Цукровий буряк, стійкий до гліфосату

1. Стійка до гліфосату рослина цукрового буряку, яка має трансген, який надає їй стійкість до гліфосату, яка відрізняється тим, що: a) із геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 1, та другим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 2, може бути ампліфіковано фрагмент ДНК довжиною 664 п.н., який має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 13 або демонструє щонайменше 95%, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 99%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 99,9 % ідентичність із нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO 13; та/або b) із геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 3, та другим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 4, може бути ампліфіковано фрагмент ДНК довжиною 3706 п.н., який має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 6 або демонструє щонайменше 95 %, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 99 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 99,9 % ідентичність з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO 6; та/або 2 (19) 1 3 88760 4 a) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 664 п.н., що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 13 або демонструє щонайменше 95%, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 99%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 99,9% ідентичність із нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO 13, з геномної ДНК згаданої рослини, її частин або насіння за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 1, та другим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 2; та/або b) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 3706 п.н., що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 6 або демонструє щонайменше 95%, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 99%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 99,9% ідентичність з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO 6, з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 3, та другим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 4; та/або c) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 288 п.н., що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 11 або демонструє щонайменше 95%, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 99 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 99,9% ідентичність з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO 11, з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 7, та другим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 8; та/або d) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 751 п.н., що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 12 або демонструє щонайменше 95%, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 99%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 99,9% ідентичність із нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO 12, з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 9, та другим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 10; та/або e) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 1042 п.н., що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 17 або демонструє щонайменше 95 %, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 99%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 99,9% ідентичність із нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO 17, з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 14, та другим праймером, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 16. 5. Тест-набір для ідентифікації трансгенної стійкої до гліфосату рослини цукрового буряку за п.1, її клітин, тканини або частин, до складу якого входять щонайменше одна пара праймерів для полімеразно-ланцюгової реакції, з яких перший праймер розпізнає певну послідовність у чужій ДНК, включеній до геному згаданої рослини, а другий праймер розпізнає певну послідовність у 3¢ або 5¢ фланкуючих ділянках згаданої ДНК. 6. Тест-набір за п.5, який відрізняється тим, що перший і другий праймери розпізнають нуклеотидну послідовність, яка становить частину нуклеотидної послідовності SEQ ID NO 5. 7. Тест-набір для ідентифікації трансгенної стійкої до гліфосату рослини цукрового буряку, її клітин, тканини або частин, до складу якого входить щонайменше одна пара праймерів для полімеразноланцюгової реакції, з яких перший праймер розпізнає певну послідовність у чужій ДНК, включеній до геному згаданої рослини, а другий праймер розпізнає певну послідовність у 3¢ або 5¢ фланкуючих ділянках згаданої ДНК, який відрізняється тим, що: а) перший праймер має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 1, а другий праймер має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 2; та/або b) перший праймер має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 7, а другий праймер має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 8; та/або c) перший праймер має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 9, а другий праймер має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 10; та/або d) перший праймер має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 14, а другий праймер має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO 16. 8. Тест-набір за п.7, який відрізняється тим, що перший і другий праймери розпізнають нуклеотидну послідовність, яка становить частину нуклеотидної послідовності SEQ ID NO 5. Цей винахід має відношення до стійких до гліфосату рослин цукрового буряку, матеріалу рослинного походження та насіння. Цукровий буряк (Beta vulgaris) вирощують як товарну культуру у багатьох країнах із загальним врожаєм, що перевищує 240 мільйонів тон. N-фосфонометилгліцин, загальновідомий як гліфосат, є гербіцидом широкого спектру дії, який широко застосовується завдяки його високій ефективності, здатності до біологічного розкладання та низького рівня токсичності для тварин та людей. Гліфосат інгібує шлях шикімової кислоти, який забезпечує біосинтез ароматичних сполук, у тому числі амінокислот та вітамінів. Зокрема, гліфосат інгібує перетворення фосфоенолпіровиноградної кислоти та 3-фосфошикімової кислоти на 5 5 енолпірувіл-З-фосфошикімову кислоту шляхом інгібування ферменту, 5-енолпірувіл-Зфосфошикімовокислої синтази (EPSP синтаза або EPSPS). У разі обробки звичайних рослин гліфосатом, ці рослини не можуть продукувати ароматичні амінокислоти (наприклад, фенілаланін та тирозин), необхідні для росту та виживання. EPSPS є присутньою в усіх рослинах, бактеріях та грибах. Вона відсутня у тварин, які не синтезують своїх власних ароматичних амінокислот. Оскільки шлях біологічного синтезу ароматичних амінокислот у ссавців, птахів або представників водної флори та фауни є відсутнім, гліфосат для цих організмів є зовсім нетоксичним або слаботоксичним. Фермент EPSPS є, звичайно, присутнім у харчових продуктах, які походять із рослинних або мікробних джерел. Гліфосат є активною складовою такого гербіциду, як раундап (Roundup®), що