Спосіб визначення еметогенних та ентеротоксигенних бацил в харчових продуктах

Реферат: Спосіб визначення еметогенних та ентеротоксигенних бацил в харчових продуктах включає підготування дослідних зразків, відділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо відділених мікроорганізмів, проведення полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів. Безпечність харчових продуктів визначають за наявністю мікроорганізмів групи В. cereus і генів токсичності NHE, HBL і cesB. При визначенні наявності мікроорганізмів групи В. cereus використовують пару праймерів groEL F та groEL R в кількості 0,2-0,3 мкМ. Полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинний відпал при 94-95 °С протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °С протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °С протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °С протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °С протягом 3-5 хв. При визначенні генів токсичності NHE, HBL і cesB використовують пари праймерів nheA F та nheAR; hblDY і hblDR; cesB F і cesB R в кількості 0,15-0,25 мкМ. Мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація мультиплексу при 94-95 °С протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °С протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °С протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °С протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °С протягом 3-5 хв. UA 122752 U (12) UA 122752 U UA 122752 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі гігієнічної безпеки харчових продуктів і продовольчої сировини та екологічної безпеки, а саме до визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь та псування сировини і продуктів. Корисна модель може бути використана в харчовій промисловості, біології, медицині, мікробіології. Відомий спосіб одночасного визначення групи В. cereus за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ШТР), при якому використовують гени gyrB та groEL як діагностичні маркери (S.H.Park, H.J. Kim, J.H. Kim, T.W. Kim, H.Y. Kim, J. Microbiol Biotechnol, - 2007.-17(7). - P.I 1771182.). Аналіз давав амплікін 400 п.о. для гена groEL з усіх бактерій групи В. cereus та 253 п.о. амплікону з В. anthracis, 475 п.о. амплікон з В. cereus, 299 п.о. амплікон з В. thuringiensis та 604 п.о. амплікон від В. mycoides для гена gyrB. Ніякі неспецифічні амплікони не спостерігалися з ДНК з 29 інших патогенних бактерій. Специфічність та чутливість ідентифікації групи В. cereus за допомогою цього мультиплексного ПЛР-аналізу оцінювали за допомогою різних видів зразків харчових продуктів. Запропонована мультиплексна ПЛР є надійним, простим, швидким та ефективним методом одночасної ідентифікації бактерій групи В. cereus з проб харчових продуктів у одній пробі. Цільові гени визначали за допомогою п'яти пар праймерів, а саме однієї пари, що є групоспецифічним праймером (groEL) та чотирьох пар видоспецифічних праймерів (gyrB). Довжина отриманих ампіконів становила 400 п.о., 253 п.о., 299 п.о., 475 п.о., 604 п.о. відповідно. Праймери BCGSH-1 F та BCGSH-1 R утворюють амплікон з 400 п.о. на групу В. cereus, праймери BASH-2F та -2R дали 253 п.о. амплікон з В. anthracis, праймери BTJH-1F та -R дають 299 п.о. амплікон з В. thuringiensis, праймери BCJH-F і 1R дають 475 п.о. амплікон з В. cereus і праймер BMSH-F і -R виробляє амплікон з частотою 604 п.о. з В. mycoides. Первинну денатурацію здійснювали при 94 °C протягом 5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30 с, відпал при 63 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 5 хв. Продукти ПЛР ампліфікації були ідентифіковані за допомогою електрофорезу у 2,5 % агарозному гелі. Недоліком способу є те, що за підібраними умовами можливо визначити не всі мікроорганізми групи В. cereus, а лише 4, для яких підібрані відповідні праймери, а саме, В. cereus, В. thuringiensis, В. mycoides, В. anthracis, тобто неможливо визначити В. pseudomycoides, В. weihenstephanensis, які є представниками цієї групи, і теж здатні продукувати токсини. Крім цього, однозначного висновку щодо можливості визначення ентерота еметичної токсичності виділених бацилярних штамів і використання для моніторингу харчових продуктів не було зроблено. Відомий спосіб визначення мікроорганізмів групи В. cereus, які мають еметичні і нееметичні властивості, які визначають для живих мікроорганізмів за допомогою мультиплексної композиції (Z. Zhang, L. Wang, H. Xu et ol // Food Control, 2014, V. 35, P. 401-406). Детекцію для всіх видів групи В. cereus проводили за специфічними генами: цериулід синтетазного гена (cesB-ген) для еметичних В. cereus та 16S rRNA для еметичних В. cereus. При цьому використовують три пари праймерів (прямий і зворотній) у складі мультиплексної ПЛР. Умови проведення ПЛР: 95 °C, 10 хв.  (95 °C, 30с  50 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 40 циклів  72 °C, 10 хв. До складу суміші ПЛР входили по 0,4 μM cesB, по 0,1 μM 16S rRNA, по 0,25 μM IAC із використанням прямих і зворотних праймерів, по 3 мкл DNA типових штамів, які доводили до 20 мкл сумішшю для ПЛР. Продукти ПЛР ампліфікації були ідентифіковані за допомогою електрофорезу у 2 % агарозному гелі. Продукти електрофорезу ідентифікували при Уф-опроміненні з використанням барвника і відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів. За допомогою трьох пар праймерів cesB, 16S rRNA, IAC були ідентифіковані як належні до еметичних і нееметичних продуцентів мікроорганізми групи B. cereus та інших видів. Тобто, визначення генів токсичності із виключенням псевдопозитивних і псевдонегативних результатів, особливо за наявності значної кількості мікроорганізмів інших груп, досягається за рахунок використання пар праймерів 16S rRNA та І АС під час проведення мультиплексної ПЛР. Недоліком цього способу є використання для детекції лише еметичних видів групи B. cereus, що явно недостатньо для моніторингу токсичності харчових продуктів, оскільки визначення не дуже поширеного cesB-гена є важливим, але недостатнім для висновку про еметичні і нееметичні властивості мікроорганізмів і виключає можливість детекції мікроорганізмів, які викликають діарейний синдром. Найбільш близьким за технічною суттю до запропонованого способу є спосіб виявлення життєздатних В. cereus, які здатні продукувати токсини (Z. Zhang, L. Feng, H. Xu, C. Liu, N.P. 1 UA 122752 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Shah, H. Wei // J. Dairy Sci, 2016. - Vol. 99, № 2. - P. 1-9), згідно з яким здійснюють аналіз токсичності харчових продуктів за допомогою ПЛР із використанням прямих і зворотних праймерів cytK, nheA, nblD. Був використаний типовий штам В. cereus ATCC14579, як ентеротоксинпозитивний мікроорганізм, що продукує три ентеротоксичні гени - cytK, nheA, hblD, який культивували за 37 °C на поживному середовищі протягом ночі. Після цього розділяли живі та мертві клітини обробкою пропідіум моноазідом (ПМА). Геномну ДНК лише живих бактерій екстрагували 3 наступним чином: 1 см зразка центрифугували при 12000 g, 2 хв. при 4 °C і суспендували стерильною водою, з використанням спеціального набору реактивів (Kit, Qiagen, China) згідно інструкції. Очищену мікробну ДНК зберігали при мінус 20 °C для подальшого використання. Для мультиплексної ПЛР використовували загальний об'єм 20 мкл. До складу ПЛР системи включали: 3 мкл геномної ДНК, 10 мкл суміші 2×Taq (Novoprotein Scientific Inc, China), no 0,175 мкМ прямого та зворотного cytK праймера, по 0,25 мкМ прямого та зворотного nheA праймера, по 0,2 мкМ прямого та зворотного hblD праймера. Стерильною дистильованою водою доводили до 20 мкл, 2 мкл використовували для дослідження. Умови проведення ПЛР: початковий цикл 10 хв, 95 °C, наступні 35 циклів денатурації при 95 °C по 30 с (17,5 хв), ампліфікація при 52,2 °C 30 с, елонгація 72 °C 30 с, фінальна елонгація 72 °C 10 хв. Після ПЛР продукти ампліфікації були ідентифіковані за допомогою електрофорезу у 2 % агарозному гелі при Уф-опроміненні з використанням GoldView (China) барвника і відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів. 3 Зразки продуктів інокулювали 22 КУО/г В. cereus ATCC14579 і змішували з 225 см поживного середовища і гомогенізували 2 хв та залишали для накопичення культури при 37 °C на 2-5 год. Після цього перемішували, додатково вводили інші збудники харчових отруєнь (колекційні культури St. aureus та Salmonella enteritidis), які інкубували окремо. Зразки центрифугували при 900×g, 1 хв. при 4 °C для видалення великих шматків продуктів, повторно центрифугували при 12000×g, 5 хв. при 4 °C. Після двократного промивання і суспендування у стерильній воді геном ДНК був екстрагований після попередньої обробки пропідіум моноазидом (ПМА), а потім підданий аналізу з використанням ПМА-мультиплекс ПЛР. Цей спосіб вибрано прототипом. Прототип і корисна модель, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - підготування дослідних зразків; - відділення мікроорганізмів з дослідних зразків; - виділення геномів ДНК з відділених мікроорганізмів; - проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів; - електрофорез продуктів мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів. Але спосіб за прототипом має наступні недоліки: - використання мультиплексної композиції лише для живих мікроорганізмів не є достатньо показовим, оскільки токсини можуть перейти до сировини і продуктів із загиблих бактерій; - не дає змоги одночасного виявлення мікроорганізмів, які належать до групи В. cereus і здатні продукувати токсини; - не може комплексно характеризувати безпечність та якість продукту відносно наявності бацилярних контамінантів, оскільки спосіб дозволяє визначити їх лише частково. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь, в якому шляхом проведення ПЛР, які включають після підготовки зразків генів проведення ПЛР в системі, що містить геноми декількох мікроорганізмів, а також використання визначених пар праймерів та інших умов проведення ПЛР, забезпечити підвищення достовірності отриманих результатів та визначення одночасно мікроорганізмів, які належать до групи В. cereus, a також можливість комплексно характеризувати безпечність та якість продукту відносно наявності бацилярних збудників харчових отруєнь. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення еметогенних та ентеротоксигенних бацил в харчових продуктах, що включає підготування дослідних зразків, відділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо відділених мікроорганізмів, проведення полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів, згідно з корисною моделлю, безпечність харчових продуктів визначають за наявністю мікроорганізмів групи В. cereus і генів токсичності NHE, HBL і cesB, при 2 UA 122752 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цьому при визначенні наявності мікроорганізмів групи В. cereus використовують пару праймерів groEL F та groEL R в кількості 0,2-0,3 мкМ, а полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинний відпал при 94-95 °C протягом 3-5 хв, далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв, а при визначенні генів токсичності NHE, HBL і cesB використовують пари праймерів nheA F та nheA R; hblD F і hblDR; cesB F і cesB R в кількості 0,15-0,25 мкМ, а мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація мультиплексу при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом можна пояснити наступним. При використанні мультиплексної композиції з великою кількістю праймерів можливо отримання псевдепозитивного або псевдонегативного результату внаслідок утворення продуктів неспецифічної ампліфікації або часткової інактивації полімерази та виснаження праймерів, що приймають участь в реакції. Можливі також зміни структури зразків генів під впливом високої температури, крім того підвищена температура може призвести до повної руйнації зразка, утворення значної кількості фрагментів, які можуть заважати проведенню дослідження, а як наслідок - псевдонегативний або псевдопозитивний результат. Діарейний синдром спричиняється потраплянням вегетативних клітин В. cereus, які в тонкому кишечнику продукують комплекс ентеротоксинів: - гемолізину HBL, що кодується hb1A, hb1C, hb1D; - негемолітичного ентеротоксину NHE, що кодується nheA, nheB, nheC; цитотоксину К (Cyt К) - некротичного ентеротоксину, який представлено простим білком у двох формах Cyt K-1 і Cyt K-2, які кодуються відповідними генами Cyt K-1 і Cyt К-2; простого білка ентеротоксину Т (bc-D-ENT) та ентеротоксину FM. Еметичний синдром спричиняється потраплянням вже сформованого еметичного токсину (цереуліду), який може бути присутній в борошняних продуктах. Еметичний токсин дуже стійкий (витримує 126 °C, 90 хв) і кислотостійкий (рН 2-11). Симптомами отруєння є нудота і блювота через 1-5 годин після потрапляння. В той же час, необхідності ідентифікування цереуліду немає, оскільки типові культури збудників отруєнь (Bacillus cereus ATCC 11778; В. cereus АТСС 14579) його не синтезують, в той же час діарейно-токсичні гени ними виробляються і найбільш показовим із генів токсичності є nheABC (Jung-Beom Kim, Jai-Moung Kim, Cheon-Hyeon Kim, Kyu Seok Seo, Yong-Bae Park, Na-Jung Choi, Deog-Hwan Oh Emetic toxin producing Bacillus cereus Korean isolates contain genes encoding diarrheal-related enterotoxins // Int. J. of Food Microbiology. 2010. - V. 144. -P. 182-186). Hb1 складається з трьох протеїнів L2, L1 і В, що кодуються генами hblC, hb1D, hb1A відповідно і локалізовані в одному опероні. NHE у своєму складі також містить три протеїни NheA (41 кДа), NheB (39 кДа), NheC(40 кДа), які кодуються одним nheABC опероном, що містить три гени nheA, nheB, nheC відповідно. Відомо, що гідрофобні сіквенси NheB і Hb1D більш довгі (£60 залишків), ніж аналогічні в NheC і Нb1В. Це може бути пов'язано з тим, що NheB і Hb1D сіквенси можуть формувати два трансмембранних хелікса і проходити в прямому і зворотному напрямі через мембрани. NheA необхідний для кінцевого етапу при лізисі клітин, тому він вважається найважливішим і саме тому він був вибраний для досліджень. Nhe комплекс пороутворюючого токсину є найбільш важливим в діарейних харчових отруєннях, представлених в ізолятах мікроорганізмів із зразків харчових продуктів, що викликали отруєння. NHE продукування у В. cereus є найбільш розповсюдженим і виявляється практично у всіх ізолятах - від 92 до 100 %. Група В. cereus, яка включає генетично близькі мікроорганізми визначається за допомогою цільового гена groEL, що кодується праймерами BCGSH (Simultaneous Detection and Identification of Bacillus cereus group Bacteria Using Multiplex PCR/ Park, Si-Hong, Hyun-Joong Kim, Jae-Hwan Kim, Tae-Woon Kim, Hae-Yeong Kim// J. