Застосування композиції, що містить антимікробний пептид, як харчового консерванту

Реферат: Винахід стосується застосування композиції, що містить антимікробний поліпептид, який включає послідовність Blad для запобігання або пригнічення псування харчового продукту мікроорганізмом. UA 113152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до галузі антимікробних агентів, які впливають на мікроорганізми, що викликають псування харчових продуктів. Вступ Консервація харчових продуктів являє собою процес обробки харчових продуктів з метою запобігання або пригнічення їх псування, що викликається ендогенним хімічним / ферментативним розкладанням, та/або спричиненого або прискорюваного мікроорганізмом. Існує багато способів консервації харчових продуктів, деякі з яких пригнічують ендогенні процеси (наприклад, антиоксиданти), деякі з яких пригнічують мікробні процеси (наприклад, антимікробні препарати), та деякі з яких пригнічують обидва типи процесів (наприклад, заморожування). Хімічну сполуку, яка використовується для пригнічення псування харчових продуктів, зазвичай називають консервантом, який може бути, наприклад, антиоксидантом або антимікробним препаратом. Конкретні способи консервування харчових продуктів включають сушіння, нагрівання, охолодження або заморожування, осмотичне інгібування (наприклад, використання сиропів та солі), вакуумну упаковку, консервування в металевій та скляній тарі, желування, заливку, тушіння, іонізуюче випромінювання, обробку пульсуючим електричним полем та консервацію харчових продуктів надвисоким гідравлічним тиском, застосування антиоксидантів та/або застосування антимікробних консервантів (наприклад, діоксиду сірки, діоксиду вуглецю, етанолу, оцтової кислоти, лимонної кислоти, молочної кислоти, сорбінової кислоти, бензоатів, нітратів та нітритів, сульфітів, пропіонату кальцію та метилхлорізотіазоліну). Незважаючи на наявність відносно великої кількості способів консервації харчових продуктів, які використовуються у даний час, існує необхідність у розробці нових антимікробних консервантів. Причиною цього є недостатньо ефективний вплив багатьох вже існуючих способів на мікроорганізми та, зокрема, проблеми з ефективністю та/або безпечністю багатьох вже існуючих антимікробних консервантів. Численні способи консервації харчових продуктів, якими намагаються створити несприятливі умови для росту мікроорганізмів, є неефективними проти організмів, що виживають в екстремальних умовах (наприклад, види Pseudomonas можуть рости при дуже низьких температурах; Bacillus coagulans є термостійкими та кислотостійкими; численні види Aspergillus мають здатність до оліготрофії; види Zygosaccharomyces мають високу ксеротолерантність). Багато з існуючих антимікробних консервантів мають помірну активність, особливо проти мікроорганізмів з вродженою або набутою стійкістю, та/або вузький спектр дії. Наприклад, види Zygosaccharomyces мають високу стійкість до етанолу, оцтової кислоти, сорбінової кислоти, бензойної кислоти та діоксиду сірки. Крім того, численні існуючі антимікробні консерванти пов'язують з різними побічними ефектами, такими як респіраторні проблеми або ДСУ. Зокрема, наприклад, діоксид сірки викликає подразнення бронхів у астматиків, нітрити є потенційно канцерогенними, бензоати пов'язують з різними видами алергій, астмою, шкірним висипом та пошкодженням мозку. Крім того, ефективні способи пригнічення росту мікроорганізмів в харчових продуктах, такі як низьке значення pH або низька водна активність, часто є неприйнятними для споживача (наприклад, забезпечують кислий смак) або мають негативні наслідки для здоров'я (наприклад, високий вміст солі або цукру). Одна з цілей даного винаходи полягає у спробі вирішення зазначених проблем і, зокрема, наприклад, у створенні нового антимікробного агенту з сильною дією широкого спектру проти мікроорганізмів, та при цьому з низькою токсичністю. Суть винаходу Авторами даного винаходу неочікувано було виявлено, що поліпептид Blad з Lupinus має потужну антимікробну дію відносно великого числа різноманітних бактеріальних і грибкових організмів, які викликають псування харчових продуктів. Автори даного винаходу також виявили, що поліпептид Blad є нетоксичним, що робить Blad чудовою хімічною сполукою для застосування як антимікробного консерванту харчових продуктів. Таким чином, авторами даного винаходу запропоновано застосування композиції, що містить антимікробний поліпептид, який включає Blad або його активний варіант, для запобігання або пригнічення псуванняхарчового продукту, яке викликається мікроорганізмом. Переважно, зазначений мікроорганізм є бактерією (переважно видом, що викликає псування харчових продуктів, родів Pseudomonas або Bacillus) або грибом (переважно видом, що викликає псування харчових продуктів, одного з наступних родів: Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Botrytis, Colletotrichum, Saccharomyces, Kluyveromyces та Zygosaccharomyces). 