Спосіб визначення метаболічної стабільності тестованої речовини за метаболізму, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза

Реферат: Винахід належить до способу визначення метаболічної стабільності тестованої речовини за метаболізму, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), де тестована речовина є кандидатним лікарським засобом, а метаболічна стабільність тестованої речовини за метаболізму, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), невідома. UA 103300 C2 (12) UA 103300 C2 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У даному винаході наводяться способи визначення стабільності метиленаміну, метиленаміноподібних сполук або сполук, що містять метиленамінову групу, в присутності семікарбазид-чутливої аміноксидази (САО) або біологічної проби, що виявляє активність САО. Способи, що розкриваються, можуть бути адаптовані в аналітичному форматі для високопродуктивних скринінгових додатків. Рівень техніки Семікарбазид-чутливі аміноксидази (САО) широко поширені в тканинах, зокрема в кровоносних судинах, що вказує на важливу роль цього ферменту в інактивації метиленамінів в системі кровообігу (Lyles, Prog. Brain Res., 106: 293-303, 1995). Зусилля багатьох дослідників були, в основному, направлені на виявлення ендогенного ліганду для САО і пошук інгібіторів цього ферменту (Precious et al., Biochem. Pharmacol., 37: 707-713, 1988; Crosbie and Callingham, J. Neural Transm. Suppl., 41: 427-432, 1994; Elliot et al., Biochem. Pharmacol. 38: 1507-1515, 1989; Boomsma et al., Comp. Biochem. Physiol. З Toxicol. Pharmacol., 126: 69-78, 2000; Yraola et al., J. Med. Chem. 49: 6197-6208; WO 02/066669). В інших роботах вивчалися альтернативні фізіологічні функції САО. Наприклад, було встановлено, що САО, яку також називають білком судинної адгезії-1 (VAP-1), активується в умовах запалення і опосередковує зв’язування лімфоцитів (WO 98/53049). У даному винаході ферментативна активність САО використовується для вимірювання метаболічної стабільності випробуваних речовин в клітинах і біологічних зразках. Метаболічна стабільність випробуваних речовин стала найважливішим фактором розробки лікарських препаратів, тому в даному винаході вирішуються проблеми виявлення потенційних випробуваних речовин, що метаболізуються САО. Досягнення в хімії, молекулярній біології і високопродуктивній технології забезпечили програмам пошуку нових ліків можливість скринінгу величезної кількості сполук для визначення їх активності по відношенню до великого набору мішеней з метою виявлення сполук-прототипів. Потім ці прототипи досліджуються з точки зору додаткових критеріїв відбору, з тим щоб виявити оптимальні «подібні лікам» властивості (наприклад, достатня фізико-хімічна стабільність, розчинність, безпека, ефективність, фармакокінетика «in vivo»). Значні зусилля направлені на ідентифікацію і виключення сполук (або класів сполук), які, швидше за все, не мають «подібні лікам» властивості на ранніх етапах досліджень. Три основні причини, через яких ліки не проходять клінічні випробування, пов'язані з відсутністю ефективності, неприйнятними побічними ефектами і несприятливими показниками ВРМВ (всмоктування, розподіл, метаболізм, виведення). Тому підсумковий успіх тієї або іншої сполуки визначається не тільки її біологічною активністю і потенціалом, але також і її показниками ВРМВ/токсичності. У результаті в програми оптимізації прототипів включені скринінги для відбору ліків з бажаними показниками ВРМВ/токсичності для підвищення імовірності того, що нові сполуки-прототипи успішно виявлять себе в клінічних випробуваннях. Метаболізм молекул ліків являє собою основний процес виведення ліків з організму. Приймаючи до уваги широке поширення САО в багатьох відділах організму, автори вважають, що САО може бути важливим ферментом, який в значній мірі визначає потенційну метаболічну уразливість ліків. Тому в даному винаході використовуються способи визначення метаболічної стабільності випробуваних речовин, які зазнають впливу САО. Способи, направлені на визначення параметрів метаболізму ліків або іншої випробуваної речовини ферментами, задіяними в процесах біотрансформації, зокрема, САО, мають важливі застосування в сфері створення нових лікарських засобів. У ході досліджень in vitro сполука А (патент США 6977263 В) інкубувалася з плазмою різних видів організмів, в тому числі людини. Сполука А виявилася більш стабільною в плазмі людини в порівнянні з вівцею, морською свинкою, щуром і мишею аж до однієї години. Крім того, протягом майже 4 годин в присутності або за відсутності семікарбазиду не спостерігалося помітного метаболізму або розпаду з'єднання в плазмі людини. При цьому дані фармакокінетики за результатами «першого дослідження на людині» показали, що та ж сполука швидко метаболізувалася і в значно більшій мірі, ніж це було продемонстровано in vitro за допомогою плазмі людини і інших видів організмів. Подальші дослідження підтвердили, що метаболізм сполуки в організмі людини в основному забезпечується зв'язаною з мембраною САО. Ці дані показують, що розчинна САО, присутня в плазмі людини, не має такий самий рівень ферментативної активності і/або специфічності по відношенню до субстрату, як зв'язана з мембраною САО в фізіологічних умовах. Тому, як показали експерименти із сполукою А, вимірювання стабільності в людській плазмі не є показником стабільності САО в організмі людини, а тому має обмежене застосування при виборі фармацевтичних агентів як кандидатів для клінічних випробувань. Короткий опис фігур 1 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На фіг. 1 наведена амінокислотна послідовність для людської САО (Genbank номер доступу No. Q16853; SEQ ID NO: 1). На фіг. 2 наведена нуклеотидна послідовність, що кодує людську САО (Genbank номер доступу No. NM_00374; SEQ ID NO: 2). На фіг. 3 наведена хімічна структура сполуки А. Докладний опис винаходу Всі публікації, що цитуються в цьому документі, включені в нього за допомогою посилання. Якщо не вказано інакше, всі технічні і наукові терміни, що використовуються в цьому документі, мають таке ж значення, яке загальновідоме рядовим фахівцям в даній галузі, до якої належить даний винахід. Термінологія, що використовується в даному описі і прикладеній формулі винаходу, призначена виключно для характеристики конкретних варіантів здійснення винаходу, і під її використанням в описі не розуміється будь-якого обмеження винаходу. Під формами однини того або іншого слова розуміють форми множини, якщо в контексті не вказано явним чином інше. Наприклад, форми однини для загальних і конкретних термінологічних визначень також включають і форми множини. Крім того, посилання на той або інший агент можуть стосуватися суміші двох або більше агентів. Тому термін «агент» включає множину агентів, в тому числі суміші і/або їх енантіомери. Потрібно також вказати, що термін «або» зазвичай вживається в своєму основному значенні, в тому числі «і/або», якщо зміст не вказує явним чином інше. Також потрібно розуміти, що терміни «включає» і/або «що включає», який використовуються в даному описі, визначають наявність вказаних особливостей, стадій, елементів і/або компонентів, але не виключають наявності або додавання однієї або декількох інших особливостей, стадій, елементів, компонентів і/або їх груп. Крім того, відповідно до даного винаходу можуть використовуватися стандартні методики молекулярної біології, мікробіології і технологій рекомбінантної ДНК, а також аналітичних методик. Зміст таких методик детально викладений в літературі. Див., наприклад, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, DNA Cloning: А Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription and Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; В. Perbal, А Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); А Handbook of Bioanalysis and Drug Metabolism, G. Evans (2004). Одним з варіантів здійснення даного винаходу є спосіб ідентифікації метаболічної стабільності випробуваної сполуки, що визначається метаболізмом, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), і такий спосіб включає (a) культивування клітин, що експресують САО; (b) додавання випробуваної сполуки до клітин; (с) інкубування випробуваної речовини з клітинами протягом попередньо визначеного періоду часу; (d) вимірювання кількості випробуваної речовини, що залишається в присутності клітин, що містять експресовану