Спосіб одержання гонадотропіну, який має активність фолікулостимулюючого гормону, з постменопаузної сечі (сечового концентрату)

Изобретение относится к мочевому фол-л и кул ости мул и рую щему гормону, фармацевтическим композициям, содержащим его и способу его очистки. Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). как известно, пригоден при лечении бесплодия. Препараты, содержащие данный гормон, используются для содействия в протекании беременности с использованием методов in vitro и in vivo. Человеческий ФСГ выделен из гипофиза и постклимактерической мочи человека. Совсем недавно ФСГ получен с использованием методик рекомбинантной ДНК. Первый коммерчески доступный продукт, включающий человеческий ФСГ, содержал ЧМГ(например, ПергоналÒ Сероно), т. е. Человеческий менопаузный гонадотропин, экстрагированный из постклимактерической мочи, представляющей собой смесь ФСГ, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и других мочевых белков. Между тем были сделаны попытки получить чистые ФСГ -препараты как для научных, так и для терапевтических целей. Продукт Метродин Ò (Сероно), в настоящее время доступный в торговле, представляет собой препарат мочевого ФСГ, содержащий другие мочевые белки, однако минимальные количества ЛГ, и используется для лечения бесплодия. Применение данного продукта особенно благоприятно, когда нежелательно вводить экзогенный ЛГ вместе с ФСГ, например, при синдроме поликистоза яичников (СПЯ). До сих пор введение ФСГ для терапевтических целей осуществляли, и успешно, исключительно путем внутримышечной инъекции. Поскольку внутримышечные инъекции, как правило, осуществляют врачи или люди из числа профессиональных медиков, пациенту приходится посещать хирургический кабинет или больницу регулярно с тем, чтобы получить лечение. Это создает значительное неудобство. Кроме того, время, не-; обходимое для осуществления данного типа введения лекарственных веществ, часто является причиной неудовольствия, выражаемого пациентами в связи с тем, что лечение обычно растягивается на несколько недель или даже месяцев. Введение путем подкожной инъекции могло бы позволить осуществить само в ведение пациентам и, следовательно, повысить содействие и готовность пациентов в лечении. Подкожное введение человеческого менопаузного гонадотропина (ЧМГ) было описано [Накамура И. и др., Плодовитость и бесплодие, 46(1), с. 46-54, 1986] в связи с лечением женского бесплодия путем пульсирующего введения ЧМГ посредством подкожного перистальтического насоса. Подкожное введение может сопровождаться таким недостатком, как местная аллергия, вследствие наличия примесей в используемом продукте и, следовательно, может привести к приостановке лечения. П. Пауз ["Человеческий фолликулостимулирующий Гормон". Acta Endocrinologlca Supplementum, 131, 1968] описал и охарактеризовал высокоочищенные препараты гипофизарных и мочевых ФСГ, полученные из замороженных гипофизов и из постклимактерического мочевого концентрата соответственно. Биологические активности составляют около 14000 международных единиц активности ФСГ на мг для гипофизарного ФСГ и 780 международных единиц активности ФСГ на мг для мочевого ФСГ. Содержание контаминации ЛГ в большинстве активных гипофизарных и мочевых препаратов, как ожидается, соответствует, приблизительно, 0,1% по массе. Методики очистки включают один или более таких способов, как хроматография надиэтиламиноэтилцеллюлозе, гельфильтрация на Сефадексе G-100, гидроксилапатитовая хроматография, электрофорез в полиакри-ламидном геле и подобное. Один из наиболее очищенных препаратов ФСГ был описан Донини и др. ["Очистка и частичное химикофизическое исследование ФСГ из Климактерической Мочи". Гонадотропины и Яичниковое развитие (Труды двух рабочих встреч). Ε и С Ливингстон. Эдинбург и Лондон, 1970] и имел биологическую активность 1255,6 международных единиц ФСГ на мг при контаминации ЛГ до 3,2 международных единиц Л Г на мг. В данном случае исходным