Поліпшений спосіб отримання ферментів целюлази і/або геміцелюлази

Реферат: Спосіб одержання ферментів целюлази і/або геміцелюлази Trichoderma reesei, при зниженому вмісті лактози, що включає щонайменше одну стадію зростання в присутності вуглецевого джерела і щонайменше одну стадію продукування в присутності індукуючого субстрату, де UA 111473 C2 (12) UA 111473 C2 індукуючим субстратом є суміш, що містить від 40 до 65 % мас. глюкози або целюлозних гідролізатів, від 21 до 25 % мас. лактози та від 10 до 39 % мас. ксилози або розчину геміцелюлозного лігноцелюлозного гідролізату, причому сума цих трьох компонентів дорівнює 100 %. UA 111473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь, до якої належить винахід Винахід стосується способу продукування ферментів для гідролізу лігноцелюлозної біомаси. Рівень техніки Збільшення виробництва біоетанолу, що володіє якостями біопалива, є в цей час актуальним. Цілі впровадження обговорюються в цей час в Європейському Союзі, основуючись на первинній пропозиції використати 20% джерел енергії, що відновляються до 2020 року при впровадженні 10% біопалива відповідно до критеріїв довготривалого використання, які повинні сприяти використанню біопалива другого покоління, що отримується з лігноцелюлозної біомаси. Лігноцелюлозна біомаса характеризується складною структурою, що складається з трьох основних полімерів: целюлози, геміцелюлози і лігніну. Традиційно спосіб перетворення біомаси в етанол складається з декількох стадій. Попередня обробка забезпечує доступність целюлози і можливо геміцелюлоз, які є мішенями ферментативного гідролізу, для ферментів. Метою попередньої обробки є зміна фізичних і фізико-хімічних властивостей лігноцелюлозного матеріалу для поліпшення доступності целюлози, укладеної в матриці з лігніну і геміцелюлози. Стадія ферментативного гідролізу забезпечує перетворення целюлози і геміцелюлоз в цукри шляхом використання целюлолітичних і/або геміцелюлолітичних ферментів. Цукри, отримані гідролізом лігноцелюлозної біомаси, являють собою пентози (головним чином, ксилозу і арабінозу), дисахариди (целобіозу) і глюкозу, які можуть ферментувати мікроорганізмами. Глюкоза, наприклад, може легко перетворюватися в етанол за допомогою дріжджів Saccharomyces cerevisiae на стадії спиртової ферментації. Нарешті, стадія дистиляції дозволяє відділяти і витягувати продукт, отриманий внаслідок ферментації, тобто етанол в попередньому випадку, з ферментованого сусла. Різні техніко-економічні дослідження показують необхідність зниження вартості на стадії ферментативного гідролізу з тим, щоб довести вартість отриманого етанолу до величин, близьких до вартості етанолу, що отримується з крохмалю. У цей час промислові целюлази отримують головним чином з філаментозного гриба Trichoderma reesei в зв'язку з його високою здатністю секретувати целюлази. Один із засобів зменшення вартості полягає в оптимізації умов здійснення способу отримання целюлаз шляхом підвищення продуктивності або шляхом отримання ферментного коктейлю, що володіє поліпшеною специфічною активністю. Дикі штами Trichoderma reesei володіють здатністю секретувати в присутності субстратуіндуктора ферментний комплекс, добре адаптований до гідролізу целюлози. Ферменти ферментного комплексу володіють трьома типами активності: ендоглюканаз, екзоглюканази і целобіаз. Інші білки, такі як ксиланази, необхідні для гідролізу лігноцелюлозної біомаси, також продукуються Trichoderma reesei. Присутність субстрату-індуктора необхідна для експресії целюлолітичних і/або геміцелюлолітичних ферментів. Регуляція генів целюлази на різних вуглецевих джерелах детально досліджувалася. Глюкоза надає катаболічну репресію на продукування