Композиції, які містять хондроїтинсульфат, протеолітичні ферменти та сульфгідрильні сполуки для підвищення біодоступності хондроїтинсульфату

Номер патенту: 114941

Опубліковано: 28.08.2017

Автори: Міралья Нікколо, Трентін Антонелла, Россіні Мауро, Бьянкі Давіде

Є ще 2 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Композиція, що містить хондроїтинсульфат, натокіназу та, як варіант, сульфгідролізовану сполуку, причому співвідношення хондроїтинсульфату/протеази/сульфгідролізованої сполуки дорівнює 1,0/0,05-0,8/0,001-0,05 за вагою.

2. Композиція за п. 1 за відсутності сульфгідролізованої сполуки.

3. Композиція за п. 1 за присутності сульфгідролізованої сполуки.

4. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, в якій хондроїтинсульфат має молекулярну масу 1-95 кДа.

5. Композиція за будь-яким з пп. 1-4, в якій хондроїтинсульфат отримують екстракцією з тваринного джерела.

6. Композиція за будь-яким з пп. 1 та 4, в якій хондроїтинсульфат отримують хімічним сульфатуванням капсульного полісахариду К4 Е. соlі усунення гідролізом залишків фруктози.

7. Композиція за будь-яким з пп. 1 та 4, в якій хондроїтинсульфат отримують хімічним сульфатуванням та наступною кислотною або радикальною деполімеризацією капсульного полісахариду К4 Е. соlі після гідролітичного усунення залишків фруктози.

8. Композиція за будь-яким з пп. 1 та 4, в якій хондроїтинсульфат отримують хімічним сульфатуванням капсульного полісахариду генетично модифікованого штаму E. соlі, в якому цей полісахарид у початковому стані є вільним від залишків фруктози.

9. Композиція за будь-яким з пп. 1 та 4, в якій хондроїтинсульфат отримують хімічним сульфатуванням та наступною кислотною або радикальною деполімеризацією капсульного полісахариду генетично модифікованого штаму Е. соlі, в якому цей полісахарид у початковому стані є вільним від залишків фруктози.

10. Композиція за будь-яким з пп. 1-9, в якій сульфгідролізовану сполуку вибрано з метіоніну, цистеїну, гомоцистеїну, S-аденозилметіоніну, ацетилцистеїну, відновленого або окисленого глутатіону та S-ацетилглутатіону.

11. Композиція за будь-яким з пп. 1-10, яка додатково містить один або більше активних елементів, які застосовують у запобіганні або лікуванні гострого або хронічного запалення та/або одну або більше поживних речовин, яку застосовують для підтримання доброго стану опорно-рухової системи людини та тварин.

12. Композиція за п. 11, в якій один або більше активних елементів вибрано з групи, яка складається з гідрохлориду глюкозаміну, сульфату глюкозаміну, N-ацетилглюкозаміну, гіалуронової кислоти, амінокислот, колагену, гідролізованого колагену, поліненасичених жирних кислот, кератину, метилсульфонілметану, фолату, відновленого фолату, вітамінів, вітамінів групи В, S-аденозилметіоніну (SAM), аскорбінової кислоти та аскорбату марганцю.

13. Композиція за будь-яким з пп. 1-12, яка додатково містить одну або більше фармацевтично та поживно прийнятних домішок, вибраних з групи, яка охоплює мікрокристалічну целюлозу, стеаринову кислоту, стеарат магнію, колоїдний діоксид кремнію, етилцелюлозу, метилцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, водні солі шелаку, альгінат натрію, крохмаль, модифіковані крохмалі, співполімери метакрилової кислоти, мальтодекстрини та поліоли.

14. Композиція за будь-яким з пп. 1-13 для застосування у профілактиці або лікуванні гострих та хронічних запалень.

15. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів у вигляді твердих препаратів для перорального застосування, у вигляді капсул, м'яких желейних капсул, таблеток, гранул, рідких напоїв або відновлених порошкових напоїв.