виробляється фірмою Monsanto Company, США. Цей гербіцид, як правило, має форму водорозчинної солі, наприклад, солі амонію, алкіламіну, лужного металу або триметилсульфонію. Однією з найпоширеніших форм є ізопропіламінова сіль гліфосату, яка являє собою форму, що застосовується у гербіциді раундап. Було показано, що стійкі до гліфосату рослини можна одержати шляхом введення до геному рослини здатності до продукування EPSP синтази, яка є стійкою до гліфосату, наприклад, CP4EPSPS від Agrobacterium sp., штам СР-4. Рослину цукрового буряка, стійку до гліфосату, можна одержати шляхом Agrobacteriumопосередкованої трансформації, завдяки введенню гена, що кодує EPSP синтазу, стійку до гліфосату, наприклад, CP4-EPSPS, до геному рослини. Така рослину цукрового буряка, що експресує CP4-EPSPS, описана у WO 99/23232. Однак рослини цукрового буряка, вирощені з клітин, подібним чином трансформованих геном CP4-EPSPS, широко різняться за своїми характеристиками унаслідок того, що ген вставляють до геному рослини у довільному положенні. Введення конкретного трансгену до конкретної ділянки на хромосомі часто називають "подією". Термін "подія" часто застосовують також для відрізнення сільськогосподарських культур, що були піддані обробці за методами рекомбінантних ДНК. Бажані події є дуже рідкими. Значна більшість подій відбраковується, оскільки трансген, вставлений до гену рослини, важливого для росту, викликає руйнування цього гену або перешкоджає його експресії, або ж вставлений трансген потрапляє до тієї частини хромосоми, що не забезпечує експресії цього трансгену або експресію дуже низького рівня. Це є причиною скринінгу великої кількості подій для ідентифікації події, що характеризується достатнім рівнем експресії введеного гена. Ця процедура є дуже трудомісткою, поглинає багато часу і у жодному разі не гарантує того, що може бути знайдена рослина із задовільними властивостями. Таким чином, мета цього винаходу полягає у наданні рослини цукрового буряка, яка демонструє високий рівень стійкості до гліфосату, однак позбавлена недоліків відносно інших важливих агро 88760 6 номічних властивостей, а саме росту, врожаю, якості, стійкості до патогенів тощо. Стійка до гліфосату рослина цукрового буряку за цим винаходом відрізняється тим, що а) згадану рослину цукрового буряка одержують із насіння, депонованого у NCIMB (Національна колекція промислових мікроорганізмів, Абердін, Шотландія, Великобританія), що має номер депонування NCIMB 41158 або NCIMB 41159 та/або b) фрагмент ДНК довжиною 630-700п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 664п.н., може бути ампліфікованим з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №1, та другим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №2, та/або с) фрагмент ДНК довжиною 3500-3900п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 3706п.н., може бути ампліфікованим із геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №3, та другим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №4, та/або d) фрагмент ДНК довжиною 270-300п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 288п.н., може бути ампліфікованим з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №7, та другим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №8, та/або е) фрагмент ДНК довжиною 710790п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 751п.н., може бути ампліфікованим із геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразноланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №9, та другим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №10, та/або f) фрагмент ДНК довжиною 990-1100п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 1042п.н., може бути ампліфікованим із геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразноланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №14 та другим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №16. Полімеразно-ланцюгова реакція (PCR) є добре відомим стандартним методом, що застосовується для ампліфікації молекул нуклеїнових кислот (дивись, наприклад, патент США №4,683,202). Рослина цукрового буряку за цим винаходом (на яку у подальшому посилаються, як на "подію Н7-1"), демонструє високу стійкість до гербіциду гліфосат. На додаток до цього, процес трансформації не чинить від'ємного впливу на характеристики росту та інші важливі агрономічні властивості події Н7-1. Подія Н7-1 експресує високий рівень гена Agrobacterium-CР4-EPSFS, який стабільно включається до геному рослини і який надає рослині стійкості до гліфосату. Згадану рослину одержують за технологією Agrobacteriumопосередкованої трансформації із застосуванням бінарного вектора PV-BVGT08. Цей вектор, у ме 7 жах від лівої до правої граничних ділянок, містить такі послідовності: кодувальну ділянку, що складається з кодувальної послідовності перехідного пептиду хлоропластів EPSPS Arabidopsis thaliana (яка позначається як ctp2), сполучену з кодувальною послідовністю CP4-EPSPS під регуляцією промотору вірусу мозаїки ранника (Scrophularia) (pFMV), і послідовність термінації транскрипції Pisum sativum. За варіантом прикладу здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, фрагменти ДНК довжиною 3706п.н., 664п.н., 288п.н., 751п.н. і 1042п.н. демонструють щонайменше 95%, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 99%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 99,9% ідентичність з такими нуклеотидними послідовностями: Послідовність №6, Послідовність №13, Послідовність №11, Послідовність №12 або Послідовність №17, відповідно. 95% ідентичність, наприклад, означає, що 95% нуклеотидів даної послідовності є ідентичними з тією послідовністю, з якою вона порівнюється. З цією метою, послідовності можуть впорядковано розміщуватись і порівнюватись із застосуванням програми BLAST (доступної, наприклад, на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html). За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, фрагмент ДНК довжиною 3706п.н. має нуклеотидну Послідовність №6; фрагмент ДНК довжиною 664п.н. має нуклеотидну Послідовність №13; фрагмент ДНК довжиною 288п.н. має нуклеотидну Послідовність №11; фрагмент ДНК довжиною 751п.н. має нуклеотидну Послідовність №12, та/або фрагмент ДНК довжиною 1042п.н. має нуклеотидну Послідовність №17. Цей винахід має також відношення до насіння, депонованого у NCIMB (Національна колекція промислових мікроорганізмів, Абердін, Шотландія, Великобританія), що має номер депонування NCIMB 41158 або NCIMB 41159. Таке насіння може використовуватись для одержання стійкої до гліфосату рослини цукрового буряку. Це насіння може висіватись, і рослина, що виросте, буде стійкою до гліфосату. Цей винахід має також відношення до клітини, тканини або частини стійкої до гліфосату рослини цукрового буряку. Іншим аспектом цього винаходу є спосіб ідентифікації стійкої до гліфосату рослини цукрового буряка, який відрізняється тим, що включає стадію(-ї) а) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 630-700п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 664п.