Композиція, що містить піддані тепловій обробці бактерини

Реферат: Винахід належить до композиції, що містить бактерини, піддані тепловій обробці, та способу одержання композиції, що містить піддані тепловій обробці бактерини. UA 98115 C2 (12) UA 98115 C2 UA 98115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується вакцин та способів стабілізування емульсійних вакцин. Зокрема, даний винахід стосується бактеринів, підданих тепловій обробці, способу виготовлення баткеринів, підданих тепловій обробці, та емульсійних вакцин, виготовлених з таких підданих тепловій обробці бактеринів. Для боротьби з інфекційними хворобами тварин використовують вакцинацію. Добавки часто включають у вакцини, тому що вони збільшують гуморальну та/або клітинну імунну відповідь на антиген. Вакцини зазвичай застосують як емульсії, тому що емульсія може взаємодіяти як добавка та має властивість утримувати антиген у місці введення. Емульсійні вакцині зазвичай містять емульгатори. Окрім застосування емульгаторів стабільність емульсійної вакцини також підтримують завдяки зменшенню розміру крапель емульсії механічним шляхом. Патент U.S. No. 5,084,269 стосується допоміжних композицій, які містять лецитин у комбінації з мінеральною олією, які менше викликають подразнення всередині тварини хазяїна та одночасно збільшують імунну відповідь. Композиції описані у патенті US 5,084,269, продаються під торговою маркою AMPHIGEN®, від Pfizer, Inc. Зазвичай бактеріальні антигени є нестабільними до нагрівання, та навіть короткотривале нагрівання призводить до зниження активності антигенів. Наприклад, вакцина проти сибірки втрачає свою активність протягом 48 годин при температурі 37° С (S. Sing, N. Ahuja, V. Chauhan, Ε. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat, and R. Bhatnagar; Bioche. Biophys. Res. Commun. 2002 Sep. 6; 295(5): 1058-62). Даний винахід стосується підданих тепловій обробці бактеринів, способу виготовлення підданих тепловій обробці бактеринів та емульсійних вакцин, виготовлених з підданих тепловій обробці бактеринів. Спосіб включає нагрівання бактерину до температури від приблизно 35 до приблизно 80°С з метою отримання бактерину, підданого тепловій обробці. Прийнятна антигенна активність - термін "прийнятна антигенна активність" означає здатність викликати захисну імунну відповідь у вакцинованих тварин при введенні вакцини або при здійсненні тесту для оцінки ефективності вакцини гомологічними живими організмами. Бактерии - термін "бактерии" означає суспензію вбитих бактерій, яку можна використовувати як компонент вакцини. Емульгатор - термін «емульгатор» означає речовину, яка робить емульсію більш стабільною. Емульсія - термін «емульсія» означає композицію, яка складається з двох рідин, що не змішуються, де маленькі краплі однієї рідини суспендовані у безперервній фазі іншої рідини. Підданий тепловій обробці бактерии - термін «підданий тепловій обробці бактерии» означає бактерии, підданий тепловій обробці, активність ліпази якого становить 50% або менше, ніж активність ліпази до теплової обробки, та має прийнятну антигенну активність. Зворотна емульсія - термін «зворотна емульсія» означає емульсію вода в олії. Ліпаза - термін «ліпаза» означає ферменти, естерази, ліпази та фосфоліпази, які руйнують емульгатор емульсійної вакцини. Нормальна емульсія - термін «нормальна емульсія» означає емульсію олія у воді. Емульсія олія у воді - термін «олія у воді» означає емульсію, де маленькі краплі олії суспендовані у безперервній водній фазі. Кімнатна температура - термін «кімнатна температура» означає температуру від 18 до 25 °С. Емульсія вода в олії - термін «емульсія вода в олії» означає емульсію, де краплі води суспендовані у безперервній фазі олії. Даний ви нахід стосується бактеринів зі зниженою ліпазою активністю, вакцин, виготовлених з таких бактеринів та способу зниження активності ліпази бактеринів. Окрім