материалом являлся человеческий климактерический гонадотропин (ЧКГ) в виде препарата ПергоналÒ , который, как указано выше, представляет собой смесь ФСГ и гормона ЛГ, а также других мочевых белков. Этот результат был достигнут периодической очисткой исходного ЧКГ на диэтиламиноэтилцеллюлозе с последующей хроматографией на колонке диэтиламиноэтилцеллюлозы, гельфильтра-цией на Сефадексе G-100 и конечной стадией препаративного полиакриламидного гель - электрофореза. Даже более высокие активности были достигнуты X. ван Хеллом и др. ["Очистка и некоторые свойства человеческого мочевого ФСГ и Л Г, Гонэдотропины (Труды 1-го международного симпозиума по Гонадотропинам, 1971). Уили-Интерсайенз. Нью-Йорк] ·. путем добавления стадий иммунохроматог-рафии и гельфильтрации к традиционному методу хроматографической очистки. Иммунохроматографию осуществляли с использованием анти-хорионический гонадотропин человека (анти-ХГЧ)-антител, связанных с Сефарозой для специфической цели удаления активности Л Г из частично очищенных фракций ФСГ. Наиболее очищенная фракция ФСГ содержала 4720 международных единиц ФСГ на мг, контаминация Л Г составила всего 15 международных единиц Л Г на мг, как испытано радиоиммуноанализом. Иммунохроматографический подход описан Донини и др. ["Очистка и выделение ФСГ и ЛГ из ЧКГ", Acta Endocrlnologica 52, с. 186-198, 1966], которые еще в 1966 году получили препарат ФСГ, имеющий активность 329,7 международных единиц ФСГ на мг и биологически необнаруживаемые количества контаминации Л Г. В другом эксперименте были получены активности фракции, составляющие значение 148,3 международных единиц ФСГ на мг и 2,4 международных единиц Л Г на мг. Поскольку никакого радиоиммуноанализа не было проведено относительно препарата с активностью 329,7 международных единиц ФСГ на мг, можно предположить по аналогии с результатами X. ван Хелла (см. выше), что при радиоиммуноанализе (РИА) могут быть обнаружены следующие количества Л Г. Физиологическая релевантность даже минимальных количеств контаминации ЛГ была показана Донини и др. в работе ["Новый подход к Биологическому определению Лютеинизирующего гормона", Acta Endocrinologica 58, ос. 463-472, 1968], где предложено новое количественное определение биологической активности Л Г, состоящее 8 введении интактным незрелым мышам постоянной дозы биологически чистого препарата ФСГ при возрастающих количествах Л Г с последующим измерением повышения маточной массы как ответ, пропорциональный активности Л Г. При данном методе всего 0,068 международных единиц Л Г способны повышать маточную массу при введении вместе с 4,44 международных единиц ФСГ. Поэтому следует, что желательно иметь абсолютно чистый препарат ФСГ, когда при лечении требуется активность ФСГ при полном отсутствии активности Л Г. Как упомянуто выше, поставляемый в настоящее время продукт Метродин Ò (Сероно) представляет собой очищенный препарат ФСГ, который получен методом по существу идентичным тому, который описан Донини и др. в упоминаемой работе [Acta Endocrinologlca, 52, с. 186-198, 1966]. Технические требования контроля качества в согласии с заявленной биологической чистотой указанного препарата обеспечивают не более 0,7 международных единиц ЛГ на 75 международных единиц ФСГ т. е. приблизительно, предел чувствительности биологической пробы на активность, В некоторых терапевтических применениях, однако, желательно абсолютное отсутствие ЛГ. Кроме того, в МетродинеÒ человеческий ФСГ сопровождается значительными количествами других мочевых белков, т. е. это не химически чистый препарат ФСГ. Заявка на патент Великобритании № 2173803А предлагает еще один подход к очистке гипофизарных гликопротеидных гормонов, среди них ФСГ. Этот подход состоит в образовании комплекса гормона с иммобилизованными моноклональными антителами с последующим элюированием гормона кислотным водным буфером, имеющим рН 3-4. Что касается ФСГ, то полученный высокоочищенный гормон все же загрязнен 0,1% по