целюлаз. Вона індукується в присутності целюлози, продуктів її гідролізу, таких як целобіоза, або деяких олігосахаридів, зокрема, дисахаридів, таких як лактоза або софороза (Ilmen et аl. 1997, Appl.Environ.Microbiol. VoI 63 p. 1298-1306). Природа вуглецевого субстрату має великий вплив на склад ферментного комплексу. Так, ксилоза в поєднанні з індукуючим вуглецевим субстратом, таким як целюлоза або лактоза, дозволяє істотно поліпшувати активність, яка називається ксиланазною, якщо вона присутня в обмежених концентраціях порядку від 0,5 до 1 мкМ (Mach-Aigner et аl., 2010 Applied and Environmental Microbiology, VoI 76 N6, стор. 1770-1776). Розчинення залишкових геміцелюлоз (ксиланів) ксиланазами сприяє ферментативному гідролізу (Varnai et al., 2010 Enzyme and Microbial Technology VoI 46, стор. 185-193). Для досягнення високої продуктивності ферментів необхідно внести швидко асимільоване джерело вуглецю для забезпечення швидкого росту Trichoderma reesei і індукуючий субстрат, який забезпечує експресію целюлаз і секрецію в культурному середовищі. Целюлоза може виконувати обидві ці ролі. Однак її важко використати на промисловій стадії і її замінюють розчинними вуглецевими джерелами, такими як лактоза, що є також індукуючим субстратом. Інші джерела, такі як целобіоза або софороза, також описані як індуктори (Ilmen et аl. (1997), Foreman et al., (2003) Biol Chem 278, стор. 31988-31997, Pakula et аl., (2005) Microbiology, 151, стор. 135-143), але є такими, що дуже дорого коштують для використання в промисловості. Головним чином було зазначено, що продукування целюлаз Trichoderma reesei з використанням розчинних субстратів значно менше, ніж продукування целюлаз в режимі "batch" за рахунок ефекту репресії цукрів, що легко асимілюються у високій концентрації. 1 UA 111473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У патенті FR-B-2555603, поданому на ім'я заявника, пропонується безперервна подача вуглецевих субстратів, що дозволяє підвищити катаболічну репресію шляхом обмеження залишкової концентрації в культурах і оптимізації кількостей цукрів для отримання кращого виходу і кращої ферментної продуктивності. У способі, описаному в цьому патенті, пропонується почати подачу субстрату з використанням розчинних цукрів, таких як вуглецеве джерело, можливо в формі суміші. Однак обмежуюче безперервне введення глюкози або ксилози, не асоційоване з лактозою або іншим індуктором целюлаз (софороза, целобіоза,...) не дозволяє отримувати високу продуктивність ферментів. У промислових способах отримання целюлолітичних ферментів лактоза залишається одним з найбільш придатних субстратів. її ціна є високою і крім того дуже коливається і складає приблизно третину собівартості ферментів. Одне з рішень, що пропонуються, представлене в патенті ЕР-В-0448430, полягає у використанні вуглецевих субстратів, що виходять з філь'єри, наприклад, гідролізованих геміцелюлоз як індукуючого джерела вуглецю. Однак продуктивність залишається нижче приблизно на 50% по відношенню до способу, в якому використовують тільки лактозу як індукуючий субстрат. У заявці на патент WO 2009/026716 описаний спосіб продукування целюлаз, в якому геміцелюлолітичні похідні складають більше 40% вуглецевого джерела і цукри, що індукують отримання целюлаз, складають від 3 до 20% цієї суміші. Цей спосіб дозволяє отримувати щонайменше в два рази більше целюлаз в порівнянні зі способом, в якому використовується тільки цукор, отриманий з геміцелюлоз. Однак описані робочі характеристики продукування целюлаз залишаються більш низькими в порівнянні зі способом, в якому використовують тільки лактозу. Сучасні дослідження показують, що для удосконалення способів продукування целюлолітичних