Штам бактерій lactobacillus plantarum, що використовується у виробництві бактеріальних препаратів та ферментованих м’ясних продуктів

Штам бактерій Lactobacillus plantarum 1MB В7121, що використовується у виробництві бактеріальних препаратів та ферментованих м'ясних продуктів. (19) (21) u201004109 (22) 08.04.2010 (24) 25.10.2011 (46) 25.10.2011, Бюл.№ 20, 2011 р. (72) КОРОЛЬ ЦВІТАНА ОЛЕКСАНДРІВНА, ДАНИЛЕНКО СВІТЛАНА ГРИГОРІВНА, КІГЕЛЬ НАТАЛЯ ФЕДОРІВНА 3 фіковано як промислово-цінний у лабораторії гігієни виробництва й мікробіології ВШІМП. Штам також має високу кислотоутворювальну та антагоністичну активності. Однак даний штам характеризується низькою солестійкістю - є стійким лише до 4,0 % NaCl, що робить його непридатним до застосування у виробництві цільном'язових ферментованих м'ясних продуктів та використанні при посолі. Окрім того, недоліком штаму є відсутність спектра та інтенсивності антагоністичної дії щодо патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів. Найближчим до штаму, що заявляється, є штам бактерій Lactobacillus plantarum 1MB В-7058 [Пат. 74726 Україна, кл. С12N 1/20, А22С 11/00, 2006, прототип], який адаптовано до м'ясної сировини і застосовується у виробництві бактеріального препарату "Лакмік" для сиров'ялених та сирокопчених м'ясних продуктів. Цей штам молочнокислих бактерій проявляє поряд зі значною енергією кислотоутворення та ароматоутворення ще й антагоністичну активність до сторонньої мікрофлори, що забезпечує необхідний санітарний стан готового продукту. Додавання до заквашувальної композиції селекціонованих штамів М. various та L. plantarum дозволяє знизити дозу нітриту натрію та сприяє формуванню яскравого червоного кольору м'яса. Однак штам L. plantarum характеризується низькою питомою швидкістю росту, що подовжує процес готування посівного матеріалу та виробництва бактеріального препарату. Окрім того, недоліком штаму є незначна протеолітична активність та здатність до нагромадження речовин вільних циклічних та ациклічних амінокислот. Низький рівень цих амінокислот відображається на менш вираженому ароматі м'ясного продукту. Задачею корисної моделі є одержання штаму Lactobacillus plantarum, адаптованого до активного розвитку у м'ясній сировині з широким спектром антагоністичної та біохімічної активностей та значним ступенем виживання під час ліофілізації. Штам бактерій Lactobacillus plantarum було одержано в результаті спрямованої селекції культури, виділеної із некомерційної сиров'яленої ковбаси. Ідентифіковано як вид Lactobacillus plantarum за основними морфологічними, культуральними і фізіолого-біохімічними властивостями [Краткий определитель Берги, 1982; Л.А.Банникова. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности, 1975]. Штам задепоновано в депозитарії Національної колекції промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного ПАНУ (ІMB НАНУ) і зареєстровано під номером ІMB В-7121. Скорочена назва мікроорганізму: Lactobacillus plantarum 1MB В-7121 -L. plantarum 7121. Штам бактерій L. plantarum 7121 використовується у виробництві бактеріальних препаратів та ферментованих м'ясних продуктів. Застосування цього штаму лактобактерій у виробництві ферментованих ковбас та суцільном'язових виробів дозволить отримати продукт гарантованої якості з 63704 4 яскравим забарвленням та специфічною смакоароматичною гамою. Штам L. plantarum 7121 характеризується такими ознаками та властивостями. Культурально-морфологічні ознаки штаму. Клітини штаму грампозитивні, нерухомі палички шириною 0,5-0,7 мкм; різної довжини від 1,0 мкм до 2,5 мкм; прямі, або вигнуті, не утворюють спор і капсул. Ниткоподібні клітини розташовуються поодиноко або в ланцюжках різної довжини. На поверхні агаризованих середовищ утворюють круглі, гладенькі колонії білого кольору діаметром 1,0-2,0 мм. Глибинні колонії - у вигляді "човників" або дисків. У рідкому середовищі МРС утворюють однорідну каламуть або дрібнодисперсний осад. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Таблиця 1. Штам є факультативним анаеробом. Оптимальна температура росту - (33 = 1) °С, мінімальна - (15 ± 1) °С, максимальна (45 ± 1) °С. Штам росте в гідролізованому молоці з вмістом 20 - 40 % жовчі, до 6,5 % NaCl, а також у м'ясо-пептонному бульйоні з активною кислотністю від 3,0 од. рН до 9,6 од. рН. Ферментує глюкозу, лактозу, галактозу, фруктозу, манозу, маніт, рафінозу, мелібіозу, цукрозу, арабінозу, ксилозу. Не ферментує мальтозу, рамнозу, сорбіт, інозит, інулін, дульцин, гліцерин, декстрин. Не утворює аміаку з аргініну, не розріджує желатину, не утворює газу з глюкози та цитрату. Лакмусове молоко відновлює й згортає, відновлює нітрит із нітрату. При внесенні 5 % культури L. plantarum 7121 в стерильне знежирене молоко за температури (33 ± 1) °С молокозсідальна активність становить (19±1)год, межа кислотоутворення - (200 ± 2) °Т. Нагромадження клітин в 3 молоці досягає (1,0 - 4,0)-108 КУО/см . За росту у 3 молоці продукує (18,0 ± 0,1) мг/100 см молочної кислоти. Штам здатний активно розвиватися у рідких різних за складом поживних середовищах, які використовують для культивування лактобактерій. Технологічні властивості штаму. L. plantarum 7121 утворює в молоці однорідний нещільний, помірно-в'язкий згусток з характерним ароматним букетом з високою молокозсідальною активністю (18±2) год. Штам, що заявляється, L. plantarum 7121 через 24 год. знижує активну кислотність середовища до 5,3 од. рН; середнє значення титрованої кислотності до таких самих умов - (100 ± 5) °Т табл. 1. Слід зауважити, що підкислення м'ясної сировини відбувається поступово, без надмірного нагромадження кислоти, яка у разі надлишку може призводити до коагуляції білків і як наслідок - погіршення структури м'ясного продукту. Позитивною властивістю штаму порівняно з аналогом є його стійкість до високих концентрацій NaCl - вище 6,5 %, завдяки чому штам L. plantarum 7121 можна залучати до складу заквашувальної мікрофлори, яку застосовують у виробництві ферментованих ковбас, а також у розсолі делікатесних суцільном'язових продуктів табл. 1. Біохімічні властивості штаму Таблиця 2. Штам, що заявляється, порівняно зі штамом L. plantarum ІMB В-7058 активніше відновлює нітрати до нітритів. Нітрит натрію використовують у виробництві ферментованих ковбас як для забарвлення, так і для пригнічення росту Clostridium botulinum упро 5 довж визрівання м'ясопродуктів. Сполукою, що відповідає за утворення стійкого червоного забарвлення ферментованого продукту, є нітрозоміоглобін. Він утворюється за участю нітритредуктази. Під дією цього ферменту нітрат перетворюється в нітрит, а нітрит у кислому середовищі - в азотисту кислоту. В результаті вивільняється оксид азоту, який взаємодіє з міоглобіном або метміоглобіном, утворюючи нітрозоміоглобін, що й забезпечує інтенсивне забарвлення готового продукту. Для утворення стабільного кольору м'ясопродуктів необхідно вносити культури з високою нітритредукувальною активністю, яку має новий штам L. plantarum 7121. Він утилізує 85,2 % нітриту натрію у середовищі. Наприкінці ферментування залишкова концентрація нітриту натрію у культуральній 3 рідині становила 4,45 мг/100 см порівняно з поча3 тковим вмістом солі NaNО2 30 мг/100 см , це свідчить про його перспективність для ферментування м'ясної сировини табл. 2. З іншого боку, високий рівень нітритредукувальної активності гарантує безпеку продукту за вмістом залишкового нітриту, що є важливим для здоров'я споживача. Штам L. plantarum 7121 характеризується достатньо високою протеолітичною активністю та здатністю до нагромадження речовин вільних циклічних та ациклічних амінокислот, діацетилу та ацетону, які впливають на смак і аромат готових продуктів табл. 2. Штам, що заявляється, активно нагромаджує вільні амінокислоти. Так, кількість вільних амінокислот з ациклічною та циклічною структурами, що утворилися завдяки дії протеолітичних ферментів L. plantarum у культуральній рідині, складала до 3 257,6 та 53,5 мг/100 см , відповідно. Такий рівень протеолізу сприяє швидкому розщепленню білка м'ясної сировини та забезпечує інтенсивне визрівання продукту. Штаму