Спосіб підготовки меляси для культивування мікроорганізмів у виробництві амінокислот

УКРАЇНА (19) А U А о,, 10430 (5і)5 С 12 Р 3/00 ОПИС ДО ПАТЕНТУ ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО НА ВИНАХІД без проведення експертизи по суті на підставі Постанови Верховно? Ради України Г* 3769-ХІІ від 23.ХІІ. 1993 р. Публікується в редакції заявника (54) СПОСІБ ПІДГОТОВКИ МЕЛЯСИ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ У ВИРОБНИЦТВІ АМІНОКИСЛОТ 1 (21)95062989 (22) 26.06.95 (24)25.12.96 (46)25.12.96. Бюл. № 4 бавление мелассы до требуемой концентрации водой, добавление в полученный раствор химического реагента, нагревание, перемешивание, выдерживание, отделение осадка, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве химического реагента используют аммофос при его массовом соотношении с ионами кальция в исходной мелассе 0,40,8:1,0. 2. Способ по п . 1 , о т л и ч а ю щ и й с я тем, что аммофос вносят в мелассу, разбавленную водой, до содержания сухих веществ 61 -68 мас.%. (56) Лужков A.M. и др. Оценка эффективности очищенной мелассы для биосинтеза лизина. - Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции "Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, медицины и научных исследований". 22-24 июня 1988, Ереван, с.137. (72) Гулий Іван Степанович, Штангеева Надія Іванівна, Лужков Александр ІУіхайловІч (RU), Клименко Лариса Степанівна, Краєва Наталія КІрілловна (RU), Poговєр Валерій Семьонович, Козявкін Анатолій Петроаич (73) Відкрите акціонерне товариство "Трипільський біохімічний завод" (UA) (57) 1. Способ подготовки мелассы для культивирования микроорганизмов в производстве аминокислот, включающий раз 3. Способ по п. 1 , о т л и ч а ю щ и й с я тем, что аммофос используют в виде 525%-ного водного раствора. 4. Способ по п. 1 , о т л и ч а ю щ и й с я тем, что после добавления аммофоса и отделения осадка мелассу обрабатывают сернистым газом до остаточного содержания в ней сульфитов 0,05-0,30 мас.%. Изобретение относится к способу подготовки свекловичной мелассы, используемой в качестве компонента питательной среды или питательной добавки для культивирования микроорганизмов в процессе произоодства аминокислот. В современном микробиологическом производстве меласса является наиболее распространенным источником углеводного питания. Существуют различные способы подготовки мелассы для ее использования в качестве источника питания при выращивании микроорганизмов в дрожжевом и спиртовом производствах, при получении лимонной кислоты. Разработка способов подготовки свекловичной мелассы для микробиологического производства аминокислот путем ее обработки химическими реагентами в настоящее время является предметом исследований. С > О W О 10430 Процесс подготовки мелассы для производства аминокислот из-за содержания в ней балластных примесей, оказывающих отрицательное действие на биосинтез и снижающих выход, качество целевого 5 продукта, а также вызывающих усложнение производственного процесса в результате осаждения солей кальция на теплообменной аппаратуре, обуславливает необходимость разработки промышленно 10 применимых технологических решений, предусматривающих эффективную очистку мелассы. Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ подготовки ме- 15 лассы для промышленного производства аминокислоты L-лизина. Этот способ предусматривает очистку мелассы, а именно разбавление ее водой до концентрации сухих веществ 37-40%, что соответствует 20 концентрации по сахару - содержанию редуцирующих веществ 23-25% (редуцирующие вещества - моносахариды, имеющие свободные альдегидные и кетонные группы) и до определенного уровня содержания 25 ионов кальция, добавление для осаждения балластных примесей химического реагента в виде серной кислоты, перемешивание, нагревание, выдержку, отделение осадка, нейтрализацию щелочью. Этот способ 30 позволяет повысить степень очистки мелассы от примесей и, соответственно, улучшить технологические показатели. Однако при осуществлении известного способа в результате очистки мелассы от примесей каль- 35 ция и других балластных веществ серной кислотой не удается снизить показатель цветности мелассы в 1,3-1,5 раза и содержание кальция до 0,5-0,7% к сухим веществам (СВ) мелассы. Кроме того одновременно 40 с осаждением указанных примесей происходит взаимодействие содержащихся в мелассе ростовых факторов - аминокислот треонина, лейцина,изолсйцина с моносахарами. В результате образуются сахэроамин- 45 ные соединения, которые не используются продуцентами целевых аминокислот. Витамины необходимые, для биосинтеза амино кислот, прежде всего, биотин в таких условиях обработки мелассы также частич- 50 но разрушаются. При нейтрализации очищенной мелассы щелочью происходит частичное превращение редуцирующих веществ в красящие вещества. Доброкачественность, характеризующая содержание