і/або геміцелюлолітичних ферментів необхідно розробляти нові індукуючі субстрати, щонайменше, такі ж ефективні, як і ті, в яких використовують лактозу, і з меншою вартістю. Даний винахід вписується в ці рамки. Короткий виклад суті винаходу Даний винахід стосується способу продукування целюлолітичних і/або геміцелюлолітичних ферментів, в якому індукуючий субстрат є сумішшю глюкози, лактози і ксилози. Докладний опис винаходу Спосіб продукування целюлолітичних і/або геміцелюлолітичних ферментів целюлолітичним і/або геміцелюлолітичним мікроорганізмом за даним винаходом включає щонайменше одну стадію росту в присутності вуглецевого джерела і щонайменше одну стадію продукування в присутності індукуючого субстрату, в якій вказаний індукуючий субстрат являє собою суміш глюкози або целюлозних гідролізатів, лактози і ксилози або розчину геміцелюлолітичних гідролізатів, причому вміст кожного з компонентів суміші визначений в наступних межах: - від 40 до 65% мас. глюкози або целюлозних гідролізатів, - від 21 до 25% мас. лактози і - від 10 до 39% мас. ксилози або розчину геміцелюлозних гідролізатів, причому сума цих трьох компонентів дорівнює 100%. Індукуючий субстрат не містить ніякого іншого цукру крім перерахованих вище компонентів. Таким чином, відносні кількості кожного з компонентів вибирають так, що сума показників вагових вмістів дорівнює 100%. Завдяки способу за винаходом, в якому використовують суміш певних цукрів як індукуючий субстрат, отримані кінцеві концентрації білків на 50-60% більше, ніж концентрації, отримані з використанням лактози як єдиного продукуючого субстрату. Вони приблизно в 3 рази перевищують концентрацію, отриману з використанням поліпшених сумішей, багатих ксилозами, таких як описані в WO 2009/026716 з рівня техніки. У способі за даним винаходом використовують суміш на основі глюкози. Більше 60% лактози, що індукує отримання целюлази, можна замінити глюкозою, що відома як репресуюча продукування целюлаз з поліпшеною кінцевою робочою характеристикою індукуючої суміші. Глюкоза має істотно меншу вартість, ніж лактоза і приблизно в 3 рази більшу розчинність у воді. Можна таким чином зменшити використовувані об'єми. Таким чином, в цьому способі глюкозу використовують одночасно на стадії росту, а також на стадії продукування на рівні 60% в складі суміші, що є індукуючим субстратом. Глюкозу, що використовується в суміші цукрів, можна також замінювати глюкозою, отриманою на стадії ензиматичного гідролізу целюлози, тобто безпосередньо способом перетворення лігноцелюлозної біомаси в етанол. Це сприяє зниженню вартості отриманні 2 UA 111473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферментів шляхом використання співпродуктів способу. У цьому випадку мова йде про целюлозні гідролізати. Ксилозу, що використовується в суміші, що є індукуючим цукром, можна замінити розчином геміцелюлолітичних гідролізатів, отриманим способом перетворення лігноцелюлозної біомаси в етанол і, зокрема, отриманим при попередній обробці біомаси. З іншого боку, можливість використати суміш, дуже насичену цукром, переважно дозволяє обмежувати ризики зараження. Введення в суміш, що є індукуючим субстратом, ксилози дозволяє істотно збільшити ксиланазну активність кінцевого ферментного коктейлю. Ксилозу можна переважно замінювати розчином геміцелюлозного гідролізату, отриманого гідролізом геміцелюлоз в процесі попередньої обробки лігноцелюлозної біомаси в способах отримання біопалива другого покоління, яке у разі необхідності може бути концентрованим. Переважно суміш, що є індукуючим субстратом, містить від 50 до 65% мас. глюкози або целюлозних гідролізатів, від 22 до 24% мас. лактози і від 15 до 25% мас. ксилози або