Текст

Реферат: Винахід стосується композицій, які містять хондроїтинсульфат (CS), натокіназу та сульфгідрильну сполуку у співвідношенні 1,0/0,05-0,8/0,001-0,05 відповідно. Композиції призначені для лікування та профілактики остеоартриту та пов'язаних з ним гострих та хронічних запальних процесів, або для застосування як поживних композицій для підтримання здорового стану опорно-рухової системи людини та тварини. UA 114941 C2 UA 114941 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід стосується композицій, що містять хондроїтинсульфат (CS), ферментів або ферментaтивних сумішей, що виявляють протеолітичною активністю окремо або в присутності сульфгідрильних сполук, та їх застосування у лікуванні та профілактиці остеоартриту та пов'язаних з ним гострих та хронічних запальних процесів, або як поживні композиції для підтримання здорового стану опорно-рухової системи людини та тварин. Ці комбінації підвищують кишкове поглинання CS при пероральному введенні. Їх дія розповсюджується на широкий діапазон молекулярних мас CS, включаючи зразки, які складаються з олігосахаридів, що відрізняються дуже низькими молекулярними масами (1-10 кДа), та, стосовно яких відомо, що їх біодоступність є більшою, ніж біодоступність зразків з більш високою молекулярною масою. На основі великої кількості клінічних даних, Європейська Антиревматична Ліга (EULAR) рекомендує застосування CS як симптоматичний лікарський засіб повільної дії проти остеоартриту (SYSADOA) для лікування остеоартриту колін, стегон та рук. CS також застосовують, як поживний засіб, окремо або у поєднанні з іншими інгредієнтамипоживний у композиціях, які виявляють протизапальну активність, як на місцевому, так і на системному рівнях. Хондроїтинсульфат (CS) є полісахаридом, що належить до класу глікозаміногліканів (GAG), які є присутніми у хребетних та безхребетних тварин, та складаються з дисахаридних послідовностей, утворених залишком глюкуронової кислоти (GlcA), який перемежовується залишком N-ацетил-D-галактозаміну (GalNAc) та разом ці залишки пов'язано бета- 1-3 зв'язками та сульфатовано у різних положеннях. В свою чергу ці дисахариди є зв'язаними разом бета- 1-4 зв'язками. Головним чином CS містить моносульфатовані дисахаридні одиниці у 4 або у 6 положенні GalNAc (які відповідно називають дисахаридом A та C). CS А та С присутні в різних відсоткових частках в залежності від походження полісахариду. Несульфатований дисахарид та дисульфатовані дисахариди, що несуть дві сульфатні групи, зв'язані з атомом оксигену у різних положеннях, також присутні у CS у меншій кількості, яка є змінною, залежить залежності від певних тваринних джерел (як-то у положенні 2 GlcA та у положенні 6 GalNAc (дисахарид D), у положенні 2 GlcA та у положенні 4 GalNac або у положеннях 4 та 6 GalNAc (дисахарид E)) (Volpi N.J. Pharm. Pharmacol. 61, 1271, 2009. Volpi N.J. Pharm. Sci. 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr. Pharm. Des. 12, 639, 2006). Хондроїтинсульфати різного тваринного походження також відрізняються різною молекулярною вагою. CS наземних тварин мають, наприклад, схожі між собою значення молекулярної маси, але вони відрізняються від CS різних видів риб, які мають більш високу молекулярну масу. Середня молекулярна маса CS наземних тварин знаходиться у межах 14-26 кДа, тоді як CS морських тварин, отримані з кальмару, хрящових та костистих риб, мають середню молекулярну масу, яка перевищує 50 кДа. Окрім CS тваринного походження, деякі продукти CS описують, як такі, що мають полісахаридну основу бактеріального походження, яку потім синтетично змінюють з метою отримати полімерні аналоги природних CS. Ці біотехнологічні CS, які мають бактеріальносинтетичне походження долають певні недоліки, пов'язані з тваринним походженням виділених CS, як-то можливу наявність вірусів та / або пріонів або інших потенційно алергічних макромолекул у складі залишкових домішок, високий вміст тваринних білків у кінцевому продукті, несумісність тваринних продуктів релігійними та харчовими обмеженнями та обмежені джерела, доступні для задоволення зростаючого світового попиту. Приклади CS бактеріально-синтетичного походження описано, наприклад, в EP 1304338, в якій капсульний полісахарид штаму O5:K4:H4 E. coli після виділення та гідролізу оригінального полімеру піддають хімічному сульфатуванню. Інші приклади бактеріально-синтетичних CS описані у WO 2012/152872, WO 2012/159655 та WO 2013/174847, в яких бактеріальний капсульний полісахарид також піддають хімічному сульфатуванню для отримання CS, подібного тому, який має тваринне походження. Нарешті, у деяких прикладах низькомолекулярні CS було отримано шляхом деполімеризації полісахаридів, отриманих шляхом екстракції, (Cho SY et al. Biol. Pharm. Bull. 27, 47, 2004, Das A. et al. Osteoart. Cartil. 