массе ЛГиО,5% по массе тиреостимулирующего гормона (ТСГ). Скотт К. Чаппел и др. описали в обзорной статье [Эндокринные обзоры, 4/2, с. 179-211,1983] микронеоднородность ΦСГ и физиологическое значение углеводородных частей, сопровождающих молекулу ФСГ. Можно построить гипотезу, что некоторые модификации встречаются во время пути метаболизма вплоть до конечной мочевой секреции, что можно объяснить химико-физической дифференциацией, представленной в экспериментах, проводимых заявителем между высокоочищенным препаратом мочевого ФСГ (вомФСГ) в соответствии с настоящим изобретением и высокоочищенным препаратом гипофизарного ФСГ, используемым для целей сравнения. Со- или посттрансляционные модификации, по-видимому, являются основой для микрогетерогенного разнообразия ФСГ, гликопротеида, состоящего из двух различных, гликозилированных, не ковалентно связанных полипептидных цепей, известных как альфа и бета-субъединица. Бета-субъединица наделяет молекулу ее биологической специфичностью. Данная статья пытается объяснить существенную разницу в значениях биологической активности на мг между высокоочищенными гипофизарными и мочевыми препаратами ФСГ. Гипотеза вновь может основываться на релевантности углеводородных частей и, более конкретно, роли концевых остатков сиаловой кислоты. Следует отметить, что несмотря на то, что и гипофизарный ФСГ, и мочевой ФСГ называются "ФСГ", еще не обнаружено никакого неопровержимого доказательства, подтверждающего являются ли молекулы, выделенные из двух источников, одинаковыми или даже химическими эквивалентными. Обнаружено, что человеческий мочевой ФСГ может быть выделен из концентрата постклимактерической мочи с такой степенью чистоты, что полученный ФСГ совершенно свободен от любых обнаруживаемых следовых количеств ЛГ и других мочевых белков. Аминокислотный анализ мочевого ФСГ в соответствии с настоящим изобретением выявил новую бета-субъединицу ФСГ из III аминокислот вместо 118 или 108, как приводится в известном уровне знания (см. например. Скотт и до., выше) для известной бета-субъединицы ФСГ. Более конкретно, настоящее изобретение предлагает новую бета-субъединицу ФСГ, аминокислотная последовательность которой имеет следующий вид: а также новый белок, содержащий новую альфа-субъединицу гонадотропина и бета-субъединицу из III аминокислот, приведенных выше. Белок имеет биологическую активность фолликулостимулирующего гормона (ФСГ)· Предпочтительно, он находится в гликозилированной форме. Наиболее предпочтительно, он в основном свободен от обнаруживаемых следовых количеств люинизирующего гормона и других мочевых белков. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая очищенный белок в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый наполнитель. Предпочтительно, композиция находится в форме, пригодной для подкожного введения. Обнаружено, что подкожное введение фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением не приводит к возникновению тех аллергических реакций, которые обычно сопровождают применение известных препаратов ФСГ. В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения предлагается способ получения нового и высокоочищенного ФСГ в соответствии с настоящим изобретением. Способ в основном базируется на комбинации стадии иммуноочистки с жидкостной хроматографией высокого давления с обращенной фазой. Стадия иммуноочистки использует иммобилизованные моноклональные антитела, по существу, как описано в вышеупомянутой заявке на патент Великобритании № 2173803А, однако с фундаментальным отличием, заключающемся в том, что элюирование ФСГ из иммунокомплекса осуществляют при более высоких значениях рН. В способе настоящего изобретения элюирование удобно осуществлять с использованием водного раствора, имеющего рН выше, приблизительно 10, и молярности выше, приблизительно 0,5. Проведенные эксперименты показали, что при таких условиях иммобилизованное антитело 8 основном не инактивируется. В соответствии с настоящим