розчину геміцелюлолозних гідролізатів можливо отриманого внаслідок попередньої обробки лігноцелюлозної біомаси, причому сума компонентів дорівнює 100%. Найбільш переважно індукуючий субстрат є сумішшю, що складається з 60% мас. глюкози або целюлозних гідролізатів, 23% мас. лактози і 17% мас. ксилози або геміцелюлозних гідролізатів. Вуглецевий субстрат, що використовується на стадії росту, вибирають з глюкози, ксилози, лактози, залишків, отриманих після етанольної ферментації мономерних цукрів ферментних гідролізатів целюлозної біомаси і/або сирого екстракту водорозчинних пентоз, можливо отриманих при попередній обробці целюлозної біомаси. Найбільш переважно субстрат росту являє собою глюкозу. Промислові джерела, що використовуються, які належать до виду Trichoderma reesei, модифіковані для поліпшення целюлолітичних і/або геміцелюлолітичних ферментів способами мутація-селекція. Наприклад, можна назвати штам IFP CL847. Можуть також застосовуватися штами, поліпшені технологіями генетичної рекомбінації. Їх слід делегувати для катаболічної репресії за допомогою глюкози ( CRE1), як наприклад CL847. Ці штами культивують в біореакторах, що струшуються і аеруються в умовах, сумісних з їх ростом і продукуванням ферментів. Умови є такими, що рН знаходиться в діапазоні від 3,5 до 6, а температура від 20 до 35°С. Переважно вибирають рН, що дорівнює 4,8, і температуру 27°C на стадії росту і рН, що дорівнює 4, і температуру 25°С на стадії продукування. Міра аерації, виражена в об'ємі повітря на об'єм реакційного середовища на хвилину або vvm, що -1 використовується під час здійснення способу, складає від 0,3 до 1,5 хв. , а швидкість обертання або rmp повинна забезпечувати регулювання тиску в О 2 від 20% до 60%. Переважно вибирають аерацію 0,5 vvm і струшування, що забезпечує тиск в O2 30%. За своїй природою вуглецевий субстрат, вибраний для отримання біомаси, вводять в біореактор до стерилізації або стерилізують окремо і вводять в біореактор після стерилізації цього останнього для отримання початкової концентрації цукру від 15 до 60 г/л. На стадії продукування водний розчин, що містить індукуючий субстрат, що складається з суміші глюкоза/лактоза/ксилоза, або розчин геміцелюлозного гідролізату, вибраний для стадії продукування ферментів, готують в концентрації від 350 до 600 г/л в поживному розчині, що використовується. Переважно концентрація складає від 450 до 550 г/л. Водний розчин впорскують після виснаження початкового субстрату так, щоб внести оптимальну кількість. Вхідний потік поживного розчину складає від 30 до 45 мг на грам клітин на годину. Залишкова концентрація цукру в культурному середовищі менше 1 г/л на стадії продукування ("підживлення"), що обмежує продукування біомаси. Переважно ця концентрація менше 0,5 г/л і ще більш переважно становить 0,1 г/л. Приклади З наведених нижче прикладів в прикладі 1 представлена культура, в якій використовується глюкоза як вуглецевий субстрат на стадії росту і на стадії продукування. Цей приклад демонструє низьку продуктивність білків, що отримується, якщо цей цукор використовують як єдиний вуглецевий субстрат, навіть якщо на стадії підживлення потік є таким, що обмежує (залишкова концентрація глюкози близька до 0). У другому прикладі показана контрольна ферментація з використанням лактози як вуглецевого субстрату на стадії росту і на стадії продукування, яка забезпечує високу продуктивність білків. У прикладі 3 відтворюється дослідний експеримент з використанням на стадії продукування суміші, такої як описана в 3 UA 111473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 заявці на патент WO 2009/026716, з високим вмістом ксилози, що дозволяє, на думку авторів, істотно підвищити