н., з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №1, та другим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №2, та/або b) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 3500-3900п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 3706п.н., з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №3, та другим праймером, що має нуклеотидну Послідо 88760 8 вність №4, та/або с) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 270-300п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 288п.н., з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №7, та другим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №8, та/або d) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 710-790п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 751п.н., з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №9, та другим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №10, та/або е) ампліфікації фрагменту ДНК довжиною 990-1100п.н., за варіантом, якому віддають перевагу, довжиною 1042п.н., з геномної ДНК згаданої рослини цукрового буряку, її частин або насіння, за допомогою полімеразноланцюгової реакції з першим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №14, та другим праймером, що має нуклеотидну Послідовність №16. Згаданий спосіб надає можливість легкого виявлення трансгенної стійкої до гліфосату рослини цукрового буряку за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Цей винахід має додаткове відношення до тест-набору для ідентифікації трансгенної стійкої до гліфосату рослини цукрового буряку або її клітин, тканини або частин. До складу згаданого набору входить щонайменше одна пара праймерів із першим і другим праймером для полімеразноланцюгової реакції, яка забезпечує можливість специфічної ідентифікації події Н7-1, її клітин, тканини або частин. За варіантом, якому віддають перевагу, перший праймер має нуклеотидну Послідовність №1, або Послідовність №7, або Послідовність №9, або Послідовність №14, а другий праймер має нуклеотидну Послідовність №2, або Послідовність №8, або Послідовність №10, або Послідовність №16. За додатковим прикладом здійснення цього винаходу, кожен із цих праймерів, перший та другий, розпізнає нуклеотидну послідовність, яка становить частину нуклеотидної Послідовності №5. Подані нижче фігури призначені для пояснення винаходу. Фіг.1. Карта бінарного вектора PV-BVGT08. Фіг.2. Ідентифікація Н7-1 шляхом аналізу із застосуванням полімеразно-ланцюгової реакції. Аналізу були піддані зразки ДНК 18 рослин. Негативний контроль: ДНК нетрансформованого цукрового буряку; позитивний контроль: ДНК оригінального трансформанта Н7-1. Фіг.3. Ідентифікація події Н7-1 за допомогою мультиплексної полімеразно-ланцюгової реакції і розрізнення трансгенної події Н7-1 і нетрансгенних рослин. Аналізу були піддані зразки ДНК 54 рослин. Фіг.4. Інсерційний сегмент pFMV-ctp2-CP4EPSPS-E9-3' із сайтами розщеплення рестриктазами Hindlll, Xbal, Clal, PstI i BamHI. Фіг.5. Аналіз інсерційного сегменту/кількості копій події Н7-1. Для саузерн-блотингу, 10мкг ге 9 номної ДНК Н7-1 розщеплювали PstI, Hindlll, Xbal, Clal і BamHI (стовпчики 3-7). Нетрансформовану геномну ДНК, як негативний контроль, розщеплювали BamHI (стовпчик 8). Плазміду PV-BVGT08, як позитивний контроль, розщеплювали BamHI. Стовпчики 2 та 9 зображають маркери розміру. Блот зондували 32Р-міченою кодувальною ділянкою CP4-EPSPS. Згаданий зонд являє собою внутрішню послідовність гена CP4-EPSPS, що охоплює пари нуклеотидів 447-1555. Фіг.6. Саузерн-блотинг події Н7-1 для визначення цілісності кодувальної ділянки ctp2-CP4EPSPS. 10мкг геномної ДНК Н7-1, нетрансгенної контрольної ДНК та нетрансгенної контрольної ДНК, змішаної з PV-BVGT08, розщеплювали Xbal та Hindlll/BamHI. Блот зондували 32Р-міченим PCRфрагментом CP4-EPSPS. Фіг.7. Саузерн-блотинг події Н7-1 для визначення цілісності промоторної ділянки. 10мкг геномної ДНК Н7-1, нетрансгенної контрольної ДНК та нетрансгенної контрольної ДНК, змішаної з PVBVGT08, розщеплювали Hindlll, Xbal та Sacl/Xhol. Блот зондували 32Р-міченим промоторним фрагментом (НіndIII)(=послідовність PV-BVGT08, 79728583п.н.) або касетою повний промотор-ctp2-CP4EPSPS-E9-3' (РmеІ/ХnоІ)(=послідовність PVBVGT08, 7935-2389п.н.). Фіг.8. Саузерн-блотинг події Н7-1 для визначення цілісності ділянки поліаденілування. 10мкг геномної ДНК Н7-1, нетрансгенної контрольної ДНК та нетрансгенної контрольної ДНК, змішаної з PV-BVGT08, розщеплювали EcoRI/PstI, Xbal, Hindlll і PstI. Блот зондували 32Р-міченим фрагментом ділянки поліаденілування Е9-31' (ВаmНІ/ХhоІ)(=послідовність PV-BVGT08, 17022389п.н.). Фіг.9. Фрагменти, застосовані як зонди для визначення відсутності остовної векторної ДНК у події Н7-1. Фіг.10. Саузерн-блотинг події Н7-1 для визначення відсутності остовної векторної ДНК у події Н7-1. 10мкг геномної ДНК Н7-1, нетрансгенної контрольної ДНК та нетрансгенної контрольної ДНК, змішаної з PV-BVGT08, розщеплювали Xbal. Блоти зондували 32Р-міченими зондами, що охоплюють остов PV-BVGT08 у цілому (зонд 1-4). Фіг.11. Порівняння між PCR-фрагментами і послідовностями PV-BVGT08 на лівій граничній ділянці. Фіг.12. Порівняння між PCR-фрагментами і послідовностями PV-BVGT08 на правій граничній ділянці. Фіг.13. Аналіз геномної ДНК за межами правого зчленування інсерційного сегменту. Приблизно 50нг геномної ДНК події Н7-1 або нетрансгенної контрольної ДНК чи води застосовували для полімеразно-ланцюгових реакцій з комбінаціями праймерів Р1, де обидва праймери розташовані за межами інсерційного сегменту, та Р3, де один праймер знаходиться у межах інсерційного сегменту, а другий праймер лежить за його межами. Фіг.14. Аналіз геномної ДНК за межами лівого зчленування інсерційного сегменту. Приблизно 50нг геномної ДНК події Н7-1 або нетрансгенної контрольної ДНК чи води застосовували для полі 88760 10 меразно-ланцюгових реакцій з комбінаціями праймерів Р2, де обидва праймери розташовані за межами інсерційного сегменту, та Р4, де один праймер знаходиться у межах інсерційного сегменту, а другий праймер лежить за його межами. Фіг.15. Карта за потомством партій насіння Н7-1. Фіг.16. Саузерн-блотинг події Н7-1 для визначення того, чи стабільно інтегрується ДНК-вставка до геному. 10мкг геномних ДНК Н7-1 (оригінальний трансформант Н7-1-1995 і три потомства, від Н71-1996 до 1998) і нетрансгенні контрольні ДНК із різних джерел розщеплювали ВаmНІ, ХbаІ і HindlII. Блот зондували 32Р-міченим CP4-EPSPS зондом PV-BVGT08 (=447-1555п.н.). Цей винахід додатково визначається, виключно ілюстративним шляхом, посиланням на наведені нижче приклади. Нижче наведено перелік скорочень, що застосовуються: ~ °С Bidest приблизно градус за Цельсієм подвійно дистильована стерильна вода Вр пара(-и) нуклеотидів СТАВ цетилтриметиламонію бромід ДНК дезоксирибонуклеїнова кислота E.coli Escherichia coli EDTA етилендіамінтетраоцтова кислота Фіг. фігура год година HCI хлористоводнева кислота тис.п.