Штам бактерій lactobacillus paracasei, що використовується у виробництві функціональних добавок для сільськогосподарської птиці

Реферат: Винахід належить до штаму Lactobacillus paracasei IMB B-7458, що застосовується як функціональна добавка для профілактики і лікування дисбактеріозів та шлунково-кишкових захворювань сільськогосподарської птиці. UA 109078 C2 (12) UA 109078 C2 UA 109078 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі ветеринарії та біотехнології та є штамом лактобацил, що використовується для отримання лікувально-профілактичної функціональної добавки для профілактики і лікування дисбактеріозів та шлунково-кишкових захворювань сільськогосподарської птиці. Результатом багаторічного застосування кормових антибіотиків у промисловому птахівництві стало значне поширення шлунково-кишкових захворювань, які посідають друге місце після вірусних і є основною причиною втрат молодняку в птахівничих господарствах. Ефективним методом лікування та профілактики шлунково-кишкових захворювань птиці є пробіотики. Пробіотики застосовують для підтримки і відновлення нормальної мікрофлори кишечнику; стимуляції імунітету та загальної резистентності організму; підвищення росту і продуктивності птиці; для профілактики і лікування хвороб шлунково-кишкового тракту птахів, викликаних умовно-патогенними мікроорганізмами. За ефективністю вони не поступаються деяким антибіотикам і хіміотерапевтичним препаратам, при цьому не пригнічують ріст нормальної мікрофлори травного тракту, не мають негативного впливу на продукти птахівництва та навколишнє середовище, тобто є екологічно чистими. Відомий штам Lactobacillus paracasei LK-26, що використовується для одержання продукції, яка містить лактобактерії [2453594, C12N1/20, А23С9/12. A23L1/29 A61K8/99, 2011, аналог]. Цей штам є активним кислотоутворювачем, володіє антагоністичною активністю до патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів; є високопродуктивним та технологічним; здатний сквашувати молоко. Недоліком даного штаму є низька адгезивність до слизових оболонок сільськогосподарської птиці. Відомий штам Lactobacillus paracasei 3-37, що використовується для виробництва кисломолочних напоїв [Пат. RU 2461617, кл. C12N1/20, А23С9/123, А61К35/74, A23L1/29, C12R1/225, аналог]. Цей штам вирізняється високою антагоністичною активністю і високою молокозсідальною активністю. Недолік даного штаму - чутливість до жовчі та низького рН. Найближчим до штаму, що заявляється, є штам Lactobacillus casei/paracasei - ВГНКИ 10.02.62 ДЕП, що використовується для приготування пробіотичної добавки [Пат. RU 2465322, кл. C12N1/20, А61К35/74, прототип]. Цей штам має високу адгезивність, антагоніст до широкого спектра збудників хвороб, продукуванням біологічно активних субстанцій. Недоліком даного штаму можна вважати те, що представник виду Lactobacillus paracasei характеризується високою специфічністю, що істотно звужує ефективність їх терапевтичного прояву для мікробіоценозу тварин. Задачею винаходу є одержання високоактивного штаму Lactobacillus ssp. paracasei скорочена назва L. paracasei, - що має виражену антагоністичну дію відносно широкого кола патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів, має високу адгезивність до слизових оболонок шлунка, є антибіотикорезистентним та стійким до жовчі і шлункового соку, а також характеризується стійкістю до таких технологічних операцій як заморожування та сублімація. Штам L. paracasei IMB В-7458 був одержаний у результаті спрямованої селекції з біологічного матеріалу кишечнику здорової птиці. Ідентифікований як вид L. paracasei за основними морфологічними, культуральними і фізіолого-біохімічними властивостями (Краткий определитель Берги, 2009; Л.А.Банникова. