Спосіб визначення зеараленона у білковому продукті

ДЛЯ СЛУЖЕБНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ ЭКЗ Г* Q ( * 0 СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК (И) (5t)5 G 01 N 2 1 / 0 0 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 (21)4771131/13 (22)27.10.89 (71) Центральная научно-исследовательская лаборатория комплексной переработки растительного сырья и отходов агропромышленного производства Южного отделения ВАСХНИЛ (72) М.М.Коганов, Г.А.Лобач, В.Л.Цорин и Т.А.Бузенко (53)541.144.7(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 389446, кл. G 01 N 21/00,1973. Авторское свидетельство СССР № 1593395, кл. G 01 N21/00,1990, непублик. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗЕАРАЛЕНОНА В БЕЛКОВОМ ПРОДУКТЕ (57) Изобретение относится к микологическим исследованиям, в частности к разработке способов тестирования микотоксинов. Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа определения зеараленона на фоне других микотоксинов. Концентрацию зеараленона определяют по степени ингибирования фотохимического восстановления дихлорфенолиндофенола хлоропластами по формуле Изобретение относится к микологическим исследованиям, в частности к разработке способов тестирования микотоксинов. Продукты переработки растений часто бывают заражены вторичными метаболитами плесневых грибов - микотоксинами, вызывающими ряд тяжелых заболеваний человека. В связи с этим для контроля качества белковых продуктов необходимы эффективные способы определения микотоксинов. Проблема обнаружения микотоксинов решалась следующим образом. Методами газожидкостной или тонкослойной хроматографии, а также методами массспектроскопии или хроматографии высокого давления. Целью изобретения является создание более быстрого и точного способа обнаружения микотоксинов в белковых продуктах, не требующего дорогостоящих реактивов и ряда длительных операций. Известен способ обнаружения микотоксинов в кормах, включающий экстракцию микотоксинов из образца в хлороформенный экстракт, обезжиривание его гексаном и бензолом, промывку на колонке с последу* Ющим обнаружением микотоксинов в очищенном экстракте методом тонкослойной хроматографии. К недостаткам этого способа следует отнести наличие подготовительных операций по обезжириванию и промывке экстракта, а также сложность самой методики определе 38-91 f 1* Achi/Аэ1/ 1000т)- 5,13Ч - 1.23х x(Pe-°/Pe- k )]. где Ст - концентрация зеараленона в белковом продукте, М/г; Асы - объем суспензии хлороплзстоэ в опыте, мл; Ре-° - скорость переноса электронов по ЭТЦ хлоропластов в присутствии токсинов в системе; Ре~к скорость переноса электронов по ЭТЦ хлоропластов в отсутствии токсинов в системе; Аэ - общий объем экстракта; Аэ - объем экстракта, введенного в суспензию хлоропластов; гл - вес образца, г. f К 1685145 ния по методу тонкослойной хроматографии, предполагающей необходимо ть проявления, эпюирования и опредепения концентрации микотоксинов в элюате. Многостадийный характер способа определения обуславливает длительность измерения, значительный расход дорогостоящих реактивов, а также неизбежные потери, снижающие точность количественного определения микотоксинов. Известен способ определения зеараленона в белковом продукте, предусматривающий введение экстракта микотоксина в суспензию хлоропластов с последующим определением концентрации зеараленона по изменению относительно контроля активности циклического фотосинтетического фосфорилирования тест-системы. По технической сущности и достигаемому результату этот способ наиболее близок к заявляемому и выбран за прототип. Достоинством прототипа является избирательность зеараленона в белковом продукте на фоне других микотоксинов. К недостаткам этого способа следует отнести недостаточно высокую чувствительность метода, сложность процедуры измерения, обусловленную необходимостью внесения кофакторов фотофосфорилирования и корректировкой рН системы, а также длительность измерений, в процессе которых требуется снятие нескольких светоиндуцированных ответов. Целью изобретения является