антигенних компонентів деякі бактерини проявляють ліпазну активність. При введенні бактеринів, які проявляють ліпазну активність, до емульсії, ліпаза може зруйнувати емульгатори, використані для створення емульсії. Емульсійні вакцини, що містять бактерини з високою ліпазою активністю, є нестабільними та ті, які містять бактерини з низькою ліпазою активністю, є стабільними. Приклади бактерій при умові, що вони вбиті, з яких отримують бактерини з ліпазою активністю, включають такі види: Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides 1 UA 98115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 LC, Clostridium perfringens, Photorhabdus luminescens, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKWI, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp Bl 1-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium та Leptospira, також відомі патогени Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae та Leptospira pomona. Ліпаза, яка руйнує емульгатори, використані для створення емульсії та, яка призводить до нестабільності емульсії та її руйнування, може включати один або кілька ферментів, які руйнують емульсії, таких як естерази, ліпази та фосфоліпази. Загалом ці ферменти, естерази, ліпази та фосфоліпази називають ліпазою. Активність ліпази бактерину вимірюють шляхом використання синтетичного субстрату, який називають О-півалоїлоксиметилумбеліферон (ОПОМ). Швидкість гідролізу викликаного ліпазою є виміром активності ліпази. Швидкість гідролізу викликаного ліпазою контролюють шляхом збільшення інтенсивності флуоресценції продукту активності ліпази. Швидкість реакції залежить від конкретних умов проведення гідролізу, так що порівняння рівнів активності ліпази, виміряних швидкістю гідролізу, здійснюють використовуючи данні, отримані з тестів, проведених при однакових умовах. Способи описані у декількох статтях, зокрема, Kurioka S., and Matsuda M. (1976) Ana. Biochem. 75: 281-289, De Suva NS, and Quinn PA. ( 1987) J. Clin. Microbiol. 25 : 729-731 , and Grau, Α., and Ortiz, A. (1998) Chem. Phys. of Lipids. 91: 109-118. Руйнування емульсійної вакцини викликає розділення фаз компонентів. Таке розділення є небажаним, тому що індивідуальні дози взяті з резервуару можуть не містити той самий рівень компонентів вакцини. Окрім цього руйнування емульсії призводить до втрати ад'ювантної активності емульгатору та призводить до зменшення антигенної активності вакцини. Атенуйовані живі віруси часто включають у вакцини поряд з бактеринами. Такі вакцини є придатними, тому що одна вакцина може викликати імунну відповідь на декілька хвороб. Наявність ліпазної активності бактрину призводить до вивільнення емульгатору з емульсії. Цей вільний емульгатор може перервати та інактивувати живі віруси вакцини, що призведе до втрати вірусної інфективності. Бактерин, придатний для застосування у вакцинах, отримують шляхом вирощування потрібного виду бактерій, після чого бактерії вбивають з метою отримання бактерину, який містить різні бактеріальні компоненти, зокрема компоненти клітинної стінки. Бактерії інактивують різними способами, зокрема їх обробляють сполукою, такою як мертіолат, формалін, формальдегід, діетиламін, бінарний етиленімін (БЕІ), бета-пропіолактон (БПЛ) та глутаральдегід. Також застосовують комбінацію цих сполук. Окрім цього бактерії вбивають стерилізуючою радіацією. Зараз з'ясували, що активність ліпази бактерину можна зменшити шляхом теплової обробки. Зокрема, активність ліпази бактерину зменшують шляхом нагрівання бактерину до температури від приблизно 35 до приблизно 80 °С з метою отримання бактерину, підданого тепловій обробці з прийнятною антигенною активністю. Теплову обробку здійснюють протягом часу достатнього для того, щоб активність ліпази підданого тепловій обробці бактерину становила 50% або менше від активності, яку мав бактерии до теплової обробки. Для гарної