Спосіб одержання 1,4-діамінобутану

Реферат: Даний винахід належить до нового способу одержання 1,4-діамінобутану (ДАБ). Спосіб, запропонований даним винаходом, передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію, яка включає біокаталітичне одержання щонайменше одного N-захищеного попередника ДАБ. Даний винахід також належить до способу одержання ДАБ, який передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію, яка включає стадії: a) біокаталітичного одержання N-захищеного попередника ДАБ, що приводить до біокаталітичної реакційної суміші, що містить N-захищений попередник ДАБ, b) виділення N-захищеного попередника з біокаталітичної реакційної суміші й c) перетворення N-захищеного попередника на ДАБ. У кращому варіанті, даний винахід належить до способу одержання ДАБ, у якому щонайменше N-захищений попередник ДАБ вибирають з групи, яка складається з N5-захищеного орнітину, N-захищеного ДАБ і Nзахищеного 4-амінобутиральдегіду. UA 108617 C2 (12) UA 108617 C2 UA 108617 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься до способу одержання 1,4-диамінобутану (DAB, ДАБ), який передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію. Сполука ДАБ є важливою сировиною для одержання деяких важливих технічних пластмас: поліаміду-4,6 або у формі гомополімеру або співполімеру, який містить, наприклад, приблизно 5 мас. % мономера поліаміду-6 (капролактаму). Гoмополімер, поліамід-4,6 (найлон-4,6), описаний ще в 1938 році (US-A-2,130,948, Carothers). Він є продуктом поліконденсації мономерів ДАБ і адипінової кислоти. На даний час головним чином продукти на основі поліаміду-4,6 виробляє і ® продає фірма DSM у Нідерландах під торговельною маркою STANYL . Відомий ряд хімічних способів синтезу ДАБ. Такі хімічні способи мають той недолік, що вихідні матеріали одержують із джерел, які вважають невідновлюваними. Таким чином існує реальна потреба розробки нових і здійсненних способів синтезу ДАБ, що ґрунтуються на використанні поновлюваних вуглецевих джерел, які використовують біохімічні способи (і які також називаються "біотрансформацією"). Спосіб одержання ДАБ, який передбачає щонайменше одну ферментативну стадію, описаний в PCT заявках, опублікованих як в WO2006/005603 і в WO2006/00504. Обидва документа описують ферментативне одержання ДАБ у мікроорганізмі, який має підвищений рівень орнітиндекарбоксилазної активності. Даний спосіб відноситься до альтернативного способу одержання ДАБ. Спосіб запропонований даним винаходом передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію, яка включає біокаталітичне одержання щонайменше одного N-захищеного попередника ДАБ і наступне in vitro перетворення N-захищеного попередника на ДАБ. Було показано, що виділення ДАБ після біокаталітичного одержання супроводжується значними труднощами. В WO2007/079944 описане виділення органічного аміну, наприклад, ДАБ. У конкретному варіанті здійснення, описаного в ньому, концентрують безклітинне поживне середовище, яке містить сульфатну або фосфатну сіль аміну (тому, наприклад, DABдисульфат) і додають основу, наприклад, аміак. Залежно від умов утворюється двошарова система. Із шару, який містить бажано органічні сполуки, може бути виділений потрібний амін. Докладний опис винаходу Відповідно до одного з варіантів здійснення спосіб одержання ДАБ передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію й містить стадії (a) біокаталітичного одержання Nзахищеного попередника ДАБ, що призводить до одержання біокаталітичної реакційної суміші, яка містить N-захищений попередник ДАБ, (b) виділення N-захищеного попередника з біокаталітичної реакційної суміші, (с) перетворення N-захищеного попередника на ДАБ. Згідно з конкретним варіантом здійснення даний винахід, який відноситься до одержання ДАБ передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію, яка включає біокаталітичне одержання щонайменше одного N-захищеного попередника ДАБ, обраного із групи, яка 5 складається із N -захищеного орнітину, N-захищеного ДАБ і N-захищеного 4амінобутиральдегіду й наступної конверсії in vitro N-захищеного попередника в ДАБ. Що стосується "перетворення in vitro", то тут це означає перетворення N-захищеного попередника ДАБ на ДАБ у середовищі, яке перебуває за межами клітини. Перетворення in vitro може бути перетворенням щонайменше під дією одного біокаталізатора або може бути хімічним перетворенням, яке передбачає щонайменше одну хімічну стадію або можуть бути комбінацією щонайменше однієї біокаталітичної і однієї хімічної стадії. Що стосується "N-захищеного попередника ДАБ", то тут це означає сполуку, яка містить захищену аміногрупу і яка може бути перетвореною на ДАБ за допомогою щонайменше однієї хімічної або біокаталітичної реакції або комбінації біокаталітичної та хімічної реакцій. 