Штам бактерій lactobacillus casеi ssp. casei imb b-7017, що використовується у виробництві бактеріальних препаратів та функціональних молочних продуктів

Штам бактерій Lactobacillus casei ssp. casei 1MB B - 7017, що використовується у виробництві бактеріальних препаратів та функціональних молочних продуктів. (19) (21) 2004032040 (22) 19.03.2004 (24) 15.03.2006 (46) 15.03.2006, Бюл. № 3, 2006 р. (72) Науменко Оксана Василівна, Рожанська Олександра Михайлівна, Кігель Наталія Федорівна 3 of forty-seven strains of Lactobacillus ssp. by in vitro techniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in humans // Applied and environmental microbiology. - 1999. - 65, N 11. - P. 4949-4956, прототип]. Штам виділено із молочних продуктів й ідентифіковано як промислово-цінний. Також штам володіє адгезивними властивостями, але індекс адгезивності невисокий ІА - (3,25±0,6). Недоліком штаму є обмежений спектр та інтенсивність антагоністичної дії щодо патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів. Він пригнічує розвиток бактерій двох видів Shigella flexneri та Yersinia enterocolitica, діаметр зон затримки росту не перевищує 5мм. Завданням корисної моделі є одержання власного штаму Lactobacillus casei ssp. casei, що адаптований до активного розвитку у молоці та має пробіотичні риси, а саме: широкий спектр антагоністичної активності; високі адгезивні властивості; кислото- та жовчостійкість; здатність знижувати рівень холестерину. Застосування цього штаму лактобацил у виробництві кисломолочних напоїв дозволить отримати продукт функціонального харчування. Штам бактерій Lactobacillus casei ssp. casei було одержано в результаті спрямованої селекції культури, виділеної із вмісту кишечнику людини. Штам досліджено за морфологічними, фізіологічними та біохімічними властивостями [Краткий определитель бактерий Берги, 1982; Л.А. Банникова Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности, 1975] та задепоновано в депозитарії Національної колекції промислових мікроорганізмів IMB (Україна) під номером IMB В-7017. Штам характеризується такими властивостями. Культурально-морфологічні ознаки штаму. Грампозитивні, нерухомі палички шириною 0,50,7мкм, різної довжини, не утворюють спор, розміщуються у вигляді поодиноких клітин або ланцюжків. В агарі з гідролізованим молоком утворюють колонії білого кольору 1,0мм в діаметрі в вигляді "човників" або дисків. В гідролізованому бульйоні утворюють однорідну каламуть та дрібнодисперсний осад. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Штам є факультативним анаеробом. Оптимальна температура росту має широкий діапазон - (30-37)°С. Штам росте в гідролізованому молоці з 30% жовчі, 6,5% NaCl, не росте у м'ясо-пептонному бульйоні з pH 9,6. Ферментує - лактозу, фруктозу, глюкозу, галактозу, маніт, маннозу, не ферментує рамнозу, ксилозу, гліцерин, декстрин, сахарозу, інозит, рафінозу. Не утворює аміак із аргініну, не гідролізує желатину, не утворює газу з глюкози, цитрату. При внесенні 5% культури в стерильне знежирене молоко за температури (37 1)°С молокозсідальна активність становить (16,5 1,0) год., межа кислотоутворення - (172,4±9,2)°Т. За росту в молоці продукує (0,58±0,10)мг/см3 молочної кислоти, (0,66 0,05)мг% діацетилу та синтезує в'язкі полісахариди. У молоці здійснює глибокий гідроліз казеїну, в результаті якого рівень вільних цикліч 12788 4 них і ациклічних амінокислот зростає до 400% порівняно до вихідного молока. Нагромадження клітин у 10%-ному знежиреному молоці складає 8,548,76 Ig КУО/см3. Штам утворює в молоці м'який, не щільний, помірно в'язкий згусток із характерним ароматним букетом. Штам, що заявляється, вирізняється від відомого за інтенсивністю та спектром антимікробної активності щодо патогенних та умовно патогенних бактерій (табл.1). Штам L. casei ssp. casei 7017 пригнічує ріст всіх використаних тест-культур. Зони затримки росту цих культур після впливу на них L. casei ssp. casei 7017 становили від 15 до 30мм у діаметрі. Генетичні особливості штаму. Штам є поліфагорезистентним: стійкий до фагів, вилучених як із мезофільних, так і з термофільних лактобактерій. За корисною моделлю було проведено дослідження пробіотичних властивостей штаму: кислото- та жовчостійкість, адгезивні