1 UA 113152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 У кращих варіантах здійснення винаходу харчовий продукт отриманий з, вироблений або є фруктом, горіхом, овочем, зерном, цукром, молочним продуктом, рідким або пастоподібним продуктом, м'ясом, рибою або хлібом. У кращих варіантах здійснення винаходу харчовий продукт є полуницею, а мікроорганізм переважно являє собою Botrytis cinerea або Colletotrichum acutatum, переважно, Botrytis cinerea. У кращих варіантах здійснення винаходу зазначена композиція додатково включає хелатуючий агент. Авторами даного винаходу також запропонований спосіб запобігання або пригнічення псування харчового продукту, яке викликається мікроорганізмом, що включає введення в призначений для цього харчовий продукт ефективної кількості композиції, яка містить антимікробний поліпептид, що включає Blad або його активний варіант. Опис креслень Даний винахід буде описаний з посиланням на прикладені креслення, де: на Фіг. 1 показана кодуюча послідовність попередника β-конглютину Lupinus albus (SEQ ID NO: 1); і на Фіг. 2 показаний внутрішній фрагмент кодуючої послідовності попередника β-конглютину, що відповідає Blad (SEQ ID NO: 3). Детальний опис винаходу Blad Blad ("banda de Lupinus albus doce" - смуга з солодкого L. albus) - це назва, дана стабільному проміжному продукту розпаду β-конглютину, основного запасного білка, що міститься в насінні рослин роду Lupinus. Він являє собою поліпептид з масою 20 кДа, що складається з 173 амінокислотних залишків, який кодується внутрішнім фрагментом (519 нуклеотидів, зареєстрований в GenBank під номером доступу ABB13526) гена, що кодує попередник βконглютину з Lupinus (1791 нуклеотидів, зареєстрований в GenBank під номером доступу AAS97865). Коли праймери, що кодують кінцеві послідовності Blad, були використані для ампліфікації послідовності з геномної ДНК Lupinus, був отриманий продукт розміром ~620 п.н., що вказує на наявність інтрону у фрагменті, що кодує Blad. Існуючий у природі Blad є основним компонентом глікоолігомеру масою 210 кДа, який накопичується (після інтенсивного обмеженого протеолізу β-конглютину) винятково в сім'ядолях видів рослин з роду Lupinus між 4 і 12 днями після початку проростання. У той час як зазначений олігомер є глікозильованим, існуючий в природі Blad є неглікозильованим. Глікоолігомер, що містить Blad, складається з декількох поліпептидів, основні з яких мають молекулярну масу 14, 17, 20, 32, 36, 48 і 50 кДа. Поліпептид масою 20 кДа Blad безсумнівно є найпоширенішим поліпептидом цього олігомеру, і скоріше за все тільки він один має лектинову активність. Присутній у природі Blad складає приблизно 80 % від усіх сім'ядольних білків в 8-денних проростках. Кодуюча послідовність попередника β-конглютину L. albus (SEQ ID NO: 1) наведена на Фіг. 1. Кодуюча послідовність вихідної субодиниці β-конглютину відповідає залишкам з 70 по 1668. Кодовані нею 533 амінокислотних залишків вихідної субодиниці β-конглютину (SEQ ID NO: 2) являють собою: Внутрішній фрагмент кодуючої послідовності попередника β-конглютину, що відповідає Blad (SEQ ID NO: 3), наведений на Фіг. 2. Поліпептид Blad (SEQ ID NO: 4) являє собою: 2 UA 113152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід відноситься до композиції, що містить антимікробний поліпептид, який включає Blad або його активний варіант. Таким чином, він відноситься до композиції, що містить антимікробний поліпептид, який включає поліпептидну послідовність (SEQ ID NO: 4) або її активний варіант. В альтернативних варіантах здійснення винаходу композиція в основному складається з антимікробного поліпептиду, що включає Blad або його активний варіант, та/або антимікробний поліпептид в основному складається з Blad або його активного варіанта. У додаткових варіантах здійснення винаходу антимікробний поліпептид, що включає (або в основному складається з) Blad або його активний варіант, може бути використаний в ізольованому вигляді. Активним варіантом Blad є варіант Blad, який зберігає здатність діяти як антимікробний агент (тобто має антимікробну активність - опис рівня такої активності та способу її вимірювання наведені нижче). Термін "активний варіант Blad" включає в свій обсяг фрагмент послідовності SEQ ID NO: 4. У кращих варіантах здійснення винаходу фрагмент послідовності SEQ ID NO: 4 вибраний таким чином, що він становить, щонайменше, 10 % довжини SEQ ID NO: 4, переважно, щонайменше, 20 %, переважно, щонайменше, 30 %, переважно, щонайменше, 40 %, переважно, щонайменше, 50 %, переважно, щонайменше, 60 %, переважно, щонайменше, 70 %, переважно, щонайменше, 80 %, переважно, щонайменше, 90 % і, найбільше переважно, щонайменше, 95 % довжини SEQ ID NO: 4. Таким чином, Blad або його варіант, як правило, має довжину, щонайменше, 10 амінокислотних залишків, наприклад, щонайменше, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160 або 173 амінокислотних залишків. Термін "активний варіант Blad" також включає у свій обсяг поліпептидну послідовність, яка має гомологію з SEQ ID NO: 4, наприклад, щонайменше, 40 % ідентичності, переважно, щонайменше, 60 %, переважно, щонайменше, 70 %, переважно, щонайменше, 80 %, переважно, щонайменше, 85 %, переважно, щонайменше, 90 %, переважно, щонайменше, 95 %, переважно, щонайменше, 97 % і, найбільш переважно, щонайменше, 99 % ідентичності, наприклад, за всією послідовністю або на ділянці з, щонайменше, 20, переважно, щонайменше, 30, переважно, щонайменше, 40, переважно, щонайменше, 50, переважно, щонайменше, 60, переважно, щонайменше, 80, переважно, щонайменше, 100, переважно, щонайменше, 120, переважно, щонайменше, 140 і, найбільш переважно, щонайменше, 160 або більше сусідніх амінокислотних залишків. Способи вимірювання гомології білків добре відомі з рівня техніки, і фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що в даному контексті гомологія розраховується на основі ідентичності амінокислот (іноді позначається як "точна гомологія"). Гомологічний активний варіант Blad, як правило, відрізняється від поліпептидної послідовності SEQ ID NO: 4 замінами, інсерціями або делеціями, наприклад, має від 1, 2, 3, 4, 5 до 8 або більше замін, інсерцій або делецій. Заміни є переважно "консервативними", тобто, інакше кажучи, амінокислота може бути замінена аналогічною амінокислотою, де аналогічні амінокислоти мають однаковою із замінною амінокислотою одну з наступних груп: ароматичні залишки (F/H/W/Y), неполярні аліфатичні залишки (G/A/P/I/L/V), полярні незаряджені аліфатичні залишки (C/S/T/M/N/Q) і полярні заряджені аліфатичні залишки (D/E/K/R). Кращі підгрупи включають: G/A/P; I/L/V; C/S/T/M; N/Q; D/E; і K/R. Антимікробний поліпептид, що включає Blad або його активний варіант (як описано вище), може складатися з Blad або його активного варіанта з будь-якою кількістю амінокислотних залишків, доданих до N-кінця та/або C-кінця, за умови, що поліпептид зберігає антимікробну активність (опис рівня такої активності й способу її вимірювання знову дивіться нижче). Переважно, щоб до одного або обох кінців Blad або його активного варіанта було додано не більше 300 амінокислотних залишків, більш переважно, не більше 200 амінокислотних залишків, переважно, не більше 150 амінокислотних залишків, переважно, не більше 100 амінокислотних залишків, переважно, не більше 80, 60 або 40 амінокислотних залишків, найбільш переважно, не більше 20 амінокислотних залишків. Антимікробний поліпептид, що включає (або в основному складається з) Blad або його активний варіант (як описано вище), може бути використаний у даному винаході в очищеному вигляді (наприклад, виділений з рослинного, тваринного або мікробного джерела) та/або у вигляді рекомбінантного білку. Одержання рекомбінантної форми дозволяє одержувати активні варіанти Blad. 3 UA 113152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Способи очищення присутнього в природі Blad вже описані в літературі (наприклад, Ramos et al. (1997) Planta 203(1): 26-34 і Monteiro et al. (2010) PLoS ONE 5(1): e8542). Придатним джерелом присутнього в природі Blad є рослина роду Lupinus, така як Lupinus albus, переважно сім'ядолі зазначеної рослини, переважно, зібрані між приблизно 4 і приблизно 14 днем після початку проростання, більш переважно, зібрані з 6 по 12 день після початку проростання (наприклад, на 8 день після початку проростання). У рівні техніки розкриті способи екстрагування спільного білку, що приводять до одержання неочищеного екстракту, який містить Blad, і способи виділення білків з такого екстракту, що приводять до одержання частково очищеного екстракту, наприклад, що включає Blad-вмісний глікоолігомер, який включає Blad. Для того щоб виділити власне Blad, можна потім використовувати ДСН-ПААГ і/або, переважно, обернено-фазну ВЕРХ на колонці C-18. Альтернативним способом одержання частково очищеного екстракту, що містить глікоолігомер, який включає Blad, є залучення хітинзв'язуючої активності Blad. Цей глікоолігомер дуже ефективно зв'язується з хітиновою колонкою, у способі очищення за допомогою хітинової афінної хроматографії, та елююється 0,05 Н розчином HСl. Детальний опис прикладу цього способу очищення наводиться нижче: Сім'ядолі восьмиденних рослин люпину збирають і гомогенізують у воді, очищеній за допомогою системи Milli-Q plus (значення pH доведено до 8,0), що містить 10 мM CaCl2 і 10 мM MgCl2. Гомогенат фільтрують через марлю і центрифугують при 30000 g впродовж 1 години при температурі 4 °C. Потім осад ресуспендують в 100 мM Tris-HCl буфері з pH 7,5, що містить 10 % (маса/об'єм) NaCl, 10 мM ЕДТА та 10 мM ЕГТА, перемішують впродовж 1 години при температурі 4 °C і центрифугують при 30000 g впродовж 1 години при температурі 4 °C. Спільну глобулінову фракцію, що міститься в надосадовій рідині, осаджують сульфатом амонію (561 г/л), перемішують на холоді впродовж 1 години й центрифугують при 30000 g впродовж 30 хвилин при температурі 4 °C. Отриманий осад розчиняють в 50 мM Tris-HCl буфері з pH 7,5, знесолюють на колонці PD-10, урівноваженій тим же буфером, і пропускають через колонку для хітинової афінної хроматографії, попередньо врівноважену тим же буфером. Цю колонку промивають 50 мM Tris-HCl буфером з pH 7,5 і білки, що зв'язалися, елююють 0,05 Н розчином HCl. Елюйовані фракції відразу нейтралізують 2 M розчином Tris, і пікові фракції об'єднують, ліофілізують і аналізують за допомогою ДСН-ПААГ. Для виготовлення хітинової колонки хітинова сировина була отримана від компанії Sigma і оброблена в такий спосіб: зразок хітину добре промивали водою, очищеною за допомогою системи Milli-Q plus, а потім 0,05 Н розчином HCl. Потім її промивали 1 % (маса/об'єм) розчином карбонату натрію, і потім етанолом доти, поки поглинання промивної рідини не ставало менше 0,05. Після цього хітин поміщали в наконечник для піпетки й урівноважували 50 мM Tris-HCl буфером з pH 7,5. Способи одержання рекомбінантних білків добре відомі з рівня техніки. Такі способи, які застосовуються тут, будуть включати вставку полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який включає Blad або його активний варіант, у придатний експресійний вектор, що дозволяє сполучати зазначений полінуклеотид з одним або декількома промоторами (наприклад, з індуцибельним промотором, таким як T7lac промотор) та з іншими цільовими полінуклеотидами або генами, введення даного експресійного вектора в підходящу клітину або організм (наприклад, Escherichia coli), експресію поліпептиду в трансформованій клітині або організмі й видалення експресованого рекомбінантного поліпептиду з цієї клітини або організму. Для полегшення такого очищення експресійний вектор може бути сконструйований так, щоб полінуклеотид додатково кодував, наприклад, кінцеву мітку, яка може сприяти очищенню: наприклад, мітку з гістидинових залишків для афінного очищення. Після того як рекомбінантний поліпептид був очищений, мітка очищення може бути видалена з поліпептиду, наприклад, шляхом протеолітичного розщеплення. У композиції, що містить антимікробний поліпептид, який включає (або в основному складається з) Blad або його активний варіант, зазначений поліпептид переважно знаходиться в частково очищеному вигляді, більш переважно, в очищеному вигляді. Зазначений поліпептид є частково очищеним, якщо він знаходиться в середовищі, у якому відсутні один або більше інших поліпептидів, з якими він зв'язаний у природніх умовах, та/або