сахара в мелассе, обработанной известным 55 способом, не превышает 55%. Таким образом, при обработке мелассы известные способом по причине использования в качестве осаждающего реагента серной кислоты с последующей нейтрализацией мелассы щелочью невозможно увеличение доброкачественности мелассы выше 65% (сохранение высокой концентрации сахара - редуцирующих веществ 37-43%) и повышение степени ее очистки путем снижения показателя цветности в 1,3-1,5 раза с одновременным снижением содержания кальция до 0,5-0,7% к СВ мелассы и сохрапением исходного количества ростовых факторов - аминокислот, витаминов. Соответственно, использование очищенной мелассы, полученной известным способом, не позволяет обеспечить повышение уровня накопления целевых аминокислот в процессе биосинтеза \\а 6-14%. В основу заявляемого изобретения поставлена задача создания способа подготовки мелассы для культивирования микроорганизмов в производстве аминокислот, в котором путем обработки мелассы реагентом, избирательно осаждающим балластные примеси и добавляемым в нее о соотнесенном к содержанию ионов кальция количестве при определенном разбавлении мелассы водой, обеспечивается достижение доброкачественности мелассы 68-69%, снижение содержания балластных примесей по показателю цветности в 1,3-1,5 раза, снижение содержания кальция до оптимального уровня 0,5—0,7% к СВ мелассы, а также сохранение в мелассе исходного содержания ростовых факторов - аминокислот, витаминов, необходимых для культивирования продуцентов целевых аминокислот, и за счет указанного технического результата повысить уровень накопления аминокислот при биосинтезе на 6-14%. Поставленная задача решается тем, что в способе подготовки мелассы для культивирования микроорганизмов в производстве аминокислот, предусматривающем ее разбавление водой, добавление химического реагента, нагревание, перемешивание, выдержку, отделение осадка, согласно заявляемому изобретению в качестве химического реагента для осаждения балластных примесей используют аммофос, который добавляют в количестве, зависимом от содержания ионов кальция в исходной мелассе, а именно - в соотношении 0,4-0,8:1,0 к содержанию ионов кальция (что соответствует 0,40-0,75% масс, от мелассы). Аммофос смесь веществ, получаемая нейтрализацией экстракционной фосфорной кислоты аммиаком, по физико-химическим свойствам соответствующая ГОСТу " 8918-85. • мммофос вносят в мелассу, которую предварительно разбавляют ьодой до со 10430 держания сухих веществ 60-68%, что соответствует содержанию редуцирующих веществ 37-43% к массе мелассы. При этом аммофос используют в виде 5-25%-ного водного раствора. После добавления аммофоса и отделения осадка мелассу обрабатывают сернистым газом, до остаточного содержания сульфитов 0,05-0,30% масс, к мелассе. Совокупность всех признаков заявляемого способа подготовки мелассы для культивирования микроорганизмов ' в производстве аминокислот, а именно - разбавление мелассы водой, введение в мелассу химического реагента, нагревание полученной смеси, перемешивание, выдерживание, отделение осадка с использованием согласно заявляемому изобретению в качестве химического реагента аммофоса в количественном соотношении к содержанию ионов кальция в исходной мелассе 0,40,8:1,0, добавляемого в виде 5-25%-ного водного раствора в мелассу, разбавленную водой до содержания сухих веществ 6 1 68%, с последующей обработкой мелассы после отделения осадка сернистым газом до остаточного содержания сульфитов 0,050,30 % масс, позволяет получить мелассу, характеризуемую доброкачественностью 68-69%, очищенную от балластных примесей в 1,3-1,5 раза по показателю цветности с одновременным снижением содержания кальция до оптимального уровня 0,5-0,7% к СВ мелассы, а также снизить потери ростовых факторов при обработке мелассы в 2,02,5 раза, и в итоге повысить уровень накопления аминокислот при биосинтезе на 6-14%. За счет новых признаков, а именно использования при очистке мелассы в качестве химического реагента аммофоса в количественном соотношении к содержанию ионов кальция в исходной мелассе 0,40,8:1,0 (что соответствует содержанию аммофоса в мелассе 0,40-0,75% масс, к мелассе) с добавлением его в виде 5-25%ного раствора в мелассу, разбавленную водой до содержания сухих веществ 61-68%, и последующей обработкой мелассы после отделения осадка сернистым газом до остаточного содержания сульфитов 0,05-0,30% масс, к мелассе, способ подготовки мелассы для культивирования микроорганизмов в производстве аминокислот приобретает новые свойства и особый характер функционирования. При этом новые признаки заявляемого способа при взаимодействии с известными обеспечивают проявление новых технических свойств следующим образом. При взаимодействии с мелассной средой аммофос проявляет осаждающее и обесцвечивающее действие. При этом основными компонентами балластных