Спосіб зменшення вмісту насичених жирних кислот

Реферат: Винахід належить до виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить генний регуляторний елемент, функціонально зв’язаний з полінуклеотидом, який кодує фермент дельта-9десатуразу. Також винахід належить до способу зменшення процентного вмісту насичених жирних кислот в рослинних або дріжджових клітинах, який включає трансформацію клітин UA 115302 C2 (12) UA 115302 C2 молекулою нуклеїнової кислоти, що містить генний регуляторний елемент, функціонально зв’язаний з полінуклеотидом, який кодує фермент дельта-9-десатуразу. UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Претендування на пріоритет Дана заявка являє собою часткове продовження заявки U.S.S.N. 11/576750, яка одночасно розглядається, яка являє собою переведення в національну фазу міжнародної патентної заявки PCT № PCT/US05/36052, поданої 7 жовтня 2005 року, призначеної для Сполучених Штатів Америки і опублікованої англійською мовою у вигляді міжнародної публікації PCT № WO 2006/042049 A2 20 квітня 2006 року. Міжнародна патентна заявка PCT № PCT/US05/36052 є продовження попередньої патентної заявки США № 60/617532, поданої 8 жовтня 2004 року. Дана заявка також є продовженням попередньої патентної заявки США № 61/358314, поданої 24 червня 2010 року. Галузь техніки Деякі втілення в основному стосуються конкретних ферментів дельта-9-десатураз, нуклеїнових кислот, які кодують вказані ферменти, а також способів їх експресії в рослинній клітині. Деякі втілення стосуються застосування активності конкретних ферментів дельта-9десатураз з метою зменшення процентного складу насичених жирних кислот в рослинних матеріалах (наприклад, в насінні) і збільшення процентного складу ω-7 жирних кислот. У цьому документі також розкриваються рослини і рослинні матеріали, отримані за допомогою способів, розкритих в конкретних втіленнях. Рівень техніки Рослинні олії поступово замінюють тваринні масла і жири як основне джерело жиру, яке поглинається в раціоні. Однак в більшості розвинених країн споживання насичених жирів складає приблизно від 15% до 20% від загального споживання калорій. Міністерство сільського господарства США останнім часом рекомендує для досягнення здорового способу життя знизити рівень насичених жирів менше ніж до 10% від щоденного споживання калорій. Щоб забезпечити інформованість споживача, посібники по маркуванню, які випускаються в наш час USDA, присвоюють продуктам, в яких загальний вміст насичених жирних кислот складає менше 1,0 г на 14 г, маркування "низький вміст насичених жирних кислот" ("low-sat"), а продуктам, в яких загальний вміст насичених жирних кислот складає менше 0,5 г на 14 г, маркування "відсутність насичених жирних кислот" ("no-sat"). Це означає, що рослинні олії повинні містити менше 7% і 3,5% насичених жирних кислот для отримання маркування "low-sat" або "no-sat", відповідно. З часу опублікування вказаного посібника стався стрибок в споживчому попиті на "low-sat" і "no-sat" олії. У цей час вказаний попит задовольняється, в основному, олією каноли і, в набагато меншій мірі, соняшниковою і сафлоровою оліями. На відміну від насичених і транс-жирів ненасичені жири (мононенасичені і поліненасичені) є корисними (особливо при помірному споживанні). Насичені жири і транс-жири спричиняють підвищення рівня небажаного LDL-холестерину в крові. Присутній в їжі холестерин також призводить до підвищення рівня LDL-холестерину і може робити внесок в розвиток хвороби серця, навіть якщо рівень LDL не підвищується. Таким чином, для дотримання здорової дієти рекомендують вибирати їжу з низьким рівнем насиченого жиру, транс-жиру