становить, щонайменше, 10 % від усіх присутніх білків. Зазначений поліпептид є очищеним, якщо він знаходиться в середовищі, у якому відсутні всі або більшість інших поліпептидів, з якими він зв'язаний у природніх умовах. Наприклад, термін "очищений Blad" означає, що Blad становить, щонайменше, 50 %, щонайменше, 60 %, щонайменше, 70 %, щонайменше, 75 %, щонайменше, 4 UA 113152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 80 %, щонайменше, 85 %, щонайменше, 90 %, щонайменше, 95 %, щонайменше, 97 %, щонайменше, 98 % або, щонайменше, 99 % від усіх білків у композиції. У композиції, що містить антимікробний поліпептид, яка включає (або в основному складається з) Blad або його активний варіант, набір білків Lupinus може складатися в основному з Blad-вмісного глікоолігомеру, який включає поліпептид, що включає (або в основному складається з) Blad або його активний варіант. Композиція, що містить антимікробний поліпептид, яка включає (або в основному складається з) Blad, також може являти собою препарат, що містить іншу хімічну сполуку(и), додану в цю композицію фахівцем у даній галузі техніки. Псування харчових продуктів і харчові продукти Псування харчового продукту мікроорганізмом означає будь-яку зміну харчового продукту, яка викликається мікроорганізмом, що приводить до зміни, наприклад, смаку, запаху або зовнішнього вигляду (наприклад, форми, кольору, консистенції, пружності), яка знижує його живильну та/або комерційну цінність. Передбачається, що термін "харчовий продукт" означає будь-яку рідку або тверду речовину, призначену для вживання людиною або твариною зметою харчування або одержання задоволення. Харчовий продукт може вживатися безпосередньо або опосередковано (наприклад, після приготування або обробки, такої як очистка зернових продуктів). У відповідних випадках передбачається, що харчовий продукт переважно є продуктом, виділеним з природного навколишнього середовища, таким як харчові продукти рослинного походження (наприклад, фрукти, овочі, насіння), та продуктом тваринного походження (наприклад, м'ясо, риба, молоко). Харчовий продукт може бути отриманий з, забезпечений або може бути фруктом, горіхом, овочем, зерном, цукром, молочним продуктом, рідким або пастоподібним продуктом, м'ясом, рибою або хлібом. Харчові продукти, отримані з фруктів, включають вино й фруктовий сік. Рослини, що забезпечують зерно, включають злаки (наприклад, кукурудзу, пшеницю, ячмінь, сорго, просо, рис, овес і жито). Цукри, переважно сахароза, можуть бути отримані з цукрового буряку або цукрової тростини. Молочні продукти включають молоко, вершки, сир і йогурт. Рідкий або пастоподібний продукт включає суп, соуси, маринади, майонез, вершкові салатні заправки та інші заправки для салатів, варення, сироп і дитяче харчування. Передбачувані м'ясні та/або рибні харчові продукти можуть бути як обробленими, так і необробленими і можуть бути приготовленими або неприготованими. Інші конкретні харчові продукти, передбачені даним винаходом, можуть бути знайдені в наступному розділі, який має відношення до прикладів харчових продуктів, підданих псуванню тими мікроорганізмами, на які можуть бути спрямовані застосування та способи даного винаходу. Харчові продукти також включають заздалегідь приготовлені компонентні харчові продукти, такі як бутерброди, пироги, пироги з заварним кремом і начинкою і т.д., особливо ті, які призначені для зберігання в охолодженому стані. Цільові мікроорганізми Авторами даного винаходу також запропоноване застосування композиції, що містить антимікробний поліпептид, який включає Blad або його активний варіант, для запобігання або пригнічення псування харчового продукту, що викликається мікроорганізмом. Мікроорганізми, які можуть викликати псування харчового продукту - мікроорганізми, що псують продукти, включають, зокрема, бактерії й гриби. У такому застосуванні антимікробний поліпептид може розглядатися як антимікробний консервант харчових продуктів. Антимікробний поліпептид може бути використаний для запобігання або пригнічення псування харчового продукту, що викликається як грампозитивними, так і грамнегативними бактеріями. Особливо кращі цільові бактерії (з наведеними в дужках прикладами харчових продуктів, псування яких вони можуть викликати) включають види Pseudomonas, що викликають псування харчових продуктів, такі як Pseudomonas aeruginosa (арабідопсис і латук), Pseudomonas syringae (різні харчові продукти рослинного походження, такі як буряк, пшениця і ячмінь), Pseudomonas tolaasii (гриби), Pseudomonas agarici (гриби), Pseudomonas fragi (молочні продукти) і Pseudomonas lundensis (молоко, сир, м'ясо й риба), найбільш переважно, P. aeruginosa; і види Bacillus, що викликають псування харчових продуктів, такі як Bacillus subtilis (томати, картопля, хліб) і Bacillus coagulans (молоко, томатний сік). Антимікробний поліпептид може бути використаний для запобігання або пригнічення псування харчового продукту, що викликається як одноклітинними (дріжджові гриби), так і багатоклітинними (міцеліальними, цвілевими) грибами. Особливо кращі цільові дріжджові гриби (з наведеними в дужках прикладами харчових продуктів, псування яких вони можуть викликати) включають види Saccharomyces, що викликають псування харчових продуктів, такі як Saccharomyces cerevisiae (цукор, цукрові сиропи, вино й безалкогольні напої, такі як фруктові 5 UA 113152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 соки); види Kluyveromyces, що викликають псування харчових продуктів, такі як Kluyveromyces marxianus (сир); і види Zygosaccharomyces, що викликають псування харчових продуктів, такі як Zygosaccharomyces bailii (вино, фруктовий сік, заправка для салатів і томатний соус) і Zygosaccharomyces rouxii (цукрові сиропи, фруктові соки, варення