САО, протягом попередньо визначеного періоду часу; і (е) зіставлення кількості випробуваної речовини за попередньо визначений період часу з кількістю випробуваної речовини в контрольній пробі, з тим щоб встановити значення, яке відображає метаболічну стабільність випробуваної речовини в присутності клітин, що містять експресовану САО. Фахівцям в даній галузі відомо, що для даного способу замість клітин може використовуватися клітинний лізат. Отже, одним з варіантів здійснення даного винаходу є спосіб ідентифікації метаболічної стабільності випробуваної речовини, що визначається метаболізмом, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), і такий спосіб включає (a) культивування клітин, що експресують САО; (b) лізування клітин з утворенням клітинного лізату; (с) додавання випробуваної сполуки до клітинного лізату; (d) інкубування випробуваної речовини з клітинним лізатом протягом попередньо визначеного періоду часу; (е) вимірювання кількості випробуваної речовини, що залишається в присутності клітинного лізату, що містить експресовану САО, протягом попередньо визначеного періоду часу; і (f) зіставлення кількості випробуваної речовини за попередньо визначений період часу з кількістю випробуваної речовини в контрольній пробі, з тим щоб встановити значення, яке відображає метаболічну стабільність випробуваної речовини в присутності клітинного лізату, що містить експресовану САО. Ще один варіант здійснення винаходу поєднує етапи (b) і (с) в одному етапі. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є спосіб ідентифікації метаболічної стабільності випробуваної сполуки, що визначається метаболізмом, каталізованим САО, в біологічній пробі, і цей спосіб включає (a) одержання біологічної проби, що містить САО; (b) 2 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 додавання випробуваної сполуки до біологічної проби; (с) інкубування випробуваної речовини з біологічною пробою протягом попередньо визначеного періоду часу; (d) вимірювання кількості випробуваної речовини протягом попередньо визначеного періоду часу; і (е) зіставлення кількості випробуваної речовини за попередньо визначений період часу з кількістю випробуваної речовини в контрольній пробі, з тим щоб встановити значення, яке відображає метаболічну стабільність випробуваної речовини в біологічній пробі, що містить САО. В одному з варіантів здійснення даного винаходу використовуються первинні клітинні культури, що є в продажу, або клітинні лінії. Серед множини прикладів клітин, що використовуються, можна назвати клітини, які можна придбати у American Tissue Culture Company. В одному з варіантів здійснення використовуються клітини CHO. Клітини можуть бути прокаріотичними або еукаріотичними. Даний винахід не обмежується видом клітин, що використовуються. До біологічних проб, серед іншого, можуть належати тканини або рідини, зрізи тканин, наприклад проби біопсії або розкриття, а також заморожені зрізи, взяті для гістологічного аналізу. Такі проби включають кров, слину, тканини, культивовані клітини (наприклад первинні культури, експлантати і трансформовані клітини), частини органів або цілі органи (наприклад печінку, легеню, поздошну кишку, артерію, пуповину), кал, сечу та ін. Біологічна проба може бути взята у еукаріотичного організму, в тому числі у ссавця, наприклад примату, такого як шимпанзе, макака або людина; корови, собаки, кішки, гризуна, в тому числі морської свинки, щура, миші, кролика, або птаха, рептилії або риб. Одним з множини прикладів здійснення даного винаходу є дослідження питання про те, чи має конкретна випробувана речовина або сполука більш високу схильність до метаболізму, або навпаки, є метаболічно стабільною в одному з відділів тканин в порівнянні з іншими відділами тканин, наприклад, чи має сполука більш високу метаболічну стабільність в печінці в порівнянні з легенями. Крім того, біологічна проба може бути оброблена, з тим щоб одержати суспензію його клітинних компонентів або використовуватися для первинної культури клітинних компонентів. Один з варіантів здійснення даного винаходу полягає в тому, щоб використовувати біологічну пробу людини або тварини, щоб кількісно оцінити метаболічну стабільність випробуваної речовини. Біологічною пробою можуть бути проби органів, одержані з одного або декількох органів тварин або людини, проби тканин, одержані з однієї або декількох тканин тварин або людини, а також проби клітин, одержані з однієї або декількох клітин тварин або людини, або з клітинних культур. У випадку експериментів з тваринами біологічні проби можуть включати тканини органу, що вивчається, одержані, наприклад, внаслідок розкриття або біопсії, а також рідини організму, такі як кров. Для клінічного застосування проби можуть включати рідини організму, такі як кров, сироватка, плазма, сеча, синовіальна рідина, ліквор, спинномозкова рідина, сперма або лімфа, а також тканини тіла, одержана з допомогою біопсії. Фахівцям в даній галузі добре відоме поняття стандарту або контролю. До стандарту або контролю може належати, серед іншого, біологічна проба здорового суб'єкта, причому таким суб'єктом може бути тварина або людина. Крім того, стандартом або контролем може бути біологічна проба суб'єкта, що не проходив лікування. В альтернативному варіанті стандарт або контроль може бути взятий від того ж суб'єкта до, під час і після лікування. Стандарт або контроль може бути від того ж суб'єкта, але це може бути проба іншої клітини, тканини або органу, а не вихідної клітини, тканини або органу, що використовується для визначення метаболічної стійкості випробуваної речовини. Стандартом або контролем необов'язково повинна бути біологічна проба, але може бути проба з відомим рівнем активності САО. Стандартом або контролем може бути речовина, яка не метаболізується САО або яка метаболізується САО з відомим рівнем чутливості по відношенню до САО. У даному винаході наводяться способи визначення метаболічної стабільності або метаболічної чутливості випробуваних речовин. Термін «випробувана речовина», що використовується в даному документі, описує будь-яку молекулу, наприклад, білок, небілкову органічну сполуку або фармацевтичний препарат, на який може впливати ферментативна активність САО або який може перебувати під її впливом. Не існує конкретних обмежень відносно випробуваних речовин, які можуть використовуватися для аналізу. В одному з варіантів здійснення даного винаходу випробуваною речовиною є сполука. До прикладів випробуваних речовин належать окремі речовини або бібліотеки малих, середніх або високомолекулярних хімічних сполук. Речовина може бути у вигляді бібліотеки випробуваних речовин, наприклад комбінаторної або рандомізованої бібліотеки, яка забезпечує достатній діапазон різноманітності або, навпаки, обмежена схожими структурами або характеристиками. Речовини можуть бути додатково зв'язані з партнером злиття, наприклад сполуками направленої доставки, спасаючими сполуками, димеризації, стабілізуючими сполуками, що 3 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 адресуються сполуками і іншими функціональними компонентами. Зазвичай для створення нових хімічних об'єктів з корисними властивостями вибирають випробувану речовину (що називається «сполукою-прототипом» або «прототипом») з буд-якою бажаною властивістю або активністю, наприклад інгібувальною активністю або модулюючою активністю. Потім сполукапрототип використовується як основа для створення варіантів сполуки-прототипу і подальшої оцінки властивостей і активності таких варіантів. Фахівці в даній галузі оцінять практичність використання даного винаходу для оптимізації вибору сполуки, що спирається на виявлення метаболічної стабільності, а значить і метаболічної чутливості потенційних сполук-прототипів, і визначення або відбору таких сполук з мінімальною чутливістю до метаболізму САО. САО даного винаходу являє собою повну послідовність САО або її фрагмент, який зберігає повну або часткову ферментативну активність. Часткова активність ферменту може становити 30% або більше від повної активності ферменту, наприклад 40% або 50%. Однією з множини прикладів є САО, що одержується від тварин. До прикладів тварин належать гризуни, наприклад щури, миші і морські свинки, або негуманоїдні примати, наприклад мавпи або шимпанзе. Ще одним прикладом є повна послідовність людської САО, яка розкривається в SEQ ID NO: 1, або її фрагменти, що мають активність