L. plantarum 7121 властиве нагромадження речовин, що обумовлюють смак та аромат продукту, у більших кількостях, ніж L. plantarum ІMB В-7058. У інокульованому середовищі, вміст 3 діацетилу становив (1,8±0,1) мг/100 см , ацетоїну 3 (1,8±0,2) мг/100 см табл. 2. Антагоністична активність штаму Таблиця 3. Антагоністичну активність визначали методом "лунок". Результат оцінювали як позитивний, якщо розмір зони затримки росту тест-культури навколо лунки був більше 10 мм. Як тест-культури представників спонтанної мікрофлори м'яса, а саме, умовно патогенні та патогенні штами Escherichia coli 0111 та 113; Proteus vulgaris 2029; Staphylococcus aureus 209, Enterobacteria cloaceae, Bacillus subtilis. Штам L. plantarum 7121 проявляє високу антагоністичну активність до згаданих тест-культур табл. 3. Найефективнішим він був до Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Зони затримки росту коливались від 15 мм до 22 мм у діаметрі. За розміром зони затримки росту В. subtilis, Enterobacteria cloaceae штам, що заявляється, має ширший спектр щодо тест-культур ніж відомий штам L. plantarum ІMB В-7058. Отже, штам L. plantarum 7121 характеризується високим рівнем протеолітичної, ароматоутво 63704 6 рювальної, нітритредукувальної, кислотоутворювальної і антагоністичної активностей, значним ступенем виживання бактеріальних клітин під час їхнього заморожування та сублімаційного сушіння. Високий ступінь виживання бактеріальних клітин L. plantarum під час заморожування та сублімаційного сушіння - 97,8 % - дає змогу одержувати високоактивний сухий бактеріальний концентрат та препарат прямого внесення. Штам L. plantarum 7121 добре сполучається з іншими видами мікроорганізмів, що застосовуються у виробництві бактеріальних препаратів та ферментованих м'ясних виробів. Винахід пояснюється прикладом використання штаму. Приклад 1. Одержання лабораторної за3 кваски L. plantarum 7121. В 100 см стерилізованого МРС за температурою (33±1) °С вносять 1 % свіжої чистої культури L. plantarum і термостатують за вказаної температури, після чого охолоджують і використовують для приготування лабораторної закваски. Для цього у середовище МРС за температури (33±1) °С вносять 3 % первинної лабораторної закваски та витримують за вказаної температури до утворення каламуті упродовж 16-18 годин. Кількість життєздатних клітин L, plantarum у заква8 3 сці складає 8,4-10 КУО/см , титрована кислотність 105 °Т, рН-4,65. Приклад 2. Виготовлення м'ясних продуктів. Готують розсіл для суцільном'язових м'ясних продуктів, збагачений бактеріальним препаратом з використанням штаму L. plantarum ІMB В-7121. До стандартного розсолу вносять бактеріальний препарат з використанням штаму L. plantarum ІMB В7121 у кількості 1,0-1010 КУО/г та витримують за температури 18 °С упродовж 24 год. Далі шприцюють шматки м'яса у кількості 35 % до маси несолоної сировини, а потім проводять масажування, посол і ферментування. Шматки м'яса обробляють стандартним розсолом та збагаченим бактеріальним препаратом, який вміщує штам L. plantarum 7121. Відмирання сторонньої мікрофлори відбувається на 5 діб раніше, прискорюється процес ферментування сировини та формування специфічної смако-ароматичної характеристики порівняно з продуктом шприцьованим стандартним розсолом. Приклад 3. Приготування ферментованої сиров'яленої ковбаси з використанням штаму L. plantarum ІMB В-7121. Сухий бакпрепарат, до складу якого входять молочнокислі бактерії L. plantarum ІMB В-7121, L. casei та денітрифікуючий мікрокок Kocurea rosea (Micrococcus roseus), вносять у кількості 0,05 % до маси сировини. Його розчиняють у кип'яченій охолодженій воді безпосередньо перед внесенням у фарш на стадії кутерування. Потім проводять шприцювання, осаджування та сушіння сиров'ялених ковбас. Контролем слугувала ковбаса, вироблена аналогічно без додавання бакпрепарату. Характеристика сиров'яленої ковбаси надана в табл. 4. У ковбасі, виготовленій з бакпрепаратом, бактерії групи кишкової палички були відсутні на 17 добу сушіння. За отриманими результатами, на 20 добу визрівання - кінець ферментування, концент 7 63704 рація вільних циклічних та ациклічних амінокислот збільшилася у ковбасі з препаратом на 1,48 разів та 6 разів, відповідно, у контролі - на 1,35 та у 4 рази, що свідчить про активний протеоліз у сировині з додаванням препарату. За біохімічними показниками рівень карбонільних сполук (у перерахунку на оцтовий альдегід), становив у ковбасі з бакпрепаратом 1,45 мг %, у контролі - 1,13 мг % , загальний вміст летких жирних кислот був вищим на 12,4 %, ніж у контролі табл.4. На кінець ферментування в ковбасі концентрація нітриту зменшилась на 17,9 % більше ніж у контролі, забарвлення було яскравіше на 23,5 % порівняно з контролем. Ці відмінності у біохімічних показниках, в амінокислотному складі, вмісті летких жирних кислот, карбонільних сполук та продуктів протеолізу позитивно відбилися на органолептичній оцінці ковбас. Після проведення дегустації встановлено, що ковбаса з препаратом мала яскраве забарвлення, 8 ніжну консистенцію, приємний кислуватосолодкуватий присмак. Контроль мав невиражений аромат та присмак старого сала. Таким чином, штам L. plantarum 7121 характеризується високим рівнем протеолітичної, ароматоутворювальної, нітритредукувальної, кислотоутворювальної і антагоністичної активностей, значним ступенем виживання бактеріальних клітин під час їхнього заморожування та сублімаційного сушіння. Отже, додавання бактеріального препарату до м'ясного фаршу забезпечує спрямоване ведення процесу ферментування м'ясної сировини, що сприяє формуванню щільної консистенції та яскравого забарвлення ферментованого продукту і специфічного смако-ароматичного букету, а також забезпечує високий рівень санітарної безпеки продукту. Штам рекомендується для виробництва заквашувальних культур, сухих бактеріальних препаратів та ферментованих м'ясних продуктів. Таблиця 1 Основні фізіолого-біохімічнІ властивості штамів Показник Оптимальна температура росту, °С Титрована кислотність через 24 години ферментування, °Т Молокозсідаюча активність (3 % інокуляту), год. Межа кислотоутворення, °Т Солестійкість (розвиток у присутності NaCl): - 4,5 % 5,0 % 6,5 % Ріст у ГБ із жовчю, % 20 40 Ріст у МПБ з рН 3,0 8,3 9,2 9,6 Утворення CO2 із глюкози Утворення CO2 із цитрату Відновлення лакмусового молока Утворення аміаку із аргініну Розрідження желатину Нітритредукуюча активність Ріст у молоці за температури, °С 15 45 Ступінь виживання під час ліофілізації, % що заявляється L. plantarum ІМВВ7121 32 L. plantarum 1MB B7058 (прототип) L. plantarum 435 (ГНЦА№ 2164) (аналог) 32 30 105 102 101 18±2 24±2 24-48 200 200 150 + + + + + + + + + + ± + + + + + + ВЗ + + + + ВЗ + Н Н Н Н ВЗ + + 97,8 + + 97,5 + Н Позначення. "+" - позитивний результат; "-" - негативний результат; "±" - варіабельний результат; "Н" не визначали, "ВЗ" - відновлюють, згортають. 9 63704 10 Таблиця 2 Біохімічні властивості штамів Показник що заявляється Нітритредукувальна активність, % 3 Вміст вільних циклічних амінокислот,мг/ 100 см 3 Вміст вільних ациклічних амінокислот, мг/100 см 3 Вміст діацетилу, мг/ 100 см Вміст ацетоїну, мг/100 см 85,2 53,5 257,6 1,8±0,2 1,8±0,2 L. plantarum 1MB В-7058 (прототип) 84,6 50,1 204,5 1,7±0,1 1,8±0,2 Таблиця 3 Антагоністична активність штамів що заявляється L. plantarum 1MB В-7121 ++ +++ ++ +++ ++ ++ Тест-культури Escherichia coli Olli Escherichia coli 113 Proteus vulgaris 2029 Staphylococcus aureus 209 Bacillus subtilis Enterobacteria cloaceae L. plantarum 1MB В-7058 (прототип) +++ ++ ++ ++ + ++ Примітка: -+- - Зона затримки росту тест-культури 2-5 мм; ++ - 5-15 мм; + ++ - 15-22 мм. Таблиця 4 Характеристика готової сиров'яленої ковбаси Ферментована ковбаса без препарату з препаратом 112,78 137,68 871,29 1228,65 73,3 80,2 1,13 1,55 3,1 1,3 61,9 76,5 Назва показника Вміст вільних циклічних амінокислот, мг/100 г Вміст вільних ациклічних амінокислот, мг/100 г Вміст летких жирних кислот, мг % Вміст карбонільних сполук, мг % Вміст нітриту натрію, мг % Забарвлення, % Комп’ютерна верстка М. Мацело Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601