та заправки для салатів). Особливо кращі цільові цвілеві гриби (з наведеними в дужках прикладами харчових продуктів, псування яких вони можуть викликати) включають види Alternaria, що викликають псування харчових продуктів, такі як Alternaria alternata (картопля), Alternaria arborescens (томати), Alternaria arbusti (азіатська груша), Alternaria brassicae (овочі), Alternaria brassicicola (капустяні культури), Alternaria carotiincultae (морква), Alternaria conjuncta (пастернак), Alternaria dauci (морква), Alternaria euphorbiicola (капустяні культури), Alternaria gaisen (груша), Alternaria infectoria (пшениця), Alternaria japonica (капустяні культури), Alternaria petroselini (петрушка), Alternaria selini (петрушка), Alternaria solani (картопля, томати) і Alternaria smyrnii (смирна, петрушка); види Aspergillus, що викликають псування харчових продуктів, такі як Aspergillus fumigatus (горіхи, картопля, рис і хліб), Aspergillus niger (фрукти й овочі, наприклад, виноград і цибуля) і Aspergillus flavus (зернові культури, арахіс); види Fusarium, що викликають псування харчових продуктів, такі як Fusarium oxysporum (фрукти) і Fusarium graminearum (ячмінь, пшениця й кукурудза); види Botrytis, що викликають псування харчових продуктів, такі як Botrytis cinerea (полуниця, виноград і томати); і види Colletotrichum, що викликають псування харчових продуктів, такі як Colletotrichum actuatum (полуниця, селера, яблука, авокадо, баклажан, кава й гуава), Colletotrichum coccodes (томати, картопля), Colletotrichum capsici (васильок, нут, перець), Colletotrichum crassipes (маракуйя), Colletotrichum gloeosporioides (овочі і фрукти, наприклад, айва і яблука), Colletotrichum graminicola (злакові культури), Colletotrichum kahawae (кава), Colletotrichum lindemuthianum (квасоля), Colletotrichum musae (банани), Colletotrichum nigrum (томати), Colletotrichum orbiculare (дині, огірки), Colletotrichum pisi (горох) і Colletotrichum sublineolum (рис). У кращих варіантах здійснення винаходу антимікробний поліпептид використовується для запобігання або пригнічення псування, що викликається мікроорганізмом, фруктів, переважно полуниці, і цей мікроорганізм переважно являє собою Botrytis cinerea або Colletotrichum acutatum, переважно, Botrytis cinerea. Фахівець у даній галузі техніки за допомогою стандартних методів зможе визначити підходящу концентрацію (тобто ефективну концентрацію), з якою антимікробний поліпептид буде застосовуватися для запобігання або пригнічення псування в будь-яких конкретних умовах. Переважно, наприклад, Blad застосовується в концентрації, щонайменше, 1 мкг/мл, щонайменше, 5 мкг/мл, щонайменше, 10 мкг/мл, щонайменше, 50 мкг/мл, щонайменше, 100 мкг/мл або, щонайменше, 150 мкг/мл і до 350 мкг/мл, до 500 мкг/мл, до 600 мкг/мл, до 1 мг/мл, до 2,5 мг/мл, до 5 мг/мл або до 10 мг/мл. Переважно, вибрана концентрація Blad становить від 10 мкг/мл до 5 мг/мл, більш переважно, від 50 мкг/мл до 2,5 мг/мл, більш переважно, від 100 мкг/мл до 1 мг/мл і, ще більш переважно, від 150 мкг/мл до 600 мкг/мл (наприклад, близько 250 мкг/мл). Авторами даного винаходу були отримані докази (див. приклади 4 і 5) того, що Blad є нетоксичним для тварин у концентрації до, щонайменше, 400 мкг/мл. Авторами даного винаходу неочікувано було виявлено, що комбінація Blad з хелатуючим агентом (наприклад, ЕДТА) дає синергічний антимікробний ефект. Таким чином, переважно використовувати хелатуючий агент для поліпшення антимікробної дії антимікробного поліпептиду, і використання такого хелатуючого агенту може знижувати концентрацію даного антимікробного поліпептиду, необхідну для досягнення певного рівня запобігання або пригнічення псування. Хелатуючий агент (також відомий як хелант, хелатор або комплексоутворювальний агент) являє собою будь-яку хімічну сполуку, яка зв'язує іон металу з утворенням нековалентного комплексу й зменшує активність іону. Придатні хелатуючі агенти включають поліамінокарбоксилати, такі як ЕДТА (етилендиамінтетроцтова кислота) і ЕГТА (етиленгліколь-біс(β-аміноетиловий ефір)-N, N,N',N'-тетраоцтова кислота). Переважно, як хелатуючий агент використовується ЕДТА, переважно в концентрації, щонайменше, 10 мкг/мл, щонайменше, 50 мкг/мл або, щонайменше, 100 мкг/мл, і до 500 мкг/мл, до 1 мг/мл, до 5 мг/мл, до 10 мг/мл або до 20 мг/мл. Переважно, ЕДТА використовується в концентрації від 0,1 мг/мл до 1 мг/мл. Результати Антимікробний поліпептид може застосовуватися для пригнічення росту мікроорганізму, що викликає псування харчових продуктів, (означає, що він має мікробостатичну дію) або знищення зазначеного мікроорганізму (означає, що він має мікробоцидну дію) на харчовому продукті так, що псування зазначеного харчового продукту, яке викликається зазначеним мікроорганізмом, запобігається або пригнічується. Фахівець у даній галузі техніки буде здатний визначити 6 UA 113152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 підходящу дозу та/або концентрацію для досягнення бажаного пригнічення росту або знищення мікроорганізму в кожному конкретному випадку. Переважно, при використанні як мікробостатичного агенту антимікробний поліпептид зменшує швидкість росту на 10 %, більш переважно, на 50 %, більш переважно, на 75 %, більш переважно, на 90 %, більш переважно, на 95 %, більш переважно, на 98 %, більш переважно, на 99 % і, ще більш переважно, на 99,9 % у порівнянні з еквівалентними умовами без використання антимікробного поліпептиду. Найбільш переважно, антимікробний поліпептид запобігає будь-якому росту мікроорганізму. Переважно, при використанні як мікробоцидного агенту антимікробний поліпептид знищує 10 % популяції мікроорганізмів, більш переважно, 50 % зазначеної популяції, більш переважно, 75 % зазначеної популяції, більш переважно, 90 % зазначеної