метиленаміноксидази. «Метаболічна стабільність» або «метаболічна чутливість» є термінами даної галузі, які зрозумілі фахівцям. Метаболічна стабільність - це готовність випробуваної сполуки або молекули ліків зазнавати метаболізму при певних умовах, або ступінь, в якій випробувана сполука або молекули ліків зазнають метаболізму. Тому чим вище міра метаболізму, тим нижче метаболічна стабільність. Метаболічна стабільність є одним з декількох основних факторів, що визначають біодоступність при пероральному введенні і загальному кліренс ліків, сполуки або випробуваної речовини. Як один з прикладів після перорального введення ліків вона спочатку зазнає впливу метаболізуючих ферментів в шлунково-кишковому тракті, а також в епітелії кишечнику. Після його всмоктування в кровотік через епітелій кишечнику вона доставляється в печінку по портальній вені. Ліки можуть ефективно руйнуватися при метаболізмі в кишечнику або в печінці, перше ніж потраплять в загальну систему кровообігу - процес, відомий як пресистемний метаболізм. Стабільність або чутливість ліків до метаболізму в печінці, а також в тканинах поза печінкою буде, зрештою, визначати концентрацію ліків, що виявляються в загальному кровообігу, і впливати на час його напіввиведення і час утримання в організмі. Форми біотрансформацій, що зазвичай називаються I етапом метаболізму, включають окислення, відновлення і гідроліз, які в основному служать для підвищення гідрофільності і інтенсифікації виведення ліків за рахунок активації або введення полярної функціональної групи в молекулу (OH, SH, NH2 або CO2H). Реакції II етапу або реакції кон’югації ще більше підвищують полярність ліків за допомогою модифікації функціональної групи з утворенням Оабо N-глюкуронідів, сульфоефірів, альфа-карбоксіамідів і адуктів глутатіону. Одним з варіантів здійснення даного винаходу є метаболічна стабільність або метаболічна чутливість ліків, сполуки або випробуваної речовини по відношенню до метаболізму САО. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вибираються найбільш важливі біологічні проби людини і інших видів для аналізу метаболічної стабільності, зв’язаної з метаболізмом САО. Наприклад, метаболізм в печінці забезпечує метаболічний кліренс більшості ліків, тому дослідження, пов'язані з пресистемним метаболізмом, можна зосередити на метаболізмі в печінці і іноді на метаболізмі в кишечнику. Повсюдна присутність САО в тканинах і біологічних рідинах і її особливо висока активність в багатьох тканинах, наприклад в легенях і кровоносних судинах, зумовлює постійну необхідність використання належних біологічних проб на додаток або замість печінки для аналізу метаболічної стабільності випробуваної речовини в присутності САО. Крім пресистемного метаболізму в кишечнику і печінці, вплив САО на випробувану речовину може обмежуватися пресистемним метаболізмом в інших тканинах, крім печінки і кишечнику, наприклад, в портальних венах, кровоносних судинах і легенях. Випробувана речовина може виявляти різну метаболічну стабільність по відношенню до різних форм САО. Різні біологічні проби можуть містити різні форми САО. Один з множини прикладів передбачає, що випробувана речовина може демонструвати порівняльну метаболічну стабільність по відношенню до розчинної форми САО в плазмі людини, але набагато більш високу метаболічну нестабільність по відношенню до мембранно-зв’язаної САО в тканинах. Крім того, при порівнянних умовах аналізу тварини можуть демонструвати набагато більшу або меншу активність розчинної САО в плазмі в порівнянні з рівнем активності розчинної САО, що виявляється у людини. В одному з варіантів здійснення даного винаходу використовуються різні хімічні інгібітори для інгібування різноманітних форм активності аміноксидази, і метаболічна нестабільність, що спостерігається, приписується метаболізму, що каталізується САО або моноаміноксидазою 4 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 МАО-А або МАО-В. Одним з прикладів є додавання гідралазину як одного з інгібіторів аміноксидази, хлоргіліну як специфічного інгібітору МАО-А, паргіліну як змішаного інгібітору МАО-А і МАО-В, семікарбазиду і брометиламіну як специфічних інгібіторів САО. Ще одним з множини прикладів винаходу є визначення метаболічної стабільності випробуваної речовини в осіб, що одержували ліки або комбінацію ліків, з тим щоб визначити зміну метаболічної стабільності випробуваної речовини у таких осіб в порівнянні з контрольною групою. Фахівці в даній галузі оцінять практичність одержання біологічних проб людини або тварин, які страждають одним або декількома захворюваннями або в яких створили один або декілька патологічних станів, піддали хірургічним або генетичним змінам або премедикації ліками, сполукою або випробуваною речовиною. Один з прикладів передбачає використання винаходу для визначення метаболічної стабільності випробуваної речовини в органах, які можуть бути уражені захворюванням, в порівнянні зі здоровими органами. Як додатковий приклад з множини наявних - метаболічна стабільність тієї або іншої сполуки може оцінюватися в легеневих тканинах, одержаних у людини, що страждає астмою, і зіставлятися з метаболічною стабільністю сполуки в здоровій легеневій тканині, взятій у такої ж за віком особи або з контрольної групи. Ще одним прикладом буде вивчення метаболічної стабільності сполуки в біологічній пробі, наприклад, в «молодій» печінці в порівнянні зі «старою» або «печінкою, що постаріла», де «молода», «стара» або «що постаріла» визначаються особливостями конкретного вигляду, на якому проводиться дослідження. В одному з варіантів здійснення даного винаходу використовується однорідна популяція клітин або одна біологічна проба. У альтернативному варіанті здійснення даного винаходу використовується неоднорідна популяція клітин або поєднання декількох біологічних проб. Для додержання способів даного винаходу можна використовувати клітини або біологічні проби будь-якого типу і в будь-якій пропорції. В одному з варіантів здійснення даного винаходу використовується рекомбінантна лінія клітин, що експресує САО. Рекомбінантний вектор експресії, представлений у винаході, включає молекулу нуклеїнової кислоти в формі, придатній для експресії нуклеїнової кислоти в клітиніреципієнті. Таким чином, рекомбінантні вектори експресії даного винаходу можуть містити одну або декілька регуляторних послідовностей, вибраних на основі клітини-реципієнта, що використовується для експресії, причому ця послідовність функціонально зв'язана з нуклеїновою кислотою, яка повинна бути експресована. По відношенню до рекомбінантного вектора експресії вираз «функціонально зв’язаний» закликаний означати, що представляюча інтерес послідовність нуклеотидів зв'язана з регуляторною послідовністю (послідовностями) таким способом, який забезпечує експресію послідовності нуклеотидів (наприклад в системі транскрипції/трансляції «in vitro» або в клітині-хазяїні, якщо вектор введений в клітину-хазяїна). Термін «регуляторна послідовність» включає промотори, енхансери і інші елементи, що контролюють експресію (наприклад сигнали поліаденілування). Такі регуляторні послідовності описані, наприклад, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Регуляторні послідовності включають направляючі конститутивну експресію послідовності нуклеотидів в багатьох типах клітин-реципієнтів (наприклад специфічні до тканин регуляторні послідовності). Фахівцям відомо, що структура вектора експресії може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна для трансформації, бажаний рівень експресії білка і т. д. Вектори експресії даного винаходу можуть вводитися в клітини-хазяїни для вироблення білків або пептидів, кодованих нуклеїновими кислотами, як це описано в цьому документі. Термін «надекспресія», що використовується в цьому документі, стосується експресії поліпептиду на рівні, що перевищує нормальний рівень експресії поліпептиду в клітині, яка нормально експресує поліпептид, або в клітині, яка не забезпечує нормальної експресії поліпептиду. Наприклад, рівень експресії поліпептиду може становити 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70, 80%, 90%, 100% або більше в порівнянні з експресією поліпептиду в немутантній клітині, яка забезпечує нормальну експресію поліпептиду. Можлива надекспресія мутантів, варіантів або аналогів представляючого інтерес поліпептиду. Термін «транзиторна» експресія, що використовується в цьому документі, стосується експресії екзогенної молекули (молекул) нуклеїнових кислот, які відділені від хромосом клітини. Транзиторна експресія зазвичай досягає свого максимуму через 2-3 дні після введення екзогенної нуклеїнової кислоти, а потім поступово знижується. Термін «стабільна» експресія, що використовується в цьому документі, стосується експресії екзогенної молекули (молекул) нуклеїнових кислот, які є невід'ємною частиною хромосоми (хромосом) клітини. У загальному випадку вектори стабільної експресії генів включають один або декілька маркерів селекції. 