5 Що стосується "N -захищеного орнітину", то тут це означає молекулу орнітину, яка містить 5 захисну групу при його N атомі; що стосується "N-захищеного ДАБ", то тут це означає молекулу ДАБ, яка містить захисну групу при одній з її аміногруп; і що стосується "N-захищеного 4амінобутиральдегіду", то тут це означає молекулу 4-амінобутиральдегіду, яка містить захисну групу при аміногрупі. Захисні групи, про які йшла мова вище, можуть бути обраними із групи, яка включає з ацильні групи, які містять 1-6 атомів вуглецю або можуть бути гуанідильною групою. Таку захисну групу слід вибирати так, щоб була можливість здійснити щонайменше одне біокаталітичне перетворення, легко виділити N-захищений попередник з біокаталітичної реакційної суміші (наприклад, з ферментаційного поживного середовища) і наступні біокаталітичні й/або хімічні реакції, що в остаточному підсумку приводить до одержання ДАБ. N-захищені попередники ДАБ можуть бути отримані ацилюванням, наприклад, 4амінобутиральдегіду або орнітину. Наприклад, ацилюванням ангідридом оцтової кислоти в мурашиній кислоті для введення формільної захисної групи або реакцією ангідридів C 2-C6 1 UA 108617 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 карбонових кислот або хлорангідридів для введення N-ацетильної, N-пропіонільної, Nбутирильної, N-валерильної або N-капроїльної захисної групи, відповідно. Попередниками, захищеними N-гуанідильною групою, є, наприклад, протеїногенний аргінін або N-гуанідиламінобутиральдегід або N-гуанідил-ДАБ. Описаний ферментативний шлях, наприклад, в EP1260588, який описує біохімічне одержання агматину з аргініну під дією аргиніндекарбоксилази. Aгматин є N-гуанідил-захищеним ДАБ. Aгматин (N-гуанідил-захищений ДАБ) може бути легко депротектованим з утворенням ДАБ шляхом кислотного гідролізу, наприклад, кип'ятінням агматину в концентрованому розчині мінеральної кислоти, наприклад, у водному концентрованому розчині хлористоводневої або сарної кислоти. Це приводить до утворення дигідросолі ДАБ і побічних продуктів: діоксиду вуглецю й аміаку (останній перебуває у формі його амонієвої солі з використаною мінеральною кислотою). Для одержання ДАБ у формі його вільного аміну, слід виділити його дигідросіль, повторно розчинити й нейтралізувати основою. Відповідно до наступного варіанта здійснення даний винахід відноситься до способу одержання ДАБ, згідно з яким щонайменше утворюється один N-захищений попередник ДАБ, 5 причому даний N-захищений попередник обраний із групи, яка складається з N -ацетилорнітину, N-ацетилДАБ і ацетил-4-амінобутиральдегіду. Відповідно до одного з конкретних варіантів здійснення спосіб одержання ДАБ, який передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію, складається зі стадій: (a) біокаталітичного 5 одержання N -ацетилорнітину, яка призводить до одержання біокаталітичної реакційної суміші, 5 5 яка містить N -ацетилорнітин, (b) виділення N -ацетилорнітину з біокаталітичної реакційної 5 суміші й (c) перетворення N -ацетилорнітину на ДАБ. Відповідно до одного з конкретних варіантів здійснення спосіб одержання ДАБ, який передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію, складається зі стадій: (a) біокаталітичного 5 одержання N -ацетилДАБ, що призводить до біокаталітичної реакційної суміші, яка містить NацетилДАБ, (b) виділення N-ацетилДАБ з біокаталітичної реакційної суміші й (c) перетворення N-ацетилДАБ на ДАБ. Відповідно до одного з конкретних варіантів здійснення спосіб одержання ДАБ, який включає щонайменше одну біокаталітичну стадію, складається зі стадій: (a) біокаталітичного одержання N-ацетил-4-амінобутиральдегіду, що приводить до біокаталітичної реакційної суміші, яка містить N-ацетил-4-амінобутиральдегід, (b) виділення N-ацетил-4-амінобутиральдегіду з біокаталітичної реакційної суміші й (c) перетворення N-ацетил-4-амінобутиральдегіду на ДАБ. При посиланні на амін або N-захищений амін у прямому або непрямому вигляді, наприклад, N-захищений ДАБ, мають на увазі, що ці терміни позначають нейтральну аміногрупу, відповідний заряджений протонований амін, а також його солі. Визначення Термін "або", так, як він використовується тут, визначається як "і/або" за винятком особливо зазначених випадків. Термін, які використовуються в однині, означають – "щонайменше один" за винятком окремо зазначених випадків. Мають на увазі, що при посиланні на іменник (наприклад, сполуку, добавку тощо) в однині, включається також і множина. При посиланні на сполуку, яка існує у вигляді стереоізомерів, така сполука може бути представлена кожним із цих стереоізомерів або їх