приме5 сей мелассы являются соединения кальция. При обработке мелассы раствором аммофоса растворимые соли кальция взаимодействуют с фосфат-ионами и осаждаются. Реакция происходит по следующей схеме: 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 H3PO4 За счет внесения в мелассную среду аммофоса в количестве, соотнесенном к содержанию ионов кальция в мелассе, а именно в соотношении 0,4-0,8:1,0 (что соответствует содержанию кальция 0,400,75% к массе мелассы), обеспечивается снижение содержания кальция до уровня, который, с одной стороны - не оказывает отрицательного воздействия на технические системы (образование осадка на стенках оборудования), с другой стороны способствует поддержанию буферности ферментационной среды при культивировании продуцентов аминокислот. При обработке мелассы раствором аммофоса его обесцвечивающее действие выражается в том, что на образовавшихся осадках балластных примесей происходит адсорбция окрашенных соединений. Часть соединений коллоидного характера осаждаются за счет дегидратации и агрегатирования коллоидов, вызванных снижением рН мелассы при обработке аммофосом. Показатель цветности после обработки мелассы заявляемым способом снижается в 1,3-1,5 раза. Обработка мелассы аммофосом за счет лредотвращения реакции меланоидинообразования (взаимодействия моносахаров с аминогруппами аминокислот) позволяет сохранить в мелассе исходное содержание необходимых для культивирования продуцентов целевых аминокислот ростовых факторов - аминокислот треонина, лейцина, изолейцина и витаминов биотина, тиамина, снизив их потери по сравнению с прототипом в 2,0-2,5 раза. Кроме того, в результате взаимодействия раствора аммофоса с мелассной средой, часть ионов, не участвующих в связывании (осаждении) примесей, становятся дополнительными источниками азота и фосфора, что позволяет снизить концентрацию источников азота, фосфорных солей при последующем приготовлении питательной среды на основе мелассы, а также использовать подготовленную заявляемым способом мелассу для 10430 подпитки непосредственно в процессе культивирования. Комплексное осаждающее и обеспечивающее действие аммофоса при осуществлении заявляемого способа усиливается за счет взаимодействия 5~25%-ного раствора аммофоса с мелассой, разбавленной водой до содержания сухих веществ 61-68%. Эти признаки способствуют не только повышению степени и качеству очистки, но и получению очищенной мелассы с показателем доброкачественности 68-69%, что позволяет осуществить биосинтез аминокислот с использованием питательных сред с высоким содержанием - 37-43% редуцирующих веществ. Сочетание действия аммофоса и сернистого газа после добавления аммофоса и отделения осадка при обработке мелассы сернистым газом до остаточного содержания сульфитов 0,05-0,30% по массе мелассы усиливает достигнутый технический результат, а именно - обеспечивает дополнительное обесцвечивание мелассы до показателя цветности 6500 единиц оптической плотности, а также ингибирование реакции цветообразоваиия, что дополнительно сохраняет моносахариды и аминосоединения, легко усваиваемые продуцентами аминокислот. Ионы аммония, вносимые с аммофосом, при пзаимодействии с сернистым газом образуют сульфит аммония, оказывающий на мелассу дополнительное обесцвечивающее действие. При этом эффективность действия сернистого газа повышается благодаря предварительному удалению из мелассы солей кальция аммофосом: сульфит - ионы не расходуются на образование осадка сульфита кальция, а полностью используются для обесцвечивания окрашенных соединений. Кроме того сернистый газ оказывает на мелассу бактерицидное действие, что дополнительно увеличивает срок ее хранения. Заявляемый способ испытан в лабораторных и производственных условиях. Обобщенные результаты испытаний, отражающие характер функционирования новых технических свойств способа, приведены в таблицах 1-4. Осуществление предлагаемого способа обеспечивает получение мелассы, используемой в качестве компонента питательной среды и/или подпитки (доОавки) в процессе культивирования продуцентов при производстве аминокислот и соответствующей специфике, требованиям этого производства по показателям доброкачественности, степени очистки от балластных примесей, содержанию ростовых факторов, азота, фос 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8 фора, а именно - мелассы, характеризуемой следующими показателями: доброкачественность - 68-69%, редуцирующие вещества - 37-43%; содержание аминокислот - треонин - 0,27-0,29 г/кг, лейцин 0,90-0,91 г/кг, изолейцин - 0,90-0,91 г/кг, витаминов - биотин - 0,17-0,19 мкг/кг, тиамин -1,40-1,45 мкг/кг; кальций - 0,5-0,7% к с.