5 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Методи культивування клітин для трансформованих проб, нетрансформованих проб, первинних культур і біологічних проб добре відомі фахівцям в даній галузі. Біологічні проби або культивовані клітини можуть зберігатися, поки не буде потрібне їх використання. Середовища, що використовуються для культивування, можуть готуватися спеціально або купуватися з комерційних джерел. Одне із застосувань даного винаходу передбачає лізування клітин. Лізування клітин може здійснюватися додаванням детергенту, що містить лізуючий буфер. При цьому винахід не обмежується використанням детергенту в лізуючому буфері, але може включати будь-який метод, який підходить для лізування клітин. Наприклад, лізування клітин може пройти під дією гіпертонічного буфера, ультразвуковою обробкою або в цикле заморожування/відтанути. Ці і інші методи лізування також добре відомі фахівцям в даній галузі. В одному з варіантів здійснення даного винаходу використовується контроль. Контроль являє собою термін, добре зрозумілий кваліфікованим фахівцям в даній галузі. Належний контроль може залежати від параметрів аналізу, що використовуються, або експериментальної задачі, що досліджується. Контролем може бути конкретний набір умов аналізу або додавання конкретної сполуки до аналізу або видалення з нього. Тому в одному з прикладів контролю розглядається умова, при якій випробувана сполука інкубується за відсутності клітин або клітинних лізатів, що експресують САО. Контроль може розглядатися як позитивний контроль, в тому випадку якщо умови аналізу або додана контрольна сполука забезпечують очікувану відповідь. Наприклад, якщо очікується, що випробувана речовина буде метаболізуватися, позитивним контролем буде сполука, яка метаболізується САО. Крім того, позитивним контролем може бути сполука, яке метаболізується САО до відомих метаболічних побічних продуктів. Одним з прикладів позитивного контролю є додавання бензиламіну. Контроль також може бути негативним. Негативним контролем може бути конкретний набір умов аналізу або додавання конкретної сполуки до аналізу або видалення її, що не викличе очікувану реакцію. Наприклад, якщо очікується метаболізація випробуваної речовини, негативним контролем буде сполука, яка не повинна зазнавати метаболізації. Одним з прикладів негативного контролю є додавання бензойної кислоти, яка не містить метиленамінової групи і не метаболізується САО. Одним з прикладів використання конкретного набору умов аналізу як негативний контроль може бути додавання інгібітору, орієнтованого на ферментативну активність САО, наприклад, гідралазину, при якому відбувається інгібування активності САО. Контролем може бути використання «носія». Наприклад, якщо випробувана речовина розчиняється в ДМСО, тоді контролем з використанням носія може бути ДМСО без випробуваної речовини. Контролем може бути і просто використання одержаних в минулому даних. Один з варіантів здійснення даного винаходу передбачає вимірювання кількості випробуваної речовини, яка інкубується в присутності САО протягом попередньо визначеного періоду часу, і зіставлення кількості випробуваної речовини в певний період часу з кількістю випробуваної речовини в контролі, з тим щоб з'ясувати метаболічну стабільність випробуваної речовини в присутності САО. Фахівцеві в даній галузі легко помітити, що метаболічна стабільність випробуваної речовини може вимірюватися за зникненням випробуваної речовини або, як альтернатива, за допомогою зміни накопичення одного або декількох метаболітів випробуваної речовини. В іншому варіанті здійснення даного винаходу є намір виміряти накопичення одного або декількох метаболітів випробуваної речовини в доповнення до вимірювання кількості випробуваної речовини або замість її. Кількість випробуваної речовини або накопичення одного або декількох метаболітів випробуваної речовини може визначатися будь-яким набором методик, доступних фахівцям в даній галузі. До прикладів належать мас-спектрометрія, високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ), рідинна хроматографія/мас-спектрометрія, рідинна хроматографія/масспектрометрія/мас-спектрометрія і рідинна хроматографія/сцинтиляційне детектування. Крім того, кількість випробуваної речовини або накопичення одного або декількох метаболітів випробуваної речовини може вимірюватися за допомогою використання індикаторних молекул, наприклад, радіоізотопів, флуоресцентних барвників або антитіл. Даний винахід не обмежується способом вимірювання кількості випробуваної речовини або будь-якого одного або декількох метаболітів випробуваної речовини. 3 14 Випробувана речовина може бути помічена радіоізотопом, наприклад H або C. Наприклад, одним з варіантів здійснення даного винаходу є спосіб ідентифікації метаболічної стабільності міченої радіоізотопом випробуваної сполуки, що визначається метаболізмом, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), і такий спосіб включає (a) культивування клітин, що експресують САО; (b) додавання міченої радіоізотопом випробуваної сполуки до клітин; (с) інкубування міченої радіоізотопом випробуваної речовини з клітинами протягом 6 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 попередньо визначеного періоду часу; і (d) вимірювання кількості міченої радіоізотопом випробуваної речовини, що залишається в присутності клітин, що містять експресовану САО, протягом попередньо визначеного періоду часу, причому процент міченої радіоізотопом випробуваної речовини, що не зазнала метаболізму, визначає метаболічну стабільність міченої радіоізотопом випробуваної речовини в присутності клітин, що містять експресовану САО. Фахівцям в даній галузі відомо, що для даного способу замість клітин може використовуватися клітинний лізат. Крім того, даний винахід не обмежується використанням радіоізотоп, але може спиратися на будь-які засоби введення мітки у випробувану речовину, доступні фахівцям в даній галузі. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є спосіб ідентифікації метаболічної стабільності міченої радіоізотопом випробуваної сполуки, що визначається метаболізмом, який каталізується САО, в біологічній пробі, і такий спосіб включає (a) одержання біологічної проби, що містить САО; (b) додавання міченої радіоізотопом випробуваної сполуки до біологічної проби; (с) інкубування міченої радіоізотопом випробуваної речовини з біологічною пробою протягом попередньо визначеного періоду часу; і (d) вимірювання кількості міченої радіоізотопом випробуваної речовини протягом попередньо визначеного періоду часу, причому процент міченої радіоізотопом випробуваної речовини, що не зазнала метаболізму, визначає метаболічну стабільність міченої радіоізотопом випробуваної речовини в присутності біологічної проби, що містить САО. Фахівець в даній галузі зможе оцінити практичність зіставлення метаболічної стабільності випробуваної речовини в клітинах або клітинних лізатах з метаболічною стабільністю випробуваної речовини в біологічних пробах. Таким чином, один з варіантів здійснення даного винаходу включає спосіб визначення профілю метаболічної стабільності випробуваної речовини, і такий спосіб передбачає (a) одержання значення метаболічної стабільності випробуваної речовини, інкубованої в присутності клітин або клітинних лізатів, що містить експресовану САО; і (b) одержання значення метаболічної стабільності випробуваної речовини, інкубованої в присутності біологічної проби, що містить експресовану САО, причому значення метаболічної стабільності випробуваної речовини в присутності клітин або клітинних лізатів, що містить експресовану САО, зіставляється з показником метаболічної стабільності випробуваної речовини в присутності біологічної проби, що містить САО, що дозволяє одержати профіль метаболічної стабільності випробуваної речовини. Такі вдосконалення, як застосування