8, 343, 2000) та полісахаридів бактеріального походження (WO 2013/174847, WO 2012/152872). Малі молекулярні розміри CS цих типів сприяють кращому пероральному застосуванню з одночасним збереженням більшості відомих активних властивостей природних CS. При пероральному введенні CS всмоктується кишковою слизовою оболонкою у тонкому кишечнику та дистальному тракті. Частково ця сполука всмоктується у вигляді високомолекулярного полісахариду у тонкому кишечнику та її більша частина поглинається у 1 UA 114941 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вигляді олігосахаридів у сліпій та товстій кишках. (Lauder R.; Compl. Ther. Med.17, 56-62, 2009). Ці олігосахариди утворюються внаслідок часткової деполімеризації первісного полісахариду гідролітичними ферментами, які є продуктами кишкової флори у нижньому відділі системи травлення. Хоча механізм, залучений до кишкового поглинання полісахаридів, які є складовими частинами CS до кінця є не зовсім зрозумілим, однак для більшості макромолекул вважається, що поглинання через параклітинний простір кишкового епітелію є кількісно значним та олігосахаридні фрагменти CS також поглинаються таким шляхом. На цьому рівні присутні щільні контакти, які утворюють бар'єр, що обмежує поглинання великих молекул, до перенесення яких не залучено посередництво певних молекулярних носіїв через слизову оболонку кишечника. Поглинання високомолекулярного CS оцінюють у кількості приблизно 1-5 %. Як було попередньо зазначено, більшість поглинених хондроїтинсульфатів складається з олігосахаридів, які виникають внаслідок ферментативного розщеплення цих сполук хондроїтиназою, яку виробляє кишкова мікробна флора. Однак, приймаючи до уваги поглинання олігосахаридів слід зазначити, що загальне поглинання CS кишковою слизовою оболонкою становить не більш, ніж 20-23 % поглиненого полісахариду (Lauder R.; Compl. Ther. Med. 17, 56-62, 2009-Barthe L. et al. Arzneimittelforsch./Drug Res. 2004; 54: 286-92). В цілому поглинання CS після перорального введення залишається проблемою та будьякий спосіб, здатний підвищити кишкове поглинання цього глікозаміноглікану є дуже актуальним. Бромелайн є цистеїновою протеазною сумішшю, яку отримують з плодів та стебел ананасу (Ananas comosus), рослини родини Bromeliaceae. Головним джерелом бромелайну є стебло цієї рослини, в якому концентрація цієї сполуки є найвищою. Взагалі можна розрізнити чотири окремі фракції цієї суміші або, згідно за більш елегантною аналітичною характеризацією, проведеної з допомогою мас-спектрометрії, у цій суміші можна розрізнити вісім протеолітичних компонентів, кожен з яких має порівнянну протеолітичну активність. Цю суміш у природній формі звичайно й застосовують з цією метою. Бромелайн класифікують, як ендопептидазу, що належить до підродини пептидаз C1A (номенклатура MEROPS). На додачу до суміші протеаз цей екстракт також містить пероксидазу, кислу фосфотазу та глікозидазу. Молекулярна маса інгредієнтів коливається у межах 8 – 28,5 кДа. Концентрацію бромелайну частіше виражають не у одиницях ваги, а у протеолітичних одиницях (у одиницях GDU або у міжнародних одиницях, IU). З точки зору власних протеолітичних характеристик, бромелайн має активність, подібну до активності панкреатичної протеази, отже він сприяє травленню. Його застосовують для лікування диспепсії у поєднанні з панкреатичними екстрактами. Також він розщеплює довголанцюгові жири. Крім того, бромелайн також має інші фармакологічні активні властивості, найбільш важливою з яких є потужна протизапальна активність, яка робить його ефективним для застосування у лікуванні запальних станів м'яких тканин, пов'язаних з травмами або післяопераційних реакцій та місцевих запалень. Показано, що активність бромелайну полягає у підвищенні біосинтезу протизапальних простогландинів (як-то простогландину E2) та навпаки, у пригніченні біосинтезу прозапальних простогландинів. Іншими типами фармакологічних активних властивостей бромелайну є його антитромботична та про-фібринолітична дія, гіпотензивна активність та здатність викликати регресію атеросклеротичних бляшок. Також