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - № 17(7). - P. 1177-1182). При цьому використовують п'ять пар праймерів і визначають мікроорганізми групи за допомогою мультиплексної ПЛР. Відомо, що токсичність харчових зразків, обумовлена збудниками бацилярних отруєнь, виявляють не тільки споріднені види, об'єднані в Bacillus cereus group, - Bacillus anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. pseudomycoid.es, B. thuringiensis і В. weihenstephanensis, - а й інші представників роду Bacillus, зокрема в Paenibacillus cookii, тому важливо з'ясувати не тільки наявність регламентованих мікроорганізмів, але й потенційну токсичність зразків завдяки присутності носіїв генів токсичності. 3 UA 122752 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Всього було використано 3 пари видоспецифічних та одна пара групоспецифічних праймерів: - nhe A-F (довжина 17), nhe A-R (довжина 19) для ентеротоксигенного гена nhe А, який характерний для усіх ентеротоксигенних представників виду Bacillus cereus; - hb1DF (довжина 20) і hblDK (довжина 18) для визначення діарейного ентеротоксину; - cesB F (довжина 17) і cesB R (довжина 19) для визначення еметичного токсину; - groEL F (довжина 21) і groEL (довжина 20) для визначення групоспецифічного гена В. cereus. Підвищення чутливості і достовірності досягається за рахунок визначення складу використаних пар праймерів (на групу В. cereus groEL F і groEL R і при проведенні мультиплексної ПЛР nhe AF та nhe AR; hb1DF і hb1DR; cesB F і cesB R), що дозволяє не тільки збільшити специфічність отримуваних ПЛР-продуктів, але й отримати однозначні результати щодо токсичності харчових продуктів. Спрощення відбувається за рахунок використання одного режиму і однієї мультиплексної ПЛР для всієї групи В. cereus (ПЛР на groEL), крім того використані параметри дозволяють скоротити час дослідження. Технічним результатом даного способу є: - швидке визначення токсичності бацилярних потенційних збудників харчових отруєнь; - підвищення достовірності отриманих результатів завдяки визначенню умов відпалу та кількості проведення циклів реплікації ПЛР; - спрощення процесу визначення мікроорганізмів групи В. cereus, здатних продукувати гени токсичності; - зменшення часу проведення досліджень; - можливість здійснення визначення під час скринінгових досліджень не лише мікроорганізмів групи В. cereus, здатних продукувати гени токсичності, а й інших бацилярних продуцентів мікробних токсинів. Спрощення досягається за рахунок: - можливості одночасного виявлення мікроорганізмів групи В. cereus, здатних продукувати гени токсичності; - використання трьох пар праймерів (пара - прямий - F і зворотній - R), причому nhe A F і nheA R, hb1D F і hb1D R, cesB F і cesB R реагують на наявність відповідних генів токсичності (hb1, nhe, ces) та групоспецифічної пари праймерів groEL F і groEL R; - використання визначених параметрів відпалу (для генів токсичності t 51-56 °C, т - час 30 с, на групу В. cereus 162-65 °C, т - час 30 с); - зменшення кількості циклів реплікації до 30. Потенційна токсичність зразків харчових продуктів, що може бути встановлена запропонованим способом, визначається якісно, оскільки сама наявність в продукті мікроорганізмів групи В. cereus, з'ясована за допомогою groEL вже свідчить про можливу небезпеку для здоров'я, оскільки генетично запрограмованою особливістю В. cereus є здатність виділяти комплекс характерних токсинів, відповідальних за прояв діарейного та еметичного синдромів. А використання у складі композиції праймерів на гени токсичності Hb1 і Nhe дозволяє за допомогою однієї мультиплексної ПЛР підтвердити небезпеку харчових продуктів внаслідок їх наявності. Для імітації інфікування і пошуку генів токсичності бактерій групи В. cereus в зразках консервованої продукції використали типові і колекційні штами мікроорганізмів з колекції культур кафедри мікробіології, вірусології і біотехнології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова і Одеської національної академії харчових технологій, а саме: - Bacillus cereus ATCC 11778; - В. cereus ATCC 14579. Неочевидним є можливість дати сигнал про токсичність, навіть не прив'язуючись до виду мікроорганізму, без уточнення комплексу його морфологічних, тінкторіальних, біохімічних і інших хемотаксономічних властивостей і генетичних особливостей, визначуваних при ідентифікації виду. Таким чином за генами токсичності навіть неустановлених видів мікроорганізмів можливо мати сигнал про токсичність, а також визначати безпечність або наявність токсичності харчових продуктів. Для виявлення чутливості ПЛР при ідентифікації ентеротоксигенних бактерій групи В. cereus були застосовані ряд десятиразових розведень суміші добових культур штамів В. cereus (В. cereus ATCC 11778, В. cereus ATCC 10702, В. cereus УКМ В 5650, В. cereus УКМ В 5671) в рідині з консервованої продукції. Усі застосовані розведення були протитровані для виявлення кількості КУО в рідині. 