в; азот общий - 1,60-1,63%; фосфор 0,3-0,6 г/кг; сульфиты - 0,05-0,30% по массе мелассы; снижение показателя цветности - в 1,3-1,5 раза по сравнению с цветностью исходной мелассы (прототип). Использование мелассы, подготовленной для культивирования продуцентов аминокислот, позволяет при биосинтезе повысить уровень накопления аминокислот: L-лизина-на 12,1 - 14,4%; L-лейцина-на 8,3- 10,1%; L - гомосерина - на 6,4 -7,5%. Таким образом, вышеизложенное позволяет сделать вывод о том, что заявляемый способ обладает новизной. Сущность заявляемого способа иллюстрирована следующими примерами. П р и м е р 1. Мелассу свеклосахарного производства - сиропообразную жидкость темно-коричневого цвета, контролируемую согласно ОСТу 18-395-82, в данном примере имеющую рМ 7,4, цветность 12000 единиц оптической плотности, доброкачественность 60,7% и содержащую общего сахара - 47,8%, сухих веществ - 78,7%, аминокислот: треонина - 0,27 г/кг, лейцина - 0,97 г/кг, изолейцина -1,0 г/кг; витаминов - биотина - 0,2 мкг/кг, тиамина - 1,5 мкг/кг; фосфора-0,05 мг/г, кальция - 1,2% на 100 г сухих веществ, сульфитов - 0,022 %, разбавляют водой до содержания сухих веществ 61% (что соответствует 37% редуцирующих веществ). При этом в промышленных условиях: исходную мелассу в количестве 4,7 т подают в аппарат объемом 8,5 м , обеспечивающий не менее одночасового запаса мелассы для сепарзторов ~ разбавленной водой и обработанной аммофосом. В этот же аппарат через щелевой расходомер (дозатор) подают воду, нагретую в подогревателе до температуры 75-80°С в количестве 1,35 т. Отдельно готовят водный раствор аммофоса (смеси веществ иа основе моноаммонийфосфата и диаммонийфосфата), получаемого нейтрализацией экстракционной фосфорной кислоты аммиаком, а именно - аммофоса марки Л по физико-химическим показателям соответствующего согласно ГОСТу 1891 d-85 следующим нормам и требованиям: массовая доля общего 10430 азота 12%, массовая доля усвояемых фосфатов 50-52%, массовая доля воды 1 %, гранулометрический состав - размер гранул менее 1 мм не более 3%, от 1 до 4 мм не менее 95%, менее 6 мм - 100%, статистиче- 5 ская рассыпчатость - 100%. Гранулированный аммофос в количестве 28,0 кг загружают в бункер и по транспортеру подают в сборник, снабженный мешалкой, затем в этот сборник добавляют в количестве 10 84 л подогретую до температуры 80-85°С воду - получают 25%-ный раствор аммофоса в воде, который в количественном соотношении по содержанию аммофоса к концентрации ионов кальция в мелассе 15 0,6:1, что соответствует 0,6% аммофоса к массе мелассы - подают в аппарат с мелассой, разбавленной, как указано выше, водой до содержания сухих веществ 61%, а именно: к 5,05 т мелассы, содержащей 61 % сухих 20 веществ добавляют 84 л 25%-ного водного раствора аммофоса. После добавления аммофоса к мелассе полученную смесь тщательно перемешивают, нагревают до температуры 80±1 °С и выдерживают в тече- 25 ние 20 минут. Затем мелассу, обработанную аммофосом, подают в сепаратор, где отделяют осадок фосфата кальция, образовавшийся в результате контактирования мелассы с ам- 30 мофосом. При этом рекомендуется использовать сепаратор датской фирмы "Westfalia" производительностью 17 т/час, п=5000 об/мин. После отделения осадка соединений кальция мелассу, подлежащую 35 длительному хранению - более двух суток, сульфитируют путем сжигания серы во вращающейся печи типа БВЯ-2. Насыщение мелассы сернистым газом осуществляют в сульфитаторе оросительного типа СО-2,0. 40 Очищенная меласса из сепараторов поступает в верхнюю часть сульфитатора, а сернистый газ направляют в нижнюю часть сульфитатора и пропускают через слой мелассы. Отработанный газ отводят через вер- 45 хнюю вытяжную трубу. Мелассу, отсульфитированную до остаточного содержания сульфитов 0,10% к массе мелассы, отводят от нижней части сульфитатора и направляют для использования в процессе би- 50 осинтеза аминокислот. При этом в результате проведенной подготовки мелассы для культивирования продуцентов аминокислот получены ее следующие качественные показатели: доброкачествен55 ность - 68%, редуцирующие вещества 37%, цветность - 6500 единиц оптической плотности, содержание ростовых факторов - аминокислот - треонина - 0,265 г/кг, лейцина - 0,97 г/кг, изолейцина - 0,90 г/кг, 10 витаминов - биотина - 0,18 мкг/кг, тиамина - 1,5 мкг/кг; содержание соединений кальция - 0,65%, фосфора - 0.50 мг/г, рН 5,56, сульфитов - 0,1 %. При этом один из основных показателей качества мелассы в производстве аминокислот принят по содержанию сахарозы, которую определяют методом Бертрана с предварительным гидролизом до моносахаридов (глюкозы и фруктозы). Метод основан на взаимодействии оксида меди со свободными альдегидными и кетонными группами моносахаридов, относящихся к так называемым "редуцирующим веществам". Поэтому содержание сахарозы в сумме с моносахаридами выражают в количестве редуцирующих веществ. Таким образом, в результате подготовки мелассы предлагаемым способом снижение ее цветности составляет 46%, т.