Штам бактерій lactobacillus plantarum для виготовлення пробіотичних препаратів для тварин та мікробних консервантів для кормовиробництва

Реферат: Винахід належить до штаму Lactobacillus plantarum, депонованого у депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів під реєстраційним номером 677 для виготовлення пробіотичних препаратів для тварин та мікробних консервантів для кормовиробництва, ізольований з кишкового тракту телят. Штам Lactobacillus plantarum, реєстраційний номер 677 має стабільно високі ферментативні та антагоністичні властивості відносно до патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів, що дозволяє використовувати його для виготовлення пробіотичних препаратів для тварин та мікробних консервантів для кормовиробництва. UA 115938 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Винахід належить до галузі біотехнології та мікробіології і може бути використаний для виробництва пробіотичних препаратів для тварин та мікробних консервантів для кормовиробництва. Відомо, що важливу роль у захисті організму від патогенних мікробів відіграє нормальна мікрофлора травного тракту тварин. Найбільш екологічним, безпечним та водночас ефективним способом корекції мікробіоценозу макроорганізму є біопрепарати, виготовлені на основі молочнокислих бактерій - найбільш цінних представників нормальної мікрофлори кишечнику, оскільки вони є природними антагоністами патогенних мікроорганізмів [1-3]. Разом з тим, світова практика свідчить про ефективне застосування біологічних консервантів, основою яких є молочнокислі бактерії, для консервування зеленої маси рослин. Використання спеціально селекціонованих штамів цих бактерій забезпечує надійну ферментацію у зеленій масі та дозволяє отримати корм високої якості [3]. В основу винаходу поставлена задача одержати штам бактерій виду Lactobacillus plantarum KT-L18/1 для виготовлення пробіотичних препаратів для тварин та мікробних консервантів для кормовиробництва з вираженими ферментативною активністю та антагоністичними властивостями по відношенню до патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів. Відомо штам бактерій Lactobacillus plantarum L5, який є найбільш близький до винаходу, що використовують для виробництва пробіотичного препарату та бактеріальної закваски. Проте зазначений штам має антагоністичну активність до обмеженого спектра умовно-патогенних мікроорганізмів та недостатньо високою ферментативною активністю [4]. Запропонований штам Lactobacillus plantarum KT-L18/1, ізольований з травного тракту телят. Штам депонований у депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (вул. Донецька, 30, м. Київ, Україна) 04.01.2016 р. за реєстраційним номером 677. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму: грампозитивні, прямі, нерухомі палички з закругленими кінцями, розміром 3-8×0,5-1,1 мкм, утворюють ланцюжки, спор та капсул не утворюють. При рості штаму на рідкому середовищі MRS на 48-72 годину спостерігається рівномірне помутніння, можливе утворення осаду. На щільному середовищі MRS виростають дрібні, сіруваті колонії, округлої або сочевицеподібної форми. На капустяному агарі з крейдою - колонії дрібні, округлі до 1-2 мм у діаметрі з зоною просвітлення. Штам не утворює індолу та сірководню. Каталазу та желатиназу не продукує. Газ з глюкози не утворює, нітрати не редукує, крохмаль не гідролізує, викликає зсідання молока. Толерантний до 6,5 % концентрації NaCl. На рідкому середовищі MRS спостерігається ріст за температури 15 °C, за 45 °C - ріст відсутній. Лакмусове молоко підкислює. Штам Lactobacillus plantarum KT-L18/1 гідролізує казеїн, ферментує широкий спектр вуглеводів. Штам не токсичний і не патогенний для лабораторних тварин при застосуванні всередину [5]. Спосіб та умови для культивування та довготривалого зберігання штаму. Штам культивують на стерильному знежиреному молоці з підвищеним вмістом сухих речовин (до 16 %) та 0,1 % тринатрій цитрату (Na3С6Н5О7·2Н2О), з вихідним значенням рН 6,8-7,0 за температури 37 °C упродовж 24 годин. Для досягнення підвищеного вмісту сухих речовин додають сухе молоко. Посівний матеріал вносять із розрахунку 1,0 % до об'єму середовища. Штам зберігається на стерильному