комбінацією. Таким чином, при посиланні на амінокислоту, яка існує у вигляді енантіомерів, амінокислота може бути L-енантіомером або Dенантіомером або бути представленою їх комбінацією. У випадку, коли існує природний стереоізомер, кращою сполукою є природний стереоізомер. Коли згадується фермент при посиланні на клас ферментів (EC) у дужках, клас ферментів є таким класом, у якому фермент класифікований або може бути класифікований відповідно до Номенклатури Ферментів, наданої Комітетом з Номенклатури Міжнародного Союзу з Біохімії й Молекулярної Біології (NC-IUBMB), причому дана номенклатура може бути знайдена в http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/. Мають на увазі, що включені й інші придатні ферменти, які поки не виділені в окремий клас, але власне можуть бути класифікованими. Термін "гомологічний" або "гомолог" або "ортолог" відноситься до споріднених послідовностей, які мають функціональний зв'язок, і звичайно визначаються, виходячи зі ступеня ідентичності послідовності. Ці терміни можуть описувати взаємозв'язок, виявлений в генах одних видів, підвидів, різновидів, сортів або штамів і відповідних або еквівалентних генів інших видів, підвидів, різновидів, сортів або штамів. Вони можуть також описувати взаємозв'язок між геном, знайденим у природі й штучно сконструйованим геном або між двома штучно сконструйованими генами. Функціональний взаємозв'язок може проявлятися одним з декількох 2 UA 108617 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 способів, які включають, але не обмежуються (a) ступенем ідентичності послідовності; (b) однією й тією ж або подібною біологічною функцією. Бажано, проявляються як (a), так і (b). Мають на увазі також, що термін гомолог охоплює послідовності нуклеїнових кислот (послідовності полінуклеотидів), які відрізняються від іншої послідовності нуклеїнової кислоти через виродженість генетичного коду й кодують ту саму поліпептидну послідовність. Всюди в тексті, де використано термін "гомолог" у застосуванні до поліпептиду, мова йде про поліпептид, який має ту ж саму або подібну біологічну функцію й деякою мірою ідентичну послідовність щодо стандартного поліпептиду. Конкретно мова йде про ідентичність послідовності, яка відповідає щонайменше 30 %, бажано щонайменше 40 %, особливо бажано щонайменше, 60 %, особливо бажано щонайменше, 65 %, особливо бажано щонайменше, 70 %, особливо бажано щонайменше, 75 %, особливо бажано щонайменше, 80 %, конкретно щонайменше 85 %, особливо бажано, щонайменше, 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше, 92 %, щонайменше, 93 %, щонайменше, 94 %, щонайменше, 95 %, щонайменше, 96 %, щонайменше, 97 %, 98 % або щонайменше, 99 %. "Ідентичність послідовності" або "подібність послідовності" тут визначається як взаємозв'язок між двома або декількома поліпептидними послідовностями або двома або декількома послідовностями нуклеїнових кислот, визначений шляхом порівняння послідовностей. Звичайно, проводять порівняння ідентичності або подібності послідовностей за всією довжиною послідовностей, але можна також проводити порівняння тільки між частинами послідовностей, вирівняних одна з одною. У даній галузі техніки "ідентичність" або "подібність" також означає ступінь подібності послідовностей між поліпептидними послідовностями або послідовностями нуклеїнових кислот, залежно від ситуації, що визначається збігом між такими послідовностями. Розроблені кращі способи визначення ідентичності або подібності, які дають найбільшу відповідність між вивченими послідовностями. У контексті даного винаходу краща комп'ютерна програма способу визначення ідентичності й подібності між двома послідовностями представлена BLASTP і BLASTN (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410, відкрито доступний з NCBI і інших джерел (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Кращими параметрами порівняння поліпептидної послідовності при використанні BLASTP є штраф за відкриття пробілу 10,0, штраф за наступний пробіл 0,5, матриця Blosum 62. Кращими параметрами порівняння послідовності нуклеїнових кислот при використанні BLASTP є штраф за відкриття пробілу 10,0, штраф за наступний пробіл 0,5, повна матриця ДНК (матриця тотожності ДНК). Що стосується "біотрансформації" або "біокаталітичної реакції", то тут це означає біохімічну реакцію, у якій як каталізатор використовують фермент. Скрізь відповідно до даного винаходу, указують, що коли використовують біокаталізатор, щонайменше, одна реакційна стадія в даному способі каталізується біологічним матеріалом або речовиною, виділеними з біологічного джерела, наприклад, з організму, або біомолекулою, виділеною з нього. Зокрема, біотрансформація