Штам bifidobacterium lactis 668, використовуваний у складі заквасок, продуктів харчування, лікарських та косметичних засобів

Штам біфідобактерій Bifidobacterium lactis 668 ВКПМ Ac-1673, використовуваний для готування кисломолочних, ферментованих і неферментованих харчових продуктів, біологічно активних добавок, бактеріальних препаратів і косметичних засобів. UA (21) a200708835 (22) 03.11.2005 (24) 27.10.2008 (86) PCT/RU2005/000545, 03.11.2005 (31) 2004138993 (32) 31.12.2004 (33) RU (46) 27.10.2008, Бюл.№ 20, 2008 р. (72) ВУСТІНА ТАТЬЯНА ФЬОДОРОВНА, ПЄРЄМІНОВ СЄРГЄЙ ІГОРЄВІЧ, МОЗГОВАЯ ІРІНА НІКОЛАЄВНА (73) ОТКРИТОЄ АКЦІОНЄРНОЄ ОБЩЄСТВО "ВІММ-БІЛЛЬ-ДАНН" (56) WO9910476 A1, 04.03.1999 WO03099037 A1, 04.12.2003 WO0197822 A1, 27.12.2001 RU2215028 C1, 27.10.2003 PRODUCT DESCRIPTION-Bf. Species 420 DIRECT FP 50 u V7. Art. No. 13581032, DANISKO. 29.04.2003 C2 2 (19) 1 3 84513 плексних продуктів лікувально-профілактичного харчування та бакпрепаратів, здатних забезпечувати високу колонізаційну резистентність кишечнику людини та тварин, відновити їхню нормальну мікрофлору та знизити захворюваність різними кишковими інфекціями. Відомі закордонні моно- і комплексні препарати - еубіотики та кисломолочні продукти, до складу яких входять біфідобактерії видів Bifidobacterium bifidum [патент FR 2336886, 29.07.1977, А23С 9/12], Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis [патент FR 2411008, 06.07.1979, А61К 35/74], Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve [патент CH 637297, 29.07.1983, A61K 39/02], Bifidobacterium lactis [патент US 6379663, 14.03.2002, A01N 63/00]. У нашій країні для готування бактерійних препаратів і продуктів лікувально-дієтичного харчування застосовують штами біфідобактерій видів Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ас-1578 [патент RU 2152993, 20.07.2000, C12N01/20], Bifidobacterium bifidum ВКПМ S-1257 [патент RU 2108383, 10.04.1998, C12N01/20], Bifidobacterium longum B379M, Bifidobacterium bifidum 791 [патент RU 2092064 10.10.1997, А23С09/12], Bifidobacterium adolescentis MC-42 [авторське свідоцтво SU 863639, 15.09.1981, C12N15/00]. У кисломолочних продуктах, збагачених біфідобактеріями, використовують і закордонні штами, наприклад, Bifidobacterium lactis HN-019 [патент RU 2208632. 20.07.2003, C12N01/20], Bifidobacterium lactis 420 [специфікація на штам Bifidobacterium lactis 420 компанії «DANISCO», від 02.05.2003]. Дотепер нічого не відомо про використання вітчизняних штамів Bifidobacterium lactis у вищевказаних областях. Найбільш близьким до штамму, що заявляється, є штам Bifidobacterium lactis 420 (прототип) [специфікація на штам Bifidobacterium lactis 420 компанії «DANISCO», від 02.05.2003\. Штам має антагоністичну активність по відношенню до деяких патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів. За рядом перевірених властивостей відомий штам Bifidobacterium lactis 420 уступає штамму Bifidobacterium lactis 668, що заявляється, зокрема, він є більш чутливим до фенолу, жовчі та менш активним по відношенню до деяких патогенних мікроорганізмів (див. табл. 1 і табл. 2). Розкриття винаходу Задачею даного винаходу є одержання штаму мікроорганізмів виду Bifidobacterium lactis для використання його при готуванні кисломолочних, ферментованих і неферментованих харчових продуктів, заквасок, біологічно активних добавок, бактерійних препаратів, косметичних засобів і т.п. засобів, що містять біфідобактерії. При вирішенні поставленої задачі досягаються такі технічні результати: штам має високу біологічну активність, зокрема, високу антиоксидантну активність (супероксиддисмутазну активність) у порівнянні з інформацією, наявною в літературних джерелах, стійкістю до умов зовнішнього середовища, швидко розмножується на штучни х живильних середовищах, має кислототвірну та антагоніс 4 тичну активність по відношенню до патогенної та умовно-патогенної мікрофлори. Одержання штамів, що мають подібні властивості, сприяє розширенню асортименту пробіотиків, використовуваних для підтримання здоров'я, зокрема, для нормалізації мікрофлори шлунково-кишкового та сечостатевого трактів, шкірних і слизових покривів людини та тварин. Поставлена задача реалізується шляхом використання штаму Bifidobacterium lactis 668 (Ас1673 ВКПМ) у складі заквасок, продуктів харчування, лікарських, бактеріальних, косметичних засобів і т.