н. тисяч пар нуклеотидів кг кілограм М, мМ мольний, мілімольний хв хвилини Na2HPO4/NaH2PO4 фосфат натрію NaCl хлорид натрію NaOH гідроксид натрію Nt нуклеотид PCR полімеразно-ланцюгова реакція пмоль пікомоль Rnase РНКаза об/хв обертів на хвилину ® RR Roundup Ready K.T. кімнатна температура SDS додецилсульфат натрію с секунда SEVAG хлороформ:ізоаміловий спирт (24:1) SSC стандартний цитратний фізіологічний розчин ТЕ буфер трисетилендіамінтетраоцтова кислота TRIS трис(гідроксиметил)амінометан Приклад 1 Ідентифікація події Н7-1 Цукровий буряк (Beta vulgaris) генотипу 3S0057 піддавали генетичній модифікації для експресії СР4-5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази або CP4-EPSPS, яка забезпечує стійкість до гербіциду гліфосату, а також застосовується як селектований маркер. Цю трансгенну лінію одержали шляхом Agrobacterium tumefaciensопосередкованої трансформації із застосуванням бінарного вектора PV-BVGT08. Між лівою та пра 11 вою граничною ділянками матричної ДНK вектора, що застосовувався для трансформації цукрового буряку, знаходяться такі послідовності: кодувальна ділянка, що складається з кодувальної послідовності перехідного пептиду хлоропластів EPSPS Arabidopsis thaliana (яка позначається як ctp2), сполучена з кодувальною послідовністю CP4EPSPS під регуляцією 35S-промотоpy вірусу мозаїки ранника (Scrophularia) (pFMV), і послідовність термінації транскрипції 3' гена rbcS-E9 Pisum sativum. Були застосовані такі методи: І. Екстракція ДНK Метод 1: Збирали свіже листя або іншу тканину (від 20мг до 100мг до 1,5мл пробірки) і додавали 400мкл екстракційного буфера (дивись нижче). Згадану тканину подрібнювали невеликим товкачиком. Суміш центрифугували впродовж 5с і інкубували від 30хв. до 60хв. при кімнатній температурі з подальшою стадією центрифугування при 13000об./хв. впродовж 1хв. Супернатант, що містив ДНK, виливали до нової 1,5мл пробірки і змішували з 320мкл ізопропанолу. Одержану суміш інкубували при кімнатній температурі впродовж 2хв. Після додання етанолу утворюється осад ДНK. Етанол зливали після центрифугування при 13000об./хв. вподовж 5хв. Одержаний зразок піддавали повітряному сушінню. Осад повторно розчиняли у 400мкл Н2О або ТЕ-буфера (дивись нижче). Екстракційний буфер (100мл): 20мл 5мл 5мл 2,5мл 67,2мл 1М TRIS (pH 7,5) 5M NaCl 0,5M EDTA 20% SDS H2 O ТЕ-буфер: 10мМ трис-НСІ (рН8,0) 1мМ EDTA Метод 2: Свіжий матеріал рослинного походження (від 20мг до 100мг) збирали до 1,5мл еппендорфівської пробірки і додавали 500мкл СТАВ-буфера (65°С, дивись нижче). Одержану суміш інкубували від 1год. до 1,5год. При температурі 65°С, після чого центрифугували впродовж 5с. Додавали 5мкл РНKази (10мг/мл). Суміш інкубували впродовж Концентрований розчин 1Μ TRIS-HCl рН8,3 1М KСl 100мМ дезоксиаденозин-5'-трифосфат (dATP) 100мМ дезоксицитидин-5'-трифосфат (dCTP) 100мМ дезокситимідин-5'-трифосфат (dTTP) 100мМ дезоксигуанозин-5'-трифосфат (dGTP) 100мМ MgCl2 вода для високоефективної рідинної хроматографії 88760 12 30хв. при температурі 37°С, після чого центрифугували впродовж 5с. Додавали 200мкл SEVAG. Після перемішування та центрифугування при 13000об./хв. впродовж 10хв. супернатант переносили до нової 1,5мл пробірки. Із згаданим супернатантом обережно змішували 1 об'єм ізопропанолу (приблизно 400мкл) з подальшим центрифугуванням при 13000об./хв. впродовж 10хв. Додавали 600мкл 70% етанолу. Одержаний осад промивали шляхом перевертання пробірки декілька разів. Суміш знову центрифугували при 13000об./хв. впродовж 2хв. Етанол обережно видаляли. Пробірку перевертали і спорожнювали на чистий папір. Одержаний зразок піддавали повітряному сушінню впродовж 15хв. Осад повторно розчиняли у 50мкл Н2О (дивись нижче). СТАВ-буфер: 1,4Μ NaCl 20мМ EDTA 100мМ трис-НСІ 2% (у відношенні маси до об'єму) СТАВ SEVAG: Хлороформ:ізоаміловий спирт (24:1) РНKаза-буфер: 10мМ трис, 15мМ NaCl, pH7,5 РНKаза А: 10мг РНKази/мл РНKаза-буфера (5мл подвійно дистильованої стерильної води+50мг РНKази А, аліквоти у 1,5мл пробірках, пробірки кип'ятити впродовж 30хв. при температурі 100°С, зберігати при температурі -20°С). Як правило, застосовували Метод 1. За цим методом можна екстрагували велику кількість зразків ДНK/день і якість ДНK є прийнятною. Метод 2 застосовували у разі, коли листовий матеріал був старішим або якщо виникали проблеми з якістю ДНK. Метод 2 є складнішим, потребує більше часу і дає нижчий вихід ДНK, хоча і більш високої якості. До кількісного визначення ДНK, як правило, не вдавались, а для проведення полімеразноланцюгової реакції застосовували, як правило, від 0,5мкл до 1мгл розчину екстрагованої ДНK. II. Полімеразно-ланцюгова реакція: Для полімеразно-ланцюгової реакції одержували 10х буферну суміш: буфер+dNTP (дезоксинуклеозидтрифосфат). Ця процедура має такий вигляд: Об'єм 3-10х концентрація буфера 100мкл 500мкл 20мкл 20мкл 20мкл 20мкл 150мкл 0,1Μ 0,5Μ 2мМ 2мМ 2мМ 2мМ 15мМ разом 1000мкл Кінцева концентрація реакційної суміші полімеразноланцюгової реакції 10мМ TRIS-HCl рН8,3 50мМ KСl 0,2мМ dATP 0,2мМ dCTP 0,2мМ dTTP 0,2мМ dGTP 1,5мМ MgCl2 13 88760 14 Полімеразно-ланцюгова реакція (25мкл): ДНК Праймер 1 Праймер 2 Taq-полімераза І Буфер 10х концентрації Вода 0,5мкл 1мкл (20пмоль) 1мкл (20пмоль) 0,2мкл (1Од, від фірми Oncor Appligene S.A., Heidelberg, Німеччина) 2,5мкл 18,8мкл III. Ідентифікація Н7-1 за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції Ідентифікацію Н7-1 здійснювали за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції із застосуванням праймерів, специфічних для події: Верхній праймер (Послідовність №1): H7-207U30: 5' ТТА АТТ ТТТ GCA GGC GAT GGT GGC TGT ТАТ 3' Нижній праймер (Послідовність №2): H7-841L30: 5' CAT ACG CAT TAG TGA GTG GGC TGT CAG GAC 3' Згаданий верхній праймер знаходиться за межами інсерційного сегменту і є частиною геномної ДНK цукрового буряка. Згаданий нижній праймер знаходиться у межах інсерційного сегменту гена CP4-EPSPS. Умови проведення полімеразно-ланцюгової реакції: 94°С, 4хв. Стадія 1 95°С, 30с Стадія 2а 55°С, 30с Стадія 2b 72°С, 2хв. Стадія 2с 72°С, 5хв. Стадія 3 4°С, впродовж ночі Стадія 4 реакція завершена Стадії 2а-с були повторені 34 рази. Очікуваним продуктом полімеразноланцюгової реакції є фрагмент ДНK (664п.н., Послідовність №13, дивись Фіг.2). IV. Ідентифікація Н7-1 за допомогою мультигоієксної полімеразно-ланцюгової реакції Для розрізнення нетрансгенних і трансгенних рослин (гомозиготних або гемі/гетерозиготних) вдавались до мультиплексної полімеразноланцюгової реакції з трьома різними праймерами. Були застосовані наведені нижче праймери: Н72 (Послідовність №14): 5' GCTCTGACACAACCGGTAAATGCATTGGCC 3' H7S2 (Послідовність №15): 5' GAC CCATAGTTTGATTTTAAGCACGACATG 3' H7R2 (Послідовність №16): 5' GCAGATTCTGCTAACTTGCGCCATCGGAG 3' Умови проведення полімеразно-ланцюгової реакції: 94°С, 2хв. Стадія 1 94°С, 1с Стадія 2а 60°С, 45с Стадія 2b 72°С, 90с Стадія 2с 72°С, 5хв. Стадія 3 4°С, впродовж ночі Стадія 4 реакція завершена Стадії 2а-с були повторені 34 рази. Нетрансгенні рослини демонструють лише один PCR-фрагмент (приблизно 350п.н.). Гомозиготні трансгенні рослини демонструють один фра гмент (приблизно 1,042тис.п.