е. в 1,8 раза по сравнению с прототипом, снижение содержания кальция - в 1,8 раза, повышение доброкачественности - на 12% относительных, т.е. до 68%, сохранение исходного содержания ростовых факторов - 97-100%. При хранении мелассы, обработанной заявляемым способом, в течение 4 месяцев ее качественные показатели практически не изменились. Мелассу, подготовленную для культивирования микроорганизмов согласно предлагаемому способу, используют в качестве углеводной составляющей питательной среды при производстве аминокислоты Lлизина микробиологическим способом. В качестве продуцента лизина используют культуру Brevibacterium sp. К-531 ВКМП-В 1959. Односуточную культуру пересевают с агара Хоттингера на жидкую питательную среду состава, %: меласса - 5,0; гидро/жзат БВК - 4,0; кукурузный экстракт - 3,0; мел 0,5. Посевной материал выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, с объемом среды 50 мл, на качалке (240 об/мин) при температуре 29±1°С в течение 16-18 часов. Посевной материал передают в количестве 7% (по объему) в ферментационную среду. Биосинтез лизина осуществляют на питательной среде следующего состава, %: меласса - 12 (по редуцирующим веществам); гидролизат БВК - 6; кукурузный экстракт - 1; хлористый аммоний NbUCI - 1; концентрацию фосфорной соли (ІЧН-фНРОз уменьшают с 0,1 до 0,07% в результате обогащения мелассы фосфором при обработке ее аммофосом. Культивирование проводят в лабораторном ферментере объемом 5 л с объемом питательной среды 2,8 л при температуре 30±1°С, аэрации и перемешива 11 10430 ний ~ 500 об/мин. Через трое суток накопление лизина на исходной мелассе (контроль) составляет 45 г/л, на мелассе, подготовленной известным способом (согласно прототипу) - 50 г/л; на мелассе, подготовленной предлагаемым способом-55,0 г/л, что превышает уровень накопления лизина по сравнению с контролем на 22%, по сравнению с прототипом - на 10%. Значения расхода аммофоса и концентрации сернистого газа, подтверждающие возможность получения технического результата при осуществлении заявляемого способа в определенных количественных интервалах указанных значений, показаны соответственно в таблице 1 и таблице 2. Оценка показателей мелассы, подготовленной заявляемым способом, приведена в сравнении с показателями исходной, неочищенной мелассы (контроля), и в сравнении с показателями мелассы, подготовленной согласно прототипу. При згом все полученные данные из числа проведенных опытов и испытаний приведены к средним значениям и показаны в таблице 2. Сравнительные показатели уровня накопления целевых аминокислот в процессе биосинтеза, полученные при использовании мелассы, подготовленной известным способом и предлагаемым способом согласно примерам 1-5, иллюстрированы данными таблицы 4. П р и м е р 2. Мелассу с исходными показателями, в данном примере имеющую рН 6,6, цветность 150СЭ единиц оптической плотности, доброкачественность 62,8% и содержащую редуцирующих веществ 49%, сухих веществ 78%, треонина - 0,4 г/кг, лейцина - 1 , 0 г/кг, изолейцина - 0,9 г/кг, биотина - 0,25 мкг/кг, тиамина - 1,6 мкг/кг, фосфора - 0,03 мг/г, кальция - 1,49% на 100 г сухих веществ, сульфитов - 0,05% разбавляют водой до осаждения сухих веществ 63% (что соответствует содержанию редуцирующих веществ 42,7%). Затем полученную мелассно-водную смесь обрабатывают 23%-ным водным раствором аммофоса марки А. Аммофос в виде "одного раствора вносят в мелассно-водную смесь в количестве 0,46% к массе мелассы, что соответствует количественному соотношению аммофоса к содержанию ионоо кальция в мелассе 0,4:1. Получе иную смесь тщательно перемешивают и выдерживают при температуре 60°С в течение 20 минут. Осадок отделяют на сепараторе. После отделения осадка содержание балластных примесей в мелассе снижено в 1,5 раза -до показателя цветности 11500 единиц оптической плотности, содержание ионов кальция - в 2,1 раза, до 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12 оптимального уровня 0,7% к содержанию сухих веществ в мелассе. Содержание редуцирующих веществ в мелассе, подготовленной для производства аминокислоты, составляет 42,5%, содержание сухих веществ - 61,6%. Доброкачественность мелассы повышена до 69%. Сохранение количества ростовых факторов в мелассе составляет 90-97%: треонин ~ 0,36 г/кг, лейцин - 0,95 г/кг, изолейцин - 0,85 г/кг, биотин - 0,23 мкг/кг, тиамин - 1,55 мкг/кг. Содержание фосфора в мелассе - 0,31 мг/г, сульфитов - 0,05%, рН 5,8. Подготовленную для культивирования продуцентов лизина мелассу используют непосредственно после ее обработки аммофосом (в течение двух суток) - без сульфитирования. В качестве продуцента при биосинтезе L-лизина используют культуру Brevibacteriurn sp. ВНИИгенетикаЭОВКПМВ 5593. Подготовку посевного материала и биосинтез осуществляют как указано в примере 1, но на питательной среде следующего состава, %: меласса 12 (по редуцирующим веществам), гидролизат ЬВК - 3, гидролизат