Спосіб одержання біомаси молочнокислих бактерій виду lactobacillus bulgaricus

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии, а точнее к способам получения биомассы молочнокислых бактерий для изготовления на ее основе препаратов медицинского и ветеринарного назначения. Давно известна важная роль молочнокислых бактерий и продуктов на их основе для оздоровления организма млекопитающих и лечения ряда заболеваний. На их основе получают большую группу препаратов, содержащих живые клетки, получившие название пробиотиков/нормофлоров. В известных способах получения биомассы молочнокислых бактерий используется довольно широкий спектр природных и специально выведенных штаммов, индивидуальные свойства которых определяют характеристики и направленность фармакологического действия препаратов, полученных на их основе. Так, например, известен способ получения молочнокислых бактерий, из клеток которых готовят препараты, понижающие уровень холестерина. Задача решается за счет применения новых штаммов и определенных для них условий культивирования [Европ. патент № 0181170, 14.03.88]. Известен способ получения биомассы молочнокислых бактерий, рост которых возможен при добавлении в среду суль фидов натрия, аммония или уксусной кислоты. Препараты, полученные из клеток этих микроорганизмов, служат для предупреждения инфекционных заболеваний [Заявка Великобритании № 1585863]. В последнее время на основе молочнокислых бактерий разрабатываются препараты, обладающие иммуностимулирующим действием, которые могут найти широкое применение в медицине и ветеринарии. Наиболее близким к предлагаемому является способ получения биомассы клеток Lactobacillus bulgaricus B-51, из которой получают препарат с высокой противоопухолевой активностью [Патент США № 3762998, ,02.10.73]. Биомассу получают путем культивирования указанного штамма на питательной среде, содержащей соевый экстракт, пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, сахарозу, Μ 04. Культивирование проводят при 37°С в течение 24 часов в анаэробных усло виях и отделяют центрифугированием биомассу. Задача, которую решают авторы предлагаемого способа, состоит г разработке метода получения биомассы со стабильными свойствами и постоянным составом, удовлетворяющей требованиям фармакопеи, для дальнейшего получения из этой биомассы препаратов с широким спектром фармакологического действия. Поставленная задача решается тем, что в способе получения биомассы молочнокислых бактерий путем ферментации штамма-продуцента Lactobacillus bulgaricus на питательной среде, содержащей источники азота, углерода, фосфора, минеральные соли и витамины в анаэробных условия х при температуре от 28 до 50°С, с последующим отделением и сушкой биомассы. В качестве продуцента используют штамм Lactobacillus bulgaricus-86 (коллекционный номер ВКПМ В5788), а ферментацию проводят на сбалансированной питательной среде следующего состава, мас.%: Общими с прототипом признаками являются: использование микроорганизма вида Lactobacillus bulgaricus; проведение ферментации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли и витамины в анаэробных условия х; последующее отделение и сушка полученной биомассы. Отличительными признаками являются: использование в качестве продуцента нового штамма Lactobacillus bulgarlcus-86, депонированного в коллекции ВКПМ (ВНИ-Игенетика, ВПКМ-В-5788); использование питательной среды следующего состава, мас.%: Суммарный аминный азот среды 0,8-1,1 мг/мл, рН среды 6,0-6,4. Поставленная задача решена в способе за счет применения нового штамма-продуцента Lactobacillus bulgaricus-86 на сбалансированной питательной среде. Известно, что молочнокислые бактерии с точки зрения потребности в разнообразных питательных вещества х относятся к наиболее сложным микроорганизмам. При их культивировании большую роль играет сбалансированность элементов питания. Даже незначительные изменения в их соотношении может привести к резкому снижению продуктивности культуры, изменению структуры и состава клеток, что в свою очередь, скажется на стабильности свойств самой биомассы и биологически активного вещества, получаемого из биомассы штамма Lactobacillus delbruccki sub.sp. bulgaricus (Weiss, Schiilinger L Kandler, 1984) (видовое название культуры), наименование штамма Lactobacillus bulgaricus-86. Штамм выделен из ассоциативной культуры при опытно-промышленной наработке биомассы молочнокислых бактерий. Штамм хранят в лиофилизированном состоянии в холодильнике не более 6 месяцев, В случае необходимости культур у используют в качестве исходного материала для получения жидкого посевного материала, для чего бактериальную взвесь из ампулы пересевают на среду MRS в пробирку, после чего культур