описані його синергетичні властивості при застосуванні у протипухлинному та антибіотичному лікуванні. Бромелайн відрізняється доброю пероральною біодоступністю, яку оцінюють, як приблизно 40 %, що є рідкою ознакою для білків. Більш того, більшість непоглиненого бромелайну залишається неушкодженою та здатна проявляти свою ферментативну активність у просвіті кишечника, оскільки вона не сильно піддається впливу шлункового соку або присутніх в слині цистатінів. З точки зору своїх характеристиками бромелайн нагадує папаїн та фікаїн, схожі екстракти, отримані, відповідно, з папаї (Carica papaya) та інжиру Ficus carica). Натокіназа є ферментом, який перший раз отримано з natto, традиційної японської їжі на основі варених соєвих бобів, ферментованих певним різновидом Bacillus subtilis, B. subtilis natto. Натокіназа є сериновою протеазою розміром приблизно 32 кДа, яка має потужну фібринолітичну активність. Її гомологія з субтилізином перевищує 72 %. Фібринолітичні активні властивості натокінази полягають у безпосередній фібринолітичній дії разом зі здатністю викликати підвищення продукування урокінази та плазміну. Натокіназа відрізняється відносно високою стійкістю до температури та низьких значень pH; ці характерні особливості надають цьому білку добру стійкість до впливу шлункового середовища, дозволяючи його застосовувати 2 UA 114941 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шляхом перорального введення. Відносна стійкість натокінази до шлункового середовища та її протеолітичні активні властивості роблять її ферментом, який у зображеному тут застосуванні може бути аналогічним до бромелайну. US 5679344 присвячено поживним композиціям, які містять глюкозамін та протеолітичні ферменти, що мають протизапальні властивості та які призначені для застосування у лікуванні розладів суглобів. Ці композиції містять принаймні одну протеазу та принаймні одну кислотостійку протеазу. US 5888514 присвячено композиціям, які містять хрящ, протеолітичні ферменти, глюкозамінсульфат та хондроїтинсульфат разом з вітамінами та рослинними екстрактами та призначені для лікування запалення кісток та суглобів. Було показано, що поєднання CS з бромелайном та одночасна наявність підсилювача активності бромелайну, як-то цистеїну, метіоніну, глютатіону або інших сульфгідрильних сполук підвищує його поглинання у тонкому кишечнику. Також було показано, що натокіназа має навіть ще більш неочікувану дію на біодоступність CS, яка зростає більш, ніж на 250 %. Метою заявленого винаходу є композиція, що містить хондроїтинсульфат та одну або кілька протеаз та вибірково, за умови, коли протеаза є іншою, ніж натокіназа, містить сульфгідрильну сполуку. Вираз "сульфгідрильна сполука" тут має відношення до природної або синтетичної амінокислоти або малого пептиду або до іншої сполуки, яка містить принаймні одну сульфгідрильну групу. Ця сульфгідрильна сполука є переважно вибраною з метіоніну, цистеїну, гомоцистеїну, S-аденозилметіоніну, ацетилцистеїну, відновленого або окисленого глутатіону та S-ацетил-глутатіону. У композиціях за винаходом, співвідношення хондроїтинсульфату / протеази / сульфгідрильної сполуки дорівнює 1,0/0,05-0,8/0,001-0,05. Хондроїтинсульфат переважно має молекулярну масу, що знаходиться у межах 1-95 кДа, більш переважно 4-50 кДа. Хондроїтинсульфат переважно є екстрактом тваринного походження. CS можна отримати шляхом хімічної сульфатації капсульного полісахариду K4 з E. coli після усунення фруктозних залишків шляхом гідролізу, як описано у EP 1304338, WO 2012/152872, WO 2012/159655, або шляхом хімічної сульфатації та наступної кислотної або радикальної деполімеризації капсульного полісахариду K4 з E. coli після усунення фруктозних залишків шляхом гідролізу, як описано у WO 2013/174847 та WO 2012/152872. Альтернативним чином, CS також можна отримати шляхом хімічної сульфатації капсульного полісахариду з генетично модифікованого штаму E. coli (наприклад, DSM23644), під час якої цей полісахарид спочатку позбавляють фруктозних залишків (WO 2012/159655). Молекулярні розміри отриманого таким чином CS також можуть бути потім зменшені шляхом кислотної або радикальної деполімеризації, як зазначено у WO 2013/174847. Протеаза переважно є вибраною з бромелайну, папаїну, фікаїну та натокінази, та переважно такою протеазою є натокіназа. У переважному втіленні винаходу передбачені композиції, які містять хондроїтинсульфат та натокіназу у відсутність сульфгідрильної