Пептидні послідовності і композиції

Реферат: Заявлений поліпептид складається не більше ніж зі 100 амінокислот, причому вказаний поліпептид включає одну або більше послідовностей, що мають щонайменше 85 % гомологію з послідовністю SEQ ID 1, або включає два або більше епітопів, що складаються з 7 і більше амінокислот, причому кожний епітоп має щонайменше 85 % гомологію з підпослідовністю SEQ ID N0:1 GDTWAGVEAIIRILQQLLFIHFRIGCQHSR, причому вказаний поліпептид має імуногенність для хребетних, експресуючих алелі головного комплексу гістосумісності (МНС), і не є повним вірусним білком ВІЛ. UA 97800 C2 (12) UA 97800 C2 UA 97800 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до пептидних послідовностей, композицій, які включають пептидні послідовності, і, особливо, до вакцин вірусу імунодефіциту, наприклад, вакцин проти вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) (HIV) і/або інших вірусів імунодефіциту, які можуть бути корисними проти синдрому набутого імунодефіциту (AIDS). Вакцини включають послідовності і композиції. Винахід також належить до застосування послідовностей і композицій. Особливо це стосується вакцин, які створюють захисний ефект проти множини вірусних штамів, включаючи існуючі віруси, а також майбутні віруси, що утворюються через мутації з існуючих вірусів (наприклад, мутантні форми існуючих штамів ВІЛ). Захист проти захворювань критично важливий для виживання всіх тварин, а основний механізм, що забезпечує захист, - це імунна система тварини. Отже, розуміння імунної системи є ключовим моментом в свідомій розробці нових і більш довершених способів лікування для людини і тварин. Механізм дії імунної системи вже досліджується багато років. Імунна система складається з багатьох типів клітин і множини різних молекул, що робить її надто складною. Навіть після багаторічних, досліджень у нас немає повного уявлення про компоненти імунної системи і про їх взаємодію одного з одним. Багато років тому стало зрозуміло, що індивід (людина або тварина), видужуючий від конкретного захворювання, може набувати на майбутнє певний захист від цього захворювання, але не від інших захворювань, з якими цей індивід ще не стикався. Цей фундаментальний аспект імунної системи в свій час був інтерпретований таким чином, що імунна системи набуває свого роду "пам'ять" на визначені патогени, в контакт з якими вона вступала, і ця пам'ять специфічна відносно певного захворювання. Поступово з'ясувалося, що контакт з менш шкідливими варіантами патогену здатний індукувати захист проти більш шкідливих варіантів (наприклад, контакт з коров'ячою віспою дає захист від натуральної віспи, а контакт з інактивованим збудником сибірки дає захист від живого збудника сибірки). Таким чином, виникла ідея про вакцинацію проти конкретних захворювань. Зараз відомо, імунна система має щонайменше два відділи, які контролюють природжений імунітет і набутий імунітет. Природжений імунітет повністю функціональний ще до того, як патоген вступить в контакт з системою, а набутий імунітет включається вже після того, як система зіткнеться з патогеном. Потім він розвиває специфічну атаку проти цього патогену. Природжена система включає множину компонентів, включаючи такі фагоцити як макрофаги, які (як випливає з їх назви) "з'їдають" або поглинають чужорідні тіла, наприклад патогени. У типовому, але не винятковому аспекті даний винахід стосується набутого імунітету (адаптивної імунної системи), і, якщо спеціально не вказане інше, поняття "імунна система" в даному контексті належить до адаптивної імунної системи. Щоб повніше зрозуміти, як функціонує імунна система, треба уважно розглянути роль її окремих компонентів. Відносно адаптивної імунної системи добре відомо, що імунітет проти патогенів забезпечується дією лімфоцитів, які являють собою самий поширений тип клітин в імунній системі. Існують два типи лімфоцитів: В-лімфоцити і Т-лімфоцити. Звичайно їх називають В-клітинами і Т-клітинами, відповідно. В-клітини мають здатність розвиватися в плазматичні клітини (плазмацити), які виробляють антитіла. Антитіла - це дуже важливий компонент імунної системи тварин. Вони виробляються у відповідь на певну сигнатурну частину прониклого в організм патогену, так званий антиген патогену (антиген визначається тут як чужорідна речовина, розпізнавана імунною системою), і, як правило, специфічні відносно цього патогену. Однак, якщо два патогени дуже схожі один на одний або щонайменше мають один і той же антиген, то антитіла, що виробляються проти одного з них, можуть також бути ефективними і проти іншого (тобто давати "перехресну реакцію"). Цим пояснюється, наприклад, той факт, що щеплення коров'ячої віспи може давати захист проти натуральної віспи. Важливо усвідомлювати, що антитіла "розпізнають" лише невелику частину антигенної молекули патогену, а не патоген загалом. Такі частини патогенів прийнято називати епітопами. Т-клітини не зв'язані з антитілами або їх виробленням. Замість цього вони розпізнають фрагменти (тобто, епітопи) чужорідних антигенів, що вступили в зв'язок з головним комплексом гістосумісності (МНС) (застосовно до людини, з комплексом лейкоцитарних антигенів людини [HLA]) через спеціалізований рецептор, відомий під назвою TCR (рецептор Т-клітин). Т-клітини, як такі, поділяються на субпопуляції, які можуть мати або регуляторну функцію, або ефекторну функцію. Ефекторні клітини залучені до "реалізації ефекту" видалення чужорідних речовин і/або тіл. Наприклад, цитотоксичні Т-клітини (CTL) - це ефекторні клітини, які мають здатність убивати інфіковані клітини, а також інші небажані види клітин, наприклад пухлинні клітини. З іншого боку, регуляторні Т-клітини грають певну допоміжну роль в посиленні ефективності ефекторних Т 1 UA 97800 