може бути ферментативною стадією. Зокрема, біокаталізатор може містити один або кілька ферментів. Біокаталізатор може бути використаний у будь-якій формі. У конкретному варіанті здійснення використовують один або кілька ферментів, виділених із природного оточення (виділених з організму, у яких вони утворюються), наприклад, у вигляді розчину, емульсії, дисперсії, (суспензії) ліофілізованих клітин, у вигляді лізату або будучи іммобілізованими на основі. В одному з варіантів здійснення oдин або кілька ферментів утворюють частину живого організму (наприклад, живих цілих клітин). Ферменти можуть виконувати каталітичну функцію усередині клітини. Також можливо, щоб фермент міг секретуватися в середовище, де перебувають клітини. Що стосується "біокаталітичної реакційної суміші", то це означає тут середовище, у якому проходить біокаталітична реакція. Це може бути клітинне оточення (для внутрішньоклітинних або позаклітинних біокаталітичних реакцій) або безклітинне середовище. Що стосується "ферментативної стадії", те тут це означає стадію способу, на якій утворення або конверсія конкретної хімічної сполуки відбувається в одноклітинному організмі, особливо бажано в мікроорганізмі в культурі клітин. "Ферментативне одержання" означає тут одержання хімічної сполуки в мікроорганізмі, який містить біокаталізатор у культурі клітин, що містить ферментоване джерело вуглецю, у якому вуглець входить до складу кожної із зазначених сполук, які можуть перетворюватися на конкретну хімічну сполуку, яка може бути отриманою або в якому клітини містять сполуку для перетворення її на конкретну хімічну сполуку, яка може бути отриманою із джерела вуглецю. Мікроорганізм може бути природним виробником конкретної хімічної сполуки або він може набути здатність продукувати конкретну хімічну сполуку в результаті трансформації геном, який кодує щонайменше один придатний фермент, використовуючи технології рекомбінантної ДНК. Природний виробник конкретної хімічної 3 UA 108617 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сполуки може бути також трансформований геном, який кодує щонайменше один придатний фермент, використовуючи технологію рекомбінантної ДНК для того, щоб збільшити продукцію потрібної хімічної сполуки й/або зменшити продукцію компонентів, які можуть знизити продуктивність потрібної хімічної сполуки або перешкодити здійсненню подальших стадій способу відповідно до даного винаходу. Кращі мікроорганізми для ферментативного одержання N-захищеного попередника ДАБ можуть мати еукаріотичне або прокаріотичне походження. Зокрема, вони можуть бути обрані із клітин тварин (у тому числі людини), рослинних клітин, бактерій, архебактерій, дріжджів і грибів. Найкраще, якщо мікроорганізми обрані із групи, яка складається з бактерій, наприклад, Bacillus (зокрема, B. subtilis), Brevibacterium (зокрема, B. ketoglutamicum), коринебактерій (зокрема, C. glutamicum), Escherichia (зокрема, E. coli), Klebsiella (зокрема, K. pneumoniae), молочнокислих бактерій (зокрема, L. lactis), пропіонових бактерій, псевдомонад (зокрема, P. putida), Rodococcus (зокрема, R. erythropolis, Streptomyces (зокрема, S. coelicor і S. clavuligerus), дріжджів, наприклад, Kluyveromyces (зокрема, K. lactis), Penicillium (зокрема, P. chrysogenum), Saccharomyces (зокрема, S. cerevisiae), Aspergillus (зокрема, A. niger), Pichia (зокрема, P. pastoris), Hansenula, Schizosaccharomyces (зокрема, S. pombe), Yarowia (зокрема, Y. lypolytica), грибів, наприклад, Talaromyces. У найкращому варіанті здійснення ферментативне одержання N-захищеного попередника відбувається в мікроорганізмі, у якому N-захищений попередник утворюється in vivo. Бажано, утворення N-захищеного попередника відповідно до даного винаходу є біотрансформацією в Nзахищений попередник з будь-якого придатного джерела вуглецю. Джерело вуглецю для способу ферментації може, зокрема, містити щонайменше одну сполуку, обрану із групи монофункціональних спиртів, поліфункціональних спиртів, карбонових кислот, діоксиду вуглецю, жирних кислот, гліцеридів, у тому числі сумішей, які містять будь-які із зазначених сполук. Придатні монофункціональні спирти включають метанол і етанол; придатні поліфункціональні спирти включають гліцерин і вуглеводи. Придатні жирні кислоти або гліцериди можна, зокрема, одержати у формі придатної до вживання в їжу олії, бажано рослинної олії. Зокрема, можна використовувати вуглеводи, оскільки вуглеводи звичайно можна одержати в більших кількостях з біологічно поновлюваних джерел, наприклад сільсько-господарських продуктів, бажано, сільсько-господарських відходів. Переважно використовують вуглевод, обраний із групи, яка складається із