і холестерину. Характеристики олій рослинного або тваринного походження переважно визначаються числом атомів вуглецю і водню в молекулі олії, а також числом і положенням подвійних зв'язків в ланцюгу жирної кислоти. Більша частина рослинних олій містить різні кількості пальмітинової (16:0), стеаринової (18:0), олеїнової (18:1), лінолевої (18:2) і ліноленової (18:3) жирних кислот. Традиційно пальмітинову і стеаринову кислоти називають "насичені", оскільки їх вуглецеві ланцюги насичені атомами водню і, отже, не містять подвійні зв'язки; вони містять максимально можливе число атомів водню. Жирнокислотні ланцюги олеїнової, лінолевої і ліноленової кислот містять 18 атомів вуглецю і один, два або три подвійних зв'язки, відповідно. Олеїнову кислоту звичайно розглядають як мононенасичену жирну кислоту, тоді як лінолева і ліноленова кислоти являють собою поліненасичені жирні кислоти. Відповідно до U.S.D.A. маркування масляних продуктів "no sat" стосується продуктів, в яких загальний вміст насичених жирних кислот складає менше 3,5% за масою (відносно загальної маси жирних кислот). Олія каноли має найнижчий рівень насичених жирних кислот серед всіх рослинних олій. "Канолу" відносять до ріпакового насіння (Brassica), в якому вміст ерукової кислоти (C22:1) складає максимум 2% відносно загальної маси жирних кислот в насінні (переважно максимум 0,5% за масою, найбільш переважно, практично 0% за масою), і яке дає, після подрібнення і повітряного сушіння борошно, яке містить менше 30 мкмоль/г знежиреного (яке не містить олії) борошна. Вказані типи ріпакового насіння відрізняються за придатністю до вживання в їжу від більш традиційних різновидів. Передбачають, що в олійному насінні синтез жирних кислот відбувається переважно в пластидах. Основним продуктом жирнокислотного синтезу є пальмітат (16:0), який ефективно подовжується з отриманням стеарату (18:0). Все ще залишаючись в пластиді, насичені жирні 1 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кислоти можуть потім піддаватися десатурації під дією ферменту, відомого як ацил-АСР дельта9-десатуразу, з введенням одного або декількох вуглець-вуглецевих подвійних зв'язків. А саме, стеарат може піддаватися швидкій десатурації під дією пластидного ферменту дельта-9десатурази з отриманням олеату (18:1). Фактично пальмітат також може піддаватися десатурації з отриманням пальмітоолеату (16:1) під дією пластидної дельта-9-десатурази, однак в більшості рослинних олій дана жирна кислота присутня тільки в слідових кількостях (00,2%). Таким чином, основними продуктами жирнокислотного синтезу в пластиді є пальмітат, стеарат і олеат. У більшості олій основною синтезованою жирною кислотою є олеат, оскільки насичені жирні кислоти присутні в набагато більш низьких пропорціях. Синтезовані жирні кислоти експортуються з пластиди в цитоплазму. Подальша десатурація рослинних жирних кислот в цитоплазмі, ймовірно, обмежується олеатом, який може піддаватися десатурації з отриманням лінолеату (18:2) і ліноленату (18:3) під дією мікросомальних десатураз, які діють на олеоїльні або лінолеоїльні субстрати, які утворюють складні ефіри з фосфатидилхоліном (PC). Крім того, залежно від рослини, олеат може піддаватися додатковій модифікації шляхом елонгації (до 20:1, 22:1 і/або 24:1), або шляхом додавання функціональних груп. Вказані жирні кислоти нарівні з насиченими жирними кислотами, пальмітатом і стеаратом, потім використовуються для синтезу тригліцеридів, які входять до складу ендоретикулярних мембран. Рослинний фермент ацил-АСР дельта-9-десатураза є розчинним. Він присутній в стромі пластиди і використовує як субстрати синтезовані жирні