сполуки. Винаходом також передбачено застосування натокінази для покращення кишкової проникності хондроїтинсульфату. Композиції за винаходом також можуть містити один або більше активних інгредієнтів, яких застосовують для запобігання або лікування гострих та хронічних запальних станів та/або один або більше поживних сполук, які застосовують для підтримання доброго стану опорно-рухової системи людини та тварин. Активні інгредієнти можуть бути вибрані, наприклад, з групи, яка охоплює гідрохлорид глюкозаміну, сульфат глюкозаміну, N-ацетилглюкозамін, гіалуронову кислоту, амінокислоти, колаген, гідролізований колаген, поліненасичені жирні кислоти, кератин, метилсульфонілметан, фолат, відновлений фолат, вітаміни, вітаміни групи В, С-аденозілметіонін (САМ), аскорбінову кислоту та аскорбат марганцю. Ці композиції також можуть містити одну або більше фармацевтично або поживно прийнятних домішок. Всі з цих інгредієнтів звичайно поєднують з хондроїтинсульфатом, наприклад, до цих композицій також може бути додано глюкозамін та метилсульфонілметан (MСM). Фармацевтично або поживно прийнятні домішки охоплюють, наприклад, мікрокристалічну целюлозу, стеаринову кислоту, стеарат магнію, колоїдний діоксид кремнію, етилцелюлозу, метилцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, водні солі шелаку, альгінат натрію, крохмаль, 3 UA 114941 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифіковані крохмалі, сополімери метакрилової кислоти, мальтодекстрини та поліоли. Композиції за винаходом переважно вводять перорально, наприклад, у вигляді капсул, м'яких желатинових капсул, таблеток, гранул, напоїв у рідкій формі або порошкоподібних напоїв, які мають бути відновлені. Добова доза CS може варіюватися між 400 мг та 3600 мг при поживному застосуванні та звичайна добова доза при застосуванні в якості ліків дорівнює 1200 мг. Опис фігури. На фігурі зображено проникність бичачого хондроїтинсульфату розміром 20 кДа (ромби), низькомолекулярного (LMW) хондроїтинсульфату розміром 9 кДа (квадрати) та високомолекулярного (HMW) хондроїтинсульфату розміром 40 кДа (трикутники) крізь кишкову слизову оболонку щурів. Експериментальна частина. Проникність CS перевіряли з допомогою моделі in vitro, в якій кишкову слизову оболонку щурів вилучали з тварин одразу після евтаназії та розташовували у камері Уссинга, зануреній у прийнятному буфері на межі двох відділень, з поверхнею слизової оболонки, спочатку підданої дії просвіту кишечника, що стикається з одним, так званим донорним відділенням, та з її базальною частиною, що стикається з іншим, акцепторним відділенням. CS розмістили у донорному відділенні у присутності або у відсутність інших інгредієнтів комбінації та наявність полісахаридів визначали у акцепторному відділенні після періоду інкубації, протягом якого відбувалося проникнення CS у акцепторне відділення через мембрану, яка складалася з кишкової слизової оболонки щурів. Далі буде більш детально описано застосований експериментальний спосіб оцінки кишкової проникності CS з різними комбінаціями цієї сполуки. Щурів Льюіса вагою 150-170 г. піддали евтаназії шляхом інгаляції CO2, після чого тонкий кишечник тварин негайно вилучили, промили та розташували у камері Уссинга, заповненій середовищем, яке містило 125 мМ хлорид натрію (NaCl), 1,3 мМ сульфат магнію (MgSO4), 5 мМ хлорид калію (KCl), 20 мМ глюкозу та 25 мМ карбонат натрію (NaHCO3). pH розчину довели до 7,4 з допомогою HEPES. Дослідження проникнення проводили при температурі 37 °C у атмосфері 95 % O2 та 5 % CO2. Перевірку проникнення здійснювали не більш, ніж через 15 хв. після вилучення кишкової слизової оболонки. Застосовані у цих дослідженнях зразки CS відрізнялися за природою та молекулярними розмірами. Зразки бичачого та біотехнологічного (бактеріально-синтетичного) хондроїтинсульфату піддали перевірці на кишкове проникнення у різних комбінаціях. Також застосовані зразки CS відрізнялися різною молекулярною масою, яка коливалася у межах 1-95 кДа або переважним знаходилася у межах 4-50 кДа. Хондроїтинсульфат додавали до донорного відділення з 3 % концентрацією (маси / об'єму). Для дослідження проникнення у присутності бромелайну, до розчину CS додали бромелайн з 1,5 % концентрацією. Альтернативним чином, разом з бромелайном додавали також сульфгідрильну сполуку з 0,075 % концентрацією, вибрану з метіоніну, цістеїну, гомоцістеїну, Sаденозілметіоніну, ацетілцістеїн S-ацетил-глутатіону та від