глюкози, фруктози, сахарози, лактози, сахарози, крохмалю, целюлози й геміцелюлози. Найкращими є глюкоза, олігосахариди, які містять глюкозу, і полісахариди, які містять глюкозу. Крім того, як джерело вуглецю можуть бути використані амінокислоти або їх похідні, глутамат або його похідні й/або орнітин або його похідні. Як джерело азоту можуть бути використані неорганічні азотовмісні сполуки, наприклад, аміак, солі амонію, сечовина, нітрати й нітрити або органічні азотовмісні сполуки, наприклад, амінокислоти або їх похідні, особливо бажано, глутамат або його похідні й/або орнітин або його похідні. Коли тут посилаються на біокаталізатор, це може відноситися до організму, який експресує щонайменше один фермент, необхідний для біокаталітичної функції, або це може відноситися щонайменше до одного ферменту, отриманого або виділеного із цього організму. Організм може мати еукаріотичне або прокаріотичне походження. Зокрема, організм може бути обраний з поміж тварин (у тому числі людини), рослин, бактерій, архебактерій, дріжджів і грибів. В одному з варіантів здійснення біокаталізатор утворюється у тваринах, зокрема, у їхніх частинах, наприклад, печінці, підшлунковій залозі, мозку, нирках, серці або інших органах. Тварини можуть, зокрема, бути обрані із групи ссавців, особливо бажано, можуть бути обрані із групи приматів (наприклад, Homo sapiens), Leporidae, Muridae, Suidae і Bovidae. Придатними рослинами як джерелом біокаталізаторів можуть бути рослини, обрані із групи Asplenium; Cucurbitaceae, зокрема, Cucurbita, наприклад, Cucurbita moschata (сквош), або Cucumis; Mercurialis, наприклад, Mercurialis perennis; Hydnocarpus; і Ceratonia. Придатні бактерії як джерела біокаталізаторів можуть, зокрема, бути обрані із групи Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Deinococcus, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Geobacillus, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Mycobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Novosphingobium, Paracoccus, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Thermus, Vibrio і Zymomonas. Придатні архебактерії як джерело біокаталізаторів можуть, зокрема, бути обрані із групи Aeropyrum, Archaeoglobus, Halobacterium, Methanobacterium, Methanobrevibacter, 4 UA 108617 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Methanocaldococcus, Methanococcus, Methanopyrus, Methanosarcina, Methanosphaera, Pyrobaculum і Thermoplasma. Придатні гриби як джерело біокаталізаторів можуть, зокрема, бути обрані із групи Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Rhizopus і Trichoderma. Придатні дріжджі як джерело біокаталізаторів можуть, зокрема, бути обрані із групи Candida, Cytophagia, Hansenula, Humicola, Kluyveromyces, Mucor, Rhizoctonia, Saccharomyces і Yarrowia. Фахівцям у даній галузі техніки буде ясно, що можуть бути використані біокаталізатори, які зустрічаються в природі (дикого типу) або мутанти біокаталізаторів, які зустрічаються в природі, і які проявляють бажану активність в способі запропонованому даним винаходом. Властивості біокаталізатора, що зустрічається в природі, можуть бути поліпшені використанням біологічних способів, відомих фахівцям у даній галузі техніки, наприклад, молекулярною еволюцією або раціональним дизайном. Мутанти біокаталізаторів дикого типу можуть, наприклад, бути отримані модифікацією кодуючої ДНК в організмі, здатному діяти як біокаталізатор або здатному продукувати біокаталітичну сполуку (наприклад, фермент), використовуючи способи мутагенезу, відомі фахівцям у даній галузі техніки (випадковий мутагенез, сайт-спрямований мутагенез, спрямовану еволюцію, рекомбінацію генів тощо). Зокрема, ДНК може бути модифікована так, щоб вона кодувала фермент, який би відрізнявся від ферменту дикого типу щонайменше на одну амінокислоту, так, щоб вона кодувала фермент, який би відрізнявся від ферменту дикого типу наявністю одного або декількох заміщень амінокислот, делецій і/або інсерцій або так, щоб мутант поєднував у собі послідовності двох або декількох вихідних ферментів або впливав на експресію подібним чином модифікованої ДНК у придатній клітині (хазяїні). Останнє може бути досягнуте способами, відомими фахівцям у даній галузі техніки, наприклад, оптимізацією кодону або оптимізацією пар кодонів, наприклад, на основі способу, описаного в WO 2008/000632. Мутантний біокаталізатор може мати поліпшені властивості, наприклад, у відношенні одного або декількох наступних аспектів: селективності щодо субстрату, активності, стабільності, стійкості до дії розчинників, pH профілю, температурного профілю, субстратного профілю, чутливості до інгібування, використання кофакторів і спорідненості до субстрату. Мутанти