стабільності емульсійної вакцини не є необхідним знижувати активність ліпази до нуля. Ми з'ясували, що вакцини, які гарно зберігаються, виготовляють з підданих тепловій обробці бактеринів, активність ліпази яких становить 50% або менше, ніж активність ліпази до теплової обробки. При використанні швидкості гідролізу тестового субстрату як виміру активності ліпази бактерину, швидкість гідролізу тестового субстрату перед тепловою обробкою порівнювали зі швидкістю гідролізу після теплової обробки. Теплову обробку здійснюють з метою зменшення швидкості гідролізу до 50% або менше у порівнянні з швидкістю гідролізу необробленого бактерину. Неважливо який спосіб використовують для вимірювання активності ліпази, за умови, що для вимірювання активності до теплової обробки та після неї використовують однаковий спосіб. Наприклад, якщо швидкість гідролізу тестової сполуки вимірюють використовуючи один субстрат, інший субстрат буде викликати іншу швидкість. Однак, якщо використовують один 2 UA 98115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 субстрат для визначення початкової активності та для визначення активності після обробки, то при порівнянні швидкостей буде видно вплив теплової обробки. Для бактеринів, які містять одну або кілька наступних бактерій Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira pomona, здійснюють тест на антигенну активність (9CFR §113.101, §113.102, §113.103, §113.104 та §113.105). Для цих штамів прийнятною антигенною активністю є здатність викликати захисну імунну відповідь у вакцинованих хом'яків, таким чином, що коли хом'яків вакцинують гомологічними живими бактеріями, щонайменше 75% вакцинованих хом'яків виживають в умовах, коли щонайменше 80% невакцинованих хом'яків помирають. У випадку, коли антигеном виступає штам Leptospira hardjo, прийнятну антигенну активність розглядають як здатність вакцини утворювати середнє геометричний титр серологічної аглютинації проти Leptospira hardjo 40 у телят, яким вводили вакцину, яка містила як антиген штам Leptospira hardjo. Для інших бактеринів прийнятною антигенною активністю є здатність викликати захисну імунну відповідь у вакцинованих тварин після вакцинування або проходження тесту для оцінки ефективності вакцини гомологічними живими організмами. Теплову обробку здійснюють у великому діапазоні температур та за різний проміжок часу. Зазвичай нагрівання здійснюють при температурі від приблизно 30 до приблизно 80 °С протягом від приблизно 20 хвилин до приблизно 24 годин. Коли бактерини нагрівають до високих температур, таких як від приблизно 75 до приблизно 80 °С, то час нагрівання скорочують до мінімального діапазону. Коли нагрівання здійснюють при низьких температурах, то час нагрівання збільшують. Іншою комбінацією температури та часу нагрівання є температура від приблизно 60 до приблизно 70 °С протягом від приблизно 9 до приблизно 10 годин. Іншою комбінацією температури та часу нагрівання є температура від приблизно 65 до приблизно 70 °С протягом від приблизно 5 до приблизно 8 годин. Іншою комбінацією температури та часу нагрівання є температура від приблизно 65 до приблизно 70 °С протягом приблизно 1 години. Іншою комбінацією температури та часу нагрівання є температура від приблизно 55 до приблизно 65 °С протягом від приблизно 5 до приблизно 8 годин. Після теплової обробки бактерини мають нижчу ліпазну активність, ніж необроблені бактерини, проте їх використовують таким же чином як і необроблені бактерини. Відповідно піддані тепловій обробці бактерини можуть бути включеними у вакцини звичайними способами виготовлення вакцин. Ці способи є добре відомими у галузі. Емульсійні вакцини отримують шляхом змішування бактерину з фазою олії та емульгатором або емульгаторами. Потім цю комбінацію піддають інтенсивному струшуванню з метою отримання емульсії. Придатні способи струшування включають гомогенізацію та наступне