популяції, більш переважно, 95 % зазначеної популяції, більш переважно, 98 % зазначеної популяції, більш переважно, 99 % зазначеної популяції й, ще більш переважно, 99,9 % зазначеної популяції в порівнянні з еквівалентними умовами без використання антимікробного поліпептиду. Найбільш переважно, антимікробний поліпептид знищує всю популяцію мікроорганізму. При застосуванні для запобігання або пригнічення псування харчового продукту антимікробний поліпептид переважно використовується в ефективній кількості, тобто, інакше кажучи, кількості, яка забезпечує такий рівень пригнічення росту та/або знищення мікроорганізму, за якого досягається обумовлений рівень запобігання або пригнічення псування (наприклад, зниження швидкості псування), переважно в порівнянні з еквівалентними умовами без використання антимікробного поліпептиду. Переважно, ефективна кількість антимікробного поліпептиду є нетоксичною для людини або тварини. Застосування й способи Авторами даного винаходу запропоновано застосування композиції, що містить антимікробний поліпептид, який включає Blad або його активний варіант, для запобігання або пригнічення псування харчового продукту, що викликається мікроорганізмом. У зв'язку із цим, авторами також запропонований спосіб запобігання або пригнічення псування харчового продукту, яке викликається мікроорганізмом, що включає введення в призначений для цього харчовий продукт ефективної кількості композиції, яка містить антимікробний поліпептид, що включає Blad або його активний варіант. Переважно, ефективна кількість антимікробного поліпептиду є нетоксичною для людей або тварин. Запобігання або пригнічення псування може здійснюватися під час зберігання, транспортування, навантаження/розвантаження, обробки або демонстрації харчового продукту. Композиція, що містить антимікробний поліпептид, може, наприклад, бути змішана з харчовим продуктом або може, наприклад, бути нанесена на поверхню харчового продукту (наприклад, у вигляді рідкої плівки або дрібних крапель). Харчовий продукт також може бути занурений у зазначену композицію (і при необхідності витриманий у ній). Для будь-якого конкретного харчового продукту застосування зазначеної композиції як консерванту може поєднуватися з будь-яким іншим добре відомим способом консервації харчових продуктів, антимікробним препаратом або іншим способом, включаючи сушіння, нагрівання, охолодження або заморожування, осмотичне інгібування (наприклад, використання сиропів і солі), вакуумне упакування, консервування в металевій або скляній тарі, желування, заливання, тушкування, іонізуюче випромінювання, обробку пульсуючим електричним полем, консервацію харчових продуктів надвисоким гідравлічним тиском, застосування антиоксидантів та/або застосування антимікробних консервантів (наприклад, діоксиду сірки, діоксиду вуглецю, етанолу, оцтової кислоти, лимонної кислоти, молочної кислоти, сорбінової кислоти, бензоатів, нітратів і нітритів, сульфітів, пропіонату кальцію й метилхлорізотіазоліну). Приклади У наступних прикладах BLAD позначає існуючий у природі Blad-вмісний глікоолігомер, що включає поліпептид Blad масою 20 кДа, очищений за методикою, описаною в Ramos et al. (1997) Planta 203(1): 26-34: див. розділи "Рослинний матеріал і умови вирощування" і "Очищення білків" у параграфі "Матеріали і методи" цього документу. Визначення: МІК - мінімальна інгібуюча концентрація: найменша концентрація антимікробного препарату, яка пригнічує видимий ріст мікроорганізму. МФК/МБК - мінімальна фунгіцидна/бактерицидна концентрація (або мінімальна летальна концентрація): найменша концентрація антимікробного препарату, необхідна для знищення 99,9 % первинного інокулуму після 24 годин при стандартизованому наборі умов. Приклад 1 - Бактерицидна дія BLAD 7 UA 113152 C2 МІК і МБК BLAD у відношенні різних видів бактерій (з використанням середовища МюлераХінтона): Види бактерій Pseudomonas aeruginosa Listeria monocytogenes Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Salmonella thyphimurium 5 10 МІК (мкг/мл) 32-256 8 4 8 64 Зокрема, P. aeruginosa і B. subtilis можуть викликати псування харчових продуктів. Було встановлено, що для P. aeruginosa бактеріостатична концентрація BLAD становить 100 мкг/мл, а бактерицидна - 250 мкг/мл. BLAD у концентрації 50 мкг/мл або ЕДТА в концентрації 1 мг/мл пригнічують ріст P. aeruginosa (тобто обидві концентрації є бактеріостатичними), але комбінація цих двох речовин у даних концентраціях є бактерицидною. Приклад 2 - Фунгіцидна дія BLAD МІК і МФК BLAD у відношенні різних міцеліальних грибів (з використанням середовища RPMI) Види грибів Види Alternaria Aspergillus fumigatus Aspergillus niger Botrytis cinerea Colletotrichum acutatum Colletotrichum gloesporioides Fusarium oxysporum 15 МБК (мкг/мл) 128-256 >512 >512 >512 128 МІК (мкг/мл) 64 32 32-64 128 64 64 64 МФК (мкг/мл) >512 >512 >512 512 >512 >512 >512 МИК BLAD у відношенні різних міцеліальних грибів (з використанням різних середовищ): Штам Botrytis cinerea BM B. cinerea BT Colletotrichum kahawae (з Кенії) C. kahawae (з Зімбабве) МИК (мкг/мл) PDB pH7,5 AM3 4-8(3) 8-32(3) 8(3) 16-32(3) 4 1-4 4-8 4-16 PDB 128(1) 32-128(3) 32 16 RPMI 128(2) 64-128(3) 64 64 Зона пригнічення BLAD (діаметр) у відношенні Botrytis cinerea BM на 0,6 % або 0,9 % (маса/об'єм) картопляно-декстрозному агарі (PDA) (3 доби інкубації при 25 °C): 20 BLAD на диск (мкг) 20 мкг 50 мкг 100 мкг 200 мкг 25 Средній діаметр зони на 0,6 % агарі (мм) 0 13 25,5 36 Средній діаметр зони на 0,9 % агаре (мм) 0 0 11 22 На 0,6 % агарі ріст B. cinera у зростаючому ступені пригнічувався зі збільшенням кількості BLAD з 20 мкг до 200 мкг. Менш виражене пригнічення спостерігалося при 5 мг/мл і 10 мг/мл на 0,9 % агарі. Зона пригнічення BLAD з концентрацією 200 мкг на диск (діаметр) у відношенні різних дріжджових грибків на 0,9 % (маса/об'єм) PDA (3 доби інкубації при 25 °C): 8 UA 113152 C2 Дріжджовий грибок Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces marxianus Zygosaccharomyces bailii Zygosaccharomyces rouxii 5 10 15 20 25 Середній діаметр зони (мм) 30 28 >40 40 Концентрація BLAD 200 мкг на диск викликала значне пригнічення росту всіх цих дріжджових грибів, кожний з яких може викликати псування харчових продуктів. Приклад 3 - аналіз консервації/знезараження полуниці Була досліджена схильність полуниці зараженню B. cinerea після обробки BLAD. Було виявлено, що до 38 % неопрацьованої полуниці, наданої комерційним постачальником, є зараженою (розмір партії: десять коробок по 500 гр), що підкреслює проблему зараження полуниці. Протокол аналізу 1. Готували однорідний і репрезентативний зразок. 