з поліпшеними властивостями можуть бути ідентифіковані застосуванням, наприклад, скринінгу з придатною високою пропускною здатністю або селективних способів, заснованих на способах, відомих фахівцям у даній галузі техніки. Коли посилаються на біокаталізатор, зокрема, на фермент із конкретного джерела, рекомбінантні біокаталізатори з конкретного джерела, рекомбінантні біокаталізатори, зокрема, ферменти, які перебувають в організмі донора, але, які фактично утворюються в організмі хазяїна (генетично модифікованому), звичайно мають на увазі, що вони включені як біокаталізатори, зокрема, ферменти з першого організму. Умови реакції для будь-якої біокаталітичної стадії в контексті даного винаходу можуть бути обрані залежно від відомих характеристик даного біокаталізатора, зокрема, ферменту, інформації, представленої тут і необов'язково від деяких звичайних експериментів. Використані значення рH реакційного середовища, можуть бути обрані в широких межах, обумовлених активністю біокаталізатора за цих значень рH. Можуть бути використані лужні, нейтральні або кислі умови залежно від біокаталізатора та інших факторів. У тому випадку, якщо спосіб передбачає використання мікроорганізму, наприклад, для експресування ферменту, який є каталізатором у даному способі винаходу, pH вибирають таким чином, щоб цей мікроорганізм був здатний виконувати свою заплановану функцію або функції. Зокрема, pH може перебувати в межах чотирьох одиниць pH нижче нейтрального значення pH і двох одиниць pH вище нейтрального значення pH, тобто між pH 3 і pH 9 у випадку бажано водної системи при 25 °C. Систему вважають водною, якщо вода є єдиним розчинником або переважаючим розчинником (> 50 мас. %, зокрема > 90 мас. % розраховуючи на загальну масу рідини), у якому, наприклад, може бути розчинена невелика кількість спирту або іншого розчинника (< 50 мас. %, зокрема 2 % конверсії). 20 з них також є позитивними при використанні (S)-α-метилбензиламіну як донора аміногрупи. П'ять із цих амінотрансфераз наведено в таблиці 5. 45 17 UA 108617 C2 Таблиця 5 Амінотрансферази, які демонструють >2 %-ну ступінь конверсії при біоперетворенні N-ацетил-4-амінобутиральдегіду в N-ацетил-ДАБ Фермент/походження Vibrio fluvialis JS17 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Paracoccus denitrificans Bacillus weihenstephanesis 5 10 15 Відкрита рамка зчитування/вставка клон Pae_AT_gi9946143 Pae_AT_gi9951072 Pde_AT_ZP00628577 Bwe_AT_ZP01186960 Платформа Sdw/RS AT3 SPEED TA 1 SPEED TA 1 Sdw/RS AT3 Sdw/RS AT3 Біоперетворення N-ацетилДАБ на ДАБ. Умови скринінгу Усі ферменти суспендують в 100 мM буфері на основі фосфату калію, pH 7,5 до кінцевого об'єму, рівного 100 мкл. Ферментативні реакції починають додаванням 150 мкл буфера, який містить 13,33 мг/мл N-ацетил-ДАБ НCl в 100 мM буфері на основі фосфату калію (кінцева реакційна концентрація дорівнює 8 мг/мл ≈ 48 мM N-ацетил-ДАБ). Реакційні суміші інкубують протягом ночі при 37 °C, струшуючи при 460 об./хв. на IKA орбітальному струшувачі. Після інкубації реакційні суміші блокують і розбавляють додаванням 750 мкл 100 мМ HСlO 4 в H2O, pH 1,0. Мікротитрувальні планшети центрифугують при 3500 об./хв. протягом 20 хвилин і аналізують на наявність ДАБ за допомогою HPLC-PCR-FL аналізу, як описано нижче. Спосіб ВЕРХ-МС аналізу для визначення ДАБ Приготування зразків: Для розведення зразків використовують суміші ацетонітрилу й води з 0,2 % мурашиною кислотою. Процентний вміст ацетонітрилу становить щонайменше 50 %. Умови РХ: Колонка 50 × 4,6 мм, HP HILIC, 3 мкм (Alltech) Температура колонки кімнатна температура (24 °C) Елюент A: ацетонітрил, який містить 0,2 % мурашиної кислоти B: вода, яка містить 0,2 % мурашиної кислоти Градієнт час (хв.) % елюента B 0 5 2.5 20 10 20 11.1 5 15 5 Потік 1 мл/хв., перед уведенням MS потік розділяється 1:5 Об'єм, що вводиться 2 мкл Умови МС: Іонізація Характеристики джерела Режим сканування (ДАБ) Турбо іон-розпилення позитивних іонів Вольтаж іона-розпилення: 5 кV Температура: 400ºC Потенціал дефрагментації:51 V Фокусуючий потенціал: 180 V режим селективного визначення іонів m/z 72 (час спокою 200 мсек) 20 25 За використаних умов ДАБ елююється за 6,3 хвилини Результати біоконверсії N-ацетилДАБ у ДАБ Відбір випробуваних ферментів, які проявляють гідролітичну активність при біоконверсії NацетилДАБ у ДАБ продемонстровано в таблиці 6. Деякі із цих ферментів також охарактеризовані своїми послідовностями, наведеними в цій патентній заявці. 