мікророзрідження. Перед емульгуванням до комбінації також можна додавати консерванти та наповнювачі. Вакцини можуть містити як бактерини, так і вірусні антигени разом. Під час виготовлення вакцини, яка містить бактерини та вірусні антигени, у неї включають бактерини та будь-які вірусні антигени, емульгатор або емульгатори та необов'язково консерванти та наповнювачі для змішування з фазою олії та емульгування. Після формування емульсії рН композиції можна встановити на бажаному рівні, використовуючи або розчин NaOH, або розчин НСІ. Для застосування вакцини бажано, щоб рН була близькою до природньої, з метою уникнення подразнення у місці введення. Зазвичай значення рН дорівнює від приблизно 7,0 до приблизно 7,3. Для отримання емульсійної вакцини придатними олійними фазами є олії, що не метаболізуються та що метаболізуються. Олії, що не метаболізуються, включають мінеральні олії, такі як біле парфюмерне масло та світла мінеральна олія. Олії, що метаболізуються, включають рослинні олії, рибні олії та гліцериди синтетичних жирних кислот. Прикладами емульгаторів, які використовують для одержання емульсійних вакцин цього винаходу, є фосфоліпіди, естери сорбітану, поліетоксильовані естери сорбітану та похідні манітолу, які є загальноприйнятими емульгаторами вакцин. Фосфоліпідні емульгатори включають лецитин, фосфатидилетаноламін, фосфатидилінозитол, фосфатидилсерин та лецитин, (наприклад, такий як AMPHIGEN®). Емульгатори естерів сорбітану включають сорбітанмонолаурат (наприклад, Span® 20 та Arlacel® 20), сорбітанмоноолеат (наприклад, Span® 80 та Arlacel® 80), сорбітанмонопальмітат (наприклад, Span® 40 та Arlacel® 40) та сорбітанмономтеарат (наприклад, Span® 60 та Arlacel® 60). Поліетоксильовані естери сорбітану включають поліетоксисорбітанмонолаурат (наприклад, Tween® 20 та Tween® 21), поліетоксисорбітанмоноолеат (наприклад, Tween® 80), поліетосисорбітанмонопальмітат (наприклад, Tween® 40) та поліетоксисорбітанмоностеарат (наприклад, Tween® 60). Емульгатори похідних манітолу включають октадеканові етери манітолу. Span®, Arlacel® та Tween® є торговими марками ІСІ Americas. AMPHIGEN® є торговою маркою Pfizer, Inc. 3 UA 98115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зазвичай вакцини отримують як нормальні емульсії олія в воді, хоча можливо приготувати зворотні емульсії. У вакцинах застосовують різноманітні наповнювачі, такі як Quil А, холестерин, фосфат алюмінію та гідроксид алюмінію, та консерванти, такі як мертіолат. Quil А є очищеною сумішшю сапонинів quillaja, екстрагованої з кори Південно Американського дерева Quillaja Saponaria Molina. Quil А впливає безпосередньо на імунну систему з метою активування її чутливості. Такий вплив викликає, як гуморальну, так і клітинно-опосередковану відповідь. Ліпофільний ланцюг дозволяє взаємодію антигену та ад'юванту, які потрапляють у цитозоль, для обробки ендогенним шляхом. Quil А зазвичай застосовують з холестерином, тому що холестерин знешкоджує небажані побічні ефекти при додаванні у відповідних пропорціях. Холестерин утворює нерозчинні комплекси з Quil А, які утворюють спіральні структури, тому що холестерин приєднується до Quil А, таким чином виводять на поверхню залишки цукрів, які стимулюють імунну відповідь. До вакцин, які містять бактерини, зазвичай додають вірусні антигени. Перевагою такого додавання є те, що одна вакцина може сформувати імунітет до кількох хвороб, замість введення декількох різних вакцин для отримання того самого результату. У вакцинах використовують як вбиті віруси, так і ослаблені живі віруси. Використовують наступні віруси птичий вірус інфекційного ларигнотрахеіту, вірус герпесу великої рогатої худоби, вірус герпесу собак, вірус герпесу коней, вірус вірусного ринотрахеіту, вірус хвороби Марека, вірус герпесу вівців, вірус герпесу свиней, вірус псевдосказу, параміксовірус птиці, респіраторносенцитіальний вірус