изобретением рН элюента, предпочтительно, выше 11 и, более предпочтительно, составляет интервал 11,3-11,7. Значения молярности, предпочтительно, выше 0,8. и, более предпочтительно около 1. Пригодными элюентами для использования в способе изобретения являются аммиак, диэтиламин и такие буферы, как ТРИС-буфер, глицин-NaOH и подобное. Последующая стадия жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (ЖХВД) позволяет достичь полного удаления любых загрязняющих белков. Данное удаление не достигается только стадией иммуноочистки. То, что такая стадия не только эффективно удаляет остаточные следовые количества загрязняющих белков, но также сохраняет полную биологическую активность ФСГ, является неожиданным в свете статьи, написанной П. Халлином и С. А. Ханом [J. Llg Chromat. 9 (13), с. 2855-2868, 1986], которая показывает потерю биологической активности для бычьего ФСГ и для человеческого ФСГ (стандарт ЧКГ), когда они подвержены ЖХВД с обращенной фазой. С другой стороны, в той же статье показывается удовлетворительное восстановление биологической активности, однако только частичное разделение, когда человеческий мочевой препарат (т. е., содержащий как ФСГ, так и ЛГ) подвергают ионообменной ЖХВД. После стадии жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой ФСГ восстанавливают с использованием традиционных методик. Для целей хранения и/или манипулирования продукт может быть лиофилизирован. Предполагаются также и другие пригодные методики с целью осуществления концентрации, стабилизации или другой обработки продукта. Безусловно, что доступность постклимактерической мочи намного выше, чем доступность человеческого гипофиза. Эта относительная доступность придает яркий характер заявленному изобретению. ФСГ-специфическое моноклональное антитело для использования в способе настоящего изобретения может быть получено с применением известных приемов. В типичном примере линию клеток гибридомы 9/14 подвергают скринингу на оптимальное сродство к ФСГ в Университете Кембридж. Моноклональные антитела продуцируют в среде супернатанта методами культивирования клеток и очищают при помощи солевого фракционирования, используя 50% (в отношении веса к объему) сульфат аммония, с последующей ионной хроматографией с обращенной фазой и ЖХВД гельфильтрацией и диализом. Моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток 9/14 и очищенное, как описано выше, имеет следующие технические требования: а) чистота белка: не менее, чем 90% б) класс иммуноглобулина: lgG1 в) константе сродства: 3,5x10 л моль г) специфичность: д) связывающая способность с ФСГ в растворе: около 1000 международных единиц ФСГ на мг МсАb. ФСГ-специфические моноклональные антитела химически связываются с Сефаро-зой 4В посредством дивинилсульфона в соответствии с методом, описанным Дж. Поратом в журнале "Методы в ферментологии", 34 , с. 13-30, 1974. В типичном примере 1 л Сефарозы 4В промывают на пористом стеклянном светофильтре вначале 5 л свежедистиллированной воды и затем 5 л 1 Μ раствора карбоната натрия, рН 11. Промытую Сефарозу суспендируют в 1 л 1 Μ раствора карбоната натрия (рН 11). При непрерывном перемешивании по каплям прибавляют 200 мл дивинилсульфона. Реакцию завершают в течение 70 минут при комнатной температуре и затем прекращают путем прибавления 1 н. раствора Η СІ (рН до 7,0). Активированную смолу суспендируют в 1 л 0,25 Μ раствора бикарбоната натрия (рН 9,0), содержащего 2 г анти-ФСГ моно-клонального антитела, с получением более чем 90% связывания антитела с активированной смолой. Полученную иммуносмолу хранят при 4°С. Далее описываются две стадии способа настоящего изобретения, приемлемые для коммерческого ЧКГ, т. н. активного ингредиента в препарате ПергоналÒ Сероно. Следует понять, что хотя ЧКГ является предпочтительным исходным материалом в способе настоящего изобретения, последний также приемлем в отношении менее очищенных материалов, таких, как постклимактеристические мочевые концентраты