2. Мили водою й знезаражували 70 % (об'єм/об'єм) розчином етанолу. 3. Двічі промивали водою. 4. Обробляли різними концентраціями BLAD (крім контролю): на 1 хвилину занурювали в розчин для обробки, перед тем як залишити сохнути в інкубаційних чашках Петрі (що містили вологу господарську губку, стерильну воду, фільтрувальний папір і пластикову сітку). 6 5. Кожну ягоду полуниці інокулювали 10 мкл розчину спор B. cinerea з концентрацією 1-5×10 спор/мл. 6. Інкубували впродовж 5 днів за наступних умов: температура: 25 °C (+/-3 °C) відносна вологість: 80-90 % освітлення: захист від прямого сонячного світла. 7. Через певні проміжки часу відбирали 1 гр зразка й гомогенізували за допомогою вортексу. 8. Готували серію десяткових розведень. 9. Розсівали на твердих середовищах і проводили підрахунок колоній. Усі експериментальні процедури виконували в стерильних умовах з використанням автоклавованого матеріалу. Наступні дані являють собою відсоток полуниці, інфікованої B. cinerea після інокуляції розчином спор B. cinerea: 30 Днів після інокуляції 0 1 2 3 4 5 35 40 45 Концентрація BLAD (мкг/мл) 50 150 250 0 0 0 33 4 0 63 15 6 77 46 50 100 56 70 100 73 70 0 (контроль) 0 44 63 93 100 100 350 0 0 5 40 60 64 Концентрації BLAD від 150 мкг/мл до 350 мкг/мл значно затримували початок зараження B. cinerea і знижували загальну частку зараженої полуниці в порівнянні з контролем. Приклад 4 - Вивчення шкірної токсичності BLAD у морських свинок Конфіденційне дослідження було виконане на факультеті ветеринарної медицини Технічного університету Лісабону для Агрономічного інституту у період з 18 липня 2006 р. до 1 серпня 2006 р. з використанням настанови ОЕСР щодо тестування хімічних речовин № 402, Гостра шкірна токсичність. Дослідження було проведене у відповідності з нормами належної лабораторної практики та благополуччя тварин. Гостру шкірну токсичність BLAD оцінювали після впливу разової дози на морських свинок, які отримали широке визнання як підходящі тварини для вивчення шкірної токсичності. BLAD наносили на безволосу ділянку шкіри тварин, розділених на дві групи по 10 тварин кожна, у дозі 200 мкг/мл та 400 мкг/мл відповідно. Після експозиції тварини знаходилися під наглядом впродовж 15 днів, під час яких фіксували масу тіла, захворюваність та смертність. Матеріали та методи 9 UA 113152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Матеріали Досліджуваний препарат: BLAD був отриманий з концентрацією 5 мг/мл (жовтувата непрозора рідина, 0-4 °C) та зберігався при температурі -80 °C. Тварини: морські свинки альбіноси; лінія Dunkin Hartley (HsdPoc: DH) від Harlan Iberica, Barcelona. Кількість використовуваних тварин: 30; маса тіла: 400-449 гр; вік: 6 тижнів. Умови вмісту: тварини були розміщені окремо у поліетиленові коробки із стерилізованими деревними ошурками (Lignocel). Умови навколишнього середовища: a) Фотоперіод: цикли світло/темнота впродовж 12 годин через 12 годин. b) Контрольовані умови середовища: середня температура 19/22 °C та середня вологість 60 %. Адаптація: тварини знаходились у експериментальних умовах навколишнього середовища впродовж семи днів до початку експерименту. Корм: підтримуючий раціон для гризунів Global Diet 2014, що поставляється Harlan Iberica, Barcelona; вода необмежено. 2. Методи Нанесення: тварин голили за 48 годин до початку випробування, та тільки тих тварин, у яких були відсутні ушкодження на шкірі, відбирали для подальшого дослідження. Аліквоту, рівну 1 мл (з концентрацією або 200 мкг/мл або 400 мкг/мл), наносили на поголену шкіру кожної тварини. Дизайн дослідження: 30 тварин, що приймають участь у дослідженні, були розділені на чотири групи: дві групи по десять тварин кожна та дві групи по п'ять тварин кожна. Групу з десяти тварин піддавали впливу BLAD з концентрацією 200 мкг/мл (дослідна група 1) та іншу групу з десяти тварин піддавали впливу BLAD з концентрацією 400 мкг/мл (дослідна група 2). Дві групи з п'яти тварин слугували як контроль: на шкіру тварин однієї групи наносили воду (аліквота об'ємом 1 мл), у той час як інша група не піддавалася ніякому впливу, але з нею поводилися як з усіма іншими групами. Оцінка результатів: після експозиції тварин щоденно оглядали впродовж 15 днів, щоб зафіксувати які-небудь ознаки нездоров'я або навіть смерть. При оцінці захворюваності особливу увагу приділяли можливій появі ушкоджень на шкірі у місці нанесення та можливим ознакам загальної токсичності, таким як зміни нормальної моделі поведінки. Масу тіла визначали індивідуально перед початком експерименту та наприкінці періоду випробувань. Результати Ні при яких концентраціях BLAD не були відмічені ознаки яких-небудь фізичних змін на ділянці шкіри, на який здійснювалося нанесення, а також зміни у питній/харчовій або загальній поведінці. Будь-які несприятливі побічні реакції або смерть були відсутні після нанесення BLAD. Збільшення маси тіла було однаковим у всіх групах (та відповідало