентрація - відповідна реакція все ж таки не доступні. Однак, Mrz 2/501 і Mrz 2/502 при низьких концентраціях є ефективними нейрозахисними засобами in vitro, очевидно, що Mrz 2/502 є більш активним у цьому відношенні (див. таблицю 15). Таблиця 15 Mrz 2/ Сполуки 501 502 503 8-СІ- І 8-СІ- ІІ 8-Вг-І Цитотоксичність in vitro ІС50 мкМ 20 In vi vo Протиконвульсивна активність Задача Вивчення NMDA-рецепторних антагоністичних властивостей досліджених агентів шляхом оцінки протиконвульсивних дій. Додатково вивчають роль органічних кислотних транспортних засобів у видаленні з головного мозку досліджених агентів, шляхом застосування інгібітору, пробеніциду (Probenicid), тривалості протиконвульсивної дії. Способи Для NMDA-дослідження на летальність (Leander et al., 1988) використовують самців мишей альбіносів Swiss (19-21г), що містяться по 10-15 на клітку. Для конвульсій, що індукуються пентилентетразол (PTZ), використовують самців мишей альбіносів Swiss (25-34г), що містяться по 40 на клітку (58´38´20см), тоді як у дослідженнях на максимальний електрошок (MES) і дослідженнях на рухову недостатність використовують NMR самок мишей (18-28г), що містяться по 5 на клітку. Усіх тварин забезпечують водою і їжею ад лібітум (на розсуд виконавця) при 12-годинному циклі день-ніч (день із 6 годин ранку) і при контрольованій температурі (20 ± 0,5°С). Всі експерименти виконують між 10 годинами ранку і 5 годинами дня. Досліджені сполуки упорскують внутрішньочеревинно (і.р) за 15 хвилин до стимулювання конвульсій, якщо не обговорено окремо (див. нижче). Mrz 2/502 розчиняють у розчині солі, доповненому NaOH. Більшість інших агентів розчиняють у наступному розчині: 0,606г Тріс; 5,0г глюкози; 0,5г Твін 80 і 95мл води. Солі холіну і тетраметиламонію розчиняють у дистильованій воді. У дослідженні на конвульсії, що індукуються NMDA, на мишах, спочатку одержують співвідношення доза відповідна реакція, щоб визначити дозу ED97 яку потім використовують для випробування антагоністичних властивостей. Після упорскування ED97- дози NMDA, тварин помішують у маленьку клітку (20´28´14см) і спостерігають протягом 20 хвилин. Фармакологічною кінцевою точкою є загибель, якій передують клонічні конвульсії і тонічні припадки. Пентилентетразол упорскують при дозі 90мг/кг (і.р). Потім підраховують наявність загальних тонічних конвульсій протягом 30 хв., оскільки цей параметр більш чутливий до антагоністів NMDA-рецепторів, чим клонічні конвульсії. За фармакологічну кінцеву точку беруть наявність тонусу в задніх кінцівках при витягуванні. MES (100Гц, 0,5 сек тривалість шоку, 50мА шокова інтенсивність, 0,9мс тривалість імпульсу, Uqo Basile) прикладають за допомогою корнеальних електродів. Підраховують наявність тонічних конвульсій (тонічне витягування задніх лап із мінімальним кутом до тіла 90°). У додатковому експерименті мишам упорскують пробеніцид (200мг/кг) за 30 хв. до уведення досліджених агентів, щоб визначити роль органічного кислотного транспортного засобу в очищенні (тривалість дії). Мета полягає у одержанні значень ED50 для всі х параметрів, оцінюваних використанням тесту Litchfield Wilcoxon (1949) для кількісної характеристики відповідної реакції на дозу. Результати З досліджених сполук, тільки чотири сполуки, усі класу II, ефективні при і.р. введенні в M.E.S.- дослідженні (Mrz 2/499, Mrz 2/502, Mrz 2/516 і Mrz 2/514, див. таблицю 16 а). Діючі спільно сполуки класу І - не активні. Очевидно, усі чотири сполуки мають дуже короткий напівперіод життя in vivo. Мабуть, PTZ- дослідження є більш чутли вою моделлю дії гліцин в-антагоністів, що вводяться і.