и тому подобное. Хорошие результаты получены с использованием в качестве исходного материала мочевого концентрата, содержащего всего 1 международную единицу ФСГ на мг. Пример 1. Получение высокоочищенного мочевого ФСГ (вом ФСГ)· Стадия 1: иммуноочистка анти-ФСГ МсАв-ДВС-Сефарозы. ЧКГ используют в качестве исходного материала. Иммуносмолу анти-ФСГ Мсаb-ДВС-Сефарозу уравновешивают в 0.1 Μ трис-НСІ, 0.3 Μ NaCI-буфере, рН 7,5 при температуре 4°С. Колонку нагружают определенным количеством международных единиц ФСГ (РИА), соответствующим 80-90 % общей связывающей способности ФСГ. Неудерживаемые белки элюируют уравновешивающим буфером до тех пор, пока OD280 элюата не станет ниже, чем 0,02. Абсорбированный мочевой ФСГ элюируют из иммуносмолы 1 Μ раствором аммиака при 4°С. Аммиачные элюаты, соответствующие, приблизительно, 4-кратному объему иммуносмолы, группируют, рН доводят до 9,0, как можно скорее, при температуре 4°С путем прибавления ледяной уксусной кислоты, и раствор ультрафильтруют в аппарате Амикон (мембрана С. О. 10000 дальт) и концентрируют до малого объема. Стадия 2. Жидкостная хроматография высокого давления с обращенной фазой. Полученный раствор, доведенный до рН 5,6 загружают в колонку C18 с обращенной фазой Pre Pak Waters, которую предварительно уравновешивают 0,05 Μ буферным раствором уксуснокислого аммония при комнатной температуре. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 100 мл/мин, и элюат записывают при 280 нм. Очистку с использованием ЖХВД осуществляют с использованием аппарата Prep 500 A(Waters), оборудованного УФ-детектором и генератором препаративного градиента. Биологически активный, высокоочи-щенный мочевой ФСГ элюируют градиентом изопропанола до 50% подвижной фазы Фракции проверяют аналитической гель-проникающей хроматографией и радиоиммуноанализом. Органический растворитель удаляют 40 дистилляцией в вакууме при 40°С, после чего раствор замораживают и лиофилизируют. Пример 2. Исследование ФСГ. Высокоочищенный препарат мочевого ФСГ настоящего изобретения подвергают нескольким химико-физическим, биологическим и иммунологическим испытаниям с тем, чтобы получить его полную характеристику. Большинство испытаний осуществляется в сравнении с высокоочищенным препаратом гипофизарного ФСГ, полученным в соответствии с методом, описываемым ниже. В качестве исходного материала используют неочищенный человеческий гипофизарный экстракт (HPG), побочный продукт, полученный из экстракции человеческосо гормона роста. Методика заключается в осуществлении следующих стадий: 1) Предварительной очистки сырого HPG путем экстракции 40%-ным этанолом, содержащим 6% уксуснокислого аммония, рН 5,6 и преципитации супернэтанта с помощью 96%-ного холодного этанола. 2) Дальнейшей очистки HPG ионообменной хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе с использованием 0,15 Μ раствора ацетана натрия, рН 7,0, в качестве элюента с последующей преципитацией 96%-ным холодным этанолом. 3) Дальнейшей очистки фракции гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с использованием 0,05 Μ бикарбоната аммония в качестве буфера. 4) Последней стадии очистки ФСГ ионообменной хроматографией на колонке SP Сефадекс С 50. Высокоочищенный гипофи-зарный ФСГ элюируют 0,1 Μ фосфа тным буферным раствором рН 6,2 и лиофилизируют. Как определено, биологическая удельная активность In vitro гипофизарного ФСГ (тест Стилмана-Ролей; международная единица второго IRP-HMG) составляет 4770 международных единиц ФСГ на мг лиофилизованного порошка. Для этого определения используют методику, описанную ниже под заголовком "Количественное определение биологической активности". Контаминация ЛГ. Данный тест осуществляют при помощи специфического радиоиммуноанализа для Л Г (лютеинизирующего гормона) с использованием стандарта ЛГ, градуированного с помощью второго ЩР-ЧКГ и І-ЛГ в качестве меченого атома, оба которые содержат в ЛГ тройной KIT {код 10204), поставляемый в настоящее время на