Спосіб отримання основи мікробіологічних живильних середовищ

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологии и касается получения основы для приготовления микробиологических питательных сред. Специфическими особенностями изобретения является получение питательной основы из различных соепродуктов с заданным количеством аминного азота для приготовления микробиологических сред. Массовый характер производства питательных сред обуславливает необходимость снижения стоимости способа изготовления. Известен способ получения основы микробиологических питательных сред, при котором в качестве сырья используют соевые бобы и проводят гидролиз протеолитическим ферментом [Трофименко Н.З., Колесинская Н.И., Носкова Л.И. Среды из ферментативных гидролизатов соевых бобов для выращивания чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов. — 1969. — №3 (7). — С.212-213]. В качестве источника протеолитических ферментов используют поджелудочную железу, которая является нестандартным ферментным сырьем, ее ферментативная активность нестабильна и неконтролируема. Это не позволяет использовать поджелудочную железу в качестве стандартизированного источника протеолитических ферментов в промышленных масштабах. Недостатком известного способа является также длительность процесса ферментолиза (5-6 суток). Экстрагирование при этом способе соевых бобов перед гидролизом приводит к вымыванию большого количества белков, сахаров, минеральных веществ и витаминов. Известен способ получения основы микробиологических питательных сред, выбранный в качестве прототипа, при котором берут в качестве субстрата измельченный соепродукт, смешивают с водным раствором, подготавливают смесь к гидролизу путем нагрева, проводят гидролиз протеолитическим ферментом [Авт.св. СССР №1102810, кл. С12N1/20, 1984]. Недостатком этого способа является использование дорогостоящего, дефицитного и нестандартного фермента панкреатина, получаемого из поджелудочных желез убойного скота. В основу изобретения поставлена задача в способе получения основы микробиологических питательных сред путем изменения состава используемых компонентов при осуществлении способа, их соотношений, изменения температурных режимов и их продолжительности обеспечить получение основы микробиологических питательных сред с заданным содержанием аминного азота в условиях массового производства. Поставленная задача решается тем, что в способе получения основы микробиологических питательных сред, включающем нагрев измельченного соепродукта, гидролиз протеолитическим ферментом в присутствии хлороформа в термостатических условиях и стерилизацию согласно изобретению соепродукт смешивают с 0,1М фосфатным буфером в соотношении 1:40-1:60, при подготовке к гидролизу смесь нагревают до температуры 85-95°С и выдерживают в течение 10-20 мин, а в качестве протеолитического фермента используют протосубтилин, причем после гидролиза гидролизат кипятят, охлаждают до комнатной температуры и после отделения непрогидролизованного остатка используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Согласно изобретению гидролиз проводят при соотношении ферментсубстрат 30-50ПЕ/100мл суспензии при температуре 47-50°С в течение 5-8ч при перемешивании. Соепродукты (мука, мучка, шрот, жмых и другие) содержат большое количество белка, сахаров, минеральных ве ществ и витаминов. Под воздействием фермента протосубтилина в оптимально подобранных условиях в суспензии соепродуктов происходит гидролиз белка до небелковых азотистых соединений, легко усвояемых микробной клеткой, и переход остальных водорастворимых химических веществ в ферментолизат, который является хорошей стандартной основой для приготовления микробиологических питательных сред. При проведении исследований установлена прямая зависимость интенсивности технологического процесса гидролиза соевого белка от температурных условий, концентрации фермента протосубтилина и использованного субстрата, и от времени инкубации суспензии, определены оптимальные технологические режимы получения основы микробиологических питательных сред. Результаты представлены в таблице 1 в виде трех технологических режимов, которые легли в основу созданного изобретения, и двух режимов, параметры которых выходят за пределы предполагаемого оптимума, подтверждая, целесообразность режимов, указанных в формуле изобретения. Оптимальность установленного времени гидролиза связана с действием ферменте протосубтилина - в интервале менее пяти часов он не успевает использовать свой гидролитический потенциал, а после восьми часов процесс гидролиза в данных условия х заканчивается. Наличие причинно-следственной связи между заявляемым способом получения питательной основы и содержанием в ней аминного азота в зависимости от использованного технологического режима иллюстрируется материалами, приведенными в табл. 1. Наибольший выход аминного азота наблюдался при использовании режима 4. Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Примеры 1-3. В качестве соевого субстрата используют муку, мучк у и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:50, доводят температуру взвеси до 100°С и выдерживают при этой температуре 5 мин, полученную смесь охлаждают до 45°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 20ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 1мл хлороформа. Гидролиз ведут при 45°С в течение 4ч без перемешивания. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. Приготовленные гидролиэаты из соевых муки, мучки и шрота соотве тственно содержат 42,38 и 30мг % аминного азота. Примеры 4-6. В качестве соевого субстрата используют муку, мучк у и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:50, доводят температуру взвеси до 95°С и выдерживают при этой температуре 10мин, полученную смесь охлаждают до 47°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 30ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 1мл хлороформа. Гидролиз ведут при 47°С в течение 5ч при интенсивном перемешивании в первые 2ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шрота соответственно содержат 95,88 и 82мг % аминного азота. Примеры 7-9. В качестве соевого субстрата используют муку, мучк у и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:50, доводят температуру взвеси до 90°С и выдерживают при этой температуре 15мин, полученную смесь охлаждают до 48°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 40ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 1,5мл хлороформа. Гидролиз ведут при 48°С в течение 6ч при интенсивном перемешивании в первые 2,5ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шрота соответственно содержат 104, 100 и 94мг % аминного азота. Примеры 10-12. В качестве соевого субстрата используют муку, мучку и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:50, доводят температуру взвеси до 85°С и выдерживают при этой температуре 20мин, полученную смесь охлаждают до 50°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 50ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 2мл хлороформа. Гидролиз ведут при 50°С в течение 8ч при интенсивном перемешивании в первые 3ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шрота соответственно содержат 130,120 и 105мг % аминного азота. Примеры 13-15. В качестве соевого субстрата используют муку, мучку и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:50, доводят температуру взвеси до 80°С и выдерживают при этой температуре 25мин, полученную смесь охлаждают до 52°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 50ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 2мл хлороформа. Гидролиз ведут при 52°С в течение 10ч при интенсивном перемешивании в первые 4ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шрота соответственно содержат 110, 98 и 90мг % аминного азота. В примерах с разведениями соевого субстрата 1:40 и 1-60 приведено использование только технологических режимов №№2, 3, 4 (табл. 1), так как использование режимов №№1 и 5 не дает заданного выхода аминного азота при увеличении расхода фермента и времени гидролиза в режиме №5. При этом изменение режимов разведения субстрата приводит к увеличению непрогидролизованного остатка, если берут густоту взвеси ниже 1:40, и к уменьшению выхода аминного азота, если берут густо ту взвеси выше разведения 1:60. Примеры 16-18. В качестве соевого субстрата используют муку, мучку и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:40, доводят температуру взвеси до 95°С и выдерживают при этой температуре 10мин, полученную смесь охлаждают до 47°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 30ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 1мл хлороформа. Гидролиз ведут при 47°С в течение 5ч при интенсивном перемешивании в первые 2ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шроте соответственно содержат 98, 90 и 85мг % аминного азота. Примеры 19-21. В качестве соевого субстрата используют муку, мучку и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:40, доводят температуру взвеси до 90°С и выдерживают при этой температуре 15мин, полученную смесь охлаждают до 48°С. вносят из расчета на 100мл суспензии 40ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 1,5 хлороформа. Гидролиз ведут при 48°С в течение 6ч при интенсивном перемешивании в первые 2,5ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шрота соответственно содержат 104, 104 и 100мг % аминного азота. Примеры 22-24. В качестве соевого субстрата используют муку, мучку и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:40, доводят температуру взвеси до 85°С и выдерживают при этой температуре 20мин, полученную смесь охлаждают до 50°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 50ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 2мл хлороформа. Гидролиз ведут при 50°С а течение 8ч при интенсивном перемешивании в первые 3ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шрота соответственно содержат 134, 124 и 105мг % аминного азота. Примеры 25-27. В качестве соевого субстрата используют муку, мучку