повышение точности и интенсификация способа за счет фотохимической реакции тест-системы. Поставленная цель достигается тем, что способ определения зеараленона в белковых продуктах на фоне других микотоксинов основан на воздействии зезраленона на скорость переноса электронов по электротранспортной цепи хлоропластов (ЭТЦ). В процессе определения полученный из белкового продукта экстракт микотоксинов вводят в суспензию хлоропластов, содержащую акцепторы электронов, например 2,6дихлорфенолиндофенол ( Д Х Ф И Ф ) , а концентрацию зеараленона рассчитывают по формуле Ст = Асы 1000т 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5,13 X 55 где Ст - концентрация зеараленона в продукте, М/г; Асы - объем суспензии хлоропластов в опыте, мл; Ps-° - скорость восстановлений ДХФИФ в присутствии токсинов в системе; Ре-к - скорость восстановления ДХФИФ в отсутствии токсинов, в контроле; Аэ - общий объем экстракта; Аэ' - объем экстракта, введенного в суспензию хлоропластов; m - вес образца, г. Введение в тест-систему (суспензию хлоропластов), содержащую акцептор электронов ДХФИФ, экстракта токсинов, приводит к тому, что при относительно низких концентрациях только зеараленон непосредственно воздействует на перенос электронов по электронтранспортной цепи х юропластов В данном случае действие зеараленона проявляется при существенно меньших концентрациях его в объеме, чем это имело место в прототипе. Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить точность определения токсина, снизить нижний предел его обнаружения, а также уменьшить расход анализируемого вещества. Изменение экстинкции от времени освещения суспензии хлоропластов носит линейный характер, что позволяет использовать для определения скорости восстановления ДХФИФ машинную обработку экспериментальных данных. Сущность способа заключается в следующем, Хлоропласты выделяют из проростков гороха дифференциальным центрифугированием. Выделение производят при температуре 2.. 5°С в изотонической среде, содержащей 0,4 М сахарозы, 0.025М трис- НОбуфер, 0,01 М NaCI, 0.002 М МдСІг и 0,5% альбумина. Для регистрации фотохимических реакций хлоропласты ресуспендируют в среде следующего состава: 0,4 М сахароза, 0,01 М NaCI, 0,002 М МдСІг. Для определения скорости переноса электронов по ЭТЦ хлоропластов в суспензию вводят акцептор электронов 2,6 дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) в количестве 0,08 мМ в 0.2М фосфат-цитратном буфере (рН6,5). Эксперименты проводят в термостатированной кювете при температуре 20°С на спектрофотометре. В экспериментах в качестве тестируемых веществ использовали стандзртьі микотоксинов афлатоксина В, стеригматоцистина, зеараленона. Токсины растворяли в димєтил сульфоксиде (ДМСО) в концентрации 3,2- 10 М. Выбор растворителя обусловлен тем, что в предваритель 1685145 раленона в суспензии от 1 • 10 до 4- 10 М наблюдается линейная зависимость снижения скорости восстановления ДХФИФ от содержания микотоксина в системе При концентрации зеараленона более 4 -Ю м достигается насыщение метода, что обусловлено тем, что дальнейшее увеличение концентрации зеараленона является нецелесообразным. Поскольку при этом необоснованно будет увеличиваться количество образца белкового продукта. При концентрации зеараленона в системе меньше или равной 5-10" М изменение Скорости восстановления ДХФИФ на уровне чувствительности измерительной аппаратуры и, следовательно, не может быть зарегистрировано. Таким образом, диапазон чувствительности данного метода от 1 • 10~5 М до 4 - 10 М концентрации зеараленона в системе. П р и м е р (осуществление метода). Суспензию хлоропластов получали по вышеописанной методике. Образец белкового продукта весом 25 г заливали 50 мл чистого ДМСО и выдерживали в течение 2 мин при перемешивании. Взвесь центрифугировали при 3000 g в течение 1 мин. Из супернатанта отбирали 10 мкл экстракта и вносили в ячейку, содержащую 50 мкл суспензии хлоропластов. Вносили в кювету измерительного прибора и определяли скорость переноса где tg а - изменение оптической плотности электронов по ЭТЦ хлоропластов. Скорость переноса электронов по ЭТЦ £ - изменение концентрации окислен- 35 хлоропластовдля данного обьема оказалась ной формы ДХФИФ и равной 12,8 • Ю3 М"1. равной 0,68, Результаты измерений при внесении в суспензию хлоропластов, содержащую ак- 7 50 • 10 50 Ст = 4 , 0 • 10 цептор электронов ДХФИФ, смеси мико— 2 10 токсинов в ДМСО, приведены в таблице 1. 