знежиреному молоці за температури 3-5 °C в сухому темному місці упродовж місяця або у ліофільно висушеному стані. Переваги демонструються такими прикладами. Приклад 1. Антагоністичні властивості. Для визначення антагоністичної активності штаму було застосовано дифузний метод агарових блоків [6; 7]. Штам глибинним методом засівали на живильний агар MRS [8], вирощували упродовж 3 діб, після чого вирізали агарові блоки з вирослими лактобактеріями та накладали їх на поверхню МПА в інші чашки зі щойно засіяними тест-культурами. Упродовж доби чашки витримували у холодильнику, а потім культивували у термостаті за оптимальної температури росту для патогенних та умовно-патогенних культур ПМ та УПМ. Результати представлені у таблиці 1. 1 UA 115938 C2 Таблиця 1 Антагоністичні властивості штамів молочнокислих бактерій Зона затримки росту, мм Lactobacillus Lactobacillus plantarum KT-L18/1 plantarum L5 20-23 9-10 19-22 7-8 15-18 8-10 16-18 6-7 15-17 0-5 9-16 4-6 10-12 5-7 № п/п Штами тест-культур ПМ та УПМ 1 2 3 4 5 6 7 5 Escherichia coli 055к59№3912 Proteus mirabilis №3177 a Shigella flexneri 2 №160 Pseudmonas aeruginosa ATCC-27853 Klebsiella pneumonia №67 Proteus vulgaris №13 Staphylococcus aureus №906 Приклад 2. Визначення кількості молочної кислоти, що утворюється у рідкому середовищі. Для молочнокислих бактерій використовували стерильне знежирене молоко. Середовище 3 інокулювали 0,1 см культури та культивували при 37 °C 14 діб. Після інкубації добре розбовтували згусток та відбирали у колбу 5,0 мл. Додавали 2-3 краплини розчину фенолфталеїну та титрували розчином натрію гідроксиду (NaOH) до появи рожевого забарвлення[3]. Таблиця 2 Утворення молочної кислоти на рідкому середовищі штамами мікроорганізмів виду Lactobacillus plantarum + Штами бактерій Lactobacillus plantarum KT-L18/1 (винахід) Lactobacillus plantarum L5 (прототип) Кількість молочної кислоти, ммоль H /л 84,7±2,5 10,0±1,5 10 15 20 25 30 35 Перевагою запропонованого штаму Lactobacillus plantarum KT-L18/1 є наявність виражених ферментативних властивостей та висока антагоністична активність відносно до патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів, що дозволяє використовувати його для виготовлення пробіотичних препаратів для тварин та мікробних консервантів для кормовиробництва. Джерела інформації: 1. Левицкий А.П. Пребиотики и проблемы дисбактериоза / А.П. Левицкий, Ю.Л. Волянский, К.В. Скидан. - Харьков: ЭДЭНА, 2008. - 100 с. 2. Денисенко В.В. Молочнокислые бактерии - основа препаратов пробиотического действия / Денисенко В.В., Найденко И.А. // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. научн. трудов. - Минск: изд. И.П. Логвинов, 2007. - Т. 1. - С. 233-241. 3. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования / Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. - М.: Наука, 1975. - 392 с. 4. Властивості штамів мікроорганізмів Lactobacillus plantarum L5 і Bacillus subtilis В3 та перспективи їх застосування у тваринництві / [Сорока В.І., Божок Л.В., Дерев'янко С.В. та ін.] // Сільськогосподарська мікробіологія: міжвід. темат. наук. зб. - Чернігів: ЦНТЕІ, 2009. - Вип. 10. С. 124-132. 5. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: учеб. пособие / под ред. Н.С. Егорова. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с. (С. 167) 6. Иркитова А.Н. Сравнительный анализ методов определения антагонистической активности молочнокислых бактерий / А.Н. Иркитова, Я.Р. Каган, Г.Г. Соколова // Известия АГУ. - 2012. - № 3-1(75). - С. 41-44. 7. Аникеев В.В. Руководство к практическим занятиям по микробилогии / В.В. Аникеев., К.А. Лукомская. - М, 1977. - 112 с. 8. de Mann J.C. A medium for the cultivation of lactobacilli / de Mann J.C., M. Rogosa, M. Elisabeth Sharpe // Journal of applied bacteriology. - 1960. - Vol. 23, № 1. - P. 130-135. 2 UA 115938 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 Штам бактерій Lactobacillus plantarum для виготовлення пробіотичних препаратів для тварин та мікробних консервантів для кормовиробництва, депонований у депозитарії Державного науковоконтрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів за реєстраційним номером 677. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3