даного винаходу в методах високопродуктивного скринінгу (ВПС), цілком відповідають рівню знань і здібностям кваліфікованого фахівця і розглядаються як варіанти здійснення даного винаходу. Один з варіантів здійснення винаходу передбачає його використання в методах високопродуктивного скринінгу (ВПС). ВПС є автоматизованим одночасним методом тестування тисяч різних хімічних сполук в аналізах, покликаних моделювати біологічні механізми або аспекти патологій захворювань. Декілька сполук, наприклад набір сполук, може тестуватися одночасно. В одному з варіантів здійснення винаходу термін «метод скринінгу ВПС» стосується аналізів, в ході яких тестується метаболічна стабільність однієї сполуки у множині біологічних проб або у множині сполук в одній або декількох біологічних пробах. Один з варіантів здійснення даного винаходу передбачає використання набору приймачів, в які можуть поміщуватися клітини, клітинні лізати, взяті в організмі проби, або інші матеріали, наприклад метиленамін або метиленамін-подібна випробувана речовина, що є предметом дослідження. Масив приймачів може являти собою будь-яку кількість приймачів, від щонайменше одного до декількох приймачів, придатних для поміщення матеріалів відповідно до обсягу даного винаходу. До прикладів, серед іншого, належать колби, чашки для культивування, предметне скло, пробірки, наприклад пробірки на 1,5 мл, 12-ямкові планшети, 96-ямкові планшети, 384-ямкові планшети і мініатюрні планшети для мікротитрування з близько 4000 приймальних ямок (заявка на патент США 20050255580). Набір приймачів можна вдосконалити, доповнивши його захисною кришкою, тим самим виключивши попадання забруднень або випаровування вмісту. Додатковою особливістю приймачів є те, що вони дозволяють провести аналіз. Множина прикладів включає аналіз шляхом мас-спектрометрії або ВЕРХ. Проте це не є обмеженням для приймачів, які можуть використовуватися в межах даного винаходу, з урахуванням того, що зразки можуть перенестися у придатну місткість для подальшого аналізу. Один з множини прикладів передбачає модифікацію способу таким чином, щоб забезпечити другий набір приймачів, причому одна або більше стадій здійснюються у другому наборі приймачів. Системи для роботи з рідинами, аналітичне обладнання, наприклад планшети-рідери флуоресценції або сцинтиляційні лічильники і роботи для клітинних культур і маніпуляцій із 7 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зразками добре відомі фахівцям в даній галузі. Механічні системи, наприклад роботизовані маніпулятори або пристрої точного вибору, доступні будь-якому кваліфікованому фахівцеві. Існують планшет-рідери, що серійно випускаються для аналізу звичайних 96-ямкових або 384ямкових планшет. Наявні рідери одиничних зразків, множини зразків або планшет, які аналізують попередньо визначену ямку і готують попередні звіти даних. Вихідні дані можуть перетворюватися і представлятися самими різними способами. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є набір, що включає щонайменше один елемент системи аналізу для здійснення способів, що розкриваються тут, і інструкцію з застосування. Таким чином, компоненти системи аналізу можуть надаватися окремо або разом в такому наборі. Компоненти системи аналізу можуть готуватися і включатися в набір згідно зі способами, які максимально збільшують стабільність окремих компонентів. Такі способи відомі фахівцям в даній галузі. Наприклад, клітини системи аналізу можуть постачатися у вигляді суспензії або в замороженому або ліофілізованому вигляді. Можуть також бути присутнім додаткові компоненти системи аналізу, наприклад буфери, контейнери для змішування компонентів аналізу, такі як планшети для мікротитрування або пробірки для тестування. Система для аналізу може постачатися в формі набору, який включає інструкцію для проведення аналізу і інструкцію з обробки і інтерпретації даних. Даний винахід більш детально описується в наведених нижче прикладах, які не обмежують сфери його охоплення, викладеної в формулі винаходу. Незважаючи на досить докладний опис і ілюстрації даного винаходу, що дозволяє кваліфікованим фахівцям в даній галузі реалізувати і використовувати його, очевидні різні альтернативи, модифікації і вдосконалення, що не стосуються основної ідеї і охоплення даного винаходу. Кваліфікований фахівець в даній галузі без великих зусиль оцінить той факт, що даний винахід добре пристосований для досягнення мети і одержання вказаних і характерних для нього результатів і переваг. Наведені нижче приклади містять описи варіантів здійснення і не покликані обмежувати сферу охоплення даного винаходу. Для фахівців в даній галузі будуть очевидні наведені в цьому документі модифікації і інші застосування. Такі модифікації не відходять від суті даного винаходу і визначаються сферою охоплення формули винаходу. Даний винахід, наочно описаний в цьому документі, може застосовуватися за відсутності будь-якого елемента або елементів, обмеження або обмежень, які специфічно не розкриваються в цьому документі. Терміни, що застосовуються, і вирази використовуються з метою опису, а не для обмеження, і у використанні таких термінів і виразів немає ніякого наміру виключити будь-які еквіваленти наведених і описаних властивостей або їх частини; навпаки, визнається можливість різних модифікацій в межах сфери охоплення заявленого винаходу. Тому потрібно розуміти, що незважаючи на повне розкриття даного винаходу в його основних застосуваннях і додаткових характеристиках, фахівці в даній галузі можуть вносити модифікації і зміну в концепції, що розкриваються в цьому документі, і що такі модифікації і зміни вважаються такими, що входять в сферу охоплення винаходу, яка визначається в прикладеній формулі. Приклад 1 А. Клонування і експресія САО людини 1) З тим щоб спростити одержання експресійної структури, початкову плазміду повної послідовності САО pDONR221 одержували таким чином: Першу ПЛР проводили за допомогою ген-специфічних праймерів, які наводяться нижче. У прямому праймері міститься половина сайту att (Invitrogen), і послідовність Козака виділена жирним шрифтом. Зворотний праймер містить іншу половину сайту att, яка також виділена жирним шрифтом. ПЛР проводили з використанням пуповини людини як матриці ДНК (готували з РНК, придбаної в Biochain, набору RT-PCR superscript II Invitrogen): Праймери первинного клонування: Прямий (SEQ ID NO: 3): 5’-AAAAGCAGGCTTAGGAATGAACCAGAAGACAATCCTC-3’ Зворотний (SEQ ID NO: 4): 5’-CAAGAAAGCTGGGTCCTAGTTGTGAGAGAAGCCCC-3’ Потім другу ПЛР проводили за допомогою універсальних праймерів, які наводяться нижче. Прямий праймер і зворотний праймер містили послідовності сайту att (набрані жирним) і векторні послідовності. Послідовності універсальних праймерів: Прямий (SEQ ID NO: 5): 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGGA-3’ Зворотний (SEQ ID NO: 6): 8 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3’ Цей продукт другий ПЛР клонували в pDONR221 за допомогою реакції Invitrogen BP. Користуючись цим вихідним вектором як матрицею, готували шість варіантів експресійних структур САО людини; три форми (одна повна і дві укорочені) без тегів і три з тегами 6HIS у карбоксильного кінця, щоб спростити очищення ферменту. 