кислоти, які утворюють ефіри з ACP, переважно стеарил-АСР. Даний фермент відрізняється від інших дельта-9-десатураз, які знаходяться в мембрані ендоплазматичного ретикулуму (ER, або мікросом), використовують як субстрат жирні кислоти, які утворюють ефіри з Co-A, і забезпечують десатурацію обох насичених жирних кислот, пальмітату і стеарату. Патенти США 5723595 і 6706950 описують рослинну десатуразу. Дріжджовий ген дельта-9-десатурази виділяють з Saccharomyces cerevisiae, клонують і секвенують. Stukey et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 16537- 44; Stukey et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20144-9. Вказаний дріжджовий ген вводять в тканину листа тютюну (Polashcok et al. (1991) FASEB J. 5:A1157; Polashok et al. (1992) Plant Physiol. 100:894-901) і експресують в даній тканині. Крім того, цей дріжджовий ген експресують в томаті. Див. Wang et al. (1996) J. Agric. Food Chem. 44:3399-402; and Wang et al. (2001) Phytochemistry 58:227-32. Хоча при використанні вказаного дріжджового гена дельта-9-десатурази і для тютюну і для томата описано деяке збільшення рівня певних ненасичених жирних кислот і деяке зменшення рівня певних насичених жирних кислот, тютюн і томат не є явно олійними культурами. Даний дріжджовий ген також вводять в Brassica napus. Патент США 5777201. Іншу грибкову ацил-СоА дельта-9-десатуразу з Aspergillus nidulans вводять в канолу, щоб досягнути знижених рівнів насичених жирних кислот в олії, яку отримують з насіння. Публікація патентної заявки США US 2008/0260933 A1. Ацил-СоА дельта-9-десатураза А. nidulans забезпечує в більшій мірі зменшення рівня стеарату (61-90%), ніж пальмітатвмісних жирних кислот (36-49%), які є в надлишку, в олії, яку отримують з насіння. ОПИС ВИНАХОДУ У даному описі розкриваються нові грибкові ферменти дельта-9-десатурази; нуклеїнові кислоти, які містять щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує таку десатуразу; а також рослини, рослинні матеріали (наприклад, насіння), частини рослин і рослинні товарні продукти, які містять перераховані вище елементи. Аспекти деяких втілень ілюструються з використанням грибкових ферментів дельта-9-десатураз, виділених з Magnaporthe grisea, Leptosphaeria nodorum і Helicoverpa zea. Деякі приклади включають в себе застосування нативних і синтетичних дельта-9-десатураз, для яких переважним субстратом є пальмітинова або стеаринова кислота. Деякі втілення включають в себе виділену молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує фермент дельта-9-десатуразу, який містить амінокислотну послідовність щонайменше на 80% ідентичну послідовності, вибраної з групи, яка складається з SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 72 і SEQ ID NO: 73. У конкретних прикладах молекула нуклеїнової кислоти містить послідовність щонайменше на 60% ідентичну послідовності, вибраної з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48 і SEQ ID NO: 49. Вказані і інші втілення можуть включати в себе виділений поліпептид дельта-9-десатурази, який містить амінокислотну послідовність щонайменше на 80% ідентичну послідовності, вибраної з групи, 2 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 яка складається з SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 72 і SEQ ID NO: 73. У даному описі також розкриваються способи експресії щонайменше однієї з вищезазначених послідовностей нуклеїнових кислот і/або поліпептидів в рослинній клітині. Перевага конкретних втілень полягає в застосуванні активності ферменту дельта-9-десатурази, який призводить до зменшення процентного вмісту насичених жирних кислот в рослині, рослинному матеріалі (наприклад, в