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 клітин і В-клітин. У зв'язку з цією функцією такі регуляторні Т-клітини часто називають "хелперними" Т-клітинами (хелперами). Вважають, що інші регуляторні Т-клітини, які носять назву "супресорних" Т-клітин (супресорів), пригнічують імунні реакції, але в цьому відношенні наше розуміння не дуже глибоке. Регуляторні Т-клітини також можуть взаємодіяти з компонентами природженої імунної системи, підвищуючи їх активність. У нормального здорового індивіда лімфоцити імунної системи знаходяться в неактивному стані "спокою" доти, поки не буде запущена імунна відповідь. Коли виникає потреба в імунній відповіді, лімфоцити активуються, проліферують і починають виконувати свої функції. Наприклад, будь-яка Т-спочиваюча клітина, на поверхні якої є рецептор (TCR), що розпізнав епітоп патогену, який вторгся в організм в комплексі з молекулою МНС, активується, проліферує (цим терміном позначається розмноження клону клітин), а потомство, яке виникло в результаті вказаних процесів, починає активно виконувати свої ефекторні функції по боротьбі з організмами, що вторгайся. Після того як імунна відповідь буде повністю реалізованою (тобто, патогени і/або інфіковані клітини будуть еліміновані), лімфоцити повернуться в стан спокою. Однак цей стан спокою не рівноцінний початковому стану неактивного спокою. Лімфоцити, які раніше були активовані, але повернулися в стан спокою, можуть дуже швидко відновити свою активність і проліферацію у відповідь на нову інфекцію, викликану тим же або родинним патогеном. Така здатність лімфоцитів, які раніше були активовані, але повернулися в стан спокою, генерувати більш швидку і потужну відповідь при повторному зіткненні з патогеном, що вторгся в організм, надає імунній системі ефективну "пам'ять". Використання пам'яті імунної системи лежить в основі дії всіх довгострокових імунопрофілактичних ліків (наприклад, вакцин) і залишається метою при розробці нових імунотерапевтичних ліків тривалої дії. Для того, щоб клітини могли виконувати свої функції в складних системах тваринного організму, вони повинні мати на своїй поверхні "рецептори". Ці рецептори здатні "розпізнавати" специфічні речовини, що контролюють такі різні, але однаково важливі процеси як активація, проліферація і адгезія до інших клітин або субстратів. Наприклад, застосовно до імунної системи, рецептори Т- і В-клітин дозволяють цим клітинам на тільки розпізнавати антиген, але і здійснювати взаємодію один з одним, тобто регулювати власну активність. Без таких рецепторів клітини втратили б важливий засіб передачі інформації і були б нездатні ефективно діяти узгодженим чином, що особливо важливо для імунної системи багатоклітинного організму. Для того щоб бути здатними специфічно розпізнавати широкий діапазон патогенів, присутніх в оточуючому середовищі, і реагувати на ці патогени, імунна система створила на лімфоцитах два типи високоваріабельних рецепторів для антигенів: антитіла В-клітин і рецептори Т-клітин (TCR). В організмі існує величезна множина рецепторів для всіляких антигенів, що дозволяє імунній системі розпізнавати широкий діапазон патогенів, які вторгаються ззовні. Фактично у кожного 12 індивіда існує приблизно 10 різних В-клітин і рецепторів Т-клітин. Кожна окрема клітина має рецептори тільки одного типу, таким чином, для реагування на конкретний патоген імунна система повинна вибрати В-клітину, яка має "найбільш відповідний" рецептор для антигену, яким маркований цей патоген. Цей процес називається "клональною селекцією" (вибором клону). Теоретично, залежно від числа антигенів/епітопів, виставлених патогеном, і від специфічності різних відібраних імунною системою В-клітин до цих антигенів/епітопів, реагувати можуть тільки один клон (моноклональна відповідь), декілька клонів (олігоклональна відповідь) або багато клонів (поліклональна відповідь). Існують великі відмінності між типами антигенів, які розпізнаються В-клітинами і Т-клітинами. Наскільки це відомо, тільки рецептори на поверхні В-лімфоцитів (тобто антитіла) здатні напряму розпізнавати такі антигени як білки вірусів і бактерій, або чужорідні молекули, розчинені в біологічних рідинах організму хазяїна. Антитіла також можуть вироблятися В-клітинами в розчинному вигляді, після того, як В-клітини будуть активовані і перетворяться в плазмацити. Антитіла також називаються імуноглобулінами (абревіатура Ig). З іншого боку, рецептори Тклітин розпізнають тільки короткі пептиди, також відомі як епітоии Т-клітин, розташовані на поверхні клітин організму. Ці епітопи Т-клітин виникають при руйнуванні більш великих білків, які або мають власне походження (тобто є природними білками організму хазяїна), або є чужорідними (тобто походять з чужорідних організмів, які викликали інфекцію). Тільки ті з них, які походять з чужорідних білків, тобто істинні антигени, в нормі здатні індукувати імунну відповідь в організмі хазяїна. Після свого виникнення ці епітопи зв'язуються зі спеціальним типом молекул МНС (головного комплексу -гістосумісності) і одержана в результаті зв'язка потім виставляється на клітинній поверхні для зв'язування з рецептором Т-клітин. 