4 UA 122752 U 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2 3 4 5 6 7 Вивчалися наступні концентрації бацил в рідині з консервів: 10 ,10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 3 10 КУО/см . Точне визначення контамінації мікроорганізмами досягається вже при розведенні 10 КУО/см. Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Склад суміші для проведення ПЛР: 10×ПЛР буфер - 2 мкл, 50 мМ MgCl2-0,8 мкл, 2,5 мМ дНТФ - 1,6 мкл, Taqполімераза (5 Од/мкл) - 0,4 мкл. Очищену мікробну ДІЖ зберігали при мінус 20 °C для подальшого використання. Цикли ПЛР: для визначення групи В. cereus за допомогою groEL F і groEL R, використовували наступні параметри ПЛР: первинний відпал при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв; для визначення наявності токсиноутворюючих генів мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію з прямими та зворотними праймерами до генів nheA, hblD та cesB здійснювали за наступних умов: первинна денатурація для мультиплексу, що складався з nheAY і nheAR; hblDY і hb1DR, cesBF і cesBR при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. Стерильною дистильованою водою доводили до 20 мкл, по 2 мкл використовували для дослідження. Як негативний контроль використали деіонізовану воду для контролю чистоти реактивів. Візуальну оцінку розміру утворених ампліконів проводили з використанням маркерів молекулярної маси. Електрофорез продуктів ПЛР з використанням відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів проводили в агарозному гелі з масовою концентрацією агарози 1,5-2 %. ДНК 3 забарвлювали бромистим етидієм (0,5 мкг/см ) і фотографували гель відеосистемою (BioRad, США) під УФ-опроміненням (довжина хвилі 312 нм). Для розробки способу визначення еметогенних та ентеротоксигенних бацил в харчових продуктах внаслідок наявності потенційних збудників харчових отруєнь бацилярної природи моделювали інфікування штамами В. cereus з колекцій культур кафедри біохімії, мікробіології та фізіології харчування ОНАХТ і мікробіології, вірусології та біотехнології ОНУ імені І.І. Мечникова, а також штамами бацил, ізольованих з промислово поширених в Україні видів рослинної сировини і продуктів їх переробки. Зразки консервів та рослинної сировини було інокульовано 8 добовою культурою кожного із тест-штамів (~10 КУО) у співвідношенні 1:1. Для видалення залишків органічних речовин здійснювали попередню обробку проб рослинної продукції центрифугуванням 1-3 хв. при 900-3000 об/хв… та подальшу фільтрацію через нітроцелюлозні мембранні фільтри "Millipore" d 0,22 мкм або повторне центрифугування протягом 3-5 хв. при 7000-9000 об/хв. Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Далі геноми мікробних ДНК піддавали аналізу з використанням мультиплексної ПЛР. Запропонований спосіб дозволяє швидко виявити потенційно небезпечні об'єкти, які містять контамінанти мікробіологічного походження, що важливо для визначення безпечності харчових продуктів і продовольчої сировини та безпеки екології людини, а також моніторингу якості харчових систем. Спосіб здійснюється в наступному порядку. 1. Підготовка дослідного зразка. Дослідний зразок готують шляхом змивання зі свіжої сировини (овочі, фрукти, інші плоди) або шляхом її подрібнення і центрифугування для відділення шматків сировини. 2. Відділення мікроорганізмів. Змив або надосадову рідину фільтрують через нітроцелюлозні мембранні фільтри, наприклад, "Millipore", що затримують мікроорганізми або повторно центрифугують 3-5 хв. при 7000-9000 об/хв. 3. Виділення геномів ДНК мікроорганізмів. 3 До фільтра з виділеними мікроорганізмами додають 1 см лізуючого буферу для розчинення 3 клітинних стінок мікроорганізмів, або осад з мікроорганізмами ресуспендують в 1 см лізуючого буферу. Далі виділення геномів мікроорганізмів проводять згідно з інструкцією до набору F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). 8 5 UA 122752 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4. Проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції. Готують систему загальним об'ємом 20 мкл, яка містить 3-5 мкл геномів ДНК виділених мікроорганізмів, 10 мкл суміші для проведення ПЛР: 10× ПЛР буфер (реакційний буфер для проведення ампліфікації, оптимізований для високоспецифічної ПЛР, позначення 10× - коефіцієнт розведення іншими компонентами реакційної суміші, що вносяться) 2 мкл, розчин MgCl2 з молярною концентрацією 0,05 моль/л - 0,8 мкл, розчин дНТФ з молярною концентрацією 0,0025 моль/л - 1,6 мкл, розчин Taq-полімерази з ферментативною активністю 5 Од/мкл - 0,4 мкл (усі реагенти фірми Fermentas, Латвія). Далі готують дві проби: в одну додають дві пари прямих та зворотних праймерів, а саме: nheA F-nheA R, hb1D F-hb1D R, cesB F-cesB R no 0,15-0,25 мкМ, в другу додають groEL F-groEL R no 0,2-0,3 мкМ. Стерильною водою доводять до 20 мкл. З отриманих систем відбирають по 2 мкл, які використовують для подальшого проведення полімеразної ланцюгової реакції. Для nheA, hblD та cesB спочатку проводять первинну денатурацію при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, потім здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. Для groEL первинний відпал при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. 