и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:60, доводят температуру взвеси до 95°С и выдерживают при этой температуре 10мин, полученную смесь охлаждают до 47°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 30ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 1мл хлороформа. Гидролиз ведут при 47°C в течение ч при интенсивном перемешивании в первые 2ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течении 10мин, После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шрота соответственно содержат 90, 85 и 78мг % аминного азота. Примеры 28-30. В качестве соевого субстрата используют муку, мучку и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:60, доводят температуру взвеси до 90°С и выдерживают при этой температуре 15мин, полученную смесь охлаждают до 48°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 40ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 1,6мл хлороформа. Гидролиз ведут при 48°С в течение 6ч при интенсивном перемешивании в первые 2,5ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шрота соответственно содержат 100, 100 и 90мг % аминного азота. Примеры 31-33, В качестве соевого субстрата используют муку, мучку и шрот, каждый из которых смешивают с 0,1М фосфатным буфером (pH 7,3) в соотношении 1:60, доводят температуру взвеси до 85°С и выдерживают при этой температуре 20мин, полученную смесь охлаждают до 50°С, вносят из расчета на 100мл суспензии 50ПЕ водного раствора фермента протосубтилина и 2мл хлороформа. Гидролиз ведут при 50°С в течение 8ч при интенсивном перемешивании в первые 3ч. Полученные гидролизаты кипятят 10мин, охлаждают до комнатной температуры и отделяют непрогидролизованный остаток центрифугированием при 4000об/мин в течение 10мин. После этого гидролизаты стерилизуют и используют в качестве основы для приготовления микробиологических питательных сред. Приготовленные гидролизаты из соевых муки, мучки и шрота соответственно содержат 125, 120 и 100мг % аминного азота. Ниже приведены рецептуры микробиологических питательных сред, приготовленных на основе полученных ферментолизатов. Рецептура 1. Компоненты берут в следующем соотношении, г/л: Пептон 10,0 Натрий хлористый 5,0 Агар 20,0 Ферментолизат суспензии соевой мучки с содержанием аминного азота 100мг % Остальное Смесь нагревают до растворения ингредиентов, фильтруют, разливают в стерильную лабораторную посуду (флаконы, пробирки и т.п.), стерилизуют, pH готовой среды составляет 7,3-7,4, Рецептура 2, Компоненты берут в следующем соотношении, г/л: Пептон 10,0 Натрий хлористый 5,0 Агар 20,0 Ферментолизат суспензии соевого шрота с содержанием аминного азота 105мг % Остальное Далее среду готовят, как указано в рецептуре 1. Рецептура 3. Компоненты берут в следующем соотношении, г/л: Пептон 10,0 Натрий хлористый 5,0 Агар 20,0 Ферментолизат суспензии соевой муки с содержанием аминного азота 134мг % Остальное .Далее среду готовят, как указано в рецептуре 1. Рецептура 4. Компоненты берут в следующем соотношении, г/л: Натрий хлористый 5.0 Агар 30,0 Ферментолизат суспензии соевой муки с содержанием аминного азота 134мг % Остальное Далее среду готовят, как указано в рецептуре 1. Для оценки ростовых свойств агаровых сред, приготовленных на основе разных серий ферментолизатов в сравнении с контрольной (мясопептонный агар с содержанием аминного азота 74,0мг %) использовали биологические показатели - рост тест-штаммов при посеве 100 расчетных бактериальных клеток, полученных методом серийных разведений из одномиллиардной взвеси суточных культур (1млрд/мл), приготовленной с использованием оптического стандарта мутности. Основные результаты сравнительного испытания контрольной среды с вариантами среды, описанными в рецептурах 1-3, приведены в таблице 2. При этом оказалось, что тест-штаммы по всхожести, количеству выросших колониеобразующих единиц (КОЕ), а также по их размеру не уступали росту и размеру КОЕ на контрольной среде, а в некоторых случаях даже их превосходили. Так, всхожесть КОЕ наблюдалась уже после 17-18ч инкубации при 37°С как на опытных средах, так и на контрольной. Количество выросших КОЕ в зависимости от использованной рецептуры равнялось для Staphylococcus aureus 209-Р от 59% до 70%, на контрольной среде - 67%. Для Escherichia coli M-17 - от 64% до 90%, на контрольной - 72%. Для Micrococcus luteus - от 77% до 89%, на контрольной - 82%. Средний размер выросших КОЕ также в большинстве случаев не уступал этому показателю на контрольной среде. Исключение составляет опытная среда, приведенная в рецептуре 4, на которой количество выросших КОЕ и их размер несколько уступали этим показателям, полученным как на контрольной среде, так и на опытных по рецептурам 1-3, что связано с отсутствием в ее рецептуре пептона (табл.2). На всех средах наблюдался рост КОЕ в S-форме. Таким образом, предлагаемый способ позволяет решить поставленную задачу, а именно получать качественную основу с заданным содержанием аминного азота для приготовления микробиологических питательных сред в условиях массового производства.