Спосіб довгострокового збереження живців плодово-ягідних культур

Спосіб довгострокового збереження живців плодово-ягідних культур, що включає збереження заморожених зразків при температурі рідкого азоту, який відрізняється тим, що збільшують об'єм робочої камери для заморожування живців плодово-ягідних культур в 10 разів (до 2 л) та зменшують градієнт температур до 0,1°С/см, швидкість охолодження при цьому змінюють від 0,1°С/год. до 1°С/хв. (19) (21) u200909222 (22) 07.09.2009 (24) 25.02.2010 (46) 25.02.2010, Бюл.№ 4, 2010 р. (72) ГОРБУНОВ ЛЕОНІД ВОЛОДИМИРОВИЧ, РЯБЧУН ВІКТОР КУЗЬМОВИЧ, ШИЯНОВА ТЕТЯНА ПАВЛІВНА, САЛІНА АЛЛА СЕРГІЇВНА (73) ІНСТИТУТ РОСЛИННИЦТВА ІМ. В.Я. ЮР'ЄВА УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК, ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК 3 47845 до 30%, на основі застосування сушки: за температури -5±2°С, вологості повітря 85±5%, без примусового обдування [8]. Ступінь вологості визначають шляхом зважування зразків та розрахунку за такими формулами: (1) i ((m0 mk) / m0 ) 100 % , s ((ms / m0) 0 100 % , (2) де: i - вологість зразка (%): i =0 нативного; i =1 після висушування; i =2 кріоконсервування; i =3 регідратації; m0 - початкова маса нативного зразка (г); mk - кінцева маса зразка після зневоднення до постійної маси (г); s - вологість зразка на одному з етапів у процесі висушування (%); ms - маса зразка на одному з етапів в процесі висушування (г). Для збереження остаточної вологості, живці перед охолодженням обробляють воском або парафіном з обох кінців. 3. Режими заморожування засновано на ступінчастому охолодженні із швидкістю 0,1°С/год до температур -5°С -20°С з інтервалом 5°С і витримкою одну та три діб, відповідно, при переміщенні зразків, розміщених в побутових термосах місткістю 2л в рефрижератори. Охолодження від температури -20 до -196°С реалізовують безпосереднім зануренням зразка в рідкий азот із швидкістю 600°С/хв. 800°С/хв. 4. Зберігання зразків проводять в посудинах Дьюара в парах азоту при температурі -160 180°С або в рідкому азоті -196°С. 5. Відтавання зі швидкістю 70°С/хв проводять при безпосередньому розміщенні зразка в примі 4 щенні при температурі 20°С. 6. Регідратація. Для цього живці ставлять на гідратацію в ексикатор з дистильованою водою і витримують на протязі 12 днів при температурі 5°С. 7. Показник збереженості оцінюють за допомогою проведення гістологічних зрізів бруньок і живців які визначають за допомогою морфоанатомічних досліджень з використанням бінокуляру (розтин бруньок та деревини з визначенням їх пошкодженням за кольором) [9]. Контроль життєздатності проводять пророщуванням в склянках з водою при температурі t =20°С 25°С та укоріненням живців в ґрунті. Набухання і розвиток бруньок вказувало на життєздатність досліджуваного зразка. Відсоток життєздатності зразка оцінюють, як відношення кількості живців з розкритими бруньками після пророщування до загальної їх кількості у зразку. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1 Об'єктом кріоконсервування були живці: чорної смородини (Ribes nigrum L.); вишні - Степова (Prunus cerasus L.), малини (Rubus idaeus L.). Контролем для обраних способів кріоконсервування застосовувалися живці берези (Betula pubescens). Результати дослідів показали, що стовідсоткова життєздатність живців берези спостерігається при висушуванні зразків від 44% до 31% в діапазоні температур від 20°С до -4°С. Стовідсоткові результати збереженості і життєздатності біооб'єкту відповідали зміні температур в діапазоні від 5 до - 196°С із швидкостями охолоджування 0,1°С/год і відігрівання 0,1°С/год і 70°С/хв (табл. 1). Відсоток вологості до охолодження складав 36%, а після відігрівання від 20%. Таблиця 1 Вплив ступінчастого охолодження живців берези на їх життєздатність при охолодженні із швидкістю 0,1°С/год до температури -20°С і 800°С /хв до -196°С Вологість після