н.). гетерозиготні рослини демонструють обидва фрагменти (дивись Фіг.3). Приклад 2 Визначення характеристик події Н7-1 Молекулярний аналіз було здійснено з метою визначення характеристик інтегрованої ДНK, присутньої у події Н7-1. Зокрема, визначили кількість інсерційних сегментів (кількість інтеграційних сайтів у межах геному цукрового буряку), кількість копій (кількість фрагментів ДНK у межах одного локусу), цілісність вставленої кодувальної ділянки та її регуляційних елементів, послідовність термінації транскрипції промотору pFMV та Е9-3', відсутність остовних послідовностей вектора, що застосовувався для трансформації та стабільного успадковування інсерційного сегменту. Додатково були ідентифіковані послідовності, що фланкують ДНK-вставку. Характеристики ДНK-вставки трансформаційної події Н7-1 цукрового буряку визначали із застосуванням саузерн-блотингу, полімеразноланцюгової реакції та зворотної полімеразноланцюгової реакції. Були включені позитивні та негативні контролі (PV-BVGT08, нетрансгенна рослинна ДНK), які піддавали такій самій обробці, що і експериментальну речовину (Н7-1). ДНК була виділена з партії №74903Н рослин події Н7-1, які були вирощені у 1997 році. ДНK також виділили з оригінального трансформанту H71/3S0057 (=6401VH) у 1995 році та з трьох додаткових потомств, які одержали у 1996, 1997 та 1998 роках. (Н7-1/64801Н, Н7-1/74922Н і H7-1/83002S). Нетрансгенна лінія 3S0057 цукрового буряку була використана як контроль. На додаток до цього, лінії 5R7150, 8K1180 і 6S0085 цукрового буряку були використані як негативний контроль. Ці лінії є звичайними нетрансгенними лініями, що застосовуються для селекції звичайного цукрового буряку. Для трансформації були застосовані еталонні речовини, що відповідають плазміді PV-BVGT08. Плазмідну ДНK і ДНK контрольної лінії цукрового буряку змішували, розщеплювали рестриктазою і відділяли електрофорезом у гелі агарози паралельно з експериментальними речовинами. Згадану плазміду було використано як маркер розміру очікуваного фрагменту та як позитивний гібридизаційний контроль. Плазмідну ДНK змішували з геномною ДНK рослин із концентрацією, що представляла менше 1 копії елементу, що піддавався аналізу, для демонстрації чутливості саузерн-блотингу (-10мкг геномної ДНK і ~28пг ДНK PV-BVGT08). Для визначення розміру застосовували маркер молекулярного розміру RAOUL™ (ONCOR/Appligene, номер за каталогом 160673). 15 Виділення ДНK: Рослинну тканину (від 1г до 3г сирої маси) з партії №74903Н події Н7-1 подрібнювали у рідкому азоті до стану тонкоподрібненого порошку за допомогою ступки та товкачика. Одержаний порошок переносили до 50мл пробірки (Oakridge) і додавали 7,5мл попередньо підігрітого (60°С) СТАВбуфера (2% СТАВ, 100мМ трис-НСІ, 20мМ EDTA (рН8,0), 1,4Μ NaCl і 0,2% меркаптоетанолу). Зразки інкубували при температурі 65°С впродовж приблизно 30хв. із періодичним перемішуванням. До зразків додавали однаковий об'єм (8мл) суміші хлороформу:ізоамілового спирту (24:1 у об'ємному відношенні, кімнатна температура). Суспензію перемішували шляхом перевертання пробірки, і дві фази відділяли центрифугуванням (10хв., 9000об/хв.). Водну фазу переносили до нової 50мл пробірки (Oakridge) з подальшим осадженням ДНK шляхом додання 5мл ізопропанолу. ДНK осаджували центрифугуванням (2хв., 9000об/хв.), і супернатант видаляли. Осаджену ДНK інкубували з промивним розчином (76% етанол і 10мМ амонію ацетат) впродовж приблизно 20хв. Після центрифугування та декантації супернатанту, ДНK піддавали сушінню під вакуумом і повторно розчиняли у ТЕ (рН8,0) при температурі 4°С впродовж ночі. Як альтернативний метод, ДНK виділяли за допомогою набору DNeasy Plant Maxi Kit від фірми Qiagen (Dusseldorf, Німеччина, номер за каталогом 68163). Виділення ДНK здійснювали за інструкцією виробника. Як додатковий альтернативний метод, ДНK виділяли за допомогою набору DNeasy Plant Mini Kit від фірми Qiagen (Dusseldorf, Німеччина, номер за каталогом 69103). Виділення ДНK здійснювали за інструкцією виробника. Кількісне визначення і розщеплення ДНK рестриктазами: Кількісне визначення ДНK здійснювали за допомогою спектрофотометра LKB Biochrom (УФ/видима частина спектру) (Amersham Pharmacia, Freiburg, Німеччина) або, за альтернативним варіантом, кількісне визначення ДНK здійснювали після електрофорезу у гелі агарози шляхом сканування ДНK за допомогою програми RELPscan (MWG-Biotech, Ebersberg, Німеччина). Як калібраційний стандарт, було застосовано набір High DNA Mass Ladder від фірми Gibco/Life Technologies (Karlsruhe, Німеччина) (номер за каталогом 10496-016). Рестриктази одержували від фірми Boehringer Mannheim (Mannheim, Німеччина), від фірми Stratagene (Amsterdam, Нідерланди) або від фірми New England Biolabs (Frankfurt, Німеччина) і застосовували за інструкцією виробника. Одержання ДНK-зондів: ДНК PV-BVGT08 виділяли з культур Е.соlі. Матриці зондів, гомологічні кодувальній ділянці CP4EPSPS, 35S-промоторy, ділянці поліаденілування Е9-3', касеті 35S-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3' і остовним ділянкам, одержували шляхом розщеплення відповідними рестриктазами з подальшим відділенням шляхом електрофорезу у гелі агарози або полімеразно-ланцюговою реакцією. Одержані продукти очищали за допомогою набору Gene Clean II 88760 16 Kit від фірми ΒΙΟ 101 (La Jolla, Каліфорнія). Мічення зондів (25пг) 32P-dCTP або 32P-dATP здійснювали за допомогою системи мічення ДНK Megaprime™ від фірми Amersham-Pharmacia Biotech Europe (Freiburg, Німеччина). Саузерн-блотинг: Зразки ДНK, оброблені рестриктазами, відділяли шляхом електрофорезу у гелі агарози впродовж ~15год. при ~35В. Після фотографування гелю, ДНK депуринізували шляхом просочення гелю впродовж 15хв. у 0,25 Μ розчині НСl, денатурували шляхом інкубування гелю впродовж 30хв. у денатураційному розчині (0,5Μ NaOH, 1,5Μ NaCl) із постійним обережним перемішуванням і, врештірешт, нейтралізували шляхом просочення впродовж 2год. у декількох об'ємах розчину (2Μ NaCl і 1Μ трис-НСІ, рН5,5). ДНK із гелів агарози переносили на нейлонові мембрани Hybond-N™ (Amersham Pharmacia Biotech Europe, Freiburg, Німеччина) за допомогою блотера PosiBlot Pressure Blotter від фірми Stratagene за методикою виробника. Після просочення фільтра впродовж 15хв. у 2´SSPE (20´SSPE: 3,6Μ NaCl, 20мМ EDTA, 0,2Μ NaH2PO4/Na2HPO4, рН7,4), ДНK фіксували на мембрані шляхом освітлення УФ-випроміненням (Transilluminator Pharmacia, Freiburg, Німеччина) впродовж 0,1хв. і нагрівання у вакуумній печі впродовж 1год. при температурі 80°С. Блоти піддавали попередній гібридизації впродовж 4год. у водному розчині 50% формаміду, 5´SSC, 0,1% лаурилсаркозину, 0,2% SDS та 2% блокувального реактиву (Boehringer Mannheim, Німеччина, номер за каталогом 1096176). Гібридизацію із зондом, міченим радіоактивною міткою, здійснювали у свіжому розчині для попередньої гібридизації впродовж 16-18год. при температурі 42°С. Після гібридизації мембрани промивали впродовж 5хв. у 2´SSC при температурі 42°С, впродовж 20хв. у 2´SSC, 1% SDS при температурі 65°С і впродовж двох періодів тривалістю 15хв. у 0,2´SSC, 