р, і, у дійсності, ті ж самі сполуки класу II активні при 2-4-кратному зниженні доз, тоді як сполуки класу І залишаються неактивними (таблиця 16 а). Солі холіну саме цих похідних N-оксиду (структури II) мають яскраво виражену протиконвульсивну активність у всіх трьох моделях, тоді як їхні не-N-оксидні похідні або не активні, або мало активні (таблиця 16 b). Крім того, здається, що солі холіну мають більшу тривалість дії. Упорскування пробеніциду значно подовжує тривалість протиконвульсивного впливу усіх досліджуваних агентів. Наприклад, напівперіоди життя сполук 2/514 і 2/570 становлять біля 40 і 80 хвилин, відповідно, у відсутності пробеніциду. У присутності пробеніциду напівперіоди життя подовжуються до порядку 180 і 210 хвилин, відповідно. Отже, очевидно, що органічні кислотні транспортні засоби в хороїдальних нервових сплетеннях поза головним мозком грають важливу роль у короткочасності дії досліджених сполук. Пробеніцид при використовуваній дозі (200мг/кг) самий по собі не має незалежну дію на конвульсії, що індукуються MES. Таблиця 16 а Mr z 2/ Сполу ки MES і.р. (ID 50 мг/кг) NMDA і.р. (ID 50 мг/кг) PTZ і.р. (ID 50 мг/кг) 585 499 501 502 503 514 519 516 515 518 539 538 554 І II 8-СІ-І 8-СІ-ІІ 8-Вr-І 8-Вr-ІІ 8-F-I 8-F-II 7,8-Д иСІ-І 7,8-Д иСІ-ІІ 7-CI,8-Br-l 7-Вr,8-СІ-І 8-0-СН 3-І >100,0 87,0 >100,0 47,6 >100,0 20,2 >60,0 16,6 >100,0 >60,0 >60,0 >60,0 >100,0 58,9 >100,0 26,0 >100,0 99,0 >100,0 40,0 98,0 >100,0 >100,0 106,0 59,0 18,6 >40,0 8,3 >100,0 12,8 >100,0 7,9 >100,0 >100,0 >100,0 Таблиця 16 b Mr z 2/ 577 569 576 586 570 572 571 574 578 575 Сполу ки ІІ(Хол.) 8-СІ-І(Хол.) 8-СІ-ІІ(Хол.) 8-Вr-І( Хол.) 8-Вr-ІІ(Хо л.) 8-F-І(Хо л.) 8-F-II(Хол.) 7,8-Д иСІ-І(Хол.) 8-0-СН 3-ll( Хо л.) 7-0-СН 3-І(Хол.) MES і.р. (ID 50 мг/кг) 23,7 >50 7,7 >50 12,8 >100 15,5 >100 >100 >100 Мікроелектрофоретичне застосування ЕАА агоністів на спиномозкові нейрони in. vivo Досліджують здатність цих гліцин в-антагоністів діяти як NMDA-рецепторні антагоністи in vivo, використовуючи i.v (вн утрішньовенне) уведення, у порівнянні з відповідними реакціями окремих нейронів у спинному мозку пацюків на мікроелектрофоретичне нанесення АМРА і NMDA. Сполуки класу II Mrz 2/502 і Mrz 2/516 є сильними NMDA-рецепторними антагоністами in vivo при значеннях ID50 1,2 і 1,8мг/кг i.v, відповідно, тоді як вихідні сполуки класу І цілком не активні навіть при збільшенні цих значень до 16мг/кг i.v. Три-чотирикратне перевищення доз також дає антагоністичні відповідні реакції на АМРА, хоча це свідчить про відсутність селективності в порівнянні з дослідженнями in vitro (таблиця 17 а). Таблиця 17 а Mr z Мікро елек трофоретичний Мікро елек трофоретичний Сполу ки 2/ NMDA (ID 50 мг/кг i.v.) АМРА (ID 50 мг/кг i.v.) 501 8-СІ-І >16,0 >16,0 502 8-СІ-ІІ 1,2 4,9 519 8-F-I >16,0 >16,0 516 8-F-II 1,8 3,6 У цій моделі солі холіну мають приблизно рівну активність із вільними кислотами після i.v уведення, але злегка більш селективні у відношенні NMDA у порівнянні з АМРА (таблиця 17 b). Знову, не-N-оксидні похідні (сполуки класу І) не активні. Таблиця 17 b Mr z Мікро елек трофоретичний Мікро елек трофоретичний Сполу ки 2/ NMDA (ID 50 мг/кг i.v.) АМРА (ID 50 мг/кг i.v.) 577 ІІ (Хол.) 34,0 >32,0 8-СІ-І 569 >16,0 >16,0 (Хол.) 8-СІ-ІІ 576 2,8 >16,0 (Хол.) 8-Вr-І 586 >16,0 >16,0 (Хол.) 8-Вr-ІІ 570 4,5 >16,0 (Хол.) 8-F-l 572 >16,0 >16,0 (Хол.) 8-F-ll 571 4,7 9,2 (Хол.) Обговорення Чотири сполуки класу II, Mrz 2/499, Mrz 2/501 Mrz 2/514 і Mrz 2/516 є гліцинв-антагоністами in vitro і мають значно більшу in vi vo системну і/або CNS-прийнятність, чим зв'язані вихідні сполуки класу І (Mrz 2/585, Mrz 2/501, Mrz 2/503 і Mrz 2/519). Доступ до CNS є головною проблемою майже для