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности, 1975). Штам первісно депоновано у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України і зареєстровано за номером IMB В7458. Штам Lactobacillus paracasei IMB В-7458, що використовується у виробництві функціональної добавки для профілактики і лікування дисбактеріозів та шлунково-кишкових захворювань сільськогосподарської птиці. Штам L. paracasei IMB В-7458 характеризується такими ознаками та властивостями. Культурально-морфологічні ознаки штаму. Клітини штаму паличкоподібні, нерухомі, грампозитивні. Мають товщину від 0,5 до 0,6 мкм та довжину від 1 до 3 мкм, розміщуються у вигляді окремих клітин або ланцюжків по 4-8 особин. Частина клітин має чітко виражену полярну зернистість. Штам росте на поверхні агару з гідролізованим молоком, утворюючі білі колонії розміром не більше 1,0 мм у діаметрі у вигляді "човників"; на поверхні агару - дрібні, білуваті пласкі колонії. В гідролізованому бульйоні та рідкому середовищі МРС культура росте з утворенням рівномірної каламуті та дрібнодисперсного осаду на дні пробірки. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Штам є факультативним анаеробом. Штам росте за температури від +12 °C до +43 °C, оптимальна температура росту - (37±1)°С. Гранична 8 кислотність у молоці 160°Т максимальна кількість мікроорганізмів у молоці складає 8,0·10 3 КУО/см . Штам ферментує рибозу, галактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, маніт, трегалозу не ферментує сахарозу, рамному, ксилолу, гліцерин, арабінозу, сорбіт та мальтозу. Росте за 1 UA 109078 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 присутності NaCl та жовчі не вище 6,5 % та 20 % відповідно, не росте у м'ясопептонному бульйоні з активною кислотністю, вищою за рН 9,6; не утворює аміаку з аргініну. Технологічні властивості штаму - табл. 1. Штам L. paracasei каталазонегативний, має нітритредукувальну активність, амілазну активність не має, газ з глюкози не утворює, індол і сірководень не продукує. У разі внесення 3 % культури в молоко за температури 30 °C молокозсідальна активність штаму становить 18 год., за температури 37 °C - 12 год. Кількість основних метаболітів діацетилу і ацетоїну склала, 23 мг % 0,58 мг %. За культивування у 3 середовищі на основі м'ясної води штам L. paracasei IMB В-7458 накопичував 90,2 мкг/см вільних амінокислот у тому числі й незамінних. Штам є кислотостійким при рН 2 і рН 3 зберігає чисельність своєї популяції на одному рівні протягом 5 год. Антогоністична активність штаму - табл. 2. Визначали за методом лунок. Штам L. paracasei IMB В-7458 характеризується високою антагоністичною активністю щодо патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів, що визначалися, оцінюючи розмір зони затримки росту відповідної тест-культури після 24-годинної інкубації за температури (37±1)°С. Діаметр зони лізису тесткультур становив 18,0 мм. Найвразливішими були штами S. aureus, P. vulgaris та Е. coli 113 і 111 - розмір зони затримки росту коливався в межах (17-19) мм, (12-18) мм, (12-20) мм відповідно. Антибіотикостійкість штаму - табл. 3. Було виявлено, що штам L. paracasei IMB В-7458 є чутливим до групи пеніцилінів, тетрациклінів, нітрофуранів, карбапенемів. Помірну резистентність проявив відносно групи цефалоспоринів, аміноглікозидів та фторхінолів, а повну резистентність до групи поліпептидів і протигрибкових засобів. Приклад 1. Отримання рідкої форми функціональної добавки на основі штаму L. paracasei. ветеринарного призначення 3 В 100 см стерильного середовища МРС з температурою (38±1)°С вносять 7 % свіжої чистої культури L. paracasei і термостатують за вказаної температури впродовж 12-14 год., після чого охолоджують і додають 0,5 % аскорбінової кислоти і стерильно розливають в ємкості. У результаті одержують функціональну добавку до корму птиці з вмістом життєздатних клітин L. 8 3 paracasei не менше ніж 6,5·10 КУО/см . Отримана добавка має виражену пробіотичну та імунокорегуючу дію. Додається в корм або воду для відпоюванню домашньої птиці з метою профілактики кишкових захворювань і дисфункції травлення. Приклад 