2) Повна послідовність САО: Набрані жирним шрифтом послідовності прямого і зворотного праймерів визначають послідовність сайту att. Послідовності праймера для клонування повної САО без тегів: Прямий (SEQ ID NO: 7): 5’-AAAAGCAGGCTTAGGAATGAACCAGAAGACAATCCTC-3’ Зворотний (SEQ ID NO: 8): 5’-CAAGAAAGCTGGGTCCTAGTTGTGAGAGAAGCCCCCGTGG-3’ Для додавання 3' 6HIS перед стоп-кодоном використовували наступні праймери: Набрані жирним шрифтом послідовності прямого і зворотного праймерів визначають послідовність сайту att, підкреслені послідовності на зворотному праймері визначають тег 6HIS. Послідовності праймера для клонування повної САО з тегом 6HIS в С-термінальному ланцюгу: Прямий (SEQ ID NO: 9): 5’-AAAAGCAGGCTTAGGAATGAACCAGAAGACAATCCTC-3’ Зворотний (SEQ ID NO: 10): 5’-CAAGAAAGCTGGGTCCTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTGTGAGAGAAGCCCCCGTGG-3’ 3) T1 (Gly27-Asn763), що являє собою фермент без області зв’язування з мембраною: Набрані жирним шрифтом послідовності прямого і зворотного праймерів визначають послідовність сайту att, підкреслені послідовності на зворотному праймері визначають додатковий N-термінальний Met. Послідовності праймера для клонування N-термінальної, укороченої САО без тегів: Прямий (SEQ ID NO: 11): 5’-AAAAGCAGGCTTAGGAATGGGCAGGGGTGGAGATGGGGGTG-3’ Зворотний (SEQ ID NO: 12): 5’-CAAGAAAGCTGGGTCCTAGTTGTGAGAGAAGCCCC-3’ Для додавання 3' 6HIS перед стоп-кодоном були використані наступні праймери: Набрані жирним шрифтом послідовності прямого і зворотного праймерів визначають послідовність сайту att, підкреслені послідовності на прямому праймері визначають додатковий N-термінальний Met, а підкреслені послідовності на зворотному праймері визначають тег 6HIS. Послідовності праймера для клонування N-термінальної, укороченої, С-термінальної САО з тегом 6HIS: Прямий (SEQ ID NO: 13): 5’-AAAAGCAGGCTTAGGAATGGGCAGGGGTGGAGATGGGGGTG-3’ Зворотний (SEQ ID NO: 14): 5’-CAAGAAAGCTGGGTCCTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTGTGAGAGAAGCCCCCGTGG3’ 4) T2 (Met211-Asn763), що представляє гаданий каталітичний домен Набрані жирним шрифтом послідовності прямого і зворотного праймерів визначають послідовність сайту att, а підкреслені послідовності на зворотному праймері визначають додатковий N-термінальний Met. Послідовності праймера для клонування каталітичного домену САО без тегів: Прямий (SEQ ID NO: 15): 5’-AAAAGCAGGCTTAGGAATGACCACGGCTCCCCGTGGTC-3’ Зворотний (SEQ ID NO: 16): 5’-CAAGAAAGCTGGGTCCTAGTTGTGAGAGAAGCCCC-3’ Для додавання 3' 6HIS перед стоп-кодоном були використані наступні праймери: Набрані жирним шрифтом послідовності прямого і зворотного праймерів визначають послідовність сайту att, підкреслені послідовності на прямому праймері визначають додатковий N-термінальний Met, а підкреслені послідовності на зворотному праймері визначають тег 6×HIS. Послідовності праймера для клонування каталітичного домену САО з С-термінальним тегом 6×HIS: Прямий (SEQ ID NO: 17): 5’-AAAAGCAGGCTTAGGAATGACCACGGCTCCCCGTGGTC-3’ 9 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Зворотний (SEQ ID NO: 18): 5’-CAAGAAAGCTGGGTCCTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTGTGAGAGAAGCCCCCGTGG-3’ Експресійні структури готували за допомогою клонування цих продуктів ПЛР в pCDNA5-FRTTo-DEST вектор (Invitrogen, Gateway System). Пряму і зворотну послідовності ДНК для кожної структури підтверджували з урахуванням експресованих послідовностей і щонайменше 100 пар основ по обох сторонах. За допомогою цих 6 структур відповідно до інструкцій виробника одержували стабільні лінії клітин для Flp-In CHO, Flp-In CHO T-Rex і Flp-In HEK 293 (Invitrogen, Flp-In system). Клітини трансфектували спільно з регуляторним вектором, pOG44, і кожною зі структур pCDNA5-FRT-To-DEST з використанням ліпфектаміну (Invitrogen) відповідно до інструкції виробника. Отже, було одержано 18 ліній клітин: CHO Flp-In повної послідовності САО; CHO Flp-In повної послідовності САО з С-термінальним тегом 6×HIS; CHO Flp-In T1 САО; CHO Flp-In T1 САО з С-термінальним тегом 6×HIS; CHO Flp-In T2 САО; CHO Flp-In T2 САО з Стермінальним тегом 6×HIS; CHO T-Rex Flp-In повної послідовності САО; CHO T-Rex Flp-In повної послідовності САО з С-термінальним тегом 6×HIS; CHO T-Rex Flp-In T1 САО; CHO T-Rex Flp-In T1 САО з С-термінальним тегом 6×HIS; CHO T-Rex Flp-In T2 САО; CHO Flp-In T2 САО з Стермінальним тегом 6×HIS; HEK 293 Flp-In повної послідовності САО; HEK 293 Flp-In повної послідовності САО з С-термінальним тегом 6×HIS; HEK 293 Flp-In T1 САО; HEK 293 Flp-In T1 САО з С-термінальним тегом 6×HIS; HEK 293 Flp-In T2 САО; HEK 293 Flp-In T2 САО з Стермінальним тегом 6×HIS. Прилиплі клітини CHO культивували при 37°С, 5% CO 2 в середовищі, що містить Ham F12, 10% фетальну бичачу сироватку, 2 мМ L-глутамін, 1% пеніцилін/стрептоміцин, 300 мкМ гігроміцину B. Прилиплі клітини HEK 293 культивували при 37°С, 5% CO2 в D-MEM (високий рівень глюкози), 10% фетальній бичачій сироватці, 2 мМ L-глутаміну і 200 мкМ гігроміцину B. Стабільні трансформанти визначали за втратою стійкості до зеоцину. Після досягнення 80% конфлюентності клітин, експресію САО індукували додаванням тетрацикліну до концентрації 1 мкг/мл. Через 18 годин клітини збирали, обробляючи трипсином протягом 3 хвилин при кімнатній температурі. Клітини промивали 3 хвилини в фосфатному буферному фізіологічному розчині перед швидким заморожуванням в рідкому азоті. Для приготування клітинного лізату для тестування активності заморожені таблетки клітин ресуспендували в лізатному буфері, що містить 10 мМ Tris-HCl (pH 7,2), 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 1% об./об. NP-40 і інкубували протягом 15 хвилин на льоді. Лізат просвітлювали центрифугуванням 800×g протягом 10 хвилин, 4°С і зберігали в аліквотах при -80°С до використання. Білки визначали за допомогою білкового реагенту Pierce Coomassie відповідно до інструкції виробника. В. Перевірка ферментативної активності рекомбінантного білка (i). Приготування зразка Для кожного аналізу 1 мл клітинного лізату (1,5 мг/мл білку) змішували з бензиламіном до кінцевої концентрації 2000 нг/мл. У кожній відповідній точці за часом 20 мкл інкубаційних суміші переносили в мікроцентрифужну пробірку (1,7 мл) і змішували з 50 мкл ацетонітрилу. Пробірки струшували у вихровому змішувачі протягом нетривалого часу для повного перемішування, а потім центрифугували при 10000×g протягом 5 хвилин. Супернатант видаляли і 50 мкл переносили у флакон пристрої автоматичного відбору проб і змішували з 50 мкл води перед аналізом РХ/МС/МС. Бензиламін, що залишається в лізаті, аналізували методом РХ/МС/МС. (ii). Аналіз Аналіз РХ/МС/МС проводили на мас-спектрометрі PE Sciex API 3000 в наступних умовах, перерахованих нижче в таблицях 1 і 2: Аналітична колонка: Jupiter С-4, 5 мкМ, 50×2,1 мм Температура колонки: навколишнього середовища Швидкість потоку: 0,2 мл/хв Об'єм введення: 15 мкл 10 UA 103300 C2 Таблиця 1 Градієнт пересувної фази Час (хв) 0 0,1 2,9 3,0 6,0 5 Розчин А (%) 40 95 95 40 40 Розчин В (%) 60 5 5 60 60 Розчин А являв собою 90% метанолу у воді, розчином В був 10 мМ амоній-ацетатний буфер, рН 7,0 Розподільний клапан: 0 1,5 хв в злив, 1,5 5 хв на МС детектор Таблиця 2 РХ/МС/МС Сполука Бензіламін RT (хв) 2,74 108,1 Перенесення маси до 65,1 +Ve (iii) Результати РХ/МС/МС аналізу клітинних лізатів наводяться в таблиці 3. Таблиця 3 Ферментативна активність САО в клітинних лініях, що експресують повну або вкороченную САО Джерело клітинного лізату Експресована САО Контроль CHO Контроль CHO Flp-In CHO Flp-In CHO Flp-In CHO Flp-In CHO Flp-In CHO Flp-In CHO Flp-In CHO Flp-In T-Rex CHO Flp-In T-Rex CHO Flp-In T-Rex CHO Flp-In T-Rex CHO Flp-In T-Rex CHO Flp-In T-Rex CHO Flp-In T-Rex Контроль HEK293 HEK293 HEK293 HEK293 HEK293 HEK293 HEK293 немає немає повна повна T1 T1 T2 T2 немає повна повна T1 T1 T2 T2 немає повна повна T1 T1 T2 T2 Тег немає немає немає С-термінальний 6HIS немає С-термінальний 6HIS немає С-термінальний 6HIS немає немає С-термінальний 6HIS один С-термінальний 6HIS немає С-термінальний 6HIS немає немає С-термінальний 6HIS немає С-термінальний 6HIS немає С-термінальний 6HIS Залишок бензиламіну (%) 0 хв. 10 хв. 2 год. 100 111 110 100 104 99 100 1 1 100 101 73 100 109 103 100 101 98 100 105 98 100 108 102 100 104 99 100 6 0 100 94 59 100 104 92 100 95 93 100 97 83 100 100 97 100 106 123 100 58 2 100 105 98 100 105 102 100 111 103 100 113 101 100 100 117 10 Активні лізати з CHO Flp-In, CHO Flp-In T-Rex або HEK293 Flp-In, що експресують повну САО (без тегів), тестували і перевіряли на активність (таблиця 4). Оскільки більшістю клітинних 11 UA 103300 C2 ліній були CHO Flp-In, що експресують повну (без тегів) САО, цей препарат згодом використовували для тестування активності. Таблиця 4 Ферментативна активність САО в клітинних лініях, що експресують повну САО Типи клітин, що експресують повну САО (без тегів) HEK293 Flp-In CHO Flp-In CHO Flp-In T-Rex 5 10 15 20 25 Залишок бензиламіну (%) 0 хв. 10 хв. 30 хв. 100 50 9 100 9 1 100 16 1 Приклад 2 Оптимізація умов аналізу РХ/МС/МС Пробу Amplex Red (проба, що серійно випускається) спочатку використовували для вимірювання специфічної активності рекомбінантної людської САО. Amplex Red являє собою безбарвне і нефлуоресціювальне похідне дигідрорезофурину. У присутності аміноксидаз і САО Amplex Red реагує з H2O2 з утворенням активно флуоресціюючого продукту, резофурину. Резофурин характеризується максимумом довжини хвилі збудження 563 нм і максимумом довжини хвилі випускання 587 нм, і аналіз допускає кількісне визначення за зчитуванням планшети мікротитру при 587 нм. Специфічна активність