всіх гліцин в-антагоністів, отриманих до цього часу, але цей новий клас сполук переборює цю основну перешкоду і, отже, вони є терапевтично актуальними гліцин в-антагоністами. Адитивні солі Використовуючи вищевикладені способи, одержують адитивні солі сполук 5, 6, 7, 8, 9 і 10 із четвертинними амінами (приміром, 4-тетраметиламонієм, 4-тетраетиламонієм), четвертинними аміноспиртами (приміром, холіном) або четвертинними амінокислотами (приміром, МДМ-триметилсерином). Солі холіну і 4-тетраметиламонію (4-NH3) істотно поліпшують біоприйнятність і є кращими. Фармацевтичні композиції Сполуки за даним винаходом можуть бути перероблені у фармацевтичні композиції, що включають фармацевтично прийнятний носій або розріджувач додатково до активної сполуки за даним винаходом. Такі композиції можуть бути введені живій тварині, особливо живій людині, шляхом перорального або парентерального способу введення. Приміром, тверді препарати або фармацевтичні композиції для перорального введення можуть бути узяті у формі капсул, таблеток, пілюль, порошків або гранул. У таких твердих фармацевтичних складах активна сполука або її проліки змішують, щонайменше, з одним фармацевтично прийнятним розріджувачем або носієм, таким, як очеретяний цукор, лактоза, крохмаль, тальк або синтетичні або натуральні смоли, речовиною, яка зв'язує, такою, як желатин, речовиною, що змазує, такою, як стеарат натрію і/або речовиною, що роз'єднує, такою, як бікарбонат натрію. Для забезпечення ефекту уповільненого вивільнення у фармацевтичну композицію може бути включена така сполука, як гідроколоїд або інший полімер. Додаткові речовини, такі, як речовини, що змазують, або буфери, можуть також бути додані загальноприйнятим способом. При бажанні, таблетки, пілюлі або гранули можуть бути покриті ентеросолюбільною оболонкою. Рідини для перорального застосування можуть бути у формі ліпосом, емульсій, розчинів або суспензій, що містять, звичайно, використовувані інертні розріджувачі, такі, як вода. До того ж, такі рідкі фармацевтичні композиції можуть також містити агенти, що змочують, що емульгують, що диспергують або, узагалі, поверхнево-активні агенти, так само як підсолоджувачи, віддушки або речовини, що надають пахощів. Відповідними препаратами для парентерального застосування можуть бути, серед іншого, стерильні водяні й неводяні розчини, суспензії, ліпосоми або емульсії. У якості фармацевтично прийнятного розріджувача або носія можуть бути використані додаткові речовини, серед яких багато які уже відомі для цієї форми уведення фармацевтичної композиції. Залежна від передбаченого способу введення й тривалості лікування, точна доза активних сполук у препаратах за даним винаходом може бути змінена, головним чином, на розсуд лікаря або ветеринара. Активні агенти даного винаходу, безумовно, можуть бути об'єднані для введення з іншими фармакологічно активними агентами. У композиціях за даним винаходом співвідношення активного агента або агентів у композиції можуть широко варіюватися, необхідним є тільки, щоб активний інгредієнт за даним винаходом, або його проліки, складали або забезпечували ефективну кількість, тобто таку кількість, при якій в обраній лікарській формі буде присутня відповідна ефективна доза. Очевидно, що декілька лікарських форм, так само як декілька індивідуальних активних сполук можна вводити одночасно або приблизно в той самий час, або навіть у тій же самій фармацевтичній композиції або в тому ж фармацевтичному складі. Спосіб лікування Як зазначено раніше, сполуки за даним винаходом придатні, особливо, у формі фармацевтичних композицій, для перорального, або парентерального введення, точні