Охолодження до температури, Вологість після відігрісушки,% °С (витримка, діб) вання, % 35,7 -20 (30) 22,3 35,5 -20 (90) 20 35,5 -20 (90) -196 (10) 20 Примітка: початкова вологість живців складає дкість відігрівання -70 °С/хв. Зберігання зразків впродовж 5 місяців приводило до зниження життєздатності біооб'єкту до 30% при використанні низьких температур -5°С, і залишався на рівні ста відсотків при використанні наднизьких -160 -196°С. Разом з тим, при використанні температури зберігання -28°С впродовж шести місяців, життєздатність біооб'єкту не змінювалася при рівні вологості, яка досягала 14%. При сушці живців чорної смородини життєздатність зразків не змінювалася при зниженні їх вологості до рівня 42%. Охолодження зразків із шви Збереженість, S±m, % 100±0 100±0 100±0 Життєздатність, V±m, % 100±0 100±0 100±0 o =40,0 %; довжина 6±1 (см), діаметр 0,4±0,2 (см). Швидкістю 0,1°С/год до температури -20°С і 800°С/год до -196°С, відігрівання - 70°С/хв дало можливість одержати стовідсоткову життєздатність деконсервованих об'єктів (табл. 2). При цьому час витримки при температурах -20 і -28°С варіював від 10 до 60 діб. Вологість деконсервованих зразків, які мають стовідсоткову життєздатність варіювала, від 34 до 43%. 5 47845 6 Таблиця 2 Вплив ступінчастого охолодження живців чорної смородини на їх життєздатність при охолодженні із швидкістю 0,1°С/год до температури -20°С і 800°С/хв до -196°С Вологість після Охолодження до температури, сушки,% °С (витримка, діб) 47,2 -20 (60) 48,2 -28 (10) 41,9 -20 (30); -196 (10) 41,9 -28 (10); -196 (10) Вологість після відігрівання, % 42,5 38,5 33,7 33,7 Збереженість, S±m, % 100±0 100±0 100±0 100±0 Життєздатність, V±m, % 100±0 100±0 100±0 100±0 Примітка: початкова вологість живців складає o =49,8%, життєздатність Vo =100; довжина 7±1 (см), діаметр 0,4±0,1 (см). Швидкість відігрівання 70°С/хв. Зберігання зразків впродовж 6 місяців не приводило до зниження життєздатності живців при їх зберіганні при температурі -28 і -196°С. Тоді як, використання вищої температури -5°С приводило до зниження життєздатності зразків до 70-80%. Максимальна життєздатність - 70% живців ма лини, після охолодження до температури -196°С, одержана при початковій вологості зразка 38% (табл. 3). При вологості 34% рівень життєздатності знизився до 57% у зв'язку з тим, що мінімально допустимий рівень після сушки, складає - 37%. Таблиця 3 Вплив ступінчастого охолодження живців малини на їх життєздатність при охолодженні із швидкістю 0,1°С/год до температури -20°С і 600°С/хв до -196°С Вологість після сушки,% 40,0 38,0 38,3 34,3 34,4 Охолодження до температури, °С (витримка, діб) -5 (30); -20 (30) -5 (30); -20 (30) -20(30); -196(10) -20 (30); -196 (10) -20 (30); -196 (10) Вологість після Збереженість, S±m, Життєздатність, відігрівання, % % V±m, % 31,1 100±0 100±0 23,3 100±0 100±0 80±15 70±16 70±16 63±16 24 29 29,8 70±16 57±17 Примітка: початкова вологість живців складає o =40,0%, життєздатність Vo =100; довжина 11±1 (см), діаметр 0,6±0,2 (см). Швидкість відігрівання - 70°С/хв. Життєздатність деконсервованих живців вишні після глибокого заморожування склала 75% при початковій вологості зразків 40 42% (табл. 4). Після охолодження зразків життєздатність виявилася дещо вище 44 75% при такому ж рівні вологості 42%. Для вологості 31% життєздатність знизилася до 44%. Таблиця 4 Вплив ступінчастого охолодження живців вишні на їх життєздатність при охолодженні із швидкістю 0,1°С/год до температури -20°С і 800°С/хв до -196°С, швидкість відігрівання 70°С/хв. Вологість після Охолодження до темпера- Вологість після відіг- Збереженість,S±m, сушки, % тури, °С (витримка, діб) рівання, % % 40 -5 (25); -20 (3) 32,4 100±0 42 -5 (30); -20 (30); -28 (15) 30,3 100±0 42 -20 (30);-196(1) 80±12 31 -20 (30);-196(1) 90±10 Життєздатність, V±m, % 80±13 80±13 75±14 44,4±14 Примітка: початкова вологість живців складає