насінні) і/або частині рослини, яка включає в себе рослинну клітину, і/або в рослинному товарному продукті, отриманому з одного з перерахованих вище елементів. При цьому в деяких втіленнях в рослині, рослинному матеріалі, частині рослини і/або рослинному товарному продукті може збільшуватися вміст ω-7 жирних кислот. Деякі втілення включають в себе спосіб зменшення кількості насичених жирних кислот в рослині, рослинному матеріалі, частині рослини і/або рослинному товарному продукті, де вказаний спосіб включає в себе трансформацію рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид дельта-9-десатурази даного винаходу, з метою зменшення кількості насичених жирних кислот в клітині. Деякі втілення включають в себе спосіб отримання рекомбінантної рослини, яка містить більш низькі кількості насичених жирних кислот, ніж рослина дикого типу того ж виду. Такий спосіб може включати в себе трансформацію рослинного матеріалу (або рослинної клітини) молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид дельта-9-десатурази даного винаходу, і культивування трансформованого рослинного матеріалу (або рослинної клітини) з отриманням рослини. У конкретних прикладах рослинну клітину і/або рослинний матеріал Arabidopsis sp. трансформують молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид дельта-9-десатурази даного винаходу. Вищеописані і інші ознаки стануть більш очевидними з нижченаведеного докладного опису деяких втілень, який приводиться з посиланням на супроводжуючі креслення. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ На фіг. 1 показаний схематичний філогенетичний аналіз різних білкових послідовностей грибкової десатурази. Повнорозмірні білкові послідовності зображених десатураз вирівнюють за допомогою ClustalX і демонструють з допомогою MEGA. На фіг. 2(a-d) показано вирівнювання генних послідовностей грибкової дельта-9-десатурази. Великі букви означають консервативні нуклеотиди в даному вирівнюванні. Заштриховані букви означають ідентичні нуклеотиди в даному вирівнюванні. На фіг. 3(a-b) приведено вирівнювання поліпептидів грибкової дельта-9-десатурази. На фіг. 4-18 показані плазмідні карти типових плазмід, які містять нуклеотидні послідовності, які кодують поліпептид грибкової дельта-9-десатурази, які можна використовувати в деяких втіленнях. На фіг. 4, зокрема, показані плазмідні карти типових плазмід, які містять нуклеотидні послідовності, які кодують LnD9DS-2 (фіг. 4a; pDAB110110) і HzD9DS (фіг. 4b; pDAB110112), які додатково містять 5'-UTR PvPhas і 3'-UTR PvPhas. На фіг. 19 приведені результати, які демонструють загальний вміст насичених жирних кислот (%FAME) в типовому насінні T 2 Arabidopsis, отриманому від рослин, трансформованих деякими типовими генними послідовностями грибкової дельта-9-десатурази. На фіг. 20 приведені результати, які демонструють вміст пальмітинової кислоти (C16:0) (%FAME) в типовому насінні T 2 Arabidopsis, отриманому від рослин, трансформованих деякими типовими генними послідовностями грибкової дельта-9-десатурази. На фіг. 21 приведені результати, які демонструють вміст стеаринової кислоти (C18:0) (%FAME) в типовому насінні T 2 Arabidopsis, отриманому від рослин, трансформованих деякими типовими генними послідовностями грибкової дельта-9-десатурази. На фіг. 22 приведені результати, які демонструють вміст пальмітолеїнової кислоти (C16:1) (%FAME) в типовому насінні T 2 Arabidopsis, отриманому від рослин, трансформованих деякими типовими генними послідовностями грибкової дельта-9-десатурази. На фіг. 23 приведене графічне зображення накопичення транскриптів мРНК HzD9DS і LnD9DS-2 (в порівнянні з транскриптами