0,1% SDS при температурі 68°С. Авторадіографічні зображення блотів одержали шляхом експонування блотів із застосуванням плівки Kodak Biomax MST™ у поєднанні з підсилювальним екраном Kodak Biomax MS™. Ідентифікація 5' і 3' геномних Фланкуючих послідовностей: Зчленування трансгена з геномною ДНK рослини ідентифікували за допомогою зворотної полімеразно-ланцюгової реакції. Геномну ДНK очищали як описано вище. Приблизно 1мкг ДНK розщеплювали у окремих реакціях рестрикційними нуклеазами TaqI, Alul, NdcIII або Rsal. Фрагменти розщепленої ДНK повторно літували Т4-лігазою впродовж ночі з подальшим проведенням полімеразно-ланцюгової реакції. За допомогою програми аналізу праймерів OLIGO® від фірми NBI (National Biosciences, Inc., Plymouth, Мічиган) одержали різні комбінації зворотних праймерів. Фрагменти, одержані шляхом ампліфікації за допомогою зворотної полімеразно-ланцюгової реакції, відділяли електрофорезом у гелі, вирізали з гелю і очищали за допомогою набору Gene Clean II™. Очищені фрагменти клонували у векторі pCR®2.1 за допомогою набору для клонування 17 ТОРО™ТА cloning® Kit від фірми Invitrogen (Groningen, Нідерланди). Інсерційні сегменти піддавали секвенуванню за допомогою MWG-Biotech (Ebersberg, Німеччина). Аналіз одержаних даних секвенування здійснювали за допомогою програми для аналізу ДНK Мас Molly® Tetra DNA analysis software (Soft Gene GmbH, Bochold, Німеччина). Аналіз за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції: Геномну ДНK одержали за допомогою набору Plant DNAeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Dusseldorf, Німеччина) за інструкціями виробника. Приблизно 50нг геномної ДНK було використано для проведення полімеразно-ланцюгової реакції. Реакційні суміші піддавали обробці при температурі 95°С впродовж 30с, 55°С впродовж 30с і 72°С впродовж 2хв. впродовж 35 циклів. Полімеразно-ланцюгові реакції здійснювали у термоблоці для проведення реакцій РТС200 cycler (Biozym, Oldendorf, Німеччина). Продукти полімеразно-ланцюгових реакцій аналізували шляхом електрофорезу у гелі агарози. 1. Кількість інсерційних сегментів: Для Н7-1 визначали кількість інсерційних сегментів, тобто кількість сайтів інтеграції трансгенної ДНK до геному цукрового буряку. Для визначення кількості інсерційних сегментів, геномну ДНK розщеплювали рестриктазами Hindlll, Xbal і BamHI. Як негативний контроль, ДНK нетрансформованої контрольної рослини, що представляла той самий генетичний фон, розщеплювали за допомогою Hindlll. Як позитивний контроль було застосовано ДНK трансформаційного вектора (PV-BVGT08). Xbal і BamHI здійснюють розщеплення PVBVGT08 лише один раз і не здійснюють розщеплення усередині міченого зонда CP4-EPSPS, що застосовувався (дивись Фіг.4). Hindlll розщеплює PV-BVGT08 тричі, але усі три сайти знаходяться за межами зонда і на тому самому боці, 5', відносно зонда. Таким чином, кожен фермент повинен вивільнити один фрагмент ДНК, який буде гібридизуватись із зондом CP4-EPSPS і буде містити частину ДНK-вставки і прилеглу геномну ДНK рослини. Кількість виявлених фрагментів вказує на кількість інсерційних сегментів, присутніх у події. Результати представлені на Фіг.5. Після розщеплення ферментами Hindlll, Xbal або BamHI, було виявлено лише один гібридизаційних фрагмент, відповідно. Фрагменти довжиною 5,2тис.п.н. унаслідок розщеплення Hindlll (стовпчик 4), 4тис.п.н. унаслідок розщеплення Xbal (стовпчик 5) і приблизно 11тис.п.н. унаслідок розщеплення BamHI (стовпчик 7) показали, що трансформант Н7-1 представляє собою одну інтеграційну подію (Фіг.4). Сильний сигнал у стовпчику 1 представляє лінеаризовану плазміду PV-BVGT08. Додаткові слабкі сигнали мають відношення до невеликих кількостей нерозщепленого PV-BVGT08 або до неспецифічних гібридизаційних фонових сигналів. 2. Кількість копій Теоретично, один інтеграційних сайт може складатись із більше ніж однієї копії ДНK-вставки. Однак це було неможливим унаслідок розміру фрагментів за даними рестрикційного аналізу, наведеними вище. Якщо б у Н7-1 було більше однієї 88760 18 копії ДНK-вставки, були б виявлені додаткові фрагменти. Це було підтверджено також шляхом розщеплення рестриктазою Pstl. PstI здійснює подвійне розщеплення у межах лівої та правої граничних послідовностей. Один із рестрикційних сайтів знаходиться у межах кодувальної ділянки CP4EPSPS, завдяки чому після розщеплення із зондом CP4-EPSPS можна було б очікувати два гібридизаційні фрагменти. Один з очікуваних фрагментів відповідає внутрішньому фрагменту довжиною приблизно 1,2тис.п.н. Другий фрагмент повинен бути граничним фрагментом. Знову ж таки, якби існувало більше однієї копії, повинні були б виявитись додаткові фрагменти. Однак результати показують, що Pstl розрізає ДНK, як очікувалось. Було виявлено внутрішній фрагмент довжиною 1,2тис.п.н. і лише один додатковий фрагмент довжиною приблизно 4,9тис.п.н. (Фіг.5: стовпчик 3, Фіг.4). Як додатковий внутрішній контроль, ДНK розщеплювали за допомогою СlаІ (Фіг.5: стовпчик 6, Фіг.4). Як очікувалось, гібридизувався один фрагмент довжиною 2,4тис.п.н., оскільки СlаІ здійснює розщеплення двічі, але за лівою та правою межами фрагменту CP4-EPSPS, що застосовувався. Цей результат також є доказом цілісності інтегрованого фрагменту ДНK і узгоджується з наведеними нижче результатами. Наслідком гібридизації плазміди PV-BVGT08 із фрагментом CP4-EPSPS став, як очікувалось, сигнал довжиною 8,6тис.п.н. (Фіг.5: стовпчик 1) (PVBVGT08=8590п.н.). Друга менша дуже слабка смуга обумовлена неповною рестрикцією PV-BVGT08. У цілому, експерименти показують, що трансформована лінія Н7-1 цукрового буряку містить у рослинному геномі одноколійну інтеграцію матричної ДНK PV-BVGT08. 3. Цілісність кодувальних ділянок: Цілісність касети гена CP4-EPSPS відносно окремих елементів (промотор pFMV, кодувальна ділянка ctp2-CP4-EPSPS і нетрансльована ділянка Е9-3') визначали шляхом розщеплення ферментами Hindlll для pFMV, Hindlll плюс BamHI для ctp2-CP4-EPSPS і EcoRI плюс PstI для нетрансльованої ділянки Е9-3'. Додаткові експерименти були проведені з Sacl плюс Xhol для ділянки pFMV-ctp2CP4-EPSPS і для ділянки Е9-3'. Плазмідну ДНK, змішану з нетрансгенною ДНK цукрового буряку і саму нетрансгенну ДНK цукрового буряку розщеплювали тими самими ферментами, як позитивні і негативні контролі, відповідно. Ці ферменти розщеплюють у межах передбачуваної ДНK-вставки, між правою та лівою межами матричної ДНK (дивись плазмідну карту на Фіг.1), тому, якщо відповідні елементи є інтактними, розмір гібридизованих фрагментів у ДНK Н7-1 і ДНK PV-BVGT08 повинен бути ідентичним. Як додатковий контроль, ДНK розщеплювали за допомогою Xbal. Xbal здійснює одне розщеплення між промотором та кодувальною ділянкою ctp2-CP4-EPSPS. Таким чином, можна очікувати фрагмент довжиною 8,6тис.п.н. у разі ДНK PVBVGT08 і, у разі Н7-1, граничний фрагмент, який різниться за розміром, порівняно з фрагментом PV-BVGT08. Результати показані на Фіг.6, 7 і 8. 