діаметр 0,4±0,1(см). o =42,0%, життєздатність Vo =100; довжина 5±1 (см), Аналіз одержаних результатів показує, що живці берези, чорної смородини зберігають початкову життєздатність в результаті застосування різних режимів сушки, ступінчастого охолодження із шви дкістю 0,1°С/год до температури -20 -28°С, тривалого зберігання при температурах -160 -196°С і подальшим відтаванням зі швидкістю 70°С/хв. Разом з тим, показано, що рівень вологості зразків 7 47845 не повинен бути менше 32% для живців берези і 37% смородини, в позитивному діапазоні використовуваних температур. При негативних температурах -28 -196°С дана величина може знижуватися до 14 і 30%, відповідно. Нижче за дані критичних значень життєздатність досліджуваних зразків різко знижується внаслідок надмірного обезводнення клітин (ефект плазмолізу). Слід зазначити, що ступінчате охолодження дає можливість усунути необхідність попередньої сушки зразків, за допомогою використання низькотемпературної сублімації внутрішньоклітинної води. Таким чином, визначення області допустимих значень вологості, швидкостей охолодженнявідігрівання, температури і часу витримки перед зануренням в рідкий азот живців берези, смородини, малини, вишні дали можливість збільшити життєздатність деконсервованих зразків в 24-5 разів порівняно з існуючими способами кріоконсервування [1, 2, 4-7]. Області допустимих значень параметрів, які забезпечують максимальну життєздатність досліджуваних живців: берези; чорної смородини; малина; вишні, відповідають вологості 32 40%; 40 50%; 37 40%; 33 45% відповідно у позитивному діапазоні температур і 14 28%, 30 40%, 23%, 37% негативному. При використанні різних режимів сушки і охолодження із швидкістю 0,1°С/год до -20°С з подальшим зануренням в рідкий азот можна реалізувати 100% рівень життєздатності деконсервованих живців смородини і берези, малина - 70%, вишні - 57%. Цей спосіб дозволяє підвищити життєздатність деконсервованих зразків у 2-5 разів, без необхідності використання обладнання, яке дорого коштує, що дає можливість зберігати генофонд рослинних клітин необмежену кількість часу. Перелік посилань: 1. Туманов И.И., Красавцев О.А., Хвалин Н.Н. Повышение морозостойкости березы и черной Комп’ютерна верстка М. Ломалова 8 смородины до -253°С путем закаливания // Докл. АН СССР.- 1959.-т.127. - С. 1301. 2. Sakai A. Survival of the twig of woody plants at -196°С // Nature. - 1960. - v. 185. - P. 393. 3. Leigh E. Towill and Philip L. Forsline Cryopreservation of sour cherry (prunus cerasus L.) using a dormant vegetative bud method // Cryoletters. - 1999. - V. 20. - P. 215-225. 4. Yongjie Wu, Yanhua Zhao, Florent Engelmann, Mingde Zhou, Deming Zhang and Shuangying Chen, Cryopreservation of apple dormant buds and shoot tips // Cpyoletters . - 2001. - V. 22. P. 375-380. 5. Popov A.S., Popova E.V., Nikishina T.V. and Vysotskaya O.N., Cryobank of plant genetic resources in Russian Academy of Sciences // International Journal of Refrigeration - 2006. - V. 29. P. 403-410. 6. Вержук В.Г., Филиппенко Г.И., Тихонова Н.Г., Жестков А.С. Способы криосохранения генплазмы плодовых культур на примере смородины, жимолости и крыжовника // Биофизика живой клетки. - 2008. - Т. 9. - С. 35-36. 7. Горбунов Л.В., Шиянова Т.П., Рябчун В.К. Оптимізація умов дегідратації живців плодовоягідних культур // Генетичні ресурси рослин. 2008. - №5 - С. 182-187. 8. Соловьева М.А. Методы определения зимостойкости плодово-ягодных культур. Методическое пособие// Ленинград Гидрометеоиздат. - 1982. - 35с. 9. Пат. 38781UA Україна, МПК А 61 D 19/02. Пристрій для кріоконсервації об'єктів тваринного і рослинного походження / Горбунов Л.В., Міщенко А.Г.; заявник та патентовласник Інститут тваринництва УААН. - Інститут тваринництва УААН. №а200602103; заявл. 27.02.2006; опубл. 26.01.2009; Бюл. №2. - 8 с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601