продукування целюлаз в порівнянні з експериментом, в якому ксилозу або геміцелюлозні похідні використовуються як єдині вуглецеві субстрати. Приклади 4-6 стосуються патенту і способів за даним винаходом. Приклад 1: Продукування ферментів на глюкозі (не стосується винаходу) Продукування целюлаз здійснюють в біореакторі з механічним струшуванням. Мінеральне середовище має наступний склад: KOH 1,66 г/л, Н3РО4 85% 2 мл/л, (NH4)2SO4 2,8 г/л, MgSO4, 7 H2O 0,6 г/л, CaCl2 0,6 г/л, MnSO4 3,2 мг/л, ZnSO4, 7 H2O 2,8 мг/л, CoCl2 10 4,0 мг/л, FeSO4, 7 H2O 10 мг/л, Corn Steep 1,2 г/л, протипінний засіб 0,5 мл/л. Біореактор, що містить мінеральне середовище, стерилізують при 120°C протягом 20 хвилин, вуглецеве джерело - глюкозу стерилізують окремо при 120°C протягом 20 хвилин, потім вводять в біореактор в стерильних умовах так, щоб отримати фінальну концентрацію 30 г/л. В біореактор висівають при 10% (ν/ν) рідку прекультуру штаму Trichoderma reesei CL847. Мінеральне середовище прекультури ідентичне тому, що знаходиться в біореакторі за винятком -1 додання фталату калію в концентрації 5 г/л для тампонування рН. Ріст грибка в прекультурі відбувається з використанням глюкози як вуглецевого субстрату в концентрації 30 г/л. Ріст інокуляту продовжується від 2 до 3 днів і проходить при 28°С в інкубаторі в умовах струшування. Перехід до біореактору здійснюється, якщо залишкова концентрація глюкози менше 15 г/л. Експеримент в біореакторі включає в себе дві стадії: - стадію росту на вуглецевому субстраті - глюкозі (початкова концентрація = 30 г/л) при температурі 27°С і рН 4,8 (регулюється аміаком 5,5 M). Аерація становить 0,5 vvm і струшування посилюється до 200-800 rpm в залежності від рО2 (тиск розчиненого кисню), який підтримується вище 30%. - Стадія отримання ферментів. Коли початковий субстрат в ферментаторі виснажується, розчин глюкози 250 г/л безперервно впорскують з витратою від 30 до 40 мг на г клітин на годину до 164 годин. Температуру знижують до 25°С і рН 4 до кінця культивування. рН регулюється шляхом додання розчину аміаку 5,5 н., який вносить азот, необхідний для синтезу екскретованих білків. Вміст розчиненого кисню підтримують вище 15-20% шляхом аерації і струшування. Після продукування ферментів йде титрування екстрацелюлярних білків методом Лоурі і у відповідності зі стандартом BSA після відділення міцелію фільтруванням або центрифугуванням. Визначеними видами целюлолітичної активності є: - Активність фільтрувального паперу (UPF: одиниця фільтрувального паперу), яка дозволяє титрувати загальну активність ферментного пулу ендоглюканаз і екзоглюканаз; - Активність арил--глюкозидази і ксиланаз для специфічних видів активності. Активність UPF вимірюють по паперу Whatman n 1 (процедура, рекомендована комісією з біотехнології IUPAC) в початковій концентрації 50 г/л; беруть пробу ферментного розчину, що аналізується, який вивільняє еквівалент 2 Вуглецевим субстратом на стадіях росту і продукування є чиста лактоза. Лактоза є важливим індуктором при продукуванні целюлаз. Це субстрат, що найбільше використовується в промисловості для продукування целюлаз. Через 30 годин росту, після виснаження початкового субстрату безперервно вводять підживлюючий розчин в концентрації 250 г/л з витратою 35 мг на г клітин на годину до 164 годин. Аналітичне визначення по кінцевому суслу дає наступні результати: Біомаса г/л 13,5 Білки г/л 37,8 UPF IU/мл 22,1 Ксиланаза 408,5 IU/мг Специфічна -глюкозидаза 0,96 IU/мг. Приклад 3: Продукування з використанням суміші 97% ксилоза/3% цукрів-індукторів продукування целюлаз або CIC (не за винаходом) Експеримент проводиться в тих же умовах, що і в прикладі 1 з використанням чистої ксилози як єдиного вуглецевого субстрату на стадії росту і на стадії продукування суміші 97% ксилоза/3% CIC, представленій в патентній заявці WO 2009/026716 A1. CIC (цукри-індуктори продукування целюлаз) являють собою суміш цукрів, що забезпечує індукцію продукування целюлаз. Її склад є наступним: 56% гентіобіози, 14% софорози, 10% трегалози, 6% целобіози, 6% мальтотриози, 8% глюкози. 