рынок компанией Биодата'к 1 В качестве антисыворотки используют овечью анти-ХГК (хорионический гонадотропин человека) антисыворотку, полученную заявителем, которая имеет 100%-ную перекрестную реакционную способность к ЛГ и менее, чем 0,1% к ФСГ. Методу радиоиммуноанализа в соответствии с наставлениями изготовителя придерживаются с тем, чтобы не было получено никакого загрязнения ЛГ, обнаруживаемого в высокоочищенном препарата мочевого ФСГ, полученном в соответствии с примером 1. Вышеприведенные результаты подтверждают с использованием более чувстви тельного анализа, называемого DELFIA (диссоциация - улучшенный лантанид-фторо-иммуноанализ), оборудование для проведения которого представляется фирмой ЛКБ-Фармация. ПААГ в ДДС-Na. Блочный электрофорез в плоском геле в додецилсульфате натрия осуществляют в восстановительных условиях на 13,5%-ном полиакриламидном геле, рН 8,8, в соответствии с методикой, описанной Лаеммли в Нэйчур. 227, С. 680-685 (1970). Окрашивание осуществляют синим блестящим кумасси R-250.0,25% в 25% метано* ле (75% уксусная кислота). Данному испытанию подвергают как препарат вомФСГ в соответствии с настоящим изобретением, так и высокоочищенный препарат гипофизарного ФСГ (вогФСГ), полученный как описано выше. В обоих препаратах мФСГ и гФСГ ос- -новная большая полоса, типичная для гликопротеидов обнаруживается при одной и той же молекулярной массе, приблизительно, 20000 дальтон, что также соответствует литературным данным. Вследствие известного поведения гликопротеидов в ПААГ в ДДС-Na это значение слегка преувеличено. Вытеснительная хроматография. Анализы как вомФСГ, так и вогФСГ осуществляют на колонке TSK S 2000 SW посредством ЛКБ с использованием 0,1 Μ буферного фосфатного раствора рН 6,8+0,2 Μ NaCI в качестве элюента. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 0,7 мл/мин* и считывания выполняют при длине волны 230 нм. Изоэлектрофокусирование. Изоэлектрофокусирование осуществляют на 5%-ном тонкослойном полиакриламидном геле (Анфолин ЛКБ (R), рН 3,5-9,5), закрепленном в 11,5%-ной (мае.) трихлоруксусной кислоте и 3,5%-ной (маc.) сульфосалициловой кислоте, и окрашивают Серебряным окрашивающим набором БИО-PЭДÒ . Мочевые и гипофизарные ФСГ не являются идентичными молекулами, а также то, что различия заключаются, по крайней мере, в их углеводородных частя х, если не в самих белковых частях. Количественное определение биологической активности. Биологическую активность in vivo ФСГ высокоочищенного мочевого ФСГ определяют методом СтилманаРолей [Эндокринология, 53, с. 604-616, 1953] с использованием в качестве эталонного вещества ЧКГ-Ха ус Эталон, градуированный по 2-му Международному Эталонному препарату ЧКГ для количественного определения биологической активности. Данный анализ принят всеми основными фармакопеями и службами здравоохранения для определения международных единиц (1.U.) биологической активности ФСГ. Как определено, вомФСГ-препарат, полученный в соответствии с примером выше, имеет удельную активность, равную 6200 1.U. ФСГ на мг лиофилизированного порошка, т. е. наиболее высокую удельную активность, когда-либо описанную для мочевого препарата ФСГ. Определение аминокислотной последовательности. а) Выделение субъединиц мочевого ФСГ. Выделение субьединиц мочевого ФСГ осуществляют с использованием системы ЖХВД Waters, оборудованной колонкой Ак-вапор RP-300, 200x4,6 мм, 7 мкм, (Браунли Лэбз). Элюентами являются А=0,1% TFA (трифторуксусная кислота, классификация ЖХВД, Пиерс). В-0,055% TFA в ацетонит-риле. Скорость перемещения фронта растворителя составляет собой 15% В. Градиент повышает на 40% В в течение 20 мин. УФ-детектор устанавливают на 229 нм. Обычно вводят аналитические серии 20 мкл раствора 0,5 мг/мл вом ФСГ и 0,5% TFA. Предварительная инкубация в растворе TFA необязательна. Препаративное разделение осуществляют с использованием той же колонки. Хорошее разрешение достигают путем вода 0,5 м,г высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ (серия № 032), растворенных в буфере А. Фракции собирают вручн ую и сушат с использованием концентратора Спид Вак. Субъединицы растворяют в воде, анализируют ЖХВД, и хранят при температуре -20°С. Бета-субъединицу элюируют, приблизительно, через 10,5 мин в качестве широкого пика, альфасубъединицу элюируют в течение 15 мин в качестве резкого пика. Узнавание каждого пика в качестве бета- и альфа-субъединицы соответственно осуществляют специфическим радиоиммуноанализом. Обычно восстановление бета-субъединицы происходит вокруг значения 50%, напротив, восстановление альфасубъединицы составляет значение более, чем 90%. б) Восстановление и карбоксиметили-рование альфа- и бета-субъединиц, Восстановление субъединиц, разделенных как описано выше, осуществляют в 0,5 Трис. 0,1 % ЭДТК, 6 Μ гуанидин-НСІ, рН 8,5. в течение 2 ч при 37°С с использованием ДТТ (дитиотрейтола Серва) при 15-кратном полярном избытке перед содержанием цистеина. Затем в реакционную смесь прибавляют йодоацетат натрия (2,1 молярный перед ДТТ) и оставляют на 30 мин в темноте. Для прекращения реакции прибавляют 1 %-ный меркаптоэтанол и TFA, Карбоксимети-лированные субъединицы очищают ЖХВД. Бета-карбоксиметилированная субъединица плохо растворяется в воде так, что конечный выход совершенно незначителен. в) Восстановление, пиридилэтилирование и трипсин-переваривание бета-субъединицы. Восстановление бета-субъединицы, разделенной как описано выше, осуществляют при комнатной температуре в течение 2 ч следующим образом: 0,1 мг бета-субъединицы, 0,5 мл 0,5 Μ раствора Трис. 0,1 % ЭДТК, 6 Μ гуанидин-НСІ, рН 8,5, 2,7 мг дитиотрейтола. Пиридилэтилирование осуществляют п утем прибавления 0,02 мл 4-винилпиридина к предыдущему раствор у. Реакция продолжается в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь загружают в С4-патрон (Бэйкер), уравновешенный 0,1% TFA. Патрон промывают 0,1% TFA и пиридилэтилированную бета-субъединицу элюируют 40% ацетонитрилом, 0,1% TFA. Элюированные фракции сушат и очищают ЖХВД как описно выше для бета-субъединицы. Пиридилэтилированную бета-субъединицу, очищенную par нее путем ЖХВД, растворяют в 1%-ном растворе NH4HCO3, рН В. В раствор прибавляют трипсин и реакцию осуществляют в течение 1,5 при 37°С. Триптические фракции очищают жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВД) с использованием ранее описанной методики за исключением того, что градиент поднимают от 0% до 55% в течение 30 мин и УФ-детектор устанавливают на 214 нм. Триптические фракции секвенируют таким жеобразом, как осуществляют секвени-рование субъединиц (см. часть д)). г) Секвенирование альфа-субъединицы. Несколько испытаний на определение последовательности аминокислотных остатков в белках (секвенирование) осуществляют с использованием альфа-субъединицы, карбоксиметилированной альфа-субъединицы или целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ, обычно загружая 5 нмоль или менее в белковый секвенсер (470 А, Эпплайд Бмосистем) и используя стандартную программу ОЗРРТН, поставляемую Эпплайд Биосистем, или специальную программу, в которой циклы, которые расщепляют РrО или Gly, замещены специальным циклом O3CPRO. Первые 45 остатков, начиная с NН2-конца молекулы, идентифицируют, что приводит к результатам, подтверждаемым аминокислотной последовательностью, известной из литературы [Т. Biol. Chem., 250. с. 6735, 1975]. Asn в положении 52 и в положении 78, относящиеся к известной последовательности, напинающейся с Ala, представляют собой аминокислоты, где происходит гликоэилирование. На конце NH2 всегда присутствует неоднородность и она всегда одна и та же во всех секвенированных пробах. Полная молекула (т. е., начинающаяся с Ala) присутствует в количестве 65% цепей, молекула, не имеющая первые две аминокислоты (т. е. начинающаяся с Asp), присутствует в количестве 5%, молекула, не имеющая первых три аминокислоты (т. е. начинающаяся с Val), присутствует в количестве 30%. 