AnD9DS) в насінні рослин каноли, яке розвивається, трансформованому pDAB7319 (AnD9DS v3 і LnD9DS-2 v2) або pDAB7324 (AnD9DS v3 і HzD9DS v2). Методом кількісної ОТ-ПЛР визначають ΔΔCt кожного гена в порівнянні з рівнем транскрипції актину, після чого кількість транскрипту HzD9DS і LnD9DS-2 нормалізують за рівнем транскрипту AnD9DS в кожному зразку. СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Нуклеотидні послідовності, перераховані в списку послідовностей, який додається, показані з використанням стандартних буквених скорочених позначень нуклеотидних основ, визначених в 37 C.F.R. § 1.822. Показаний тільки один ланцюг кожної нуклеотидної послідовності, однак 3 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мається на увазі, що комплементарний ланцюг включений в даний опис з посиланням на показаний ланцюг. У списку послідовностей, який додається: SEQ ID NO:1 описує прямий праймер, який використовується для ПЛР-ампліфікації фрагменту гена ацил-СоА дельта-9-десатурази Magnaporthe grisea (яка інколи називається MgD9DS). SEQ ID NO:2 описує зворотний праймер, який використовується для ПЛР-ампліфікації фрагменту гена ацил-СоА дельта-9-десатурази M. grisea (яка інколи називається MgD9DS). SEQ ID NO: 3 описує типовий фрагмент гена ацил-СоА дельта-9-десатурази M. grisea (яка інколи називається MgD9DS), ампліфікований методом ПЛР. SEQ ID NO: 4 описує типовий клон MgD9DS, який не містить інтронів. SEQ ID NO: 5 описує типову нуклеотидну послідовність, яка кодує першу ацил-СоА дельта9-десатуразу Leptosphaeria nodorum, яка інколи називається LnD9DS-1. SEQ ID NO: 6 і 7 описують послідовності праймерів, відповідні для застосування в деяких втіленнях. SEQ ID NO: 8 описує типову нуклеотидну послідовність, яка кодує другу ацил-СоА дельта-9десатуразу L. nodorum, яка інколи називається LnD9DS-2. SEQ ID NO: 9 описує ділянку яка кодує типовий нативний ген дельта-9-десатурази M. grisea (позначений MgD9DS v1). SEQ ID NO: 10 описує ділянку яка кодує типовий нативний ген дельта-9-десатурази Helicoverpa zea (позначений HzD9DS v1). SEQ ID NO: 11 описує ділянку яка кодує типовий нативний ген дельта-9-десатурази (LnD9DS-2 v1) L. nodorum. SEQ ID NO: 12 описує амінокислотну послідовність типової нативної дельта-9-десатурази M. grisea (MgD9DS). SEQ ID NO: 13 описує амінокислотну послідовність типової нативної дельта-9-десатурази Н. zea (HzD9DS). SEQ ID NO: 14 описує амінокислотну послідовність типової нативної дельта-9-десатурази L. nodorum (LnD9DS-2). SEQ ID NO: 15 описує послідовність типового канола-оптимізованого гена дельта-9десатурази M. grisea (MgD9DS v2). SEQ ID NO: 16 описує послідовність типового канола-оптимізованого гена дельта-9десатурази Н. zea (HzD9DS v2). SEQ ID NO: 17 описує послідовність типового канола-оптимізованого гена дельта-9десатурази L. nodorum (LnD9DS-2 v2). SEQ ID NO: 18-39 описують послідовності праймерів і зондів, відповідні для застосування в деяких втіленнях. SEQ ID NO: 40-43 описують типові альтернативні послідовності Kozak, які можна використовувати для підвищення експресії в деяких втіленнях. SEQ ID NO: 44 описує послідовність іншого типового канола-оптимізованого гена дельта-9десатурази L. nodorum (LnD9DS-2 v3). SEQ ID NO: 45 описує послідовність іншого типового канола-оптимізованого гена дельта-9десатурази Н. zea (HzD9DS v3). SEQ ID NO: 46 описує амінокислотну послідовність маркера Myc. SEQ ID NO: 47 описує амінокислотну послідовність маркера HA. SEQ ID NO: 48 описує типову нуклеотидну послідовність, яка кодує дельта-9-десатуразу Aspergillus nidulans, яка інколи називається AnD9DS v2. SEQ ID NO: 49 описує другу типову нуклеотидну