у высевают в колбу вместимостью 0,75 л с 0,3 л питательной среды MRS. Поддержание проводят путем пересева 2 раза в неделю на чередующиеся среды MRS среду № 1, №2. Для поддержания культуры в колбы с 0,3 л среды вносят 10% культуры и термостатируют при температуре 39 ± 1°С в течение 22-24 часов, после чего культуру помещают на хранение в холодильник при температуре 5±1°С на 3-4 суток. Штамм имеет следующую характеристику. Культурально-морфологические особенности штамма: штамм выращенный при 40±1°С в течение 18-24 часов на питательной среде MRS, образует однородную муть и слабый мелкодисперсный осадок; в полужидких средах - висячие каплеобразные колонии, в толще агара - белесые дисковидные колонии с неровными краями до 1 мм в диаметре; на твердой агаризованной среде - полупрозрачные беловатые, гладкие с блеском, слабо выпуклые, круглые с неройными краями, диаметром 1-3 мм. Морфология клеток: грамположительные, средней длины и толщины с округлыми краями, ровные палочки размером от 0,5 до 3-8 мк, возможно расположение цепочками разной длины от 2 до 6-8 клеток полисавидно. Физиологическая характеристика штамма: факультативный анаэроб, неподвижный, катализоотрицательный, не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатину, слабо гидролизует эскулин, не образует аммиак из аргинина. Молоко створаживает, образуя кислоту (1,27%), молоко С лакмусом восстанавливает без образования газа, интенсивно восстанавливает молоко с метиленовой синью, не растет на средах е повышенным (> 4%) содержанием хлористого натрия и рН 9,6; не выживает после прогревания при температуре 63°С в течение 30 минут, не образует слизь, растет на средах с желчью, слабо гидролизует крахмал. Не сбраживает: арабинозу, мальтозу, дульцит, ксилозу, раффинозу, инозит, рибозу, адонит, маннит, инулин, целлобиозу, галактозу, эскулин, сорбозу сорбит, рамнозу, амигдалин, трегалозу, маннозу, и-метил-сіглюкозид, глицерин. Штамм отнесен к группе delbruecki рода Lactobacillus, рост возможет от 28° до 50°С. оптимальная температура от 36 до 40°С. Заметный рост возможен в диапазоне рН от 3,5 до 8,5, оптимальный рН для роста - 6,0±0,4. Максимум накопления биомассы (10-14 г/л), обладающей биологической активностью достигается к 12-16 часам культивирования. Синтез биомассы находится в прямой зависимости от соблюдения найденных методом аддитивно-решетчатого описания с использованием ортогональных многоуровневых планов оптимального соотношения ростовых факторов (источники азота, фосфора, витаминов). Для проведения опытов использовали план пятифакторного эксперимента на четырех уровнях. Оптимизируемыми факторами являлись: Κ1 - концентрация гидролизата казеина (1-4-й уровень по аминному азоту - 300-600 мг/л); К2 - концентрация гидролизата соевой муки (50-200 мг/л по аминному азоту); К3 - концентрация кукурузного экстракта (25-100 мг/л по NH2); К4 - концентрация дрожжевого автоли-зата (50,100.150 и 200 мг/л); К5 - концентрация калия фосфорнокислого двухзамещенного (0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 г/л). Базовым показателем, по которому шла оптимизация среды, являются выход влажной биомассы культуры В с 1 литра культуральной жидкости. После проведения оптимизации (статистической обработке подвергались данные 3-х опытов, каждый проводился в 3-х повторностях), максимальный выход биомассы со стабильными биологическими свойствами получен для следующи х концентраций ростовых факторов: Гидролизата казеина - 500 ± 100 мг/л по аминному азоту; Гидролизата соевой муки - 200 мг/л по аминному азоту; Кукур узного экстракта - 75 ± 25 мг/л по аминному азоту; Дрожжевого автолизата - 150 мг/л по аминному азоту; К2НРО4-0,5ипи2,0г/л (Концентрация сахара во всех опытах была равной 10 г/л). При оптимизации источников углерода использовали сахар в концентрации 6,0; 8,0 и 10,0 г/л; гидролизованный крахмал (ДЕ-26,5) в концентрации 6,0; 8,0 и 10,0 г/л; гидролизованный сахар (степень гидролиза 36.5%) в концентрации 6,0; 8.0; 10,0 и 12,0 г/л. В первой серии опытов из-за осадка, образующегося при росте продуцента на крахмале, не удалось оценить количество образующейся биомассы. Поэтому во второй серии опытов крахмал не использовался (табл.1). Из представленных данных видно, что наибольший выход биомассы LB был достигнут на среде, содержащей в качестве источника углерода сахара в концентрации 6-8 г/л. Наиболее низкий выход биомассы наблюдался на средах, содержащих глюкозу. По данным этой серии опытов в производственную питательную среду в качестве углеродного компонента был включен сахар в концентрации 6-8 г/л. Сбалансированная по элементам углеводного азотного, фосфорного питания, ростовым фактором, пита-тельная среда прошла апробацию в лабораторных