рекомбінантної САО виявилася рівною 280 пмоль/міна/мг білку і еквівалентної специфічної активності САО, що виявляється в тканинах легень людини. Для подальших аналізів з метою одержання профілю сполук в пробах РХ/МС/МС рекомбінантну людську САО (рчСАО) використовували при такій певній специфічній активності. Описаний вище аналіз РХ/МС/МС використовували для оцінки чутливості сполуки А до метаболізму рчСАО. Хімічна структура сполуки А наводиться на фіг. 3 (патент США 6977263 B2 загалом розповсюджується на молекули і способи їх одержання). Сполуку А, наведену в таблиці 5, інкубували при 37°С з рчСАО (що має певну специфічну активність, яка була порівнянна з тією, що виявляється в тканинах людини, як це описано вище) протягом спочатку 4 годин або 24 годин. В нульовий момент часу і в 4 години (або 24 години) відбирали аліквоту зразка і гасили ацетонітрилом. Зразки потім аналізували РХ/МС/МС для вимірювання кількості вихідної сполуки, що залишається після 24 годин, в порівнянні з кількістю, що була присутньою в нульовий момент часу.) Значення, наведені в таблиці 5, являють собою процент вихідної сполуки, що залишається в пробі через різні вказані проміжки часу після інкубування з рчСАО. Таблиця 5 Процент вихідної сполуки, що залишається після інкубування з рчСАО Сполука A % вихідної сполуки, що залишилася 0 год. (%) 4 год. (%) 100 25 24 год. (%) 3,2 30 35 40 Приклад 3 Перевірка метаболічної стабільності сполуки А в препаратах супернатанту гомогенатів тканин людини і тварин (i). Використані тканини Використовували наступні тканини: легені, печінку і клубову кишку морської свинки, яванського макака і людини; артерію морської свинки і мавпи і пуповину людини. (ii). Підготовка тканини Тканини обробляли для одержання супернатанту. Не вдаючись в деталі, посічені тканини одразу ж промивали рясними об'ємами фізіологічного розчину (попередньо охолодженого до 4°С) для видалення крові. Зібрані тканини гомогенізували в охолодженому 0,01 M натрійфосфатному буфері при 7,4 (10 мл на г тканини) в Polytron. Гомогенат обробляли Triton X-100 з підвищеною концентрацією приблизно 1% при постійному обережному струшуванні протягом 2 годин при 4°С, а потім центрифугували (4°С, 15 хвилин, 3000×g). Супернатант обережно 12 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 відділяли і відбирали аліквоти 2 мл, потім заморожували приблизно при -80°С до подальшого вживання. (iii). Оптимізація умов інкубування з випробуваною сполукою 14 Все інкубування проводили при 37°С з використанням попередньо нагрітої водяної бані. Cмічену випробувану сполуку M.. D інкубували при 1 або 10. Попередню інкубування проводили для кожного поєднання тканина/сполука, щоб вибрати необхідну тривалість інкубування. Тривалість інкубування складала від 1,5 до 6 годин. Використовували достатній об'єм інкубування, щоб мати можливість провести аналіз щонайменше п'яти послідовних проб протягом інкубування. Окремі аліквоти (1 мл), взяті з інкубаційної суміші, одразу ж гасили двома об'ємами ацетонітрилу, і погашені суміші піддавали ліофільному сушінню. Ліофілізовані проби одразу ж розчиняли для аналізу проби або зберігали при приблизно -80°С до проведення аналізу. Розчинення проводили в 500 LD суміші (90% 20 мМ ацетат амонію, pH 4,0 і 10% метанолу (об./об.)). LD після центрифугування 100 розчинених зразків розділяли з допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) з подальшим сцинтиляційним детектування. (iv). Аналіз даних і розрахунки Розчинені зразки після інкубування аналізували ВЕРХ з подальшим сцинтиляційним детектування. Ідентичність випробуваної сполуки і відповідних метаболітів бензальдегіду і кислоти перевіряли зіставленням часів утримування з еталонними стандартами вихідної сполуки і її відповідних метаболітів. Кількість випробуваної сполуки, що залишається, розраховували як процент радіоактивності вихідного піка в сумарній радіоактивності на радіохроматограмі розчиненого зразка. Процент тестової сполуки, що залишається залежно від часу інкубування в лінійно-логарифмічній шкалі описується кінетикою першого порядку. Константу першого порядку розраховували для окремих інкубувань як нахил логарифма кількості випробуваної сполуки, що залишається відносно часу на основі лінійної регресії за методом найменших квадратів. (v). Результати дослідження метаболічної стабільності випробуваної сполуки в препаратах тканин Константа швидкості першого порядку (1/год) для метаболічного розпаду випробуваної сполуки наводиться в таблиці 6. В припущенні, що метаболізм описується кінетикою МіхаелісаМентен, припущення кінетики першого порядку M означає, що KD до 10 М>>М для ферментативної реакції. D10 Таблиця 6 Метаболічна стабільність сполуки А в тканинних препаратах Вид Сполука А Тканина MD1 0,418 0,352 0,675 0,688 0,318 0,0775 0,747 0,127 2,05 0,328 0,177 0,835 Печінка Клубова кишка Людина Легеня Пуповина Печень Клубова кишка Морська свинка Легеня Артерія Печінка Клубова кишка Мавпа Легеня Артерія 35 MD10 0,365 0,353 0,706 0,697 0,305 0,0782 0,709 0,111 2,64 0,277 0,208 0,673 Як показано в таблиці 6, в даному винаході продемонстрована хорошу кореляцію між даними тканин і клінічним метаболічним профілем сполуки, що спостерігається А. За порівнянням з вимірюваннями стабільності тільки в людській плазмі даний винахід дозволяє більшточно визначати стабільність фармацевтичного препарату по відношенню до САО людини і є більш надійним прогнозуючим інструментом для регулювання вибору і фармацевтичних розробок клінічних кандидатів. 40 13 UA 103300 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Спосіб визначення метаболічної стабільності тестованої речовини за метаболізму, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), де тестована речовина є кандидатним лікарським засобом, а метаболічна стабільність тестованої речовини за метаболізму, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), невідома, де спосіб включає a) культивування рекомбінантних клітин, що експресують повнорозмірну САО; b) додавання тестованої речовини до рекомбінантних клітин; c) інкубування тестованої речовини з рекомбінантними клітинами протягом попередньо визначеного періоду часу; d) вимірювання кількості тестованої речовини, що залишається в присутності рекомбінантних клітин, що експресують САО, за попередньо визначений період часу; і е) порівняння кількості тестованої речовини, виміряної на стадії d), з кількістю тестованої речовини в контрольній пробі, для визначення метаболічної стабільності тестованої речовини в присутності рекомбінантних клітин, що експресують САО. 2. Спосіб визначення метаболічної стабільності міченої радіоізотопом тестованої речовини за метаболізму, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), де тестована речовина є кандидатним лікарським засобом, а метаболічна стабільність тестованої речовини за метаболізму, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), невідома, де спосіб включає a) культивування рекомбінантних клітин, що експресують САО; b) додавання міченої радіоізотопом тестованої речовини до рекомбінантних клітин; c) інкубування міченої радіоізотопом тестованої речовини з рекомбінантними клітинами протягом попередньо визначеного періоду часу; d) вимірювання кількості міченої радіоізотопом тестованої речовини, що залишається в присутності рекомбінантних клітин, що експресують САО, протягом попередньо визначеного періоду часу; і е) порівняння кількості міченої радіоізотопом тестованої речовини, виміряної на стадії d), з кількістю міченої радіоізотопом тестованої речовини, яка не була метаболізована, для визначення метаболічної стабільності міченої радіоізотопом тестованої речовини за метаболізму, який каталізує САО. 3. Спосіб за п. 1 або п. 2, при якому рекомбінантні клітини, що експресують САО, одержують проміжною або стабільною трансфекцією клітин ДНК, що кодує САО. 4. Спосіб за п. 3, де ДНК містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 2. 5. Спосіб за п. 3, де ДНК кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1. 6. Спосіб за п. 1 або 2, в якому клітини, що експресують САО, є прокаріотичними клітинами. 7. Спосіб за п. 1 або 2, в якому клітини, що експресують САО, є еукаріотичними клітинами. 8. Спосіб за п. 1 або за п. 2, в якому кількість тестованої речовини визначають методом, вибираним з групи, до якої належать мас-спектрометрія, високоефективна рідинна хроматографія, рідинна хроматографія/мас-спектрометрія, рідинна хроматографія/масспектрометрія/мас-спектрометрія і рідинна хроматографія/сцинтиляційне детектування. 