4 UA 111473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Після виснаження початкового субстрату суміш 97% ксилоза/3% CIC в концентрації 360 г/л впорскують відповідно до описаних рекомендацій з витратою 0,4 г вуглецю.. L-1 h-1. Аналітичне визначення по кінцевому суслу дає наступні результати: Біомаса 14,3 г/л Білки 18,7 г/л UPF 6,4 IU/мл Ксиланаза 6000,1 IU/мг Специфічний UPF 0,34 IU/мг Специфічна -глюкозидаза 1,15 IU/мг. Кінцева продукція білків близька до представленої в патенті WO 2009/026716 A1, де автори отримали кінцеву концентрацію білків 25 г/л з штамом P59G. Специфічна активність FPase (0,34 IU/мг) є слабкою, тоді як активність ксиланази є дуже високою. Приклад 4: Продукування з використанням суміші лактоза (23%)/глюкоза(60%)/ксилоза (17%) в концентрації 500 г/л (за винаходом) Експеримент в прикладі 4 проводиться в тих же умовах, що і в прикладі 1 з використанням глюкози як вуглецевого субстрату росту в концентрації 60 г/л. Потім на стадії продукування в режимі «підживлення» використовують розчин, в якому три вуглецевих субстрати змішані в наступних пропорціях: лактоза (23%)/ глюкоза(60%)/ксилоза (17%) в концентрації 500 г/л. Цю -1 суміш впорскують з розрахунку 45 мг.г год-1. Аналітичне визначення по кінцевому суслу дає наступні результати: Біомаса 26,1 г/л Білки 61,8 г/л UPF 33,7 IU/мл Ксиланаза 4017 IU/мг Специфічний UPF 0,55 IU/мг Специфічна -глюкозидаза 1,2 IU/мг. Кінцева продукція білків більш ніж в 3 рази перевищує кінцеву продукцію з прикладу 3. Активність фільтрувального паперу, яка є показником целюлазної активності, приблизно в 5 разів вище. Ксиланазна активність в 10 разів вище, ніж в прикладі 2, виконаному з використанням лактози як єдиного вуглецевого субстрату росту і продукування, але приблизно на 50% нижче, ніж в прикладі 3. Приклад 5: Використання суміші лактоза (23%)/глюкоза(60%)/розчин С5-цукрів (17%) в концентрації 500 г/л (за винаходом) Приклад 5 здійснюється в тих же умовах, що і приклад 4. Глюкозу використовують на стадії росту в концентрації 15 г/л. Ксилозу підживлюючого розчину замінюють розчинним геміцелюлозним розчином або розчином С5-цукрів, отриманим з пшеничної соломи, просоченою сірчаною кислотою 0,08 н. і заздалегідь обробленої паровим вибухом (19 бар, 5 -1 -1 хвилин). Суміш впорскують з розрахунку 30 мг.г год. протягом 170 годин. Аналітичне визначення по кінцевому суслу дає наступні результати: Біомаса 19,1 г/л Білки 57,3 г/л UPF 25,1 IU/мл Ксиланаза 1151 IU/мг Специфічний UPF 0,44 IU/мг Специфічна -глюкозидаза 1,4 IU/мг. Цей експеримент дозволив підвищити продукцію білків більш ніж на 50% в порівнянні з прикладом 2 і ксиланазну активність майже в 3 рази. Більшу частину лактози замінили на стадії росту і продукування глюкозою і розчином С5-цукрів. Концентрація глюкози на стадії росту поменшала в порівнянні з прикладом 4 з 60 до 15 г/л. Концентрація біомаси поменшала з 26 до 19 г/л, але це мало вплинуло на кінцеву концентрацію білків (зниження на 7%). Таким чином, досягнуте максимальне використання цукрів і істотне зниження вартості вуглецевого джерела. Приклад 6: Використання суміші: лактоза (23%)/С6-гідролізати (56%)/ксилоза (21%) в концентрації 500 г/л (за винаходом) Приклад 6 здійснювали в тих же умовах, що і приклад 4. Глюкозу використали на стадії росту в концентрації 15 г/л. Глюкозу в підживлюючому розчині замінили розчином гідролізату, отриманим ферментативним гідролізом пшеничної соломи, просоченої сірчаною кислотою 0,08 н. і заздалегідь обробленої паровим вибухом (19 бар, 5 хвилин). Ферментативний гідроліз пшеничної соломи здійснювали при 50°C і рН 4,8. Він привів до гідролізу 95% целюлози на 5 UA 111473 C2 5 10 15 глюкозі. Лактозу і ксилозу розчиняли в цьому розчині для отримання суміші: лактоза (23%)/С6гідролізати (56%)/ксилоза (21%) в концентрації 500 г/л. -1 -1 Суміш впорскували з розрахунку 30 мг.