2 UA 97800 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Потрібно зрозуміти, що внаслідок деструктивної суті імунної відповіді, вона повинна бути направлена тільки на чужорідні патогени, але не на клітини і білки власного організму. Таким чином, імунна система повинна проводити відмінність між "своїм і чужим". Було висловлене припущення про те, що клони лімфоцитів, реагуючих на "своє", виробляються, але вони знищуються ще до того, як можуть здійснити яку-небудь реакцію. Цей процес називається "клональною делецією" (знищенням клону). Також висловлювалося припущення про те, що будь-які лімфоцити, реагуючі на "своє", можуть зберігатися, але у "вимкненому" стані. Цей механізм називається "клональною толерантністю". Якою б ні була суть цього процесу, залишається незрозумілим, який точний механізм дозволяє лімфоїдним тканинам, наприклад тимусу, ідентифікувати окремі клони Т-клітин, які реагують на "своє", виділяючи їх з пулу Тлімфоцитів, реагуючих тільки на "чуже". Автори даного винаходу направили свої зусилля на більш повне дослідження механізму відділення "свого" від "чужого", що і привело до появи на даного винаходу. Автори даного винаходу встановили спосіб прогнозу імуногенності речовини, наприклад, пептиду, який дозволяє здійснити прискорену ідентифікацію імуногенних пептидних послідовностей в межах білків більш великого розміру. Вже багато років тому було встановлено, що ключову роль в імунній системі тварин грає головний комплекс гістосумісності (МНС). Молекули МНС дозволяють Т-клітинам розпізнавати антигени, що вже обговорювалося вище. Існують три загальних типи молекул МНС: клас І, клас II і клас III. Молекули МНС класу І і класу II - це глікопротеїни, які представлені на поверхні клітини, а молекули класу III звичайно являють собою розчинні молекули, які знаходяться всередині клітини. Відома множина різновидів молекул МНС. Наприклад, у людини (в цьому випадку МНС носить назву HLA або лейкоцитарні антигени людини) існує декілька сотень різних алелів генів, які кодують молекули МНС, а це означає, що в популяціях людини нараховується багато різних типів HLA. У різних видів тваринних МНС має типові назви, які встановилися на основі різних традицій і принципів. Наприклад, у мишей МНС називається Н-2, у щурів - RT1, а у кроликів - RLA. Різні області гена, які кодують різні молекули МНС у індивіда, звичайно мають різні назви, наприклад, HLA-A, HLA-C і т. д. у людини. Молекула МНС - це ключова молекула в імунній системі, оскільки саме ця молекула представляє епітопи антигенів імунній системі. Наприклад, якщо Т-клітина повинна реагувати на визначений патоген, то цей патоген повинен мати щонайменше один антиген (наприклад, білок), який, в свою чергу, має щонайменше один епітоп (наприклад, пептидну частину білка), причому цей епітоп може зв'язуватися з молекулою МНС на поверхні клітини, тобто взаємодіяти з Т-клітиною, яка зв'язує комплекс МНС-пептид. Таким чином, імунна відповідь залежить від здатності МНС зв'язуватися з епітопом. Якщо немає епітопа, з яким може зв'язуватися МНС, або немає Т-клітини, здатної зв'язуватися з комплексом МНС-пептид, то імунної відповіді не буде. Однак, відносно "своїх" білків один або декілька епітопів можуть мати здатність зв'язуватися з молекулою МНС, тобто потенційно індукувати імунну відповідь. У таких випадках клони лімфоцитів, реагуючих на "своє", повинні одержати специфічний "сигнал" на делецію або "вимкнення". Оскільки, як було указано вище, як "свої", так і "чужі" (тобто чужорідні) пептиди можуть зв'язуватися з молекулами МНС, зв'язування різних пептидів з молекулами МНС стало предметом особливо пильної уваги в галузі імунології. Багато які дослідники пішли по шляху обчислення або прогнозу сили зв'язування між визначеними типами МНС (особливо HLA і Н-2) і пептидними послідовностями, намагаючись пояснити імунну відповідь або її відсутність (тобто "сигнал", необхідний для проведення відмінностей між своїм і чужим). Приклади такого підходу дані в наступних посиланнях. Altuvia Y., Schueler О., Margalit H. 1995. "Ranking potential binding peptides to MHC molecules by a computational threading approach". J. Мої. Biol., 249:244-250. Altuvia Y., Sette A., Sidney J., Southwood S., Margalit H. 1997. "A structure-based algorithm to predict potential binding peptides to MHC molecules with hydrophobic binding pockets". Hum. Immunol. 58:1-11. Meister G. E., Roberts C. G. P., Berzofsky J. A., De Groot A. S., "Two novel T cell epitope prediction algorithms based on MHC-binding motifs; comparison of predicted and published epitopes from Mycobacterium tuberculosis and HIV protein sequences" Vaccine, 13:581-591, (1995). Gulukota K., Sidney J., Sette A., DeLisi C. 1997. "Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules". J. МоI. Biol. 267:1258-1267. Pamer E. G., Harty J. T., Bevan M. J. "Precise prediction of a dominant class I MHC-restricted epitope of Listeriamonocytogenes". Nature 1991; 353: 852-855. 3 UA 97800 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Parker K. C, Bednarek M. A., Coligan J. E. 1994. "Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains". J. Immunol. 152:163-175. Rammensee H. G., Friede T., Stevanoviic S. 1995. "MHC ligands and peptide motifs: First listing". Immunogenetics 41:178-228. Ruppert J., Sidney J., Celis E., Kubo R. T., Grey H. M., Sette A. 1993. "Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A2.1 molecules". Cell 74:929-937. Schueler-Furman O., Elber R., Margalit H. 1998. "Knowledge-based structure prediction of MHC class I bound peptides: A study of 23 complexes". Fold Des. 3:549-564. Sette A., Buus S., Appella E., Smith J. A., Chesnut R., Miles C, Colon S. M., Grey H.M. 1989. "Prediction of major histocompatibility complex binding regions of protein antigens by sequence pattern analysis". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3296-3300. Sette A., Sidney J., del Guercio M. F., Southwood S., Ruppert J., Dahlberg C, Grey H. M., Kubo R. T. 1994a. "Peptide binding to the most frequent HLA-A class I alleles measured by quantitative molecular binding assays". МоI. Immunol. 31:813-822. Sette A., Vitiello A., Reherman B., Fowler P., Nayersina R., Kast W. M., Melief C. J. M., Oseroff C, Yuan L., Ruppert J. et al. 1994b. "The relationship between class I binding affinity and immunogenicity of potential cytotoxic T cell epitopes". J. Immunol. 