д. Штам Bifidobacterium lactis 668 може бути використаний в моно- або композиційній пробіотичній концепції при одержанні або виготовленні різних заквасок, кисломолочних, ферментованих і неферментованих харчових продуктів, біологічно активних добавок, бактеріальних препаратів, косметичних засобів. Штам Bifidobacterium lactis 668 виділений з вмісту кишечнику здорової дитини та депонований 29 квітня 2008 у ВКПМ (Росія, Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, 1, ГНИИГ-ВКПМ) за № Ас-1673. Штам, що заявляється, виживає в умовах in vitro, які імітують умови шлунково-кишкового тракту (ШКТ), зокрема, в присутності 40% жовчі, 0,4% фенолу, ферментів ШКТ та при низьких значеннях рН. Штам Bifidobacterium lactis 668, що заявляється, може бути використаний при виробництві кисломолочної продукції, ферментованих харчових продуктів, таких як: квас і т.п., неферментованих харчових продуктів, наприклад: соки, напої і т.п., заквасок та біологічно активних добавок до їжі. Так само, штам Bifidobacterium lactis 668 може широко використовува тися для виробництва косметичних засобів, наприклад: кремів, лосьйонів, живильних масок, гелів, косметичного молочка і т.д. Крім того, штам Bifidobacterium lactis 668 може бути використаний і при виробництві бактеріальних препаратів у вигляді свіч, пероральних та інших засобів. Культуральні, морфологічні та фізіологобіохімічні властивості штаму Bifidobacterium lactis 668. Клітини є грампозитивними, нерухомими, неспоротвірними, каталазонегативними, анаеробними, поліморфними паличками з біфуркацією або стовщенням на 1-2-х кінцях; у рідких живильних середовищах ростуть по всій висоті об'єму, крім зони аеробіозу; при рості на агаризованому середовищі ГМК в анаеробних умовах утворюють дрібні (до 1мм у діаметрі) круглі безбарвні колонії. Оптимальна температура вирощування 3739°C. Штам Bifidobacterium lactis 668 зброджує глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, саліцин, ксилозу, арабінозу, рафінозу з утворенням оцтової та молочної кислот, без утворення газу; сквашує молоко до 32 год. із утворенням згустку; активно нарощує мікробну масу при рості на кукурудзяно-лактозному середовищі (ГМК-1) (склад ГМК-1: кукурудзяно-молочна суміш -15г; пептон -15г; лактоза -9г; аскорбінова кислота 5 84513 0,5г; натрій лимоннокислий тризаміщений -0,6г; магній сірчанокислий - 0,12г; калій фосфорнокислий однозаміщений -2г; натрій фосфорнокислий двозаміщений - 1г; агар - 3г; дистильована вода 1л), біфідум середовищі (БФ) (склад біфідум середовища: глюкоза - 7,5г; лактоза - 2,5г; панкреатичний гідролізат казеїну - 30г; натрій хлористий 2,5г; магній сірчанокислий - 0,5г; L-цистеїн - 0,5г; аскорбінова кислота - 0,5г; дріжджовий екстракт 5г; ацетат натрію - 0,3; агар - 0,75г; дистильована вода - 1л); максимально накопичує мікробну масу до 1224год., досягаючи в 1мл значення Ig КУО (колонієутворювальні одиниці), рівного 8-9; виявляє антагоністичні властивості по відношенню до патогенної та умовно-патогенної мікрофлори (таблиці 1 та 2 наведені наприкінці опису), а саме, більш ніж в 100 разів пригнічує ріст Candida albicans та Proteus vulgaris, більш, ніж в 10000 разів пригнічує ріст Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, більш, ніж в 100000 разів пригнічує ріст Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis при спільному культивуванні в умовах in vitro. Таким чином, пропонований штам Bifidobacterium lactis 668 є технологичним, оскільки активно розмножується в живильному середовищі із накопиченням виробничої біомаси в короткі, 1224год., терміни культивування з високою концентрацією мікробних клітин (Ig КУО~9); має кислототвірні та інгібуючі властивості по відношенню до патогенної та умовно-патогенної