великої рогатої худоби, вірус чуми м'ясоїдних, вірус парагрипу собак, вірус парагрипу-3 великої рогатої худоби, вірус пара грипу-3 вівець, вірус чуми великої рогатої худоби, вірус граничної хвороби вівців, вірус діареї великої рогатої худоби (ВДВРХ), вірус класичної чуми свиней, птичий вірус лейкозу, вірус імунодефіциту великої рогатої худоби, вірус лейкемії великої рогатої худоби, вірус інфекційної анемії коней, вірус імунодефіциту котів, вірус лейкемії котів, вірус пневмонії вівців, вірус легеневої аденокарциноми вівців, коронавірус собак, коронавірус великої рогатої худоби, коронавірус кошачого ентериту, вірус кошачого інфекційного перитоніту, вірус свинячої епідемічної діареї, вірус свинячого гемаглютинуючого енцефаломієліту, парвовірус свиней, вірус трансмісивного гастроентериту, коронавирус індички, вірус ефемерної лихоманки великої рогатої худоби, сказ, вірус пузирчастого стоматиту, вірус птичого грипу, вірус конячого грипу, вірус свинячого грипу, вірус собачого грипу, вірус східного енцефаліту коней, вірус венесуельського енцефаліту коней та вірус західного енцефаліту коней. Якщо бактерии проявляє активність ліпази, це може призвести до вивільнення емульгатору з емульсії. Цей вільний емульгатор може зруйнувати оболонку живого вірусу та інактивувати живі віруси вакцини, що призведе до втрати вірусної інфективності. Відповідно теплова обробка бактерину потрібна для стабілізації емульсії та збереження стимулюючої дії ад'юванту, також як і інфективності вірусів. Наступні приклади наведені з метою подальшої ілюстрації та не обмежують об'єм заявленого винаходу. Стадії способу Стадія 1 Визначення мутності Мутність вимірювали у нефелометричних одиницях (НО) способом розсіювання світла. Інтенсивність розсіювання світла зразком при визначених умовах порівнюють з інтенсивністю розсіювання світла контрольною суспензією. Чим більше значення розсіювання світла, тим більше мутність зразка. Джерело світла спрямовано на зразок та розсіювання світла вимірюють при 90° до напряму джерела світла. Пристрій калібрують шляхом вимірювання розсіювання світла суспензією формазину. Калібрування нефелометру Ультра-фільтровану воду одержують шляхом фільтрування дистильованої води крізь мембранний фільтр з розміром пор 0, 2 мкм. Перший розчин одержують шляхом розчинення 1,00 г гідрозинсульфату, (NH2)H2SO4, в ультра-фільтрованій воді та розведення ультрафільтрованою водою до 100 мл у мірній колбі. Другий розчин приготували розчиненням 10,00 г гексаметилентетраміну в ультра-фільтрованій воді та розведенням ультра-фільтрованою водою до 100 мл у мірній колбі. Суспензію формазину готували шляхом змішування 5,0 мл першого розчину з 5,0 мл другого розчину. Суміш залишали на 24 години при приблизно 24 °С. Суміш розводили до 100 мл ультра-фільтрованою водою з метою отримання базової мутної суспензії, мутність якої становить 400 НО. Суспензію формазину з помутнінням, яке становить 40 НО, отримують шляхом розведення 10,00 мл базової мутної суспензії до 100 мл ультрафільтрованою водою. Калібрувальні розчини виготовляли шляхом розведення базового розчину. 4 UA 98115 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Вимірювання мутності Зразок, що вимірюють, розводять ультра-фільтрованою водою, щоб зменшити мутність так, щоб вона потрапляла у калібрувальний діапазон нефелометра. Мутність вимірюють та наявну мутність розраховують використовуючи наступне рівняння: Наявна мутність у НО = Μ x (D + O)/O де: Μ є мутністю розведеного зразка, у НО; D дорівнює об'єму води для розведення, у мл; О є наявний об'ємом зразка, у мл; Стадія 2 Аналіз на активність ліпази Активність ліпази визначали використовуючи О-півалоксиметилумбеліферон як флуорогенний субстрат. В результаті ліпаза-каталізованого гідролізу цього не флуоресцентного субстрату отримують гідроксиметилетер, який є нестабільним у водних умовах. В результаті розкладання нестабільного гідроксиметилетеру отримують формальдегід та флуоресцентний продукт умбеліферон. Контролюючи інтенсивність флуоресценції умбеліферону, як функцію часу, отримують чутливе кінетичне вимірювання ферментної активності ліпази. Розчини О-півалоксиметилумбеліферону (Molecular Probes product no. P35901) були виготовлені у чистому DMSO, при готовій концентрації 5 мМ; не використаний розчини зберігали при -20 °С, не допускаючи потрапляння сонячного світла. 