кукурузного экстракта - 3, фосфорнокислый аммоний однозамещенный - 0,1. Уровень накопления лизина на исходной мелассе (контроль) составляет 50 г/л, на мелассе, подготовленной известным наиболее близким способом (по прототипу) - 52 г/л, на мелассе, подготовленной предлагаемым способом - 58 г/л, что на 11,5% превышает уровень накопления аминокислоты, получаемой с использованием мелассы, подготовленной согласно прототипу. П р и м е р 3. Мелассу с исходными показателями: рН 6,6, цветность 15000 единиц оптической плотности, доброкачественность 64%, содержащую редуцирующих веществ 46%, сухих веществ 72 %, треонина - 0,4 г/кг, лейцина -1,0 г/кг, изолейцина 0,9 г/кг, биотина - 0,25 мкг/кг, тиамина -1,6 мкг/кг, фосфора - 0,02 мг/г, кальция 1,30% на 100 сухих веществ, сульфитов 0,04% разбавляют водой до содержания сухих веществ 64%. Затем в нее добавляют 5%-ный водный раствор аммофоса в количестве, соответствующем отношению аммофоса к содержанию ионов кальция в мелассе 0,8:1, что соответствует 0,75% аммофоса к массе мелассы, содержащей 64,0% сухих вещесто. Время взаимодействия мелассной среды с аммофосом при постоянном перемешивании состав'яет 20 минут, температура процесса 60±1 с С. Затем мелассу, обработанную аммофосом, подают на сепаратор. После отделения 13 10430 14 осадка на сепараторе мелассу обрабатывастава, %: меласса - 12 (по редуцирующим ют сернистым газом до общего содержания веществам), серно-кислый аммоний - 3, сульфитов 0,30% по массе мелассы. Содерфосфорнокислый аммоний однозамещенжание редуцирующих веществ в мелассе, ный - 0,12, сернокислый марганец - 0,002, подготовленной для производства амино- 5 мел - 3,0; тиамин - 200 мкг/л, дестибиотин кислоты, составляет 41%, сухих веществ - 200 мкг/л. 61 %. Доброкачественность мелассы - 68%, После культивирования продуцента цветность - 10000 единиц оптической плотлейцина на круговой качалке в течение 72 ности. Сохранение количества ростовых часов накопление лейцина составляет на факторов в мелассе составляет 85-93%: тре- 10 исходной мелассе (контроль) - 10,2 г/л, на онин - 0,34 г/кг, лейцин - 0,93 г/кг, изолеймелассе, подготовленной известным спосоцин - 0,82 г/кг, биотип - 0,23 мкг/кг, тиамин бом (согласно прототипу) - 10,9 г/л; на ме- 1,5 мкг/кг. Содержание фосфора - 0,41 лассе, подготовленной предлагаемым мг/г, сульфитов - 0,3%, рН 5,3, содержание способом -12,0 г/л, что превышает уровень кальция - 0,5% на 100 г сухих веществ. 15 накопления лейцина по сравнению с контПодготовленную согласно заявляемому ролем - на 15%, по сравнению с прототиспособу мелассу после хранения в течение пом на 10%. двух месяцев использооапи для биосинтеза П р и м е р 5. Мелассу с исходными лизина. В качество продуцента L-лизина испоказателями, в данном примере имеющую пользуют культуру B«evibacter!um зр. ВНИ- 20 рН 7,2, цветность 10000 единиц оптической Игенстика-90 ВКПМ В 5593 Порядок плотности, доброкачественность 60%, соподготовки посевного материала и биосиндержащую общего сахара - 47%, сухих ветез лизина осуществляют, как в примере 1, ществ -78%.содержаниекальция- 1,2% на на питательной среде следующего состава, 100 г сухих веществ, сульфитов - 0,02%, %: меласса - 12 (по редуцирующим вещест- 25 аминокислот - треонина - 0,28 г/кг, лейцлвам}, гидролизат БВК - 3, гидролизат кукуна - 0,96 г/кг, изолейцина - 1,0 г/кг, витарузного экстракта - 3, фосфорнокислый минов - биотина - 0,2 мкг/кг, тиамина - 1,4 аммоний однозамещенный - 0,1. В процесмкг/кг; фосфора - 0,06 мг/г, разбавляют се биосин їеза дополнительно вводили питаводой до содержания сухих веществ 62% тельную среду в количестве 1 л, 30 (что соответствует 37,3% редуцирующих весодержащую мелассу, подготовленную ществ). предлагаемым способом (30% по редуцируОтдельно готовят водный раствор амющим веществам), кукурузный экстракт мофоса и обрабатывают мелассу аммофо1,5%, хлористый аммоний - 4,5%. Через 70 сом, отделяют осадок соединений кальция часов культивирования уровень накопления 35 на сепараторе и сульфитируют, как в примелизина на исходной мелассе (контроль) соре 1, но при этом сульфитирование осущеставляет 52 г/л, на мелассе, подготовленной ствляют до остаточного содержания наиболее близким способом (прототип) - 54 сульфитов 0,05% к массе мелассы. При этом г/л, на мелассе, подготовленной предлагаев результате проведенной подготовки мемым способом - 62 г/л, что на 13% превы- 40 лассы получены показатели; доброкачестшает уровень накопления аминокислоты, венность 68%, редуцирующих веществ получаемой с использованием мелассы, 37%, цветность 7000 единиц оптической подготовленной согласно прототипу. плотности; содержание аминокислот - треП р и м е р 4. Мелассу с исходными онина - 0,28 г/кг, лейцина - 0,94 г/кг, изокачественными показателями и обработан- 45 лейцина - 0,95 г/кг; витаминов - треонина ную аммофосом, как указано и примере 2, - 