2. Виробництво бактеріального концентрату L. paracasei 3 У 100 дм водопровідної води з температурою 45 °C розчиняють 3,0 кг сухого знежиреного молока та встановлюють рН 6,7. Одержане молоко підігрівають до температури 55 °C та вносять 30 г протосубтиліну Г3х активністю 70 од/г. Гідроліз молока ведуть за температури (55±2)°С протягом 3 годин. У гідролізоване молоко додають компоненти у таких кількостях: лактоза - (800-1200) г, глюкоза - (300-700) г, дріжджовий екстракт - (300-700) г, натрій лимоннокислий тризаміщений - (300-700) г, натрій оцтовокислий однозаміщений - (200-300) г, 3 магній сірчанокислий - (15-25) г, марганець сірчанокислий (10-17) г, твін - (80-100) см . Отриману молочну суміш стерилізують за температури (121±2)°С упродовж (30±5) хвилин та охолоджують до температури (42±2)°С. Активну кислотність ростового середовища 3 встановлюють на рівні 6,5 од. рН і вносять (7,0-9,0) дм штаму L. paracasei. Культивування проводять протягом (16±1) годин за температури (38±2) з періодичним перемішуванням та контролем активної кислотності ростового середовища на рівні 6,5 од. рН, застосовуючи 25 %ний водний розчин аміаку. Після закінчення культивування ростове середовище охолоджують до температури (10-12)°С та відокремлюють біомасу. Одержану біомасу змішують у 3 співвідношенні 1:2 зі захисним середовищем такого складу (в г/дм ): тризаміщений 3 лимоннокислий натрій - 50, сахароза - 120, сухе знежирене молоко - 70 г та вода - до 1 дм . Суспензію клітин у захисному середовищі розливають у стерильні кювети шаром (2-3) см. Сушіння здійснюють за наступних режимів: початкова температура мінус (40±1)°С, кінцева 2 плюс (30±2)°С, залишковий тиск не більше 6,65 Па (0,679 кгс/м ). Тривалість сушіння - (30-34) год. Чисельність життєздатних клітин молочнокислих бактерій у 1 г сухого бактеріального 10 концентрату становить 5,5·10 КУО. Штам Lactobacillus paracasei IMB В-7458 рекомендується для залучення до складу функціональних добавок для профілактики і лікування дисбактеріозів та шлунково-кишкових захворювань та нормалізації мікробіоценозу сільськогосподарської птиці. 2 UA 109078 C2 Таблиця 1 Технологічні властивості штаму L. paracasei IMB В-7458 Показник Гранична кислотність у молоці,°Т Молокозсідальна активність, год. 3 Чисельність мікроорганізмів у молоці, КУО/см Кількість діацетилу, мг % Кількість ацетону, мг % 3 Накопичення вільних амінокислот, мг/см Ступінь виживання під час ліофілізації, % L. paracasei IMB В-7458 160 18 8 8,0·10 23 0,58 90,2 73,0 Таблиця 2 Антогоністична активність штамів за методом лунок Тест-культури E. coli ПСК E. coli 113 E. coli 111 P. aeruginosa S. aureus P. vulgaris 240111 Штам L. paracasei ssp paracasei IMB В-7458 L. paracasei LK-26 18±2 22±2 14±2 22±2 19±1 18±2 14±2 18±2 18±1 25±1 15±3 18±2 Таблиця 3 Антибіотикостійкість штаму L. paracasei IMB B-7458 1 2 3 4 5 6 Стійкість до є антибіотика Група цефалоспоринів Цефтриаксон 28 Цефазолін 22 Цефтіомакс 33 Цефепім 10 Цефамексин 16 Цефоперазон 0 7 8 9 10 11 Група аміноглікозидів Гентаміцин Стрептоміцин Амікацин Неоміцин Канаміцин 14 18 0 0 14 12 13 Ряд фторхінолів Ципрофлоксацин Офлоксацин 17 21 14 15 Група пеніцилінів Амоксицилін Ампіцилін 20 26 № п/п Антибіотики Стійкість до антибіотика Група тетрациклінів 16 Доксициклін 26 17 Тетрациклін 21 Група агзаміцинів 18 Рифампіцин 24 Група нітрофуранів 19 Фурадонін 26 Група карбапенемів 20 Меропенем 27 Група хлорамфеніколу 21 Левоміцетин 26 підклас азалідів 22 Азитроміцин 0 23 Еритроміцин 28 Протигрибкові засоби 24 ітраконазол 0 Поліміксини 25 Поліміксин 0 № п/п 26 27 5 3 Антибіотики Ряд лінкозаміни Лінкоміцин Клінзаміцин 24 0 UA 109078 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 Штам Lactobacillus paracasei IMB B-7458 як функціональна добавка для профілактики і лікування дисбактеріозів та шлунково-кишкових захворювань сільськогосподарської птиці. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4