5мМ розчину Опівалоксиметилумбеліферону розводили буфером TRIS-HCI (рН 8,0) до 750 мкМ, та отриману суміш підігрівали до 37 °С. Зразок Leptospira або контрольне буфер/середовище відцентрифуговували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі при 6500 об./хв. з метою отримання осаду та супернатанту. Взаємодію здійснювали шляхом комбінування 15 мкл 10 мМ буферу TRIS-HCI (рН 8,0) з 15 мкл супернатанту при кімнатній температурі з зразку Leptospira або контрольного буферу/середовища у 96-лункових планшетах з лунками маленького об'єму (Corning 3393, чорний полістирол з незв'язуючою поверхнею, напівплощинний); попередня інкубація протягом 10 хвилин при 37 °С; потім активація взаємодії шляхом додавання 20 мкл 750 мкМ О-півалоксиметилумбеліферону або контрольного буферу/середовища. Отримана суміш містила 53 мМ буфер TRIS-HCI (рН 8,0) та 0 або 300 мкМ О-півалоксиметилумбеліферон. Інтенсивність флуоресценції вимірювали з інтервалом 30-45 секунд протягом 1 години (Spectramax Gemini XS, 37°С, λex = 360 нм, λem=460 нм, установка чутливості фотоелектронного помножувача «середня», 6 зчитувань на лунку). Швидкість реакції визначали за згином отриманої прогресуючої кривої. Приклади Приклад 1 Зниження активності ліпази за допомогою теплової обробки Пул leptospira, вбитих мертиолатом, який містить наступні штами: Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo та Leptospira pomona, обробляли з метою отримання бактерину. Шість зразків бактерину зберігали протягом ночі (приблизно 12 годин) при 4 °С, 37 °С, 45 °С, 56 °С, 65 °С та 80 °С. Зразок, який зберігали при 4 °С, брали як необроблений контроль. Зразки, які зберігали протягом 12 годин при 37 °С, 45 °С, 56 °С, 65 °С та 80 °С , брали як зразки, що пройшли теплову обробку. Після зберігання вимірювали швидкість гідролізу тестового субстрату в присутності кожного бактерину згідно з способом 2. Швидкість гідролізу для зразка поділена на швидкість зразка, який зберігали при 4 °С, помножене на 100, дорівнює процентному значенню вихідної активності ліпази кожного бактерину, яка залишилась після зберігання. Наступна таблиця показує температуру зберігання та процент наявної активності ліпази, що залишилась після зберігання. Приклад 2 Одержання експериментальних композицій вакцини Вирощували культури Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo та Leptospira pomona. Мутність кожної культури вимірювали у нефелометричних одиницях (НО). Бактерії вбили мертіолатом з метою отримання бактеринів. Кожен бактерии піддавали тепловій обробці при 65 °С протягом 8 годин з метою зменшення активності ліпази. Бактерини комбінували та змішували з AMPHIGEN®, допоміжними речовинами, консервантами та буфером, розведеними так, щоб кожні 5 мл дози вакцини, містили компоненти перелічені на таблиці нижче. Концентрації антигенів 5 UA 98115 C2 5 10 Композицію гомогенізували використовуючи гомогенізатор Silverson та суспендували, використовуючи мікророзріджувач від Microfluidics. Після гомогенізації та суспендування рН композиції встановлювали на рівні від 7,0 до 7,3. Приклад 3 Тестування для оцінки ефективності вакцини на хом'яках та коровах Вакцину Прикладу 2 вводили хом'якам та коровам для оцінки ефективності вакцини використовуючи стандартні лабораторні моделі та тварин-хазяїв. Тестових хом'яків після цього вакцинували дозою Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa або Leptospira pomona для оцінки