відновленого або окисленого глютатіону. Для дослідження проникнення у присутності натокінази цей фермент додали до розчину, як і бромелайн, з 1,5 % концентрацією. Загальний період інкубування сягав три години, та кожні 30 хв. протягом цього часу зразки (100 мкл) розташовували у акцепторному відділенні, та вилучений об'єм замінювали свіжим середовищем. Після розщеплення полісахариду хондроїтинaзою ABC (специфічна активність 0,5 од./мл) вибрані зразки піддали ВЕРХ-аналізу на присутність дисахаридних складових з застосуванням описаного вище способу. Застосований спосіб ВЕРХ-аналізу полягав у застосуванні потужної аніонообмінної колонки (SAX), елюенту на основі підкисленої води з pH 4 та лінійного градієнту з 1,2 M NaCl з 0 % до 100 % за 25 хв., після першого ізократичного елюювання протягом 5 хв. виключно у підкисленій воді. Застосована швидкість потоку дорівнювала 1,0 мл/хв та рівень дисахаридів визначали з допомогою УФ-детектора з довжиною хвилі 232 нм. Кількість CS у акцепторном відділенні обчислювали з відкаліброваною по 8 точкам кривою стандартного хондроїтинсульфату, яка відповідала 0,78 % - 100 % від початкової концентрації CS (С). Стандартні зразки хондроїтинсульфату попередньо інкубували з хондроїтиназою ABC, розчиненої у такому ж саме середовищі, яке застосовували для експериментів. На основі знайденого у акцепторному відділенні хондроїтинсульфату, коефіцієнт удаваної проникності (Papp) обчислювали з допомогою формули Papp (cm/sec) = Q/ACt, в якій Q є загальною кількістю 2 прониклого CS (мкг), A є площиною дифузії камери Уссинга (cм ), C є початковою 3 концентрацією CS у донорному відділенні (мкг/cм ) та t є часом інкубування (30-180 хв.). 4 UA 114941 C2 5 10 15 20 25 30 35 Коефіціент приросту R обчислювали, виходячи зі значення Papp, як (Papp CS + протеаза) / (Papp CS без протеази). Papp обчислювали після отримання кожного зразка, а саме на 30, 60, 90, 120, 150 та 180 хв. досліджень. Потім для отримання коефіцієнту середньої проникності кожного зразка у експерименті було обчислено середню величину різних значень P app, отриманих у ці точки часу. Дані щодо проникнення CS наведено у вигляді окремо виміряних середніх значень піків концентрації дисахаридів Δdi-0S, Δdi-6S та Δdi-4S. Статистичну величину цих даних піддали аналізу з допомогою параметричного t-критерію Стьюдента, з p < 0,05 в якості мінімального значення. Чинність цієї експериментальної моделі також підтверджується тим фактом, що три зразки CS різної молекулярної маси, як-то 9, 20 та 40 кДа демонструють наявність проникності до кишкової мембрани, яка є функцією молекулярної маси, як це відбувається в природних умовах. Про це свідчить графік, на якому зображено сукупне перенесення CS у всі інтервали часу, розглянуті протягом 180-хвилинного періоду експерименту (див. Фіг.). Далі для перевірки проникності були застосовані зразки CS нетваринного походження з низькою (9 кДа) або високою (40 кДа) молекулярною масою, та таку перевірку здійснювали у присутності або у відсутність протеаз та, у випадку бромелайну, з або без додавання підсилюючої сполуки. Дані досліджень проникнення зразків CS протягом часу було отримано у відсутність інших ад'ювантів або у присутності бромелайну, бромелайну та метіоніну або натокінази. Хоча відомо про здатність бромелайну сприяти параклітинному проникненню багатьох макромолекул, вона є також пов'язаною зі здатністю цієї речовини до послаблення щільних контактів (Grabovac et al., Int. J. Pharm. 326, 153-159, 2006). Застосування у цих дослідженнях самого тільки бромелайну без втручання інших факторів не призвело до підвищення поглинання низькомолекулярного CS, що може бути видно з наведеного у Таблиці 1 порівняння отриманих середніх значень Papp. Однак для комбінації низькомолекулярного CS, бромелайну та метіоніну було виявлено помітне підвищення такого поглинання. Неочікуване підвищення проникності кишкової слизової оболонки також спостерігали у випадку застосування комбінації низькомолекулярного CS та натокінази (Таблиця 1). Співвідношення приростів R мали значення, які перевищували 1 для комбінації CS/бромелайну/метіоніну та значно перевищували 1 для комбінації CS/натокінази, тоді як у випадку комбінації CS/бромелайну показник R був меншим, ніж 1 (Таблиця 2). Отже, метіонін демонструє неочікувано сприятливу дію на підсилення бромелайном кишкової проникності CS, та було виявлено (що було ще більш неочікувано), що натокіназа без втручання