мікрофлори, високу антиоксидантну активність (супероксиддисмутазна активність, СОД-активність дорівнює 95,0±0,1 в од./мг білка). Крім того, вивчення спектра чутливості до антибіотиків та антибактеріальних препаратів виявило, що штам Bindobacterium lactis 668 має природну стійкість до: азтреонаму, амікацину, гентаміцину, канаміцину, неоміцину, нетилміцину, поліміксину, сизоміцину, стрептоміцину, сульфаніламіду, тобраміцину, цефтазидиму; є чутливим до левоміцетину, ампіциліну, бензилпеніциліну, ванкоміцину, доксицикліну, карбеніциліну, лінкоміцину, меропенему, оксациліну, олеандоміцину, офлоксацину, піперациліну, рифампіцину, фурагіну, фурадоніну, фуразолідону, цефепиму, цефотаксиму, цефтриаксону, це фуроксиму. Таким чином, за рядом властивостей та їхньою сукупністю штам Bifidobacterium lactis 668 має більшу біологічну активність у порівнянні з відомими штамами Bifidobacterium lactis. Штам Bifidobacterium lactis 668 має стійкість до фенолу та жовчі; стійкість до низьких значень рН і ферментів LLJKT; виражену антагоністичну активність по відношенню до Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis; природну стійкість до: азтреонаму, амікацину, гентаміцину, канаміцину, неоміцину, нетилміцину, поліміксину, сизоміцину, стрептоміцину, сульфаніламіду, тобраміцину, цефтазидиму; гарну те хнологічність (здатність штаму виростати з великим титром, рівним Ig КУО -9 на підібраних середовищах і добре зберігатися в кисломолочних продуктах протя 6 гом необхідного тривалого строку придатності); виражену антиоксидантну активність. Здатність штаму Bifidobacterium lactis 668 виростати з великим титром в живильному середовищі в короткі терміни культивування, його антагоністична, кислототвірна, антиоксидантна активності, здатність зберігатися протягом тривалого часу в кисломолочній продукції та інші корисні властивості уможливлюють використання штаму в складі різних продуктів харчування та засобів лікувально-профілактичного призначення. Здійснення винаходу Приклад 1. Використання штаму Bifidobacterium lactis 668 у складі біологічних речовин, зокрема, у складі біологічно активних добавок. 1 пасаж: ліофілізований штам Bifidobacterium lactis 668 у кількості ~0,1г сухої біомаси вносять у пробірки з живильним біфідум середовищем і титрують методом десятикратних розведень до 10-9. Інкубують при температурі 37-38°С до утворення видимого росту в останніх розведеннях. 2 пасаж: вирослу культуру з 10-7-9 розведень в об'ємі до 10% вносять у живильне біфідум середовище та культивують при температурі 37-38°C протягом 12-24 год. до утворення густого росту з видимою зоною аеробіозу. 3 пасаж: одержану біомасу в кількості до 10% об'єму вносять у середовище накопичення та культивують 12-24 год. при 37-38°С до одержання біомаси з вмістом живих біфідобактерій не менше 108 КУО/мл. В результаті одержують біологічно активну добавку, яка є суспензією клітин біфідобактерій Bifidobacterium lactis 668 з титром не менше 10 8 КУО/мл, при необхідності можна одержати концентрат клітин біфідобактерій з більш високим титром. Приклад 2. Використання штаму Bifidobacterium lactis 668 для готування неферментованих харчових продуктів. 1 пасаж: ліофілізований штам Bifidobacterium lactis 668 у кількості ~0,1г сухої біомаси вносять у пробірки з живильним біфідум середовищем і титрують методом десятикратних розведень до 10-9. Інкубують при 37-38°С до утворення видимого росту в останніх розведеннях. 2 пасаж: вирослу культуру з 10-7-9 розведень в об'ємі до 10% вносять у живильне біфідум середовище та культивують при температурі 37-38°C протягом 12-24 год. до утворення густого росту з добре видимою зоною аеробіозу. 3 пасаж: одержану біомасу в кількості до 10% об'єму вносять у середовище накопичення та культивують 12-24 год. при 37-38°C до одержання біомаси з вмістом живих біфідобактерій не менше 108 КУО/мл. Одержання неферментованого харчового продукту: вирослу і, при необхідності, сконцентровану біомасу вносять у харчову сировину (молоко, соки та ін.), перемішують і розливають у ємності. В результаті одержують продукт із концентрацією живих біфідобактерій не менше 106 КУО/мл. Приклад 3. Готування кисломолочного продукту лікувально-профілактичного призначення з ви 7 84513 користанням штаму Bifidobacterium lactis 668 як компонента заквасочних культур для готування ферментованих кисломолочних продуктів. 