5. Електрофорез продуктів мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції. Електрофорез здійснюють з використанням відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів в агарозному гелі з масовою концентрацією 1,5-2,0 %. ДНК забарвлюють бромистим етидієм 3 (0,5 мкг/см ) і фотографують гель відеосистемою, наприклад BioRad (США) під УФопроміненням при Х=312нм. За результатами електрофорезу по електрофореграмі визначають наявність або відсутність регламентованих мікроорганізмів. Умови проведення та результати наведені в таблиці та на фіг. 1, 2. На фіг. 1 зазначено: електрофореграма продуктів ПЛР, виділених з рослинної сировини і консервів, зі специфічними олігонуклеотидними праймерами на групу B. cereus: 1. 400 п.о. на групу B.cereus (позитивний контроль nagroEL); 2. негативний результат (зразок з груші, відсутня смуга на 400 п.о.); 3. позитивна реакція на groEL (зразок з картоплі); 4. позитивна реакція на groEL (зразок "Суп гороховий з беконом"); 5. позитивна реакція на groEL (зразок консервів "Ікра з баклажанів"); 6. позитивна реакція на groEL (зразок консервів "Зелений горошок"); 7. позитивна реакція на groEL (зразок "Ікра кабачкова"); 8. позитивна реакція на groEL (зразок "Ікра кабачкова"); 9. позитивна реакція на groEL (зразок "Перець у томатній заливці"); 10. 400 п.о. на групу B. cereus (позитивний контроль на groEL – типова культура B. cereus АТСС 11778); 11. маркер молекулярної маси (pBR322/BsuRI, Fermentas)$ 12. негативний контроль ПЛР. На фіг. 2 зазначено: електрофореграма продуктів мультиплексної ПЛР: 1. 154 п.о., 485 п. о., 617 п. о. (позитивний контроль на гени токсичності cesB, HBL і NHE відповідно); 2. негативний результат груші, відсутні смуги 154 п.о., 485 п. о., 617 п. о.); 3. негативний результат на cesB і HBL, позитивний на NHE (зразок з картоплі - відсутні смуги 154 п.о. і 485 п. о.); 4. негативний результат на cesB і HBL, позитивний на NHE (зразок "Суп гороховий з беконом" - відсутні смуги 154 п.о. і 485 п. о.); 5. позитивна реакція HaNHE і HBL (зразок "Ікра з баклажанів" негативний результат на cesB - відсутня смуга 154 п.о.); 6. позитивна реакція на cesB і NHE, негативна на HBL - відсутня смуга 485 п. о. (зразок "Аджика лагідна по-болгарськи"); 7. позитивний результат на NHE, негативний результат на cesB і HBL - відсутні смуги 154 п.о. і 485 п. о. (зразок консервів "Зелений горошок"); 6 UA 122752 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8. позитивна реакція на NHE і HBL, негативний результат на cesB - відсутня смуга 154 п.о. (зразок "Ікра кабачкова", контамінований культурою В. cereus ATCC 11778); 9. позитивна реакція на NHE і HBL, негативний результат на cesB - відсутня смуга 154 п.о. (зразок "Перець у томатній заливці", контамінований культурою В. cereus ATCC 11778) 10. модельний зразок типова культура В. cereus ATCC 11778 485 п. о., 617 п. о. (позитивний контроль на гени токсичності HBL i NHE відповідно, негативний на cesB - відсутня смуга 154 п.о.); 11. маркери молекулярної маси (pBR322 / BsuRI, Fermentas); 12. негативний контроль ПЛР. Приклади, які ілюструють здійснення способу. Приклад 1. Об'єкт дослідження - груша. Сировину подрібнювали, перемішували зі стерильною водою при співвідношенні 1:1, потім для видалення залишків органічних речовин здійснювали центрифугування 3 хв. при 1500об/хв…, далі здійснювали фільтрацію через нітроцелюлозні мембранні фільтри "Millipore" d 0,22 мкм. Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Далі геноми мікробних ДНК піддавали ПЛР аналізу: брали дві проби на визначення групи В. cereus та на наявність токсиноутворюючих генів, зокрема ентеротоксинів і еметичного токсину. Відсутність смуг на електрофореграмах свідчить про відсутність представників групи В. cereus та генів токсичності nhe, hb1 та cesB. Приклад 2. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але як досліджувану сировину брали картоплю, робили змиви стерильною водою, здійснювали центрифугування 2 хв. при 2000 об/хв. для видалення твердих залишків, наявних у змивних водах, потім - повторне центрифугування протягом 2 хв. при 9000 об/хв. для осадження мікрорганізмів. Аналіз ПЛР проводили аналогічно прикладу 1. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 2), фіг. 1, 2 (смуга 3). З електрофореграми видно, що знайдені продукти ампліфікації розмірами 400 п. о. (наявність групи В. cereus) і 617 п. о. (ген токсичності nhe). Приклад 3. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але досліджували харчоконцентрати, а саме, "Суп гороховий з беконом", змішували зі стерильною водою у співвідношенні 1:2, здійснювали центрифугування 4 хв. при 1500 об/хв… для видалення твердих залишків харчоконцентратів, потім - повторне центрифугування протягом 2 хв. при 9000 об/хв. Аналіз ПЛР проводили аналогічно прикладу 1. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 3), фіг. 1, 2, (смуга 4 на фіг. 1, 2). З даних електрофорезу на фіг. 1, 2 видно, що знайдені продукти ампліфікації розмірами 400 п. о. і 617 п. о. (наявні мікроорганізми групи В. cereus та ген токсичності nhe відповідно). Приклади 4-6 ілюструють дослідження наявності мікроорганізмів групи В. cereus в різних консервованих продуктах з ознаками псування. Умови проведення ПЛР і результати наведені в таблиці та на фіг. 1, 2. Приклад 4. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але досліджували консерви з ознаками псування "Ікра з баклажанів". Наважку змішували зі стерильною водою у співвідношенні 1:2, здійснювали центрифугування 3 хв… при 2000 об/хв… для видалення твердих залишків консервів, потім - повторне центрифугування протягом 2 хв. при 9000 об/хв. Аналіз ПЛР проводили аналогічно прикладу 1. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 4), фіг. 1, 2 (смуга 5). З даних електрофорезу на фіг. 2 видно, що знайдені продукти ампліфікації розмірами 400 п. о., 465 п. о. і 617 п. о. (наявні мікроорганізми групи В. cereus та гени токсичності hbl і nhe відповідно), тобто продукція є токсичною. Приклад 5. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але досліджували приправу, а саме "Аджику лагідну по-болгарськи". Наважку змішували зі стерильною водою у співвідношенні 1:2, здійснювали центрифугування 4 хв при 1500об/хв… для видалення твердих залишків, потім повторне центрифугування протягом 2 хв при 9000 об/хв. Аналіз ПЛР проводили аналогічно прикладу 1. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 5), фіг. 1, 2, (смуга 6 на фіг. 1, 2). З даних електрофорезу на фіг. 1, 2 видно, що знайдені продукти ампліфікації розмірами 400 п. о., 154 п. о. і 617 п. о. (наявні мікроорганізми групи В. cereus та еметичний ген токсичності cesB і nhe відповідно). Продукція є токсичною і не придатна до вживання. Приклад 6. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але об'єкт дослідження - консервований горошок з ознаками псування. Зразок центрифугували 2 хв при 1500 об/хв… для видалення 3 залишків органічних речовин. Потім 5 см рідини фільтрували крізь мембранні фільтри 7 UA 122752 U 5 10 15 20 25 30 35 40 нітроцелюлози "Millipore" d 0,22 мкм. Фільтр після фільтрації використали для виділення ДНК з використанням експрес-набору, як в попередніх прикладах. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 6), та на фіг. 1, 2 (смуга 7). Приклади 7, 8 ілюструють дослідження наявності мікроорганізмів групи В. cereus на консервованій продукції, модельно контамінованій В. cereus. Приклад 7 ілюструє дослідження наявності мікроорганізмів групи В. cereus на консервованій продукції "Ікра кабачкова", модельно контамінованій В. cereus. Виділення геномів мікроорганізмів проводили згідно інструкції до набору F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Очищену мікробну ДНК зберігали при мінус 20 °C для подальшого використання. ПЛР здійснювали аналогічно прикладу 1. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 7), та на фіг. 1, 2 (смуга 8). На електрофореграмі наявні смуги, які відповідають визначеним ампліконам розмірами 400 п. о., 465 п. о., 617 п. о., тобто зразок містить мікроорганізми групи В. cereus, гени токсичності hbl і nhe відповідно - продукція є токсичною. На фіг. 1 наведена смуга 12 - негативний контроль на чистоту реактивів. Приклад 9 ілюструє дослідження наявності генів мікроорганізмів групи В. cereus, а саме, ентеротоксигенного гена nhe А, діарейного ентеротоксину hb1D, еметичного гена cesB та groEL для визначення групової приналежності до В. cereus. Для дослідження брали типову культуру В. cereus ATCC 11778. Для визначення групової приналежності мікроорганізмів до В. cereus використали прямий і зворотній праймери: groEL F BCGSH-1F 5'- GTGCGAACCCAATGGGTCTTC-3' groEL R BCGSH-1R 5'- CCTTGTTGTACCACTTGCTC-3' довжина амплікону склала 400 п.о. Для визначення діарейного ентеротоксину HBL використали: hblDY 5'-GTTAGATACAGCGAAGCCAC-3' hblD R 5'-CCGCCAGTTACAACAATA-3' довжина амплікону склала 465 п.о. Для визначення наявності ентеротоксигенного гена NHE використали: nheA F 5'-AGGTAAATGCGATGAGTAG-3' nheA R 5'-TTGTTGAATGCGAAGAG-3'. Довжина отриманого амплікону склала 617 п.о. Для визначення наявності еметичного гена використали: cesB F 5'-ACCCATCTTGCGTCATT-3' cesB R 5'-CAGCCAAGTGAAGAATACC-3' Довжина отриманого амплікону склала 154 п.