19 Фіг.6. Шляхом розщеплення Hindlll і ВаmІll вивільнили ген CP4-EPSPS і блот зондували фрагментом CP4-EPSPS, який одержали за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції. Негативний контроль (стовпчик 6) не показав жодної гібридизаційної смуги. Як геномна ДНK події Н7-1, так і плазміда PV-BVGT08, змішана з нетрансгенною ДНK, продукували фрагмент довжиною приблизно 1,7тис.п.н., який відповідає очікуваному розміру. Наслідком розщеплення ХbаІ був очікуваний фрагмент довжиною 8,6тис.п.н. лінеаризованого PVBVGT08. Для події Н7-1, наслідком розщеплення виявився граничний фрагмент довжиною приблизно 4,0тис.п.н. (дивись також Фіг.4 і 5). І знову ж таки, негативний контроль не показав жодного сигналу. Фіг.7. Шляхом розщеплення Hindlll вивільнили промотор вірусу мозаїки ранника і блот зондували фрагментом промотору, який одержали за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції. Негативний контроль (стовпчик 5) не показав жодного гібридизаційного сигналу. Як геномна ДНK події Н7-1, так і плазміда PV-BVGT08, змішана з нетрансгенною ДНK, продукували фрагмент довжиною приблизно 0,6тис.п.н. Цей фрагмент відповідає очікуваному розміру (стовпчик 4 і 6) промотору. Наслідком розщеплення ХbаІ був очікуваний фрагмент довжиною 8,6тис.п.н. лінеаризованого PV-BVGT08 і, для події Н7-1, лівий граничний фрагмент довжиною приблизно 1,3тис.п.н. (стовпчик 1 і 3). Цей фрагмент довжиною 1,3тис.п.н. є також додатковим доказом того, що подія Н7-1 містить лише одну копію трансгена. І знову ж таки, негативний контроль (стовпчик 2) не показав жодного сигналу. Шляхом розщеплення Sacl/Xhol вивільнили промотор разом із кодувальною ділянкою CP4EPSPS і ділянкою поліаденілування. Наслідком гібридизації з касетою повний промотор-сtр2-СР4ЕР8Р8-сигнал поліаденілування (фрагмент Pmcl/Xhol) було одержання очікуваних фрагментів промотор-ctp2-CP4-EPSPS (2,3тис.п.н.) і сигналу поліаденілування (0,7тис.п.н.) як у разі ДНK PVBVGT08, змішаної з нетрансгенною ДНK, так і геномної ДНK Н7-1 (стовпчик 9 і 11). Фіг.8. Шляхом розщеплення PstI і EcoRI вивільнили сигнал поліаденілування Е9-3', і блот зондували фрагментом сигналу поліаденілування. Негативний контроль (стовпчик 3) не показав жодної гібридизаційної смуги. Як плазміда PVBVGT08, змішана з нетрансгенною ДНK, так і геномна ДНK події Н7-1 продукували фрагмент довжиною приблизно 0,6тис.п.н., який відповідає очікуваному розміру. Наслідком розщеплення ХbаІ був очікуваний фрагмент довжиною 8,6тис.п.н. лінеаризованого PV-BVGT08 і, для події Н7-1, граничний фрагмент довжиною приблизно 4,0тис.п.н. Шляхом розщеплення PstI вивільнили сигнал поліаденілування Е9-3' у поєднанні з частиною 3' (0,5тис.п.н.) кодувальної ділянки CP4-EPSPS. Одержаний фрагмент (1,2тис.п.н.) виявляли як очікуваний як з геномною ДНK Н7-1, так і з ДНK PV-BVGT08. Шляхом розщеплення Hindlll одержали фрагмент (8,0тис.п.н.) лінеаризованого PV-BVGT08 88760 20 мінус фрагмент промотору (стовпчик 13) і, у разі Н7-1, граничний фрагмент довжиною 5,2тис.п.н. (стовпчик 11). Один фрагмент (5,2тис.п.н.) розщеплення Hindlll і один фрагмент (4,0тис.п.н.) розщеплення ХbаІ також є додатковим доказом того, що подія Н7-1 містить лише одну копію ДНK-вставки. І знову ж таки, негативні контролі не показали жодного сигналу. У цілому, результати блотів доказують, що усі елементи перенесеної ДНK є інтактними і що подія Н7-1 містить одну інтактну кодувальну ділянку CTP2-CP4-EPSPS з її регуляційними елементами, промотор pFMV і послідовність термінації транскрипції Е9-3'. 4. Аналіз з метою виявлення остовних фрагментів Остовна ділянка Ті-плазміди визначається, як ділянка за межами матричної ДНK, обмежена лівою і правою граничними послідовностями, яка складається з оrі генів і селекційних генів для бактеріальної реплікації і бактеріальної селекції і яка, як правило, не переноситься до рослинного геному Agrobacterium-опосередкованою трансформацією. Для підтвердження відсутності основної векторної ДНK у події Н7-1, геномну ДНK Н7-1 з нетрансформованого контролю і геномну ДНK Н71, змішану з ДНK PV-BVGT08, розщеплювали рестриктазою ХbаІ і зондували трьома зондами, що перекриваються, які одержали за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції, що охоплювали остовну послідовність у цілому. Четвертий зонд складається з цілого остову у одному фрагменті. Зонди, що застосовувались, представляють остовну послідовність (дивись Фіг.9): 1: 2730-5370п.н. 2: 5278-6419п.н. 3: 6302-7851п.н. 4: 2730-7851п.н. Фіг.10 показує результати саузерн-блотингу. Стовпчики 6, 10, 14 і 18: гідролізат геномної ДНK Н7-1, зондований остовними фрагментами цілого остову, не показав жодної гібридизаційної смуги. Лише стовпчики 4, 8, 12, 16 і 20: геномна ДНK Н71, змішана з ДНK PV-BVGT08, показала смуги 8,6тис.п.н., як очікувалось. Згадані смуги представляють лінеаризовану ДНK PV-BVGT08. Стовпчики 2 і 4: геномна ДНK Н7-1 і геномна ДНK Н7-1, змішана з PV-BVGT08, гібридизовані з фрагментом CP4-EPSPS, показали гібридизаційні сигнали. Смуга 4тис.п.н. у стовпчику 2 представляє правий граничний фрагмент, дві смуги стовпчика 4 представляють знову ж таки правий граничний фрагмент (4,0тис.п.н.) і лінеаризовану плазміду PV-BVGT08 (8,6тис.п.н.). Обидві смуги мають однакову інтенсивність. Це чітко вказує на те, що концентрація доданої ДНK PV-BVGT08 є порівнянною з концентрацією елементу CP4EPSPS у ДНK Н7-1. Концентрація застосованої плазмідної ДНK є еквівалентною 0,5 копії. Якби до геному Н7-1 були інтегровані остовні послідовності, були б виявлені чіткі сигнали. Ці результати підтверджують, що Н7-1 не містить жодної остовної послідовності, що виявляється, тієї плазміди, яка була застосована для трансформації. Ці результати були також підтверджені 21 даними аналізу 5' і 3' геномних фланкуючих ділянок (дивись нижче). 5. Ідентифікація 5' і 3' геномних фланкуючих послідовностей Agrobacierium-опосерелкована трансформація, як правило, веде до інтеграції усіх послідовностей до рослинного геному між лівою і правою границями. 5' і 3' кінцеві ділянки інтегрованої плазмідної ДНK повинні знаходитись у межах або поблизу від лівої або правої граничної послідовностей, відповідно. Таким чином, для ідентифікації цих ділянок було застосовано зворотну полімеразно-ланцюгову реакцію. Клоновані продукти полімеразно-ланцюгової реакції секвенували і дані секвенування порівнювали з послідовністю PVBVGT08. Фіг.11 показує порівняльний аналіз послідовності фрагменту, клонованого за допомогою зворотної полімеразно-ланцюгової реакції (D1U.RPT) (=геном Н7-1, верхня послідовність), одержаної з праймерами для аналізу лівої граничної ділянки, з послідовністю PV-BVGT08 (нижня послідовність). Порівняння обох послідовностей показало, що гомологія припинялась точно у межах граничної послідовності. Фіг.12 показує порівняльний аналіз послідовності фрагменту, клонованого за допомогою зворотної полімеразно-ланцюгової реакції (B3UNI.RPT) (=геном Н7-1, верхня послідовність), одержаної з праймерами для аналізу правої граничної ділянки, з послідовністю PV-BVGT08 (нижня послідовність). Порівняння обох послідовностей показало, що гомологія припинялась вже за 18 нуклеотидів перед гранічною послідовністю. В цілому, це є