інших факторів є здатною до збільшення кишкової проникності низькомолекулярного CS приблизно в два рази. Цікаво відзначити, що з допомогою описаних тут комбінацій може бути додатково підвищена біодоступність низькомолекулярного CS, який завжди є більш біодоступним, ніж відповідний великий полісахарид. Таблиця 1 -1 Низькомолекулярний хондроїтинсульфат Низькомолекулярний хондроїтинсульфат + бромелайн + метіонін Низькомолекулярний хондроїтинсульфат + бромелайн Низькомолекулярний хондроїтинсульфат + натокіназа 40 -7 Papp (см сек ) x 10 2,13±0,61 2,65±1,36 1,41±0,76 3,56±0,04 Середні значення Papp, визначені для проникнення низькомолекулярного (LMW) хондроїтинсульфату, застосованого без домішок або у поєднанні з бромелайном; бромелайном та метіоніном або з натокіназою. Таблиця 2 Співвідношення приросту (R) Низькомолекулярний хондроїтинсульфат + бромелайн + метіонін/низькомолекулярний хондроїтинсульфат Низькомолекулярний хондроїтинсульфат + бромелайн/низькомолекулярний хондроїтинсульфат Низькомолекулярний хондроїтинсульфат + натокіназа/низькомолекулярний хондроїтинсульфат 5 1,25±0,18 0,66±0,35 1,67±0,20 UA 114941 C2 5 Співвідношення приростів комбінацій порівняно до окремо застосованого низькомолекулярного (LMW) хондроїтинсульфату. Прийнятний для порівняння ефект спостерігали відносно поглинання високомолекулярного хондроїтинсульфату (40 кДа), а також хондроїтинсульфату нетваринного походження (Таблиці 3 та 4). У цьому разі підсилююча дія застосованої комбінації була ще більш очевидною та перевищувала поглинання окремо застосованого CS майже в три рази, що вказує на наявність такої підсилюючої дії у випадку застосування полісахаридів з великими розмірами, для яких поглинання є більш критичним. 10 Таблиця 3 -1 Високомолекулярний хондроїтинсульфат Високомолекулярний хондроїтинсульфат + бромелайн + метіонін Високомолекулярний хондроїтинсульфат + натокіназа -7 Papp (см сек ) x 10 0,53±0,25 1,27±0,80 1,57±1,10 Середні значення Papp, визначені для проникнення високомолекулярного (НMW) хондроїтинсульфату, застосованого без домішок або у поєднанні з бромелайном; бромелайном та метіоніном або з натокіназою. 15 Таблиця 4 Співвідношення приросту (R) Високомолекулярний хондроїтинсульфат + бромелайн + метіонін / високомолекулярний хондроїтинсульфат Високомолекулярний хондроїтинсульфат + натокіназа/ високомолекулярний хондроїтинсульфат 20 2,42±0,36 2,86±1,64 Співвідношення приростів комбінацій порівняно до окремо застосованого високомолекулярного (НMW) хондроїтинсульфату. Дослідження проникності зразка CS тваринного походження (молекулярна маса - 15-20 кДа) у відсутності або у присутності "коктейлю" бромелайну та метіоніну підтверджують здатність комбінації підвищувати проникність CS, отриманого з будь-якого джерела (Таблиця 5). Таблиця 5 -1 Еталонний хондроїтинсульфат Еталонний хондроїтинсульфат + бромелайн + метіонін 25 30 35 40 -7 Papp (см сек ) x 10 1,34±1,24 1,45±0.45 Середні значення Papp визначено для проникнення бичачого хондроїтинсульфату, застосованого без домішок або у поєднанні з бромелайном + метіонін. Нижче наведені приклади композицій за винаходом. Приклад 1, Композицію отримали шляхом змішування: 1200 мг бичачого хондроїтинсульфату, 600 мг бромелайну, 30 мг L-метіоніну. Приклад 2. Композицію отримали шляхом змішування: 1200 мг бичачого хондроїтинсульфату, 600 мг натокінази. Приклад 3. Композицію отримали шляхом змішування: 1200 мг біотехнологічного хондроїтинсульфату з молекулярною масою 9 кДа, 600 мг бромелайну, 30 мг L-метіоніну. Приклад 4. 6 UA 114941 C2 5 10 15 20 25 Композицію отримали шляхом змішування: 1200 мг біотехнологічного хондроїтинсульфату з молекулярною масою 9 кДа, 600 мг натокінази. Приклад 5. Композицію отримали шляхом змішування: 1200 мг біотехнологічного хондроїтинсульфату з молекулярною масою 40 кДа, 600 мг бромелайну, 30 мг L-метіоніну. Приклад 6. Композицію отримали шляхом змішування: 1200 мг біотехнологічного хондроїтинсульфату з молекулярною масою 40 кДа, 600 мг натокінази. Приклад 7. Композицію отримали шляхом змішування: 1200 мг біотехнологічного хондроїтинсульфату з молекулярною масою 9 кДа, 600 мг натокінази, 30 мг L-метіоніну. Приклад 8. Композицію отримали шляхом змішування: 1200 мг біотехнологічного хондроїтинсульфату з молекулярною масою 40 кДа, 600 мг натокінази, 30 мг L-метіоніну. Приклад 9. Композицію отримали шляхом змішування: 1200 мг бичачого хондроїтинсульфату, 600 мг натокінази, 30 мг L-метіоніну. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 40 45 50 55 60 1. Композиція, що містить хондроїтинсульфат, натокіназу та, як варіант, сульфгідролізовану сполуку, причому співвідношення хондроїтинсульфату/протеази/сульфгідролізованої сполуки дорівнює 1,0/0,05-0,8/0,001-0,05 за вагою. 2. Композиція за п. 1 за відсутності сульфгідролізованої сполуки. 3. Композиція за п. 1 за присутності сульфгідролізованої сполуки. 4. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, в якій хондроїтинсульфат має молекулярну масу 1-95 кДа. 5. Композиція за будь-яким з пп. 1-4, в якій хондроїтинсульфат отримують екстракцією з тваринного джерела. 6. Композиція за будь-яким з пп. 1 та 4, в якій хондроїтинсульфат отримують хімічним сульфатуванням капсульного полісахариду К4 Е. соlі усунення гідролізом залишків фруктози. 7. Композиція за будь-яким з пп. 1 та 4, в якій хондроїтинсульфат отримують хімічним сульфатуванням та наступною кислотною або радикальною деполімеризацією капсульного полісахариду К4 Е. соlі після гідролітичного усунення залишків фруктози. 8. Композиція за будь-яким з пп. 1 та 4, в якій хондроїтинсульфат отримують хімічним сульфатуванням капсульного полісахариду генетично модифікованого штаму E. соlі, в якому цей полісахарид у початковому стані є вільним від залишків фруктози. 9. Композиція за будь-яким з пп. 1 та 4, в якій хондроїтинсульфат отримують хімічним сульфатуванням та наступною кислотною або радикальною деполімеризацією капсульного полісахариду генетично модифікованого штаму Е. соlі, в якому цей полісахарид у початковому стані є вільним від залишків фруктози. 10. Композиція за будь-яким з пп. 1-9, в якій сульфгідролізовану сполуку вибрано з метіоніну, цистеїну, гомоцистеїну, S-аденозилметіоніну, ацетилцистеїну, відновленого або окисленого глутатіону та S-ацетилглутатіону. 11. Композиція за будь-яким з пп. 1-10, яка додатково містить один або більше активних елементів, які застосовують у запобіганні або лікуванні гострого або хронічного запалення та/або одну або більше поживних речовин, яку застосовують для підтримання доброго стану опорно-рухової системи людини та тварин. 12. Композиція за п. 11, в якій один або більше активних елементів вибрано з групи, яка складається з гідрохлориду глюкозаміну, сульфату глюкозаміну, N-ацетилглюкозаміну, гіалуронової кислоти, амінокислот, колагену, гідролізованого колагену, поліненасичених жирних 7 UA 114941 C2 5 10 кислот, кератину, метилсульфонілметану, фолату, відновленого фолату, вітамінів, вітамінів групи В, S-аденозилметіоніну (SAM), аскорбінової кислоти та аскорбату марганцю. 13. Композиція за будь-яким з пп. 1-12, яка додатково містить одну або більше фармацевтично та поживно прийнятних домішок, вибраних з групи, яка охоплює мікрокристалічну целюлозу, стеаринову кислоту, стеарат магнію, колоїдний діоксид кремнію, етилцелюлозу, метилцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, водні солі шелаку, альгінат натрію, крохмаль, модифіковані крохмалі, співполімери метакрилової кислоти, мальтодекстрини та поліоли. 14. Композиція за будь-яким з пп. 1-13 для застосування у профілактиці або лікуванні гострих та хронічних запалень. 15. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів у вигляді твердих препаратів для перорального застосування, у вигляді капсул, м'яких желейних капсул, таблеток, гранул, рідких напоїв або відновлених порошкових напоїв. Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Compositions containing chondroitin sulphate, proteolytic enzymes and sulphydryl compounds for improving the bioavailability of chondroitin sulphate

Автори англійською

Miraglia, Niccolo, Rossini, Mauro, Bianchi, Davide, Trentin, Antonella

Автори російською

Миралья Никколо, Россини Мауро, Бьянки Давидэ, Трэнтин Антонэлла

МПК / Мітки

МПК: A61K 31/198, A61K 31/737, A61K 38/06, A61K 38/48, C12N 9/50, A61K 36/48

Мітки: підвищення, містять, сполуки, сульфгідрильні, біодоступності, хондроїтинсульфату, хондроїтинсульфат, протеолітичні, ферменти, композиції

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/10-114941-kompozici-yaki-mistyat-khondrotinsulfat-proteolitichni-fermenti-ta-sulfgidrilni-spoluki-dlya-pidvishhennya-biodostupnosti-khondrotinsulfatu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Композиції, які містять хондроїтинсульфат, протеолітичні ферменти та сульфгідрильні сполуки для підвищення біодоступності хондроїтинсульфату</a>

Подібні патенти