о. Умови проведення ПЛР та результати наведені в таблиці та на фіг. 1, 2 наведених результатів видно, що в зразку наявні мікроорганізми групи В. cereus (фіг. 1) та гени токсичності NHE і HBL (фіг. 2, смуга 10). Для порівняння наведені маркери молекулярної маси (смуга 11). На фіг. 2 наведена смуга 12 - негативний контроль на чистоту реактивів. Таблиця Результати ПЛР дослідження наявності генів токсичності бацилярних мікроорганізмів в зразках харчових продуктів № з/п 1 Досліджувані зразки груші Умови проведення циклів ПЛР Параметри реакції 1 94 °C, 4 хв.  (94 °C, 30 с  62 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 5 хв. Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв.  (94 °C, 60 с  54 °C, 30 с 72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 5 хв. 8 Вид гена groEL cesB hblD nheA UA 122752 U Продовження таблиці Результати ПЛР дослідження наявності генів токсичності бацилярних мікроорганізмів в зразках харчових продуктів № з/п Досліджувані зразки Умови проведення циклів ПЛР Параметри реакції 1 95 °C, 5 хв.  (94 °C, 60 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  64 °C, 30 с  72 °C, 4 хв. 2 картопля Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв.  (94 °C, 30с  54 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 4 хв. Параметри реакції 1 94 °C, 3 хв.  (94 °C, 60 с  65 °C, 30 с харчоконцентрати 72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 5 хв. 3 "Суп гороховий з Параметри реакції 2 беконом" 94 °C, 5 хв.  (94 °C, 60 с  55 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 5 хв. консерви з ознаками псування Параметри реакції 1 94 °C, 3 хв.  (94 °C, 60 с  64 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 3 хв. "Ікра з 4 баклажанів" Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв.  (94 °C, 30с  54 °C, 30с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 4 хв. Параметри реакції 1 95 °C, 3 хв.  (94 °C, 60 с  62 °C, 60 с  "Аджика лагідна 72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 4 хв. 5 по-болгарськи" Параметри реакції 2 95 °C, 3 хв.  (94 °C, 30 с  51 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 4 хв. Параметри реакції 1 95 °C, 3 хв.  (94 °C, 60 с  64 °C, 60 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 3 хв. "Зелений 6 горошок" Параметри реакції 2 94 °C, 3 хв.  (94 °C, 30 с  52 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 4 хв. зразки, контаміновані мікроорганізмами Параметри реакції 1 94 °C, 5 хв.  (94 °C, 60 с  63 °C, 60 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 4 хв. 7 "Ікра кабачкова" Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв.  (94 °C, 30с  53 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 4 хв. Параметри реакції 1 94 °C, 5 хв.  (94 °C, 60 с  63 °C, 30 с  "Перець у 72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 4 хв. 8 томатній заливці" Параметри реакції 2 95 °C, 5 хв.  (94 °C, 30с  53 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 5 хв. 9 Вид гена groEL cesB hblD nheA + + + + + + + + + + + + + + + + + + UA 122752 U Продовження таблиці Результати ПЛР дослідження наявності генів токсичності бацилярних мікроорганізмів в зразках харчових продуктів № з/п 9 5 10 15 20 Досліджувані зразки Модельний зразок типова культура В. cereus АТСС 11778 Умови проведення циклів ПЛР Параметри реакції 1 95 °C, 5 хв.  (94 °C, 60 с  63 °C, 30 с 72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 5 хв. Параметри реакції 2 95 °C, 5 хв.  (94 °C, 60 с  54 °C, 30 с  72 °C, 30 с) 30 циклів  72 °C, 5 хв. Вид гена groEL cesB hblD + + nheA + ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення еметогенних та ентеротоксигенних бацил в харчових продуктах, що включає підготування дослідних зразків, відділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо відділених мікроорганізмів, проведення полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів, який відрізняється тим, що безпечність харчових продуктів визначають за наявністю мікроорганізмів групи В. cereus і генів токсичності NHE, HBL і cesB, при цьому, при визначенні наявності мікроорганізмів групи В. cereus використовують пару праймерів groEL F та groEL R в кількості 0,2-0,3 мкМ, а полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинний відпал при 94-95 °С протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °С протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °С протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °С протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °С протягом 3-5 хв., а при визначенні генів токсичності NHE, HBL і cesB використовують пари праймерів nheA F та nheAR; hblDY і hblDR; cesB F і cesB R в кількості 0,15-0,25 мкМ, а мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація мультиплексу при 94-95 °С протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °С протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °С протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °С протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °С протягом 3-5 хв. 25 10 UA 122752 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 11