153:5586-5592. Stevanovic Stefan (2002): "Structural basis of immunogenicity", Transplant Immunology 10 133136. Sturniolo T., Bono E., Ding J., Raddrizzani L., Tuereci O., Sahin U., Braxenthaler M., Gallazzi F., Protti M. P., Sinigaglia F., Hammer J. 1999. "Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices". Nat. Biotechnol. 17:555561. Sudo T., Kamikawaji N., Kimura A., Date Y., Savoie C. J., Nakashima H., Furuichi E., Kuhara S. and Sasazuki T. "Differences in MHC Class I self peptide repertoires among HLA-A2 subtypes." J. Immunol.: 155: 4749-4756, (1995). Tana T., Kamikawaji N., Savoie C.J., Sudo T., Kinoshita Y., Sasazuki T. "A HLA binding motifaided peptide epitope library: A novel library design for the screening of HLA-DR4-restricted antigenic peptides recognized by CD4+T cells." J. Human Genet, 43:14-21 (1998). Falk K. et al. "Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules", Nature, Vol. 351, 290-297 (1991). Elliott T. et al. "Peptide-induced conformational change of the class I heavy chain", Nature, Vol. 351, 402-407, (1991). Parham P. "Deconstructing the MHC", Nature, Vol. 360, 300-301, (1992). Hwai-Chen Guo et al. "Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle", Nature, Vol. 360, 364-367, (1992). Chen Y. et al. "Naturally processed peptides longer than nine amino acid residues bind to the class I MHC molecule HLA-A2.1 with high affinity and in different conformations", J. Immunol., 152, 2874-2881, (1994). Hunt D. F. et al. "Characterization of peptides bound to the class I MHC molecule HLA-A2.1 by mass spectrometry", Science, Vol. 255, 1261-1263, (1992). Загалом, відомий рівень техніки намагається прогнозувати імуногенність окремих пептидів через обчислення сили зв'язування між визначеним пептидом і відомим зв'язуючим середовищем визначеної молекули МНС. Зв'язуюче середовище включає в себе "карман" в молекулі МНС, який пристосований для зв'язування пептиду визначеної довжини (наприклад, з 7-15 амінокислот). Структура кармана може бути відома з попередніх рентгенокристалографічних досліджень. Цю силу можна розрахувати математично, застосовуючи відповідні алгоритми атомної і молекулярної взаємодії. Альтернативно, відомий рівень техніки може дозволити спробувати "оцінити в балах" силу зв'язування пептиду, основуючись на передумовах, існуючих в пептиді, наприклад, на специфічних амінокислотах в особливих положеннях всередині пептиду визначеної довжини, наприклад, пролін в третьому положенні пептиду з восьми амінокислот, що зв'язується з визначеною відомою молекулою HLA. Загалом, такі підходи завжди мали обмежений успіх. Автори даного винаходу вважають, що вони удосконалили вищезазначені теорії за рахунок кращого розуміння того, яким чином Т-клітини, які реагують проти "своїх" речовин в організмі, наприклад, власних білків, розпізнаються до і після їх елімінації (клональної делеції) або переходу в мовчазний стан (клональної анергії). Відповідно до цього автори даного винаходу зуміли ідентифікувати специфічні імуногенні пептидні послідовності, які можуть дати захист проти специфічних патогенів, і розробили вакцини для цих патогенів на основі ідентифікованих 4 UA 97800 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовностей. Застосовно до даного винаходу його автори розробили пептиди, корисні у вакцинах ВІЛ, які викликають відповідь Т-клітин. Протягом багатьох років ВІЛ-інфекція була захворюванням, яке не піддається лікуванню. Коли це захворювання було ідентифіковане в 1981 році, існуючі способи противірусної терапії були неефективні і не могли стримувати шкоду, яка наноситься вірусом імунній системі хворого. Вірус спричиняє пряме і посереднє руйнування CD4-позитивних Т-клітин, які необхідні для повноцінного функціонування імунної системи. У міру того, як у хворого знижується кількість Тклітин CD4+, захворювання прогресивно погіршується. Коли кількість Т-клітин CD4+ падає нижче визначеного рівня, стан хворого розглядається як погіршення до стадії повномасштабного AIDS. Визначення точки, в якій відбувається цей перехід, різні, але загалом вважається, що здорова ВІЛ-інфікована людина переходить в стадію AIDS, коли у неї кількість Т-клітин CD+ стає менше 200 в 1 мілілітрі крові. Відносно недавно відбулося поліпшення противірусної терапії, а прогресування захворювання вдалося суттєво сповільнити. Сучасні схеми комбінованої терапії дозволяють (у деяких хворих) невизначено довго відтягувати початок повномасштабного AIDS. Однак, лікування за цими схемами дороге і обтяжливе для хворих в зв'язку з тим, що їм доводиться приймати кожний день багато таблеток (багатьом хворим важко запам'ятати схему прийому необхідних ліків), крім того, часто розвиваються неприємні побічні ефекти (це недивно, коли хворому доводиться приймати життєво необхідний коктейль з декількох різних ліків). Сучасні методи лікування не тільки обтяжені цими проблемами, але і не дозволяють вилікувати захворювання, а просто відтягують початок повномасштабного AIDS. Більше того, в останні роки публікується все більше повідомлень про появу і поширення лікарсько стійких вірусів імунодефіциту людини. У зв'язку з цим є реальна і настійна потреба у вакцині, здатній попереджувати і/або виліковувати інфекції, викликані вірусами імунодефіциту, зокрема ВІЛ, а також попереджати і/або виліковувати AIDS. Раніше спроби розробити вакцини ВІЛ основувалися на ідентифікації існуючого штаму ВІЛ і подальшому виробленні вакцини, специфічної до цього вірусу. Звичайно вакцини були направлені на виклик відповіді В-клітин (вироблення антитіла), причому це антитіло повинно реагувати з поверхневими антигенами специфічного штаму ВІЛ, проти якого розроблялася вакцина. У типовому випадку поверхневі білки з антигенними компонентами варіюються від одного штаму ВІЛ до