18 UA 108617 C2 Таблиця 6 Гідроліз N-ацетил-ДАБ у ДАБ Біокаталізатор Rhizopus japonicus ліпаза Aspergillus niger ліпаза (ліпаза AP6) Alcaligenes sp. ліпаза (ліпаза QL) Bacillus amyloliquefaciens протеаза (протеаза B) Bacillus licheniformis протеаза (Delvolase) Rhizopus oryzae ліпаза Еспераза Алкалаза Різновиди Aspergillus (Ацилаза) Прозим 6 Протеаза М Bacillus subtilis (Протеаза N) Mycobacterium neoaurum Lаміноамідаза Цердаза Хімічний контроль Хімічний контроль 5 10 15 20 25 30 Фірма-постачальник Biocatalysts LTD Концентрація ДАБ (мкМ) 690 SEQ ID Uniprot No No Amano 278 Meito Sangyo 186 DSM-Gist 142 19 DSM-Gist 162 20 DSM-Gist NOVO NOVO Sigma Amano Amano Amano 1846 158 130 270 346 206 514 DSM 1174 Novozymes 530 108 104 P61872 21 Висновок Показано, що велику кількість гідролітичних ферментів використовують як біокаталізатори для перетворення N-ацетил-ДАБ на ДАБ. Попередники N-захищеного ДАБ з іншими ацил-захисними групами можуть бути отримані, наприклад, ацилюванням, наприклад, 4-амінобутиральдегіду або орнітину. Наприклад, ацилюванням оцтовим ангідридом у мурашиній кислоті для введення формільної захисної групи або реакцією ангідриду C2-C6 карбонових кислот або ацилхлориду для введення N-ацетильної, N-пропіонільної, N-бутирильної, N-валерильної або N-капроїльної захисної групи, відповідно. Передбачається, що такі попередники N-захищених ДАБ, як, наприклад, N-форміл ДАБ і вищі гомологи з C3-C6 ацильними захисними групами, можуть бути аналогічно перетворені на ДАБ за допомогою вищеописаних ферментів. 5 Біоконверсія N -ацетилорнітину в N-ацетилДАБ Культивація клітин і експресія Біоконверсію проводять із використанням декарбоксилаз. Більша частина декарбоксилаз експресується в E.coli за стандартних умов. carb Попередні культури одержують інокуляцією 5 мл середовища LB з E. coli Top10, яке містить рBAD-DEST_lysA, рBAD-DEST_kdcA, рBAD-DEST_kivD або рBAD-DEST_kgd з вихідних гліцеринових стоків. Попередні культури інкубують протягом ночі при 28 °C. 0,5 мл кожної carb попередньої культури розбавляють в 50 мл середовища LB . Культури інкубують при 28 °C до досягнення D600, рівної 0,6 (у середньому через 3-4 години). Експресію білка індукують додаванням арабінози до кінцевої концентрації, рівної 0,02 %. Після нічної інкубації при 28 °C клітини збирають (10 хв., 5000 об./хв., 4 °C). Для аналізу електрофорезом у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) по 1 мл зразка відбирають перед індукцією, через 3 години після індукції й уночі. Клітини осаджують центрифугуванням (5 хв., 13,000 об./хв.) і осад зберігають при -20 °C. Дві орнітиндекарбоксилази рBAD2_ODC E.coli DH5α/LJ110 вирощують і експресують за дещо відмінних умов. У цьому випадку основну культуру вирощують до D620, рівної 1,5 перед стимулюванням 50 мкМ IPTG. Усі решта умов залишаються тими ж, що й описані вище. Одержання зразків, які не містять клітин (CFE) під дією ультразвукового випромінювання Осади клітин разморожують у кризі й ресуспендують в 2 об'ємах 50 мМ калій-фосфатного (KРi) буфера при pH 7,5. Суспензії клітин піддають дії ультразвукового випромінювання протягом 10 хвилин з періодичними імпульсами протягом 10 секунд. Після дії ультразвукового 19 UA 108617 C2 випромінювання клітинний дебрис відокремлюють центрифугуванням (20 хв., 13,200 об./хв., 4 °C). Використовують аналіз електрофорезом у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфата натрію (SDS-PAGE) для визначення рівнів експресії й зразки, які не містять клітин (CFE), зберігають при -20 °C. 5 Таблиця 7 Умови біоконверсії для перетворення N-Ac-орнітину в N-Ac-ДАБ Реакція Глутамат DC A Аспартат DC A LysA KdcA KivD Kgd Лізин DC Орнітин DC LJ110 Орнітин DC DH5a Порожній Порожній 10 15 200 мМ Кацетат рН 4,6 1,875 200 200 мМ мМ КФ КФ рН рН 6,9 7,5 200 200 100 мМ мМ мМ 10 ККФ N-Ac- мM ацетат рН орні- PLP рН 5,7 6,5 тину 1,25 0,05 1,875 1,25 0,05 1,875 1,25 0,05 1,875 1,25 1,875 1,25 1,875 1,25 1,875 1,25 0,05 1,875 1,25 0,05 1,875 1,25 0,05 1,875 0,05 1,875 1,25 0,05 50 100 Фе4M мМ 1M Во- УсьмM рмеNaCl ЕД MgCl2 да ого ThD нт ТА 0,25 0,5 0,05 0,05 0,05 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 1 0,575 5 1 0,325 5 1 0,8 5 1 0,8 5 1 0,8 5 1 0,8 5 1 0,8 5 1 0,8 5 1 0,8 5 1 2,05 5 1,8 5 Усі реакції перетворення N-Ac-орнітину на N-Ac-ДАБ проводять при перемішуванні й інкубації при 37 °C. Зразки відбирають у момент часу: 0; 2; 18; 28 і 44 годин і зберігають при 20 °C. Для аналізу 500 мкл кожного зразка додають до 500 мкл ацетонітрилу й центрифугують при максимальній швидкості протягом 10 хвилин. Зразки аналізують ТСХ і елююють сумішшю аміак: метанол (1:1) і проявляють спреєм нінгідрину. Для кількісного аналізу визначають вміст зразків за допомогою РХ-MС-MС (LC MS-MS) відповідно до нижчеописаного способу. Спосіб аналізу ВЕРХ-MС для визначення N-ацетил-ДАБ Приготування зразків: Для розведення зразка використовують суміш ацетонітрилу й води з 0,2 % мурашиною кислотою. Процентний вміст ацетонітрилу становить щонайменше 50 %. Експерименти проводять при використанні PE SCIEX API2000 РХ-MС/MС від Applied Biosystems. Умови РХ: Колонка 50 × 4,6 мм, HP HILIC, 3 мкм (Alltech) Температура колонки кімнатна температура (240C) Елюент A: ацетонітрил, який містить 0,2 % мурашиної кислоти B: вода, яка містить 0,2 % мурашиної кислоти Градієнт час (хв.) % елюента B 0 5 2,5 20 8 20 8,1 5 12 5 Потік 1 мл/хв., перед уведенням MS потік розділяється 1:5 Об'єм, який вводиться 2 мкл 20 20 UA 108617 C2 Умови МС: Іонізація Турбо іон-розпилення позитивних іонів Характеристики Вольтаж іона-розпилення: 5 кV джерела Температура: 400 °C Потенціал дефрагментації:11 V Фокусуючий потенціал: 350 V режим селективного Режим сканування (N-Ас-ДАБ) m/z 72 &114 (час спокою 200 мсек) визначення іонів 5 10 За використаних умов N-Ac-ДАБ елююється за 4,2 хвилини. 5 Результати біоконверсії N -ацетил-орнітину в N-ацетил-ДАБ Для перетворення орнітину на ДАБ зразки, отримані в момент завершення реакції (44 годин) аналізують ТСХ (Фігура 1). Усі зразки, отримані в момент завершення реакції, аналізують за допомогою РХ-MС-MС (LC MS-MS). Ті з них, які характеризуються величиною, яка є щонайменше на 3 мікромоля більш високою у порівнянні з рівнемконтрольних зразків представлено в таблиці 8. Таблиця 8 Результати РХ-MС-MС з біоконверсії N-ацетил-ДАБ m/z 131  72 мікромоль/л зразок 1 3 4 5 6 m/z 131  114 мікромоль/л 9 3 4 10 5 3 8 4 ммоль/л CB200109 ммоль/л 370 344 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 20 25 30 35 1. Спосіб одержання 1,4-діамінобутану [ДАБ], який передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію, яка включає біокаталітичне одержання щонайменше одного Nзахищеного попередника ДАБ і наступне перетворення in vitro N-захищеного попередника на ДАБ, де N-захищений попередник ДАБ вибирають з групи, яка складається з N5-захищеного орнітину, N-захищеного ДАБ, Ν-захищеного 4-амінобутиральдегіду або гуанідил-захищеного попередника. 2. Спосіб одержання ДАБ, який передбачає щонайменше одну біокаталітичну стадію, який включає стадії: a) біокаталітичного одержання N-захищеного попередника ДАБ, що приводить до біокаталітичної реакційної суміші, яка містить N-захищений попередник ДАБ, b) виділення N-захищеного попередника з біокаталітичної реакційної суміші, c) перетворення N-захищеного попередника на ДАБ, де N-захищений попередник ДАБ вибирають з групи, яка складається з N5-захищеного орнітину, N-захищеного ДАБ, Ν-захищеного 4-амінобутиральдегіду або гуанідил-захищеного попередника. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що принаймні один N-захищений попередник ДАБ вибирають з групи, яка складається з N5-ацетилорнітину, N-ацетил-ДАБ і Ν-ацетил-4амінобутиральдегіду. 4. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що біокаталітичною стадією є ферментативна стадія. 5. Спосіб за п. 4 який відрізняється тим, що ферментативна стадія протікає в одноклітинному організмі. 21 UA 108617 C2 5 10 15 20 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що ферментативна стадія протікає в одноклітинному організмі, клітині-хазяїні, вибраній з групи, що складається з тваринних клітин, рослинних клітин, бактерій, архей, дріжджів і грибів. 7. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що виділення N-захищеного попередника з біокаталітичної реакційної суміші проводять щонайменше в одну стадію, вибрану з групи, що складається з фільтрування, седиментації, кристалізації, афінної хроматографії, розділової хроматографії, мембранного поділу й випаровування. 8. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що конверсія на стадії с) N-захищеного попередника в ДАВ передбачає щонайменше одну ферментативну стадію або стадію хімічної обробки. 9. Спосіб одержання ДАВ за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що N-захищений ДАВ перетворюється на ДАВ під дією гідролітичного ферменту. 10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що гідролітичний фермент вибирають з групи, яка складається з гідролаз ефірів карбонових кислот, гідролаз тіолових ефірів, ліпаз і пептидаз, а саме з ліпаз і пептидаз. 11. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що гідролітичним ферментом є пептидаза, вибрана з групи карбоксипептидаз серинового типу, металокарбоксипептидаз, карбоксипептидаз цистеїнового типу, серинових ендопептидаз, цистеїнових ендопептидаз, аспарагінових ендопептидаз і металоендопептидаз, зокрема, із серинових ендопептидаз. 12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що сериновою ендопептидазою є субтилізин, переважно субтилізин Карлсберга. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 22