ефективності вакцин. Кількість тварин, що вижили, була показником ефективності вакцини. Титри мікроагглютинації биків вимірювали проти Leptospira hardjo, щоб продемонструвати ефективність тієї фракції вакцини на коровах. Нижче наведена таблиця показує, що вакцини, вироблені з підданих тепловій обробці бактеринів Leptospira, здатні до викликання антигенної відповіді, яка відповідає критерію ефективності. Термічні умови для Leptospira 65 °С (8 годин] необроблені Canicola 10/10 10/10 Хом'яки, що вижили lctero Grippo 10/10 10/10 10/10 10/10 Pomona 10/10 10/10 Серологія на биках Hardjo позитивний позитивний 15 20 Приклад 4 Фізикохімічний аналіз вакцин Вакцину готували з підданих тепловій обробці бактеринів Leptospira згідно з способом Прикладу 2. Такі ж вакцини готували з необроблених бактеринів Leptospira згідно з способом Прикладу 2. Обидві композиції вакцин зберігали при 4 °С протягом 60 днів. Аналіз розміру частинок здійснювали для кожної вакцини щойно приготовленої на 0 день та знову на 60 день, використовуючи лазерний дифрактометр. Діаграми наведені нижче показують розподілення частинок за розміром для кожної вакцини на 0 день до та на 60 день після зберігання. 6 UA 98115 C2 5 Розмір частинок вакцин, виготовлених з підданих тепловій обробці бактеринів Leptospira, залишався незмінним, що вказує на стабільність емульсії. Розмір частинок вакцин, виготовлених з бактеринів Leptospira не підданих тепловій обробці, збільшився, що вказує на руйнування емульсії. Приклад 5 Віруліцидний аналіз 7 UA 98115 C2 5 10 15 Вакцини виготовляли за способом прикладу 2, з бактеринів Leptospira, не підданих тепловій обробці, та бактеринів Leptospira, підданих тепловій обробці. Після 5 або 6 місяців вирощування, вакцини тестували на віруліцидну активність проти вірусу ВБГ-І, ПГ-3 та РСВВРХ. Аналіз на віруліцидну активність здійснювали шляхом регідратації віруліцидних моновалентних контрольних проб (ВАК) допоміжним розчинником. Дві моновалентні віруліцидні контрольні проби регідратовували відносно кожного об'єму. Дві моновалентні віруліцидні ВАК об'єднали та інкубували протягом 20-25 °С протягом 2 годин до титрування та інокуляції на клітини з метою вимірювання TCID5Q (доза, яка на 50% інфікує культуру тканин), титр живого вірусу. Зменшення титру вірусу більш ніж 0,7 ТСSD50/мл є небажаним. Результати віруліцидного аналізу, які показують зменшення титру вірусу, наведені на таблиці нижче: Вакцина, виготовлена з бактеринів Leptospira не підданих тепловій обробці, показує високі рівні віруліцидної активності. Вакцина, виготовлена з бактеринів Leptospira підданих тепловій обробці, не показала віруліцидної активності. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 30 35 40 45 50 1. Композиція, що містить а) емульсію, що містить олію та один або кілька емульгаторів; та b) бактерин Leptospira, підданий тепловій обробці, який містить суспензію вбитих бактерій Leptospira, де вказаний бактерин має активність ліпази 50 % або менше, ніж активність ліпази бактерину перед обробкою, та має прийнятну антигенну активність, та де вказана композиція має підвищену стабільність у порівнянні з композицією, що містить не підданий тепловій обробці бактерин. 2. Композиція за п. 1, де теплова обробка включає нагрівання бактерину, який проявляє ліпазну активність, до температури від приблизно 45 °C до приблизно 80 °C протягом часу від приблизно 6 годин до приблизно 24 годин. 3. Композиція за п. 1, де теплова обробка включає нагрівання бактерину, який проявляє ліпазну активність, до температури від приблизно 63 °C до приблизно 67 °C протягом часу від приблизно 6 до приблизно 24 годин. 4. Композиція за п.1, де теплова обробка включає нагрівання бактерину, який проявляє ліпазну активність, до температури від приблизно 45 °C до приблизно 80 °C протягом приблизно 12 годин. 