послідовність, яка кодує дельта-9десатуразу А. nidulans, яка інколи називається AnD9DS v3. SEQ ID NO: 50 описує амінокислотну послідовність, яка кодується нуклеїновими кислотами, описаними в SEQ ID NO: 48-49 (AnD9DS). SEQ ID NO: 51 описує амінокислотну послідовність іншої типової десатурази AnD9DS. SEQ ID NO: 52 описує амінокислотну послідовність типової нативної дельта-9-десатурази (ScOLEl) Saccharomyces cerevisiae. SEQ ID NO:53-66 описують плазміди, відповідні для застосування в деяких втіленнях. SEQ ID NO: 67-71 описують деякі регуляторні елементи нуклеїнових кислот, відповідні для застосування в деяких втіленнях. SEQ ID NO: 72 описує 68 N-кінцевих залишків (1-68) типової десатурази AnD9DS. SEQ ID NO: 73 описує 175 С-кінцевих залишків (281-455) типової десатурази AnD9DS. SEQ ID NO: 74 описує карту плазміди pDAB110110. SEQ ID NO: 75 описує карту плазміди pDAB110112. 4 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SEQ ID NO: 76 описує типову нуклеотидну послідовність, яка кодує типову ацил-СоА дельта9-десатуразу M. grisea, яка інколи називається MgD9DS. SEQ ID NO: 77 описує амінокислотну послідовність, яка входить в склад типової нативної дельта-9-десатурази L. nodorum з послідовністю SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 78 описує амінокислотну послідовність, яка входить в склад типової нативної дельта-9-десатурази Н. zea з послідовністю SEQ ID NO: 13. СПОСІБ (СПОСОБИ) ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ I. Огляд деяких втілень Автори винаходу попередньо вводять грибкову ацил-СоА дельта-9-десатуразу Aspergillus nidulans в канолу, щоб досягнути зменшення рівня насичених жирних кислот в олії, отриманій з насіння. Публікація патентної заявки США US 2008/0260933 A1. Дельта-9-десатураза А. nidulans забезпечує більш високий ступінь виснаження олії, яка отримується з насіння по стеарату (6190%), ніж по наявних в надлишку пальмітатвмісних жирних кислотах (36-49%). Таким чином, спільне введення дельта-9-десатурази, яка переважно діє на пальмітатвмісні насичені вуглеводні, дозволяє досягнути зменшення загального вмісту насичених вуглеводнів шляхом доповнення вибірковою по стеарату активності дельта-9-десатурази А. nidulans. У деяких втіленнях даного винаходу розкриваються поліпептиди грибкової дельта-9-десатурази з різною субстратною специфічністю. Конкретні втілення включають в себе пальмітат-специфічну дельта-9-десатуразу (наприклад, нативний грибковий фермент, розкритий в даному документі, або його функціональний еквівалент; а також синтетичний поліпептид, який переважно використовує як субстрат пальмітинову кислоту). Даний опис розкриває молекули нуклеїнової кислоти, які кодують поліпептид дельта-9десатурази, які містять нуклеотидну послідовність щонайменше на 60% ідентичну послідовності, вибраної з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48 і SEQ ID NO: 49. У деяких втіленнях молекула нуклеїнової кислоти може додатково містити генний регуляторний елемент, функціонально зв’язаний з послідовністю, яка кодує поліпептид дельта-9-десатурази. У конкретних втіленнях генний регуляторний елемент може являти собою промотор фазеоліну, 5'нетрансльована ділянка фазеоліну, 3'-нетрансльована ділянка фазеоліну, 3'-нетрансльована ділянка ORF1 Agrobacterium tumefaciens, промотор вірусу мозаїки жилок маніоки Cassava vein Mosaic Virus, ділянка приєднання матриксу RB7 Nicotiana tabacum, Т-ланцюжкова бордюрна послідовність, промотор LfKCS3 і промотор FAE 1. Також розкриваються поліпептиди дельта-9-десатурази, які містять амінокислотну послідовність щонайменше на 80% ідентичну послідовності, вибраної з групи, яка складається з SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 72 і SEQ ID NO: 73, а також молекули нуклеїнової кислоти, які кодують такі поліпептиди дельта-9десатурази. У деяких втіленнях молекули нуклеїнової кислоти і поліпептиди дельта-9-десатурази можуть… Втілення даного винаходу включають в себе способи зменшення кількості насичених жирних кислот в рослинному матеріалі, рослинній клітині, рослинній тканині, або в цілій рослині. Такі способи можуть включати в себе трансформацію рослинного матеріалу, рослинної клітини, рослинної тканини, або цілої рослини щонайменше однієї з вищезазначених молекул нуклеїнової кислоти, з метою зменшення кількості насичених жирних кислот в рослинному матеріалі, рослинній клітині, рослинній тканині, або в цілій рослині. Конкретні втілення включають в себе способи виборчого зменшення кількості пальмітинової і/або стеаринової жирної кислоти в рослинному матеріалі, рослинній клітині, рослинній тканині, або в цілій рослині. Розкриті тут способи можна здійснювати, наприклад, на рослинах або на рослинних матеріалах, отриманих з рослин (наприклад, на рослинах роду Arabidopsis, або канола). Конкретне втілення стосується способів отримання або регенерації рекомбінантної рослини, яка містить знижені кількості насичених жирних кислот в порівнянні з рослиною дикого типу того ж виду, де способи включають в себе трансформацію рослинної клітини або рослинного матеріалу щонайменше однієї з вищезазначених молекул нуклеїнової кислоти; і культивування трансформованого рослинного матеріалу з отриманням рослини. Також розкриваються рослини, рослинні матеріали, рослинні клітини і насіння, отримані за допомогою одного з вищезазначених способів. II. Скорочення 5 UA 115302 C2 z 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 х:уΔ - жирна кислота, яка містить х атомів вуглецю і у подвійних зв'язків в положенні z, рахуючи від карбоксильного кінця ACP - ацил-переносний білок CoA - кофермент А FA - жирні кислоти FAM - флуоресцеїн FAS - синтаза жирних кислот FAME - метиловий ефір жирної кислоти KASII - синтаза β-кетоацил-АСР II MUFA - мононенасичена жирна кислота WT - дикий тип III. Терміни Жирна кислота: У даному описі термін "жирна кислота" стосується довголанцюжкових аліфатичних кислот (алканових кислот) з різною довжиною ланцюга, наприклад, приблизно від C12 до C22, хоча існують кислоти як з більш довгим, так і з більш коротким ланцюгом. z Структура жирної кислоти описується формулою х:уΔ , де х означає загальне число атомів вуглецю (С), а у означає число подвійних зв'язків у вуглецевому ланцюгу в положенні «z», рахуючи від карбоксильного кінця кислоти. Метаболічний шлях: Термін "метаболічний шлях" стосується ряду хімічних реакцій, які протікають в клітині і каталізовані ферментами, які призводять до утворення метаболічного продукту або до ініціації іншого метаболічного шляху. Метаболічний шлях може включати в себе декілька або багато стадій і може конкурувати з іншим метаболічним шляхом за специфічні субстрати для реакцій. Подібним чином, продукт одного метаболічного шляху може бути субстратом для іншого метаболічного шляху. Метаболічна інженерія: З метою даного винаходу термін "метаболічна інженерія" стосується створення раціональних стратегій зміни одного або декількох метаболічних шляхів в клітині, так, щоб в результаті постадійної модифікації вихідної речовини в загальній схемі всіх метаболічних шляхів, які функціонують в клітині, можна було б отримати продукт, який має точно задану хімічну структуру. Десатураза: У даному описі термін "десатураза" стосується поліпептиду, здатному здійснювати десатурацію (тобто вводити подвійний зв'язок) однієї або