чітким підтвердженням правильної інтеграції згаданої послідовності між лівою та правою межами Ті-плазміди PV-BVGT08. Послідовність припинялась всередині або безпосередньо перед межами. Ці дані підтверджують результати остовного аналізу, які полягали у тому, що до геному Н7-1 за межами граничних ділянок не були інтегровані жодні послідовності остову. Для визначення того, чи є фланкуючі послідовності на правому або лівому боці інсерційного сегменту події Н7-1 цукрового буряку інтактними рослинними геномними послідовностями, здійснили зворотну полімеразно-ланцюгову реакцію з комбінаціями праймерів Р1, Р2, РЗ і Р4. Праймери комбінацій праймерів Р1 і Р2 знаходяться за межами інсерційного сегменту. Якщо ДНK інсерційного локусу у межах події Н7-1 є ідентичною ДНK нетрансформованого контролю, наслідком полімеразно-ланцюгової реакції повинні бути два PCR-фрагменти, що представляють результат синтезу двох комбінацій праймерів. Праймери комбінацій праймерів Р3 і Р4 конструювались таким чином, що один із відповідних праймерів знаходиться усередині інсерційного сегменту CP4-EPSPS, а другий праймер знаходиться за межами згаданого інсерційного сегменту, у межах геномної ДНK рослини. Завдяки цьому, полімеразно-ланцюгова реакція повинна дати фрагменти лише ДНK події Н7-1. Дані секвенування зворотною полімеразноланцюговою реакцією у поєднанні з даними векто 88760 22 ра PV-BVGT08 дають послідовність, що включає інсерційний сегмент Н7-1 (послідовність PVBVGT08), праву та ліву ділянки зчленування і додаткову ДНK цукрового буряку (Послідовність №5). Для ідентифікації зчленувань трансгена з геномною ДНK рослини (ідентифікація специфічності події) і ділянок геномної ДНK з лівого та правого боків інсерційного сегменту, були застосовані такі комбінації праймерів: Комбінація Р1 (праймер для аналізу геномної ДНK за межами правої граничної ділянки, Послідовність №18, Послідовність №19): Верхній праймер: 5' CGG ТАА ATG CAT TGG ССТ TTG ТТ Нижній праймер: 5' CAC CCA GAT ССС ААТ ААА АСС GTA AT Очікуваний продукт полімеразно-ланцюгової реакції: 241п.н. Комбінація Р2 (праймер для аналізу геномної ДНK за межами лівої граничної ділянки, Послідовність №20, Послідовність №21): Верхній праймер: 5' ААА TGG TTG TAG ATA ААТ AAG GAA АТС А Нижній праймер: 5' АСА TGT TTG AGC ACT СТТ СТТ GT Очікуваний продукт полімеразно-ланцюгової реакції: 377п.н. Комбінація Р3 (праймер для аналізу зчленування трансгена з геномною ДНК рослини, Послідовність №7, Послідовність №8): Верхній праймер: 5' ATG CAT TGG ССТ TTG ТТТ TTG AT Нижній праймер: 5' TGT CGT TTC CCG ССТ ТСА G Очікуваний продукт полімеразно-ланцюгової реакції: 288п.н. (Послідовність №11). Комбінація Р4 (праймер для аналізу зчленування трансгена з геномною ДНК рослини, Послідовність №9, Послідовність №10): Верхній праймер: 5' CGC TGC GGA CAT СТА CAT ТТТ TGA AT Нижній праймер: 5' AGT ТАА СТТ ТСС ACT TAT CGG GGC ACT G Очікуваний продукт полімеразно-ланцюгової реакції: 751п.н. (Послідовність №12). При проведенні експериментів із застосуванням полімеразно-ланцюгової реакції з ДНK події Н7-1 і з ДНK нетрансгенної контрольної рослини із застосуванням комбінації праймерів Р3, одержали лише фрагмент ДНK події Н7-1. У протилежність до цього, при проведенні експериментів із застосуванням полімеразно-ланцюгової реакції з комбінацією праймерів Р1, гомологічною послідовностям за межами інсерційного сегменту, одержали фрагменти як ДНK події Н7-1, так і нетрансгенної контрольної ДНK. Дивись ці результати на Фіг.13. Результати вказують на те, що послідовність, що знаходиться поряд із правим зчленуванням інсерційного сегменту, є присутньою у трансгенній ДНK події Н7-1 і у ДНK нетрансгенних рослин. Можна зробити висновок, що ця ДНK, за межами інсерційного сегменту події Н7-1, є нетрансгенною геномною ДНK. При проведенні експериментів із застосуванням полімеразно-ланцюгової реакції з ДНK події 23 Н7-1 і з ДНK нетрансгенної контрольної рослини із застосуванням комбінації праймерів Р4, яка має один із праймерів, розміщений всередині інсерційного сегменту CP4-EPSPS, одержали лише фрагмент ДНK події Н7-1. У протилежність до цього, при проведенні експериментів із застосуванням полімеразно-ланцюгової реакції з комбінацією праймерів Р2, гомологічною послідовностям за межами інсерційного сегменту, одержали фрагменти як ДНK події Н7-1, так і нетрансгенної контрольної ДНK (Фіг.14). Результати вказують на те, що послідовність, що знаходиться поряд із лівим зчленуванням інсерційного сегменту, є присутньою як у трансгенній ДНK події Н7-1, так і у ДНK нетрансгенних рослин. Можна зробити висновок, що ця ДНK, за межами лівого зчленування, є нетрансгенною геномною ДНK. У цілому, можна стверджувати, що послідовності за межами інсерційного сегменту події Н7-1 цукрового буряку є ідентичними послідовностям, присутнім у нетрансгенних рослин. Можна зробити висновок, що ці послідовності є рослинними геномними послідовностями, присутніми в батьківській клітинній лінії, що застосовувалась для трансформації, та в інших звичайних лініях цукрового буряку. 6. Генераційна стабільність Для демонстрації стабільності інтегрованої ДНK, оригінальну трансформаційну подію Н7-1 порівнювали з трьома потомствами (64801Н, 74922Н і 83002S; дивись Фіг.15) цієї лінії, які одержали шляхом самозапилення нетрансгенних ліній цукрового буряку. Оригінальну трансформовану лінію і три потомства одержали у 1995, 1996, 1997 і 1998 роках. Як контроль, аналізували чотири різні нетрансгенні лінії цукрового буряку (3S0057, 5R7150, 88760 24 8К1180, 6S0085). Усі ДНK розщеплювали ХbаІ, HindllI і ВаmНІ, відповідно, і гібридизували з міченим фрагментом СР4-EPSPS. Для демонстрації того, що уся матрична ДНK стабільно інтегрувалась до рослинного геному, усі стовпчики потомства Н7-1, розщеплені однаковою рестриктазою, повинні показати смугу однакового розміру. ДНК потомства Н7-1 стовпчиків 3-6 показують очікувані фрагменти: ДНK, розщеплена ВаmНІ, дала смуги приблизно 11тис.п.н., ДНK, розщеплена ХbаІ, дала фрагменти довжиною 4,0тис.п.н. і, у разі рестрикції Hindlll, одержали смуги 5,2тис.п.н. Усі смуги однієї рестрикції, але різних років, були ідентичними за своїм розміром. Усі нетрансгенні лінії не показали жодного сигналу (Фіг.16). Ці результати показують, що введена послідовність стабільно інтегрується до геномної ДНK і стабільно успадковується. СХЕМА ПОСЛІДОВНОСТЕЙ - довільний текст ПОСЛІДОВНІСТЬ №5 ДНK-вставка з 3' і 5' фланкуючими послідовностями ПОСЛІДОВНІСТЬ №6 Продукт полімеразно-ланцюгової реакції ПОСЛІДОВНІСТЬ №11 Продукт полімеразно-ланцюгової реакції ПОСЛІДОВНІСТЬ №12 Продукт полімеразно-ланцюгової реакції ПОСЛІДОВНІСТЬ №13 Продукт полімеразно-ланцюгової реакції ПОСЛІДОВНІСТЬ №17 Продукт полімеразно-ланцюгової реакції 25 88760 26 27 88760 28 29 88760 30 31 88760 32 33 88760 34 35 88760 36 37 88760 38 39 88760 40 41 88760 42 43 88760 44 45 88760 46 47 88760 48 49 88760 50 51 88760 52 53 88760 54 55 88760 56 57 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 88760 Підписне 58 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601