іншого, оскільки мутації вірусу, що створюють нові віруси, нерідко зачіпають саме поверхневі білки. Наслідки цього полягають в тому, що традиційні вакцини ВІЛ, якщо вони взагалі функціональні, можуть створювати захист тільки проти одного специфічного штаму вірусу, але не проти нового штаму, який виник в результаті мутації. Тому для захисту від мутантного штаму, який виник, необхідна нова вакцина. Проміжок часу між появою нових штамів вірусу за рахунок мутацій вельми невеликий. В організмі інфікованого індивіда нові штами виникають весь час в результаті тиску відбору, створюваного імунною системою цього індивіда. В результаті популяція вірусу в організмі інфікованого індивіда змінюється з часом (протягом тижнів, місяців і років), тобто через високу частоту мутацій ніякої потреби в реінфекції немає. Таким чином, єдино можливий шлях цілеспрямовано боротися з інфекцією, викликаною вірусом імунодефіциту у індивіда, або цілеспрямовано боротися з можливими новими штамами вірусу, які можуть інфікувати індивіда або виникнути в його організмі, оснований на тому, щоб цілеспрямовано впливати на консервативну область протеома. Такий підхід за своєю природою проблематичний, оскільки основна імунна відповідь на ВІЛ направлена на ті ділянки, які самі по собі схильні до частих мутацій внаслідок (а) імунологічний тиску і (b) малої міри видової прив'язки реплікаційногоапарату вірусу. У минулому було зроблено багато досліджень, направлених на розробку вакцин до вірусів імунодефіциту (включаючи вакцини до ВІЛ). Вони були переважно основані на виробленні антитіл і зосереджені на глікопротеїнах ВІЛ 120 і 160, які, на думку дослідників, вважалися кращими кандидатами на вакцину ВІЛ. Особливо важливі дослідження перераховані в наступних посиланнях: Blood. 2006 Feb. 7; "HIV nonprogressors preferentially maintain highly functional HIV-specific CD8+T-cells". Berts M. R., Nason M. C, West S. M., De Rosa S. C, Migueles S. A., Abraham J., Lederman M. M., Benito J. M, Goepfert P. A., Connors M., Roederer M., Koup R. A. Indian J Med Res. 2005 Apr.; 121(4):287-314. "Impact of genetic diversity of HIV-I on diagnosis, antiretroviral therapy & vaccine development". Lai R. B., Chakrabarti S., Yang C. J. Virol. 2005 Apr.; 79(8):4580-8. "Vaccine-elicited memory cytotoxic T lymphocytes contribute to Mamu-A*01-associated control of simian/human immunodeficiency virus 89.6P replication in rhesus monkeys". Seaman M. S., Santra S., Newberg M. H., Philippon V., Manson K., Xu L., Gelman R. S., Panicali D., Mascola J. R., Nabel G. J., Letvin N. L. 5 UA 97800 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 J Infect Dis. 2005 Mar. 1; 191(5):666-77. Epub 2005 Jan 27. "Correlation between immunologic responses to a recombinant glycoprotein 120 vaccine and incidence of HIV-I infection in a phase 3 HIV-I preventive vaccine trial". Gilbert P. B., Peterson M. L., Follmann D., Hudgens M. G., Francis D. P., Gurwith M., Heyward W. L., Jobes D. V., Popovic V., Self S. G., Sinangil F., Burke D., Berman P. W. J Infect Dis. 2005 Mar. 1; 191(5):654-65. Epub 2005 Jan 27. "Placebo-controlled phase 3 trial of a recombinant glycoprotein 120 vaccine to prevent HIV-1 infection". Flynn N. M., Formal D. N., Harro C. D., Judson F. N., Mayer K. H., Para M.F. J Exp Med. 2004 Jun. 21; 199(12):1709-18. "Cytotoxic T lymphocyte-based control of simian immunodeficiency virus replication in a preclinical AIDS vaccine trial". Matano T., Kobayashi M., Igarashi H., Takeda A., Nakamura H., Kano M., Sugimoto C, Mori K., Iida A., Hirata T., Hasegawa M., Yuasa T., Miyazawa M., Takahashi Y., Yasunami M., Kimura A., O'Connor D. H., Watkins D. I., Nagai Y. Immunol Res. 2004; 29(1-3): 161-74. "Insights into the role of host genetic and T-cell factors in resistance to HIV transmission from studies of highly HIV-exposed Thais". McNicholl J. M., Promadej N. J. Virol. 2005 Dec; 9(24):15368-75: "Genetic and Stochastic influences on the interaction of human immunodeficiency virus type 1 and cytotoxic T lymphocytes in identical twins". Yang O. O., Church J., Kitchen C. M., Kilpatrick R., Ali A., Geng Y., Killian M. S., Sabado R. L., Ng H., Suen J., Bryson Y., Jamieson B. D., Krogstad P. J. Virol. 2005 Sep. 79; (17):11523-8. "Human immunodeficiency virus mutations during the fist month of infection are preferentially found in known cytotoxic T-lymphocyte epitopes". Bernardin F., Kong D., Peddada L., Baxter-Lowe L. A., Delwart E. Однак, хоч відомі епітопи вивчалися дуже інтенсивно, жоден з них досі не виявився задовільним для формування основи вакцини ВІЛ. Крім того, вакцини, основані тільки на одному епітопі, навіть за тієї умови, що вони можуть створити деякий захист, частіше за все специфічні відносно специфічного фенотипу HLA, що робить таку вакцину неефективною в значній частині популяцій людини. Відповідно до цього даний винахід мав на меті - вирішити проблеми, пов'язані з відомим рівнем техніки, як це описано вище. Подальша мета даного винаходу полягала в тому, щоб запропонувати поліпептид, здатний викликати у хребетних імунну відповідь CTL (цитотоксичних Т-лімфоцитів), яка направлена проти множини штамів вірусів імунодефіциту і/або виявляється у множини індивідів, експресуючих різні МНС (HLA). Подальша мета даного винаходу полягає в тому, щоб запропонувати вакцину вірусу імунодефіциту (наприклад, вакцину ВІЛ), основану на поліпептиді, запропонованому цим винаходом. Переважно, щоб така вакцина була здатна створювати захист проти численних вірусних штамів і/або була ефективна для великого числа індивідів, експресуючих різні МНС (HLA). Відповідно до цього даний винахід пропонує поліпептид, який складається не більше ніж з 100 амінокислот, причому цей поліпептид включає одну або більше послідовностей, що мають