г. год. протягом 170 годин на стадії підживлення. Аналітичне визначення по кінцевому суслу дає наступні результати: Біомаса 16,1 г/л Білки 43,1 г/л UPF 31,4 IU/мл Ксиланаза 6595,1 IU/мг Специфічний UPF 0,73 IU/мг Специфічна -глюкозидаза 1,2 IU/мг. Отриманий ферментний коктейль має дуже хорошу якість, оскільки кінцева активність FPase є близькою до активності, досягнутої в прикладі 4, навіть якщо концентрація білків є більш слабкою. Кінцева активність FPase приблизно в 5 разів перевищує ту, яка отримана в прикладі 3 і приблизно на 50% вище отриманої в прикладі 2, в якій лактоза використовується як єдиний вуглецевий субстрат на стадії підживлення. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 30 35 40 45 50 1. Спосіб отримання ферментів целюлази і/або геміцелюлази мікроорганізмом, що включає щонайменше одну стадію зростання в присутності вуглецевого джерела і щонайменше одну стадію продукування в присутності індукуючого субстрату, в якому вказаний індукуючий субстрат є сумішшю глюкози або целюлозних гідролізатів, лактози і ксилози або розчину геміцелюлолітичних гідролізатів, причому вміст кожного з компонентів суміші визначений в наступних межах: від 40 до 65 % мас. глюкози або целюлозних гідролізатів, від 21 до 25 % мас. лактози і від 10 до 39 % мас. ксилози або розчину геміцелюлозних гідролізатів, причому сумарна кількість цих трьох компонентів дорівнює 100 %; при цьому вказаний мікроорганізм належить до виду Trichoderma reesei і делетується для катаболітної репресії глюкозою. 2. Спосіб за п. 1, в якому мікроорганізм вибраний із штаму CL847. 3. Спосіб за п. 1 або 2, в якому внесення індукуючого субстрату здійснюється в розчині, причому концентрація індукуючого субстрату в поживному розчині, що використовується на стадії продукування, складає від 350 до 600 г/л. 4. Спосіб за п. 3, в якому концентрація складає від 450 до 550 г/л. 5. Спосіб за п.1 або 2, в якому суміш, що є індукуючим субстратом, містить від 50 до 65 % мас. глюкози або целюлозних гідролізатів, від 22 до 24 % мас. лактози і від 15 до 25 % мас. ксилози або розчину геміцелюлозних гідролізатів, причому сумарна кількість компонентів суміші дорівнює 100 %. 6. Спосіб за п. 5, в якому індукуючий субстрат є сумішшю, що складається з 60 % мас. глюкози або целюлозних гідролізатів, 23 % мас. лактози і 17 % мас. ксилози або геміцелюлозних гідролізатів. 7. Спосіб за п. 1 або 2, в якому вуглецевий субстрат, що використовується на стадії зростання, вибирають з глюкози, ксилози, лактози, залишків, отриманих після етанольної ферментації мономерних цукрів ферментних гідролізатів целюлозної біомаси і/або сирого екстракту водорозчинних пентоз, можливо отриманих при попередній обробці целюлозної біомаси. 8. Спосіб за п. 1 або 2, в якому значення рН підтримують в діапазоні від 3,5 до 6, а температура складає від 20 до 35 °C. 9. Спосіб за п. 1 або 2, в якому вхідний потік поживного розчину складає від 30 до 45 мг на грам клітин на годину. 10. Спосіб за п. 1 або 2, в якому залишкова концентрація цукру в культурному середовищі на стадії продукування менше 1 г/л, переважно 0,5 г/л і ще більш переважно 0,1 г/л. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6