0,2 мкг/кг, тиамина - 1,3 мкг/кг; фосфора после отделения осадка на сепараторе ис-0,30 мг/г, сульфитов 0,05%, рН 6,2. Сохрапользуют для биосинтеза аминокислоты нение количества ростовых факторов (амилейцина-штамм Brevlbacterium fiavum 32 нокислот, витаминов) в мелассе составляет DBKMn-2736. Односуточную культуру пере- 50 93-100%, доброкачественность повышена севают с агара Хоттингера на жидкую питадо 68%. Содержание балластных веществ тельную среду состава, %: меласса - 5,0; снижено до показателя цветности 7000 едигидролизат БВК (белково-витаминного ниц оптической плотности - в 1,4'раза. концентрата) - 4,0; кукурузный экстракт Подготовленную для культивирования 3,0; мел - 0,5. Посевной материал выращи- 55 продуцента аминокислоты мелассу испольвают в колбах Эрленмейера объемом 750 зуют для биосинтеза гомосерина - штамм мл, с обьемом среды 50 мл, на качалке (240 Brevibacterium fiavum 103. Посевной матеоб/мин) при температуре 29±1°С в течение риал готовят, как указано в примере 4. Био16-18 часов. Посевной материал передают синтез осуществляют в качалочных колбах D ферментационную среду следующего сона питательной среде объемом 20 мл следу 15 10430 ющего состава, %: меласса - 10 (по редуцирующим веществам), кукурузный экстракт 0,5, гидролизатБВК-5,0, серно-кислый магний - 0,05, сернокислый аммоний - 2,0, фосфорнокислый аммоний однозамещенный 0,1, мел - 2 , 0 . После культивирования в течение 72 часов при температуре 32°С накопление гомосерина составляет на исходной мелассе (контроль) - 17 г/л, на мелассе, подготовленной известным способом согласно прототипу ~ 18,7 г/л, на мелассе, подготовленной предлагаемым способом - 20,1 г/л, что превышает уровень накопления лейцина по сравнению с контролем - на 15%, по сравнению с прототипом - на 7%. Разработанные и выбранные пределы количественных параметров в предлагаемом способе поясняются следующими доводами. Расход аммофоса в его количественном соотношении к содержанию ионов кальция 0,4-0,8:1,0 (что соответствует расходу аммофоса 0,40-0,75% к массе мелассы) установлен исходя из его к о м п л е к с н о г о осаждающего балластные примеси, декальцинирующего и обесцвечивающего действия в мелассе. Указанные количества аммофоса выбраны относительно ионов кальция в исходной мелассе в связи с необходимостью снижения содержания основных компонентов осаждаемых примесей соединений кальция до оптимального уровня: с одной стороны, этот оптимальный уровень с о д е р ж а н и я ионов кальция не оказывает отрицательного воздействия на технические системы и технологический процесс (осаждение солей на теплообменной аппаратуре, при выделении аминокислот), а другой стороны - способствует созданию буферности ферментационной среды, стабильности процесса биосинтеза аминокислот. При использовании аммофоса в количестве менее 0,4:1 к содержанию ионов кальция в мелассе (менее 0,40% к массе мелассы) он не проявляет достаточного осаждающего эффекта. Превышение расхода аммофоса более 0,8:1 к содержанию у.онов кальция в мелассе (более 0,75% к массе мелассы) технологически и экономически нецелесообразно, так как упеличивается его объемный расход, а селективные свойства по отношению к примесям кальция, коллоидным окрашенным соединениям снижаются и, кроме того, понижается рН мелассы, что препятствует дальнейшей обработке ее сернистым газом. При разбавлении мелассы до содержания сухих веществ менео 6 1 % снижается количество сахара, вводимого1 с мелассой в 16 питательную среду и, соответственно, снижается выход целевого продукта аминокислоты. При концентрации сухих веществ более 68%, происходит карамелизация са5 хара при последующей стерилизации мелассы. В пределах указанных концентраций сухих веществ избирательное осаждающее действие аммофоса по отношению к ионам кальция и коллоидным балластным приме10 сям усиливается. При использовании водного раствора аммофоса его содержрние в воде менее 5% недостаточно для взаимодействия с приме15 сями по всему объему очищаемой мелассы. При содержании аммофоса в водном растворе более 25% снижается его растворимость, увеличиваются затраты на гомогенизацию смеси. 20 Общее содержание сульфитов в мелассе после ее обработки сернистым газом менее 0,05% является недостаточным для блокирования реакционных групп редуци25 рующих веществ и ингибирования реакций цветообразования, что не обеспечивает дополнительного обесцвечивания мелассы. При общем содержании сульфитов более 0,3% начинается кислотное разложение мо30 иосахаридов, что способствует повышению цветности мелассы, ингибирующему действию на биосинтез аминокислот. Предлагаемый способ испытан в опытно-промышленных условиях крупиотоннаж35 ного биотехнологического производства с реализацией процессов биосинтеза аминокислот в научно-техническом центре этого производства. Результаты, полученные при практическом осуществлении способа, 40 