щонайменше 60 % гомологію з будь-яким з перерахованих нижче варіантів SEQ ID 1-4, або включає два або більше епітопів, що складаються з 7 і більше амінокислот, причому кожний епітоп має щонайменше 60 % гомологію з підпослідовністю будь-якого з перерахованих нижче варіантів SEQ ID 1-4, довжина якої відповідає довжині епітопа: SEQ ID 1 GDTWAGVEAIIRILQQLLFIHFRIGCQHSR SEQ ID 2 KVGSLQYLALTALITPKKIKPPLPSVKKLTEDRWNKPQKT SEQ ID 3 EPVPLQLPPLERLTLDCSEDCGTSGTQ SEQ ID 4 YKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDELDLWVYHTQGYFPD причому поліпептид має імуногенність у хребетних, експресуючих алелі головного комплексу гістосумісності, причому поліпептид не є повним білком ВІЛ. Таким чином, поліпептид - це такий поліпептид, який може включати повністю будь-яку з вказаних вище послідовностей (або включати щонайменше два її фрагменти, що складаються з 7 і більше амінокислотних залишків), але загальна довжина такого поліпептиду не може перевищувати 100 амінокислотних залишків. Поліпептид також має бути імуногенним у хребетних, експресуючих алелі МНС (HLA для людини). Поняття "імуногенний поліпептид" в цьому контексті означає поліпептид, який викликає імунну відповідь у хребетних, наприклад, по типу зв'язування з МНС і подальшій реакції з цитотоксичними Т-лімфоцитами. Один спосіб, який дозволяє визначити, чи має поліпептид імуногенність, описаний нижче в експерименті 1. Однак, даний винахід не обмежується такими способами, і компетентний фахівець може за своїм бажанням вибрати будь-який відомий спосіб визначення імуногенності. 6 UA 97800 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Як згадувалося вище, поліпептид може включати два епітопи з 7 або більше амінокислотних залишків, які реагують з одним або більше МНС і, таким чином, викликають широку відповідь CTL. Імунна відповідь може розвиватися у одного індивіда або щонайменше у двох різних індивідів (індивіди можуть належати до одного біологічного виду або різних біологічних видів). Таким чином, поліпептид може включати щонайменше два різних епітопи з 7 або більше амінокислотних залишків, причому кожний з епітопів по окремості викликає імунну відповідь у різних суб'єктів. Термін епітоп в контексті даного винаходу - це частина поліпептиду, здатна зв'язуватися з МНС хребетних, переважно, викликаючи імунну відповідь, наприклад, реакцію комплексу МНС-епітоп з CTL. Один спосіб, який дозволяє визначити, чи є поліпептид епітопом, описаний нижче в експерименті 1. Однак, даний винахід не обмежується такими способами, і компетентний фахівець може за своїм бажанням вибрати будь-який відомий спосіб, який дозволяє визначити, чи є поліпептид епітопом. Автори даного винаходу виявили, що вказані вище послідовності включають множину епітопів CTL, які можуть забезпечити захист проти вірусів імунодефіциту, особливо ВІЛ, для багатьох видів хребетних в масштабах популяцій, а також для значної частини глобальної популяції людини. На доповнення до цього, автори даного винаходу проаналізували всі відомі послідовності штамів ВІЛ і виявили, що індивідуальні послідовності вищою мірою консервативні у всіх відомих штамах ВІЛ. Як такі ці послідовності навряд чи можуть значно змінюватися в нових штамах, виникаючих в результаті мутацій існуючих штамів. Відповідно до цього, епітопи, які знаходяться в межах цих послідовностей і здатні створювати захист, з високою імовірністю представлені в нових штамах в незмінному вигляді, оскільки мутації, як правило, не зачіпають ці регіони генів. Таким чином, ці епітопи мають блискучу можливість створювати захист не тільки проти існуючих штамів ВІЛ (зокрема референтних штамів, наприклад монофілетичного таксона В для ВІЛ-1, стандартного референтного штаму НХВ-2; додаткову інформацію про референтні штами можна одержати на сайті бази даних http://BDI-web.lanl.gov), але і проти тих штамів, які ще невідомі, наприклад, мутантних форм вказаних вище референтних штамів. Як обговорювалося вище, послідовності були ідентифіковані після аналізу всіх відомих послідовностей штамів ВІЛ. Таким чином, послідовності - це консенсусні послідовності, виведені з вказаного вище аналізу. Незважаючи на консенсусний характер, у деяких випадках послідовності точно відповідають природним послідовностям відомих штамів ВІЛ. Внаслідок вираженого консерватизму послідовностей у всіх вірусах консенсусні послідовності, навіть відрізняючись від фактичних послідовностей, відрізняються від них по невеликому числу амінокислотних залишків, тобто послідовності можуть містити багато дрібних епітопів (8-мерів, 9-мерів, 10-мерів і т. д.), по яких вони не відрізняються від природних послідовностей. Таким чином, вказані вище консенсусні послідовності, загалом, містять багато ефективних епітопів, повністю відповідних природним епітопам, а також ефективних епітопів, які лише трохи відрізняються від природних епітопів. Компетентному фахівцеві повинно бути зрозуміло, що винахід поширюється не тільки на консенсусні послідовності і їх епітопи, але і на відповідні фактичні послідовності будь-якого штаму вірусу імунодефіциту (наприклад, ВІЛ). Таким чином, в сферу винаходу також входять такі послідовності, які мають деяку гомологію з консенсусними послідовностями. Така гомологія допускає, наприклад, заміщення до трьох амінокислот в 8мерному епітопі (гомологія 62,5 %), а також в 9-мерному, 10-мерному і 11-мерному епітопі. Переважно, щоб в межах послідовності, яка розглядається винаходом і відповідає повним послідовностям SEQ ID 1-4, ідентифікації піддавалися не більше 10 таких заміщень (гомологія 66,6 % для 30-меру). Переважно, щоб такі заміщення являли собою консервативні заміщення, що узгоджуються з відомими схемами заміщень. Пам'ятаючи про те, що цей винахід поширюється не тільки на консенсусні послідовності, але і на