1 пасаж: ліофілізований штам вносять у біфідум середовище культивування та титрують методом десятикратних розведень до 10-9. Інкубують при 37-38°С до утворення видимого росту в останніх розведеннях. 2 пасаж: вирослу культуру штаму Bifidobacterium lactis 668 з останніх розведень вносять у середовище накопичення об'ємом до 10% і культивують при температурі 37-38°C до одержання біомаси з вмістом біфідобактерій не менше 108 КУО/мл. З пасаж: одержану біомасу в кількості до 10% об'єму вносять у середовище накопичення та культивують 12-24 год. при 37-38°C до одержання біомаси зі вмістом живих біфідобактерій не менше 108 КУО/мл. Одержання кисломолочного продукту: одержану біомасу штаму Bifidobacterium lactis 668 в об'ємі до 10% вносять у пастеризовану молочну суміш при температурі 37-38°С разом з іншими заквашувальними культурами, використовуваними за нормою, культивують до утворення згустку (рН = 4,5-4,6). Продукт з концентрацією живих біфідобактерій Bifidobacterium lactis 668 не менше 106 КУО/мл охолоджують до 22°C, розливають у тару та доохолоджують до 6°C. Кількість пасажів може бути збільшена залежно від об'єму виробництва. Приклад 4. Використання штаму біфідобактерій Bifidobacterium lactis 668 для одержання бактеріальних препаратів. Культуру штаму 1-го або 2-го пасажу (приклад 1) вносять у живильне біфідум середовище, культивують при температурі 37-38°C до одержання біомаси біфідобактерій з вмістом живих клітин не менше 108 КУО/мл. До одержаної біомаси додають захисні середовища висушування (сахарозожелатинове середовище, знежирене молоко). Одержану суспензію розливають в ампули або флакони або інші ємності, заморожують при температурі мінус 40-45°C і ліофілізують із замороженого стану у вакуум-сушильних апаратах. Одержа 8 ний препарат містить не менше 108 живих клітин біфідобактерій Bifidobacterium lactis 668 в 1г. Формуючи дози адекватного рівня споживання пробіотичних мікроорганізмів за добу, рівні не менше 5х108 - 5 х1010 КУО (для біфідобактерій), можна використати одержаний препарат як бактеріальний препарат пробіотика. Приклад 5. Використання штаму біфідобактерій Bifidobacterium lactis 668 для одержання косметичних засобів. Культуру штаму 1-го або 2-го пасажу (приклад 1) вносять у живильне біфідум середовище, культивують при температурі 37-38°C до одержання біомаси біфідобактерій Bifidobacterium lactis 668 з вмістом живих клітин не менше 108 КУО/мл. Одержання косметичних засобів: вирослу біомасу (при необхідності концентрат) штаму 668 біфідобактерій вводять до складу косметичного засобу. Приклад 6. Використання штаму біфідобактерій Bifidobacterium lactis 668 для одержання ферментованого продукту. Культуру штаму 1-го або 2-го пасажу (приклад 1) вносять у живильне середовище (біфідум), культивують при температурі 37-38°C до одержання біомаси біфідобактерій з вмістом живих клітин не менше 108 КУО/мл. Для одержання ферментованого продукту типу квасу вирослу біомасу (при необхідності концентрат) штаму біфідобактерій Bifidobacterium lactis 668 вводять у підготовлену основу (вода, цукор, мед, сусло, аскорбінова кислота) разом з Lactobacillus plantarum та Lactobacillus fermentum, перемішують і культивують при 37°С до одержання напою з титрованою кислотністю 65-85°T. Потім напій охолоджують і розливають по пляшках. В результаті одержують готовий лікувальнопрофілактичний продукт з вмістом в 1 мл не менше 107 живих пробіотичних мікроорганізмів. Антагоністична активність штамів Bifidobacterium lactis 668 (що заявляється) і Bifidobacterium lactis 420 (прототип) по відношенню до патогенних мікроорганізмів. 9 Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 84513 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601