обобщены и представлены в таблицам 1-4. Практические данные, иллюстрирующие конкретные показатели, получаемые в результате подготовки мелассы заявляемым способом, подтверждают достижение 45 технического результата и поставленной задачи, а именно - снижение содержания балластных примесей в мелассе, ее цветности в 1,3-1,5 раза, снижение содержания кальция до оптимального уровня 0,5-0,7% к су50 хим веществам мелассы, сохранение в мелассе исходного содержания ростовых факторов, повышение значения доброкачественности мелассы до 68-69%, что в 1,1 раза превышает значения доброкачествен55 ности мелассы, полученной при обработке известным способом (прототипом). Достигнутый технический результат позволяет при биосинтезе аминокислот на мелассе, подготовленной заявляемым способом, увеличить уровень их накопления на 6-14%. Таблица 1 Сравнительная оценка качественных показателей мелассы и уровня накопления аминокислот при биосинтезе в зависимости от расхода аммофоса на обработку мелассы Показатели п/п 1. 0,00 0,10 Расход аммофс-а, % к массе мелассы 0,50 0,75 0,80 0,35 0,40 1,200 1,029 0,765 0,700 0,690 0,500 8820 7980 7400 7390 6050 8820 7700 7010 6500 0,30 1,00 1,00 0,30 1,00 0,97 0,27 0,90 0,90 0,20 1,50 0,20 1,40 0,05 0,15 Размерность Содержание кальция % ка 100 г сухих веществ 2. Показатель цветности Обработка аммофосом Обработка аммофосом и сернистым газом Содержание ростовых факторов Аминокислоты: треонин лейцин изолейцин Витамины: биотин тиамин Содержание фосфора 2,0 0,500 0,462 0,400 5110 5015 5010 5005 5000 4480 5000 5000 5005 0,29 0,90 1,00 0,30 0,95 1,00 0,29 1,00 0,99 0,24 0,90 0,90 0,27 0,70 0,87 0,26 0,50 0,70 0,17 1,40 0,17 1,39 0,17 1,40 0,18 1,45 0,16 1,40 0,16 1,20 0,14 1,15 0,28 0,30 0,37 0,60 0,67 0,71 1,10 Единица оптической плотности 2.1. 1,0 2.2. 3. 3.1. 3.2 4. со о г/кг мкг/кг г/кг со Продолжение табл. 1 fsfc п/п 5.. Показатели 1 Размерность 0,00 Содержание целевой аминокислоты в культуральной жидкости лизин лейцин гомосерин 0,10 Расход аммофоса, % к массе мелассы 0,80 0,75 0,50 0,35 0,40 1,0 2,0 50,0 10,5 17,5 45,6 10,3 17,7 t V г/л 49,0 10,2 17.9 48,7 10,5 18,0 52,4 10,5 18,1 55,5 11,1 18,5 56,7 11,8 18.9 56,0 12,0 20.2 54,0 11,0 18.0 Таблица 2 Сравнительные показатели, характеризующие известный и предлагаемый способы подготовки мелассы для культивирования микроорганизмов в производстве аминокислот п/п Способ подготовки мелассы Редуци- ДоброРостовые факторы рующее качост- Аминокислоты в мелассе, Витамины в мевещественг/кг лассе, мкг/кг во, % ность треонин лейцин изолей- биотин тиамин цин Азот об щий, % Фосфор, мг/г Кальций, Вяз% на 100 кость, г сухих ссТ, веществ при 80 °С Показатель цветности, ед. оптической плотно СО о сти 1. Контроль /неочищенная меласса/ 2. Прототип /получение очищенной мелассы/ Предлагаемый 3. способ /получение очищенной и обогащенной мелассы/ 3.1. При обработке аммофосом 3.2. При обработке аммофосом и сернистым газом 47 62 0,3 1,0 1,0 0,2 1,5 1,6 0,03 1,2-1,5 18,6 12000 23 64 0,12 0,40 0,45 0,08 0,6 0,7 0,013 0,6-0,9 16,2 10000 37 68,5 0,27 0,9 0,9 0,18 1,5 1,6 0,3-0.6 0,5-0.7 15,2 8000 40 68.3 0,28 0,9 0.9 0,16 1.5 1,6 0,3-0,6 0,5-0,7 15.2 6500 ю о Таблица 3 Изменение цветности мелассы при хранении и уровня накопления аминокислот при биосинтезе в зависимости от расхода Срок хранения * Показатели п /п Общее содержание сульфитов Б мелассе после обработки аммофосом и сернистым газом, % 0,20 0.10 0.05 0.00 4887,5 4989,2 5098,6 7820,0 4887,8 4989.8 5506,5 9626,4 4888,0 4990,0 5710,4 9890,7 4889,2 5086.0 6169,3 появление 4890,5 5178,8 6618,0 плесени 0,30 4676.0 4676.5 4677,2 4685,0 4769,0 0,35 4689.0 4689.2 4689.8 4699,0 4726.5 1. Цветность, единиц оптической плотности 2. Уровень накопления L-лизина, г/л 57,5 58,8 58.4 58,7 58,9 57.6 3. Уровень накопления L-лейцина, г/л 11,8 11.9 12,2 11,9 12,1 11,8 4. Уровень накопления Ь-гомосерина, -/л 19,9 20.0 20,2 ?0,0 20.3 19.9 1 2 3 4 Таблица 4 Сравнительные показатели уровня накопления целевых аминокислот в процессе биосинтеза при использованиии мелассы, подготовленной известным и заявляемым способами • N: п/п Способ подготовки мелассы г/л 1. 2. 3. 3.1. 3.2. Контроль /неочищенная меласса/ Прототип /получение очищенной мелассы/ Предлагаемый способ /получение очищенной и обогащенной мелассы/ При обработке аммофосом При обработке аммофосом и сернистым газом 47,0 о л» « о Показатели уровня накопления целевых аминокислот при биосинтезе, г/л L-лизин L-лейцин ] L-гомосерин Увеличение, % г/л г/л Увеличение, % Увеличение, % к к к к к к контролю прототипу контролю прототипу контролю, прототипу 10.1 — — 17.0 — — 51,3 — 10,9 — — 18,7 — — 57,5 22,3 12,1 11,8 16,8 8.3 19,9 17.05 6,4 58,7 24,2 14,4 12.0 18,£ 10,1 20.1 18.2 7.5 ю ю 10430 Упорядник Замовлення 4014 Техред М.Моргентал Коректор О. Кравцова Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.ГагарІна, 101