відповідні природні послідовності, потрібно зазначити, що винахід також пропонує поліпептид, який складається не більше ніж зі 100 амінокислот, причому цей поліпептид включає одну або більше послідовностей, що визначаються вказаними нижче амінокислотними залишками вірусного білка ВІЛ, або включає два або більше епітопів, що складаються з 7 і більше амінокислот, які є фрагментами послідовності, яка визначається наступними амінокислотними залишками вірусного білка ВІЛ: амінокислотні залишки 51-80 білка VPR, амінокислотні залишки 142-181 білка VIF, амінокислотні залишки 69-95 білка REV, амінокислотні залишки 81-123 білка NEF, причому вказаний поліпептид має імуногенність для хребетних, експресуючих алелі головного комплексу гістосумісності (МНС), і не є повним білком ВІЛ. 7 UA 97800 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Нумерація послідовностей, яка згадується в даному винаході, визначається відповідно до добре відомих принципів. Так, наприклад, нумерація починається з 1 від відомого кодонуініціатора трансляції (ATG). Це відповідає метіоніну (М) в тому сегменті геному ВІЛ, який кодує цікавлячий нас білок. Іншими словами, нумерація починається з 1 відносно метіоніну, показаного цим як перша амінокислота в цікавлячій нас білковій послідовності, як це використовується і визначається в базах даних, які підтримують інформацію про встановлені послідовності (тобто GenBank, SwissProt і т. д.). Даний винахід буде описаний з більшими подробицями за допомогою прикладів, які належать виключно до наступних фігур: Фігура 1 показує вироблення гамма-IFN первинними культурами лімфоцитів від мишей, вакцинованих ВІЛ-v і NRP, які були стимульовані Con A (10 мкг/мл), розчинними лізосомами (5 мкг/мл), очищеними розчинними поліпептидами (Р1, Р2, Р3 і Р4-5 мкг/мл), а також підібраними по HLA клітинами людини Т1 (Т1) і не підібраними по HLA клітинами людини JURKAT (Ju), трансфекованими лізосомою, Р1, Р2, Р3 або Р4 відповідно до протоколу, описаного в тексті (відношення кількості спленоцитів до кількості трансфекованих клітин 10:1). Вироблення гаммаIFN представлене як різниця між рівнем вироблення у відповідь на антиген, що розглядається, і рівнем вироблення гамма-IFN у відповідь або на розчинні лізосоми, або на відповідні клітини, трансфековані лізосомами. Фоновий рівень опосередкованого лізосомами вироблення гаммаIFN становив 25±10 пг/мл для розчинного антигену, 316±43 пг/мл для антигену в клітинах Т1 і 19±6 пг/мл антигену в клітинах Jurkat. Фігура 2 показує вироблення гамма-IFN первинними культурами лімфоцитів від мишей, вакцинованих BUI-v і NRP, які були стимульовані Con A (10 мкг/мл), розчинними лізосомами (5 мкг/мл), очищеним еквімолярним розчином рекомбінантних білків ВІЛ (5 мкг/мл), а також підібраними по HLA клітинами людини Т1 (Т1) і не підібраними по HLA клітинами людини JURKAT (Ju), трансфекованими або лізосомою, або очищеним еквімолярним розчином рекомбінантних білків ВІЛ відповідно до протоколу, описаного в тексті (відношення кількості спленоцитів до кількості трансфекованих клітин 10:1). Вироблення гамма-IFN представлене як різниця між рівнем вироблення у відповідь на антиген, що розглядається, і рівнем вироблення гамма-IFN у відповідь або на розчинні лізосоми, або на відповідні клітини, трансфековані лізосомами. Фоновий рівень опосередкованого лізосомами вироблення гамма-IFN становив 25±10 пг/мл для розчинного антигену, 316±43 пг/мл для антигену в клітинах Т1 і 19±6 пг/мл антигену в клітинах Jurkat. Фігура 3 показує вироблення гамма-IFN (як на фігурах 1 і 2) відносно експериментальної групи 3, підтверджуючи реактивність пептиду SEQ ID 3; Фігура 4 показує вироблення гамма-IFN (як на фігурах 1 і 2) відносно експериментальної групи 4, підтверджуючи реактивність пептиду SEQ ID 4; Фігура 5 показує вироблення гамма-IFN (як на фігурах 1 і 2) відносно експериментальної групи 5, підтверджуючи реактивність антигенів, витягнутих з повних білків VIF, REV і NEF вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ); Фігура 6 показує вироблення гамма-IFN первинними культурами лімфоцитів від мишей, вакцинованих ВІЛ-v і NRP-v, які були стимульовані або іономіцином (0,78 мкг/мл) і РМА (0,05 мкг/мл), Con A (5 мкг/мл), або підібраними по HLA клітинами СЕМ людини, інфікованими монофілетичним таксоном D (UG21-R5) або монофілетичним таксоном A (UG-29-X4) ізолятів ВІЛ-1 відповідно до протоколу, описаного в прикладах (відношення кількості спленоцитів до кількості трансфекованих клітин 10:1). Вироблення гамма-IFN представлене різницею між кількістю клітин, продукуючих цей інтерферон в групі ВІЛ-v, і кількістю клітин, продукуючих цей інтерферон в групі NRP-v. Кількість клітин, продукуючих гамма-інтерферон в ВІЛ-v і NRP-v спленоцитах, стимульованих Con А або іономіцином і РМА, склала більше 4900 і більше 8000, відповідно. Статистичну значущість оцінювали на основі непараметричного аналізу Манна-Уїтні, порівнюючи встановлені значення гамма-IFN в групах ВІЛ-v і NRP-v. Типові поліпептиди, які пропонуються винаходом і описані вище, включають один або більше (переважно два або більше) епітопів. Ці епітопи, переважно, є епітопами Т-клітин, наприклад епітопами цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL). Звичайно імуногенність поліпептиду відповідає штаму вірусу імунодефіциту (переважно ВІЛ) або, переважно, множині таких штамів. У цьому контексті відповідність імуногенності поліпептиду штаму вірусу імунодефіциту треба розуміти таким чином, що поліпептид є частиною вірусного білка і викликає імунну відповідь, наприклад, вияв реактивності СЕД при зв'язуванні з МНС. Один спосіб, який дозволяє визначити, чи має поліпептид таку імуногенність, описаний нижче в експерименті 1. Однак, даний винахід не обмежується такими способами, і компетентний фахівець може за своїм бажанням вибрати будь-який відомий спосіб визначення імуногенності. 