очікуваному збільшенню у тварин такого молодого віку, що розвиваються). Висновок BLAD у концентраціях до 400 мкг/мл (та можливо вище) не має шкірної токсичності. Приклад 5 - Вивченні пероральної токсичності BLAD у білих щурів Конфіденційне дослідження було виконане на факультеті ветеринарної медицини Технічного університету Лісабону для Агрономічного інституту з використанням настанови ОЕСР щодо тестування хімічних речовин № 401, Гостра пероральна токсичність. Дослідження було проведене у відповідності з нормами належної лабораторної практики та благополуччя тварин. Гостру пероральну токсичність BLAD оцінювали після впливу разової дози на щурів, які отримали широке визнання як підходящі тварини для вивчення пероральної токсичності. BLAD вводили шляхом примусового годування тварин, розділених на дві групи по 10 тварин кожна, у дозі 200 мкг/мл та 400 мкг/мл відповідно. Після експозиції тварини знаходилися під наглядом впродовж 15 днів, під час яких фіксували масу тіла, захворюваність та смертність. Після періоду спостереження тварин умертвляли та піддавали некропсії. Матеріали та методи 1. Матеріали Досліджуваний препарат: BLAD був отриманий з концентрацією 5 мг/мл (жовтувата непрозора рідина, 0-4 °C) та зберігався при температурі -80 °C. Тварини: Rattus norvegicus, лінія Wistar Hannover, придбані віварієм факультету ветеринарної медицини Лісабону у Harlan Iberica, Barcelona. Кількість використовуваних тварин: 30; Маса тіла: 250-300 гр; 10 UA 113152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вік: 10 тижнів. Умови утримання: тварини були поміщені окремо у поліетиленові коробки із стерилізованими деревними ошурками (Lignocel). Умови навколишнього середовища: a) Фотоперіод: цикли світло/темнота впродовж 12 годин через 12 годин. b) Контрольовані умови середовища: середня температура 19/22 °C та середня вологість 60 %. Адаптація: тварини знаходилися у експериментальних умовах навколишнього середовища впродовж семи днів до початку експерименту. Корм: підтримуючий раціон для гризунів Global Diet 2014, що поставляється Harlan Iberica, Barcelona; вода необмежено. 2. Методи Введення: аліквоту, рівну 1 мл (з концентрацією 200 мкг/мл, або 400 мкг/мл), вводили шляхом пероральної (рото-стравохідної) інтубації, широко відомої як примусове годування. Введення проводили за допомогою металічного зонду, що підходить для використовуваного виду тварин. Перед введенням препарату тварин піддавали голодній витримці впродовж 18 годин та годували через 3 години після введення. Дизайн дослідження: 30 тварин, що приймали участь у дослідженні, були розділені на чотири групи: дві групи по десять тварин кожна та дві групи по п'ять тварин кожна. Групу з десяти тварин піддавали впливу BLAD з концентрацією 200 мкг/мл (дослідна група 1) та іншу групу з десяти тварин піддавали впливу BLAD з концентрацією 400 мкг/мл (дослідна група 2). Дві групи з п'яти тварин слугували як контроль: тварини однієї групи отримували воду (аліквоту об'ємом 1 мл), у той час як інша група не піддалась ніякому впливу, але з нею поводились як з усіма іншими групами. Оцінка результатів: після введення тварин щоденно оглядали впродовж 15 днів, щоб зафіксувати які-небудь ознаки нездоров'я або навіть смерть. Масу тіла визначали індивідуально перед початком експерименту та у кінці періоду випробувань. Після періоду спостереження тварин умертвляли (шляхом задушення у атмосфері, насиченій вуглекислим газом) для наступного розтину. Результати Ні при яких концентраціях BLAD не були відмічені ознаки яких-небудь фізичних змін або змін у питній/харчовій або загальній поведінці. Будь-які несприятливі побічні реакції або смерть були відсутніми після введення BLAD. Збільшення маси тіла було однаковим у всіх групах (та відповідало очікуваному збільшенню у тварин такого молодого віку, що розвиваються). Посмертний макроскопічний огляд органів грудної та черевної порожнини не виявив у них ніяких змін. Висновок BLAD у концентраціях до 400 мкг/мл (та можливо вище) не має пероральної токсичності. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Застосування композиції, що містить антимікробний поліпептид, який включає послідовність Blad, як показано у SEQ ID NO: 4, або її активний варіант, для запобігання або пригнічення псування харчового продукту мікроорганізмом, причому зазначений активний варіант має протимікробну активність і включає послідовність, яка має принаймні 70 % ідентичність до SEQ ID NO: 4 або фрагменту SEQ ID NO: 4, що має довжину принаймні 100 амінокислот. 2. Застосування за п. 1, де мікроорганізм є бактерією або грибом. 3. Застосування за п. 2, де бактерія є видом, який викликає псування харчових продуктів, з родів Pseudomonas або Bacillus. 4. Застосування за п. 2, де гриб є видом, який викликає псування харчових продуктів, одного з наступних родів: Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Botrytis, Colletotrichum, Saccharomyces, Kluyveromyces і Zygosaccharomyces. 5. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, де харчовий продукт отриманий з, забезпечує або являє собою фрукт, горіх, овоч, зерно, цукор, молочний продукт, рідкий або пастоподібний харчовий продукт, м'ясо, рибу або хліб. 6. Застосування за будь-яким з пп. 1-5, де харчовий продукт є полуницею. 7. Застосування за п. 6, де мікроорганізм являє собою Botrytis cinerea або Colletotrichum acutatum, переважно Botrytis cinerea. 8. Застосування за будь-яким з пп. 1-7, де зазначена композиція додатково включає хелатуючий агент. 11 UA 113152 C2 9. Спосіб запобігання або пригнічення псування харчового продукту мікроорганізмом, що включає введення до харчового продукту, який цього потребує, ефективної кількості композиції, як вона визначена у п. 1 або п. 8. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 12