5. Композиція за п. 1, де теплова обробка включає нагрівання бактерину, який проявляє ліпазну активність, до температури приблизно 65 °C протягом приблизно 8 годин. 6. Композиція за п. 1, де теплова обробка включає: нагрівання бактерину, який проявляє ліпазну активність, до температури від приблизно 55 °C до приблизно 65 °C протягом часу від приблизно 5 до приблизно 8 годин. 7. Композиція за будь-яким з пп. 1-6, де вбиті бактерії представлені одним з п'яти штамів Leptospira, вибраних з групи, яка складається з Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae та Leptospira pomona. 8. Композиція за п. 7, яка є вакциною. 9. Вакцина за п. 8, яка додатково містить живі віруси. 10. Вакцина за п. 8, яка додатково містить композицію лецитину, Quil A та холестерин. 11. Вакцина за п. 8, яка додатково містить вбиті віруси. 12. Вакцина за п. 9, яка додатково містить вбиті віруси. 13. Вакцина за п. 9, де живі віруси є одними з трьох, вибраних з групи, яка складається з вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби (ІРТ), вірусу парагрипу-3 (ПГ-3) та респіраторносинцитіальний вірус великої рогатої худоби (РСВВРХ). 14. Вакцина за п. 12, де живі віруси є одними з трьох, вибраних з групи, яка складається з вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби (ІРТ), вірусу парагрипу-3 (ПГ-3) та респіраторносинцитіальний вірус великої рогатої худоби (РСВВРХ). 8 UA 98115 C2 5 10 15 20 25 30 35 15. Вакцина за п. 14, де вбиті віруси представлені одним або двома вірусами, вибраними з групи, яка складається з бичачого вірусу діареї (БВД) Типу 1 та бичачого вірусу діареї (БВД) Типу 2. 16. Вакцина за п. 15, яка додатково містить масляну композицію лецитину, Quil A та холестерин. 17. Спосіб одержання композиції за п. 1, де вказаний спосіб включає наступні стадії: а) одержання емульсії, що містить олію та один або кілька емульгаторів; b) одержання бактерину Leptospira, підданий тепловій обробці, де вказана теплова обробка включає нагрівання бактерину Leptospira, що має ліпазну активність, до температури від приблизно 45 °C до приблизно 80 °C протягом часу від приблизно 6 годин до приблизно 24 годин; та с) змішування емульсії стадії (а) з бактерином, підданим тепловій обробці стадії (b). 18. Спосіб за п. 17, де бактерин, підданий тепловій обробці, одержують за способом, що включає наступні стадії: а) вимірювання активності ліпази бактерину; b) нагрівання бактерину до температури від приблизно 45 до приблизно 80 °C протягом від приблизно 6 годин до приблизно 24 годин; с) вимірювання активності ліпази бактерину після теплової обробки; d) порівняння активності ліпази бактерину до нагрівання та після нагрівання; та е) вибирання бактерину, підданого тепловій обробці, де активність ліпази після теплової обробки становить 50 % або менше активності ліпази бактерину до теплової обробки. 19. Спосіб за п. 17, де бактерин містить суспензію одного з п'яти штамів вбитих Leptospira, вибраних з групи, яка складається з Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae та Leptospira pomona. 20. Спосіб за п. 18, де бактерин містить суспензію одного з п'яти штамів вбитих Leptospira, вибраних з групи, яка складається з Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae та Leptospira pomona. 21. Композиція за п. 1, де підданий тепловій обробці бактерин, одержують за способом, що включає наступні стадії: а) одержання бактерину, який проявляє ліпазну активність; б) нагрівання бактерину до температури від приблизно 45 до приблизно 80 °C протягом часу, достатнього для зменшення активності ліпази до 50 % або менше від активності ліпази бактерину до теплової обробки. 22. Композиція за п. 21, де проміжок часу, достатній для зменшення активності ліпази до 50 % або менше від рівня активності до теплової обробки, становить від приблизно 6 годин до приблизно 24 годин. 23. Композиція за п. 1, де композиція не є віруліцидною. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9