8 UA 97800 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поліпептид, який розглядається в даному винаході, включає дві або більше послідовності, описані вище. У типовому поліпептиді за бажанням можуть бути представлені дві, три, чотири, п'ять або більше послідовностей. Чим більше таких епітопів представлено в пептиді, тим ширше діапазон захисту, створюваний в популяціях людини і/або у тваринних особнів з різними HLA або МНС. Поліпептид, який пропонується даним винаходом, може також за бажанням включати одну або більше додаткових послідовностей, які не являють собою епітопи. Типові додаткові послідовності - це послідовності з одного або більше білків вірусу імунодефіциту (переважно білків ВІЛ). Такі послідовності можуть бути розташовані між двома або більше послідовностями (епітопами), описаними вище, і/або можуть бути розташовані на одному або обох кінцях поліпептиду. Присутність таких додаткових послідовностей не повинна вплинути на функцію поліпептиду за тієї умові, що поліпептид як ціле утворення не буде дуже великим, що могло б перешкодити представленню епітопів в імунній системі хребетних. У специфічних варіантах реалізації винаходу, якщо поліпептид гомологічний SEQ ID 1, додаткові послідовності переважно являють собою одну або більше білкових послідовностей VPR (переважно зі штаму ВІЛ), якщо поліпептид гомологічний SEQ ID 2, додаткові послідовності переважно являють собою одну або більше білкових послідовностей VIF (переважно зі штаму ВІЛ), якщо поліпептид гомологічний SEQ ID 3, додаткові послідовності переважно являють собою одну або більше білкових послідовностей REV (переважно зі штаму ВІЛ), і, нарешті, якщо поліпептид гомологічний SEQ ID 4, додаткові послідовності переважно являють собою одну або більше білкових послідовностей NEF (переважно зі штаму ВІЛ). У найбільш переважних варіантах реалізації винаходу додаткові послідовності з вищезгаданих білків - це послідовності з числа представлених нижче консенсусних послідовностей або такі послідовності, які мають щонайменше 60 % гомологію з цими консенсусними послідовностями: Консенсус VPR ВІЛ - SEQ ID 5 MEQAPEDQGPQREPYKEWTLELLEELKNEAVRHFPRPWLHGLGQHIYETYGDTWA GVEAIIRILQQLLFIHFRIGCQHSRIGIIRQRRARNGASRS Консенсус VIF ВІЛ- SEQ ID 6 MENRWQVMIVWDRMRIRTWSLVKHHMYISKKAKGWFYRHHYESTHPRISSEV HIPLGDDAKLVITTYWGLHTGERDWHLGQGVSIEWRKKRYSTQVDPDLADQLIHLY YFDCFSESAIRKAILGHIVSPRCEYQAGHNKVGSLQYLALTALITPKKIKPPLPSVKKL TEDRWNKPQKTKGHRGSHTMNGH Консенсус REV ВІЛ - SEQ ID 7 MAGRSGDSDEELLKAVRIIKILYQSNPYPSPEGTRQARRNRRRRWRARQRQIRSISERI LSTCLGRPAEPVPLQLPPLERLTLDCSEDCGTSGTQQSQGTEEGVGSPQILVESPTVLE SGTKE Консенсус NEF ВІЛ - SEQ ID 8 MGGKWSKSSVVGWPAVRERMRRAEPAAEGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNAD CAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILD LWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGER.YPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGENNCLLHP MSQHGMEDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDC Переважна гомологія цих послідовностей з вищезазначеними послідовностями становить 75 %, 85 %, 95 % або, головним чином, 100 %. У даному винаході спеціальних обмежень на штам вірусу імунодефіциту не накладається, причому поліпептиди можуть бути імуногенними проти будь-якого відомого штаму ВІЛ і/або одержані з будь-якого відомого штаму ВІЛ. Майбутні штами, виникаючі в результаті мутацій будь-якого існуючого штаму, також можуть бути цільовим об'єктом, проти якого буде направлена імуногенність поліпептидів або з якого ці поліпептиди будуть одержані. Послідовності, які визначають поліпептиди, що розглядаються в даному винаході, належать до білків VPR, VIF, REV і NEF з будь-якого штаму ВІЛ (консенсусні послідовності якого для всіх проаналізованих послідовностей або, альтернативно, положення цих послідовностей в межах білка описані вище). Авторами винаходу були проаналізовані представлені нижче специфічні послідовності і з них вибрані переважні послідовності ВІЛ, які стосуються винаходу, або мутантні варіанти цих послідовностей. Таким чином, специфічні послідовності, гомологічні SEQ ID 1-4, описаним вище, - це, переважно, такі послідовності, які розташовані у відповідних положеннях в межах перерахованих нижче білків. Схожим чином, послідовності, які пропонуються даним винаходом, визначаються положеннями амінокислотних залишків в межах білків будь-якого вірусного штаму, а саме положення 51-80 в білці VPR, положення 142-181 в білці VIF, положення 69-95 в білці REV і положення 81-123 в білці NEF. Список представлений в 9 UA 97800 C2 5 10 наступному вигляді: |номер версії (номер gi)|iдeнтифiкaцiя в базі даних (наприклад, gb для GenBank)|інвентарний номер NCBI|додаткова інформація по вибору (наприклад, інвентарний номер нуклеотидної послідовності, з якої одержана білкова послідовність). Послідовності і відповідні вірусні штами, з яких вони одержані, можна знайти в загальнодоступній базі даних NCBI по білках, доступ до якої можна одержати за наступною адресою URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query/static/help/helpdoc.htmlffProtein. База даних по білках містить дані про послідовності з трансльованих кодуючих регіонів послідовностей ДНК в таких джерелах як GenBank, EMBL, DDBJ, а також про білкові послідовності, представлені в Protein Information Resource (PER), SWISS-PROT, Protein Research Foundation (PRF) і Protein Data Bank (PDB) (послідовності із визначених структур). 10 UA 97800 C2 11 UA 97800 C2 12 UA 97800 C2 13 UA 97800 C2 14 UA 97800 C2 15 UA 97800 C2 16 UA 97800 C2 17 UA 97800 C2 18 UA 97800 C2 19 UA 97800 C2 20 UA 97800 C2 21 UA 97800 C2 22 UA 97800 C2 23 UA 97800 C2 24 UA 97800 C2 25 UA 97800 C2 26 UA 97800 C2 27 UA 97800 C2 28