9. Спосіб за п. 1 або п. 2, в якому принаймні одну стадію виконують роботизовані пристрої. 10. Спосіб за п. 1 або за п. 2, в якому кількість тестованої речовини, яка залишилась у присутності клітин, що експресують САО, визначають шляхом вимірювання виникнення одного або декількох метаболітів тестованої речовини. 11. Спосіб за п. 1 або за п. 2, в якому контрольна проба є умовами, за якими тестовану речовину інкубують протягом попередньо визначеного періоду часу за відсутності клітин, що експресують САО, або клітинних лізатів, одержаних від таких клітин. 12. Спосіб за п. 1 або за п. 2, в якому контрольна проба є сполукою, що метаболізується САО, яку інкубують з клітинами, що експресують САО, протягом попередньо визначеного періоду часу. 13. Спосіб за п. 12, де сполукою є бензиламін. 14. Спосіб за п. 1 або за п. 2, в якому контрольна проба є сполукою, стійкою до метаболізму САО, яку інкубують з клітинами, що експресують САО, протягом попередньо визначеного періоду часу. 15. Спосіб за п. 14, де сполукою є бензойна кислота. 16. Спосіб за п. 1 або за п. 2, в якому контрольна проба є умовами, за якими тестовану речовину інкубують протягом попередньо визначеного періоду часу за відсутності клітин, що експресують САО, або гідралазину. 14 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 17. Спосіб визначення профілю відносної метаболічної стабільності тестованої речовини за метаболізму, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), в рекомбінантних клітинах, які експресують САО, та в біологічній пробі, яка містить САО, де спосіб включає а) визначення метаболічної стабільності тестованої речовини в присутності рекомбінантних клітин, що експресують САО, за допомогою: і) додавання тестованої речовини до клітин; іі) інкубування тестованої речовини з клітинами протягом попередньо визначеного періоду часу; ііі) вимірювання кількості тестованої речовини, яка залишається в присутності клітин, за попередньо визначений період часу; і iv) порівняння кількості тестованої речовини, яка залишається в присутності клітин, за попередньо визначений період часу, з кількістю тестованої речовини в контрольній пробі, для визначення метаболічної стабільності тестованої речовини в присутності клітин, що експресують САО, b) визначення метаболічної стабільності тестованої речовини в присутності біологічної проби, що містить експресовану САО, за допомогою: і) додавання тестованої речовини до біологічної проби; іі) інкубування тестованої речовини з біологічною пробою протягом попередньо визначеного періоду часу; ііі) вимірювання кількості тестованої речовини протягом попередньо визначеного періоду часу; і iv) порівняння кількості тестованої речовини, яка залишається в присутності біологічної проби, за попередньо визначений період часу, з контрольною пробою, для визначення метаболічної стабільності тестованої речовини в присутності біологічної проби, що містить САО; і с) порівняння метаболічної стабільності тестованої речовини в присутності рекомбінантних клітин, що експресують САО, з метаболічною стабільністю тестованої речовини в біологічній пробі, що містить САО, для визначення профілю відносної метаболічної стабільності тестованої речовини за метаболізму, що каталізує САО, в рекомбінантних клітинах, які експресують САО, і в біологічній пробі, що містить САО. 18. Спосіб визначення профілю відносної метаболічної стабільності міченої радіоізотопом тестованої речовини за метаболізму, який каталізує семікарбазид-чутлива аміноксидаза (САО), в рекомбінантних клітинах, які експресують САО та в біологічній пробі, яка містить САО, де спосіб включає a) визначення метаболічної стабільності міченої радіоізотопом тестованої речовини в присутності рекомбінантних клітин, що експресують САО, за допомогою: і) додавання міченої радіоізотопом тестованої речовини до клітин; іі) інкубування міченої радіоізотопом тестованої речовини з клітинами протягом попередньо визначеного періоду часу; ііі) вимірювання кількості міченої радіоізотопом тестованої речовини, яка залишається в присутності клітин, за попередньо визначений період часу; і iv) порівняння кількості міченої радіоізотопом тестованої речовини, яка залишається в присутності клітин, за попередньо визначений період часу, з кількістю міченої радіоізотопом тестованої речовини в контрольній пробі, для визначення метаболічної стабільності міченої радіоізотопом тестованої речовини в присутності клітин, що експресують САО, b) визначення метаболічної стабільності міченої радіоізотопом тестованої речовини в присутності біологічної проби, що містить експресовану САО, за допомогою: і) додавання міченої радіоізотопом тестованої речовини до біологічної проби; іі) інкубування міченої радіоізотопом тестованої речовини з біологічною пробою протягом попередньо визначеного періоду часу; ііі) вимірювання кількості міченої радіоізотопом тестованої речовини, яка залишається в присутності біологічної проби, протягом попередньо визначеного періоду часу; і iv) порівняння кількості міченої радіоізотопом тестованої речовини, яка залишається в присутності біологічної проби, за попередньо визначений період часу, з контрольною пробою, для визначення метаболічної стабільності міченої радіоізотопом тестованої речовини в присутності біологічної проби, що містить САО; і с) порівняння метаболічної стабільності міченої радіоізотопом тестованої речовини в присутності рекомбінантних клітин, що експресують САО, з метаболічною стабільністю міченої радіоізотопом тестованої речовини в біологічній пробі, що містить САО, для визначення профілю відносної метаболічної стабільності міченої радіоізотопом тестованої речовини за метраболізму, що каталізує САО, в рекомбінантних клітинах, які експресують САО, і в біологічній пробі, що містить САО. 15 UA 103300 C2 5 10 15 20 25 30 19. Спосіб за п. 17 або п. 18, при якому рекомбінантні клітини, що експресують САО, одержують проміжною або стабільною трансфекцією клітин ДНК, що кодує САО. 20. Спосіб за п. 19, де ДНК містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 2. 21. Спосіб за п. 19, де ДНК кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1. 22. Спосіб за п. 17 або п. 18, в якому клітини, що експресують САО, є прокаріотичними клітинами. 23. Спосіб за п. 17 або п. 18, в якому клітини, що експресують САО, є еукаріотичними клітинами. 24. Спосіб за п. 17 або п. 18, де біологічна проба є пробою крові, плазми, сироватки, артерії, пуповини, печінки, клубової кишки або легені. 25. Спосіб за п. 17 або п. 18, в якому кількість тестованої речовини визначають методом, вибираним з групи, до якої належать мас-спектрометрія, високоефективна рідинна хроматографія, рідинна хроматографія/мас-спектрометрія, рідинна хроматографія/масспектрометрія/мас-спектрометрія і рідинна хроматографія/сцинтиляційне детектування. 26. Спосіб за п. 17 або п. 18, в якому принаймні одну стадію виконують роботизовані пристрої. 27. Спосіб за п. 17 або п. 18, в якому метаболічну стабільність тестованої речовини визначають шляхом вимірювання виникнення одного або більше метаболітів тестованої речовини на додачу до, або замість тестованої речовини. 28. Спосіб за п. 17 або п. 18, в якому контрольна проба є умовами, за яких тестовану речовину інкубують протягом попередньо визначеного періоду часу за відсутності клітин, що експресують САО, або клітинних лізатів, одержаних від таких клітин. 29. Спосіб за п. 17 або п. 18, в якому контрольна проба є сполукою, що метаболізується САО, яку інкубують з клітинами, що експресують САО, протягом попередньо визначеного періоду часу. 30. Спосіб за п. 29, де сполукою є бензиламін. 31. Спосіб за п. 17 або п. 18, в якому контрольна проба є сполукою, стійкою до метаболізму САО, яку інкубують з клітинами, що експресують САО, протягом попередньо визначеного періоду часу. 32. Спосіб за п. 31, де сполукою є бензойна кислота. 33. Спосіб за п. 17 або п. 18, в якому контрольна проба є умовами, за якими тестовану речовину інкубують протягом попередньо визначеного періоду часу за відсутності клітин, що експресують САО, і гідралазину. 16 UA 103300 C2 17 UA 103300 C2 18 UA 103300 C2 19 UA 103300 C2 20 UA 103300 C2 21 UA 103300 C2 22 UA 103300 C2 23 UA 103300 C2 24 UA 103300 C2 25 UA 103300 C2 26 UA 103300 C2 27 UA 103300 C2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 28