65 % цепей Ala Pro Asp Val Cln... 5 % цепей Asp Val Cln... 30 % цепей Val Gin... Неоднородность альфа-субъединицы. Осуществляют несколько серий секвенирования с использованием бета-субъединицы, карбоксиметилированной бета-субъединицы, целого высокоочищен-ного человеческого мочевого ФСГ и трипти-ческих пептидов из пиридилэтилированной бета-субъединицы. Образцы загружают в секвенсер белков (470, А. Эпплайд Биосистем) с использованием стандартной программы O3RPTH, предложенной Эпплайд Биосистем. Результаты показывают, что данная субъединица имеет длину III аминокислот и следующую аминокислотную последовательность: Asn в положении 7 и 24, относящихся к вышеприведенной последовательности, начиная с Asn в положении 1, представляют собой аминокислоты, где происходит гликолизирование. В конце NH2 бета-субъединицы всегда присутствует неоднородность, и она всегда одна и та же во всех секвенированных образцах. Полная молекула (т. е. начинающаяся с Asn) присутствует в количестве 35% цепей, молекула, не имеющая первые аминокислоты (т. н. начиная с Ser) присутствуе т в количестве 15%, молекула, не имеющая первые две аминокислоты (т. е. начинающаяся с Cys), присутствует в количестве 50 %. 35 % цепей Asn Ser Cys Gly Leu... 15 % цепей Ser Cys Gly Leu... 50 % цепей Cys Gly Leu... Неоднородность бета-субъединицы. Приме р- 3. Фармацевтические препараты. Получение фармацевтических лекарственных форм, содержащих высокоочищенный мочевой ФСГ, полученный в соответствии с настоящим изобретением, не представляет трудности. Поскольку вещество сохраняет свою биологическую активность после лиофилизации, последняя содействует получению предпочтительной формы для инъецируемых препаратов. Лиофилизированный препарат, содержащий вом ФСГ, воссоздают с использованием физиологического раствора и/или других пригодных разбавителей, с получением инъецируемого раствора. Некоторые наполнители могут быть пригодно использованы в композиции в качестве ее части, такие, как например, манит, лактоза, глицин, глюкоза, сахароза и их смеси. Могут быть использованы и другие традиционные носители, наполнители и тому подобное. Операбельны и смеси. В экспериментах, проводимых в соответствии с настоящим изобретением, лактозу использовали в качестве наполнителя для инъецируемых препаратов. При получении инъецируемых составов рН необязательно доводят до определенного значения путем прибавления традиционных кислотных или основных веществ. Кислотные вещества включают уксусную кислоту и тому подобное. Основные вещества включают гидроокись натрия и тому подобное. Могут быть использованы смеси. Предполагается использование одного или более стабилизаторов, например, альбумина и тому подобного. Типичный пример фармацевтического производства для изготовления партии 20000 ампул, каждая из которых содержит 75 международных единиц ФСГ, представляет собой следующее. Вычисленное количество (в единицах биологической активности) насыпного порошка лиофилизированного ФСГ растворяют в 700 мл холодной апирогенной воды для инъекции. Если необходимо, рН доводят до значения между 6,2 и 6,8 с использованием либо уксусной кислоты, либо гидроокиси натрия, в зависимости от случая. Затем раствор подвергают стерильной фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм. 200 г лактозы растворяют в 2 л апирогенной воды для инъекции, подвергают стерильной фильтрации как описано выше и прибавляют в раствору ФСГ. Апирогейную воду для инъекции, прибавляют для того, чтобы достичь конечный объем, равный 15 л, раствор разливают в ампулы (0,75 мл каждая) и лиофилизируют в стерильном лиофилизаторе. Получают ампулы, каждая из которых содержит 75 международных единиц ФСГ и 10 мг лактозы. В предпочтительном варианте каждая ампула может содержать 150 международных единиц ФСГ и 10 мг лактозы. В соответствии с другим примером фармацевтического препарата ампулы получают с содержанием в каждой 1 мг человеческого альбумина в качестве стабилизатора, кроме лактозы в качестве наполнителя.