стендовых, опытно-промышленных условиях для выращивания штамма Lactobaclllus bulgarlcus-86. При проведении эксперимента в опытно-промышленных условиях биомассу отделяли центрифугированием или сепарированием на сепараторе Westfale V=200 л/час, затем промывали от остатков питательной среды и подвергали переработке для получения ферментативных лизатов и биологических экстрактов по известным схемам. Если непромытую биомассу подвергали лиофильной сушке, то в зависимости от режима сушки, подобранного наполнителя и стабилизатора, жизнеспособность клеток лактобациллы составляла от 1 ·103 до 1,0 -109 кл/г препарата. Полученная биомасса обладала очень низкой токсичностью LD50 > 20 г/кг массы мышей. Штамм Lactobacillus bulgaricus-86 обладает высоким уровнем антагонистической активности в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры человека (табл.2). Кроме того, выявлены другие биологические свойства штамма: Иммунокоррегирующий потенциал; Неспецифическая нуклеазная активность; Устойчивость к антибиотикам, применяемым в клинической практике. Следует отметить, что, в зависимости от условий культивирования, соотношения компонентов питательной среды, одни свойства (например, иммуномодулирующие) могут усиливаться, другие (антагонистические) уменьшаться (табл.2). Как видно из данных табл.3,4, производственный вариант средоприготовления и выращивания Lactobacillus bulgarlcus-86 позволяет получать биомассу со стабильными свойствами. Биомасса, получаемая по вышеописанной технологии, может являться субстанцией для изготовления высокоэффективных гастроэнтерологических препаратов; аналоги - нормафлор (Болгария), лактобактерин (Россия). Исследования по подбору эффективных доз, схем и способов введения этих препаратов, их безвредности, проводятся специализированными учреждениями МЗ Украины. Если из биомассы про специальной технологии готовить препараты, то можно получать субстанции со стабильными свойствам и широким спектром фармакологического действия. Πример 1. Посевную питательную среду MRS в пробирке засевают штаммом Lactobaclllus bulgaricusΒΚΠΜ В-5788 изампулы и выдерживают 24 часа при температуре 40 ± 1°С, после чего культур у пересевают в колбу вместимостью 0,75 л с 0,3 л питательной среды MRS или среды №1 и термостатируют 24 часа при температуре 40 ±1°С. Культивирование в опытно-промышленных условиях проводили в ферментере объемом 10 м 3 с инокулятором объемом 1 м 3. Для засева инокулятора используют односуточную культур у Lactobacillus bulgarfcus ВКПМ В-5788 из колбы, расход посевного материала составляет 4,5.-5,0 л на 500 л питательной среды. Используют питательную среду такого состава: Гидролиз казеина осуществляли в реакторе с помощью протеолитического фермента протеаза "С" из расчета 1500 ед/г казеина (метод ФОЛП) в течение 10-12 часов при температуре 40°С и рН равном 9,5-10,0. В аналогичных условиях гидролизовали соевую мук у, только количество ферментного препарата составляло 3000 ед/г соевой муки. Для получения дрожжевого автолизата 200 г пекарских дрожжей суспендировали в 200 л воды и выдерживали 18-24 часа при температуре 48-50°С. Затем смешивали все компоненты питательной среды, кипятили, сепарировали (или фильтровали) и стерелизовали в ферментере при температуре 12б-128°С 40 минут. После охлаждения среды до 40°С проводили засев инокулятора односуточной посевной культурой штамма Lactobacillus bulgarfcus-86, выращенной на среде MRS. Культивирование проводили в анаэробных условиях при температуре 40°С в течение 8-16 часов, после чего инокулят в асептических условиях пересевают в подготовленную питательную среду (7,0 м 3) Рост культуры в ферментере сопровождается закислением питательной среды, увеличением оптической плотности культуральной жидкости. Через 12 часов при стабилизации роста культуры (рН = 3,9, ОД = 2,2), процесс культивирования прекращали, охладив культуральную жидкость в ферментере водопроводной водой до температуры 20 С. Затем культуральную жидкость сепарировали на сепараторе West-fale при скорости подачи 200 л/час. Отделенную биомассу выгружали из сепаратора и замораживали при температуре минус 35°С или высушивали на сублимационной сушилке. Полученная субстанция биомассы Lactobacillus bulgaricus-86 обладает качественными характеристиками, представленными в табл.5. Πример 2. Получение биомассы штамма 86 осуществляли способом, описанным в примере 1, После выгрузки из сепаратора половину влажной биомассы в асептических условиях смешивают со стабилизатором. В качестве стабилизатора используют стерильную ферментационную питательную среду № 1. Биомассу со стабилизатором сушат в сублимационной сушилке ТГ-50. Качественные характеристики высушенной биомассы соответствуют приведенным в табл.5.