40 мых опытах было установлено отсутствие влияния 1% ДМСО на скорость переноса электронов по ЭТЦ. Диапазон концентраций токсинов в наших опытах составил от 5* ЙОГ6 М до 5 \(ҐМ. 5 Перед измерением в реакционную среду, содержащую 2 мл фосфатно-цитратного буфера, 1 мл ДХФИФ, 1 мл НгО, добавляли 50 мкл суспензии хлоропластов (что соответствует концентрации хлорофилла в кю- 10 вете 0,05 мг/мл). Далее в смесь вносим определенное количество токсинов в ДМСО. Полученный раствор разливали в 2 фотометрические кюветы. Одна из кювет использовалась для контроля, температуры, 15 другая периодически освещалась. Согласно программе измерение оптической плотности проводилось автоматически через каждые 30 с. В промежутка между измерениями включали источник света и ос- 20 вещали рабочую кювету в течение 10 с. В процессе работы значение оптической плотности вводилось в память ЭВМ. Скорость переноса электронов по ЭТЦ хлоропластов рассчитывали по восстанов- 25 лению ДХФИФ, в пределах участка линейной зависимости в единицах оптической плотности на миллиграмм хлорофилла в час, по формуле 30 Ре- = tg « • £ ; (м/с) , При внесении а суспензию хлоропластов, содержащую ДХФИФ, смеси микотоксинов в ДМСО: афлатоксина В, стеригматоцистина {без зеараленона) отношение скорости переноса е~по ЭТЦ хлороп- 45 ластов в опыте к контролю (Ре~/Ре-) в диапазоне концентраций от 5 '10 до 5*10 М имело значение близкое к единице. Из сравнения этих данных с данными таблицы 1 следует, что снижение скорости 50 переноса электронов по ЭТЦ хлоропластов наблюдается только при наличии зеараленона, в растворе ДМСО, вносимом в тестсистему, содержащую Д Х Ф И Ф . Это свидетельствует об избирательности данного способа определения зеараленона на фоне других микотоксинов. В свою очередьданные таблицы 1 показывают, что в диапазоне концентраций зеа Из расчета следует, что концентрация зеараленона в исследуемом образце белкового продукта равно 1,9 • 10~6 М/г. Из вышеизложенного следует, что предложенный способ позволяет избирательно определять наличие микотоксина зеараленона в белковом продукте на фоне других микотоксинов и рассчитывать его концентрацию. Учитывая высокую точность определения, а также малую продолжительность определения, данный способ, очевидно, может быть использован для экспресс-анализа зеараленона в белковых продуктах при контроле его качества в процессе производства. 1685145 8 где Ст - концентрация зеараленона в белковом продукте, М/г; Асы - объем суспензии хлоропластов в Способ определения зеараленона в опыте, мл; белковом продукте, включающий экстракцию органическим растворителем и опреАэ - общий объем экстракта зеараленоделение концентрации зеараленона по на, мл; степени ингибирования фотохимической Аэ1 - объем экстракта, введенного в сусактивности хлоропластов высших растений, пензию хлоропластов, мл; о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью m - вес образца, г; повышения точности и упрощения способа, 10 Ре-к- скорость восстановления дихлорконцентрацию зеараленона определяют по фенолиндофенола в отсутствие зеараленостепени ингибирования фотохимического на, контроль; восстановления дихлорфенолиндофенола Ре° - скорость восстановления дихлорхлоропластами по формуле фенолиндофенола в присутствии зеарале15 нона, ОПЫТ. Формула Асы Ст Х10 изобретения 1000т 5,13 X - 4 Соотношение скорости переноса е" по ЭТЦ Концентрация токсинов в суспензии хлоропластов, М 5-10* 1-Ю'5 1-Ю"4 2-Ю'4 3-Ю 4 4-Ю4 5-Ю 4 Редактор Н.Сильнягина о хлоропластов в опыте (Р е- ) к контролю к (Ре") 1,0 0,8 0,68 0,51 0,31 0,18 0,21 Составитель Н Родова Техред М.Моргентал Корректор И Муска Заказ 3860/ДСП Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул Гагарина, 101