властивості, холестеразна активність. Для порівняння використовували різні штами виду Lactobacillus casei: штам-прототип фірми Chr. Hansen і штаманалог L. casei Shirota (Yakult) (табл.2). Як видно з даних таблиці 2, штам L. casei ssp. casei 7017 характеризується високою біологічною активністю: стійкий до низької кислотності середовища, резистентний до дії жовчі, має підвищені адгезивні властивості. За здатністю впливати на рівень холестерину в дослідах in vitro штам L. casei ssp. casei 7017 перевищує всі використані пробіотичні культури - кількість зв'язаного холестерину становить більше 15% до початкового вмісту. Таким чином, запропонований штам володіє пробіотичними властивостями та є перспективним об'єктом у виробництві кисломолочних продуктів функціонального харчування. Приклад 1. Приготування бактеріального концентрату з використанням штаму L. casei ssp. casei 7017. У 70л водопровідної води відновлюють 700г сухого знежиреного молока, вносять 490r пептону, 210г лимоннокислого натрію, 350г оцтовокислого натрію, 14г MgSO4, 35г MnSO4, 700г лактози, 70мл твіну 80. Після розчинення в середовищі встановлюють pH 8,3 шляхом додавання 40%-ного розчину гідроксиду натрію, стерилізують при 121°С протягом 30 хвилин і охолоджують до температури 55 С. Окремо готують і вносять до основи стерильні розчини: 700г глюкози, розчиненої в 2л дистильованої води, 35г аскорбінової кислоти - у 400мл води, стерилізовані при 105 С протягом 15 хвилин, та 1,4л дріжджового автолізату. Після внесення всіх компонентів активна кислотність середовища повинна бути на рівні рН(6,4-6,5). В підготовлене середовище вносять по 1,2л інокулятів штамів Lactobacillus casei ssp.casei 7017, Lactobacillus acidophilus 7771, Streptococcus salivarius ssp.thermophilus 7331 з концентрацією клітин кожного не менше 108КУО/см. Нагромадження бактеріальної маси проводять за температури (37±1) С протягом 12 годин із періодичною нейтралізацією середовища 25%-ним водним розчином аміаку до активної кислотності pH (6,4-6,5). Після закінчення 5 процесу культуральну рідину охолоджують до (15±1) С, нейтралізують до pH (6,7-6,8) і відділяють біомасу на суперцентрифузі при 15000об/хв. Одержану біомасу змішують у співвідношенні 1:2 із стерильним захисним середовищем, 1л якого готують з окремих стерильних розчинів із розрахунку: 200г сахарози, розчиненої в 400мл дистильованої води і стерилізованої при 105 С протягом 15 хвилин; 50г лимоннокислого натрію - у 100мл дистильованої води та 50г сухого знежиреного молока - у 500мл водопровідної води, стерилізованих при (121 1) С протягом 30 хвилин. Суспензію клітин розливають у стерильні кювети шаром не більше 6мм, заморожують за мінус 40°С протягом 16 годин і висушують у сублімаційній сушарці КС-30 за температури від -250С до +300С із масовою часткою вологи в сухому концентраті не більше 5%; тривалість сушіння - 18 годин. 1г сухого бактеріального концентрату містить (1,0-2,0).1011 клітин лактобактерій, в тому числі (1,0-1,1).108 клітин паличок L. casei ssp. casei 7017, молокозсідальна активність концентрату складає 7-8 годин. Бактеріальний концентрат виявляє високу антимікробну активність по відношенню до кишкової палички, протею та стафілококу. Його мінімальна бактерицидна доза складає 10мг, а бактеріостатична 0,01мг. Цей рівень антагонізму достатній для забезпечення елімінації небажаної мікрофлори з кишечнику та санітарного рівня продукту в процесі його виробництва і зберігання. Приклад 2. Приготування функціонального молочного продукту з використанням штаму L. casei ssp. casei 7017. Молоко із вмістом жиру 2,5%, пастеризують за температури (86±2)°С із витримкою 20 хвилин, охолоджують до температури заквашування (37±1)°С та вносять бактеріальний концентрат, виготовлений за прикладом 1, у кількості 5г/т. Сквашування проводять протягом 7-8 годин. Титрована кислотність готового продукту - (70-75)°Т, активна - (4,6±0,1) од. рН. Кількість життєздатних клітин палички L. casei ssp. casei 7017 у продукті досягає (1,0-1,1).108КУО/см3, загальна чисельність бактерій в грамі продукту складає (1,2-1,3).109 клітин. У продукті на 40% знижено рівень холестерину і міститься на 35% менше лактози та майже в 2 рази більше вільних амінокислот у порівнянні з вихідним молоком, р