індивідуальні дози, так само як добові дози, у кожному конкретному випадку визначаються, звичайно, відповідно до добре встановлених медичних і/або ветеринарних принципів і відповідно до розпоряджень лікаря, що лікує, або ветеринара. На додаток до перорального або парентерального введення, можна використовувати ректальне (прямокишкове) і/або внутрішньовенне введення, коли використовують парентеральне введення, то дози звичайно значно знижуються, хоча пероральне введення є кращим. Придатною є кількість приблизно від одного до трьох грамів на день у формі повторної або розділеної дози. Більш широкий інтервал, порядку 0,5 10 грамів на день, також може бути застосований у залежності від стану конкретного хворого. Хоча знайдено, що 500мг активної основи особливо придатні для застосування в таблетках, індивідуальні дозування можуть варіюватися приблизно від 200 до 1000мг, а 500мг, що рекомендуються для застосування в таблетках, можна, звичайно, уводити перорально, приміром, від одного до трьох разів у день. Саме собою зрозуміло, що в разовій дозі можна вводити більше, ніж одну таблетку, якщо потрібно досягти вищевказаних добових кількостей, що рекомендуються, для перорального уведення від одного до трьох грамів у день. Як уже сказано, сполука за винаходом або його пролікарська форма можуть бути введені живій тварині, включаючи живу людину, будь-яким із численних шляхів, приміром, перорально у виді капсул або таблеток, парентерально у формі стерильних розчинів або суспензій, або підшкірною або внутрішньом'язовою імплантацією шматочка тканини, а в деяких випадках внутрішньовенно у формі стерильних розчинів. Іншими очевидними способами введення є шкірний, підшкірний, транс-букальний, внутрішньом'я зовий і внутрішньочеревинний, і конкретний спосіб уведення, як, звичайно, вибирає лікар або ветеринар. Таким чином, установлене, що даний винахід пропонує нові сполуки піридо-фталазин-діону і фармацевтичні композиції, що містять їх, а також спосіб боротьби з неврологічними порушеннями, зв'язаними з ексцитотоксичністю і внаслідок цього з дисфункцією глутаматергічної нейротрансміссії, усе разом це дає довгоочікуване рішення проблеми, що раніше існувала, яка неадекватно розв'язувалась за попереднім рівнем техніки. Варто розуміти, що даний винахід не обмежується сполуками, композиціями, способами або методиками, які строго відповідають зазначеним, оскільки численні модифікації і їхні зміни відразу ж стають очевидними для фахівця в тій області техніки, до якої цей винахід належить, тому даний винахід варто розглядати обмеженим тільки загальними рамками об'єму, що можуть бути встановлені на підставі прикладених пунктів. Bottenstein JE, Sato GH (1979): Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, pp. 514-517. Canton T, Doble A, Miquet JM, Jimonet P, Blanchard JC (1992): J. Pharm. Pharmnacol. 44, pp. 812-816. Dansyz W, Parsons CG, Bresink I, Quack G (1995): Drug News & Perspectives 8, pp. 261-277. Foster AC, Wong EHF (1987): Brit. J. Pharmacol. 91, pp. 403-409. Hartfree EF (1972): Analytical Biochemistry 48, pp. 422-427. Kessier M, Terramani T, Lynch G, Baudry M (1989): J. Neurochem. 52, pp. 1319-1328. Leander JD, Lawson RR, Ornstein PL, Zimmerman DM (1988). Brain Res. 448, p. 115. Litchfield JT, Wilcoxon F (1949): J. Phannacol. Exp. Ther. 96, p. 99. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randell RJ (1951): J. Biol. Chem. 193, pp. 265-275. Parsons CG, Grüner R, Rozental J (1994) .Neuropharmacology 33, pp. 589-604. Wroblewski F, LaDue JS (1955): Soc. Exp. Biol. Med. 90, p. 210. Yoneda Y, Su zuki T; Ogita K, Han DK (1993): J. Neurochem. 60, pp. 634-645.