декількох жирних кислот з отриманням жирної кислоти, яка представляє інтерес, або її попередника. Рослинний розчинний фермент десатуразу жирних кислот може регіоспецифічно вводити подвійний зв'язок в субстрат насичений ацил-АСР. Ацил-СоА десатурази регіоспецифічно вводять подвійний зв'язок в субстрат насичений жирний ацил-СоА. Дана реакція включає в себе активацію молекулярного кисню двоелектронним відновленим дизалізним центром, координованим чотириспіралевим пучком, які утворюють центр конфігурації десатурази. У деяких втіленнях особливий інтерес представляють ацил-СоА дельта-9-десатурази. 1 Дельта-9-18:0 -ACP десатураза потрібна до всіх рослин для підтримки рідинності мембрани. Хоча цей фермент насамперед здійснює десатурацію стеароїл-АСР, в меншій мірі він також активний відносно пальмітоїл-АСР. Варіантна десатураза: У даному описі термін "варіантна десатураза" охоплює десатурази, які мають специфічні профілі активності, які відповідають їх участі в утворенні незвичайних жирних кислот. Варіантну десатуразу можна виділити з організму, отриманого внаслідок програми направленої еволюції, або її можна отримати рекомбінатними методами у вигляді синтетичної десатурази, відмінної консервативними амінокислотами від однієї або декількох охарактеризованих десатураз. Рослина-нащадок: З метою даного винаходу термін "рослина-нащадок" стосується будь-якої рослини, яку можна отримати за допомогою методів селекції рослин, або отриманої з неї рослинного матеріалу. Методи селекції рослин добре відомі в даній галузі і включають в себе природну селекцію, штучну селекцію, селекційне розведення з використанням аналізу молекулярних маркерів ДНК, трансгенну і комерційну селекцію. Рослинний матеріал: У даному описі термін "рослинний матеріал" стосується будь-якої клітини або тканини, отриманої з рослини. Молекула нуклеїнової кислоти: Полімерна форма нуклеотидів, яка може включати в себе смислові і антисмислові ланцюги РНК, кДНК, геномної ДНК, а також синтетичні форми і змішані полімери вищезгаданих сполук. Нуклеотид включає в себе рибонуклеотид, дезоксинуклеотид або модифіковану форму нуклеотиду будь-якого типу. У даному описі термін "молекула нуклеїнової кислоти" використовується як синонім термінам "нуклеїнова кислота" і "полінуклеотид". Цей термін включає в себе одноланцюжкові і дволанцюжкові форми ДНК. 6 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Молекула нуклеїнової кислоти може містити або природні, або модифіковані, або ті і інші нуклеотиди, з’єднані зв'язками, які зустрічаються в природі, або, міжнуклеотидними зв’язками, які не зустрічаються в природі. Молекули нуклеїнової кислоти можуть бути модифіковані за допомогою хімічних або біохімічних способів, або вони можуть містити неприродні або дериватизовані нуклеотидні основи, що може легко визначити рядовий фахівець в даній галузі. Такі модифікації включають в себе, наприклад, введення міток, метилування, заміну одного або декількох природних нуклеотидів на аналог, міжнуклеотидні модифікації, такі як незаряджені містки (наприклад, метилфосфонати, фосфотриефіри, фосфорамідати, карбамати і інш.), заряджені містки (наприклад, фосфоротіоати, фосфородитіоати і інш.), виступаючі фрагменти (наприклад, пептиди), інтеркалятори (наприклад, акридин, псорален і інш.), хелатуючі засоби, алкілуючі засоби і модифіковані містки (наприклад, альфа-аномерні нуклеїнові кислоти і інш.). Термін "молекула нуклеїнової кислоти" також включає в себе будь-яку топологічну конформацію, таку як одноланцюжкова, дволанцюжкова, частково двоспіральна, триспіральна, шпилькова, циклічна і закрита конформації. Функціонально зв'язаний: Перша нуклеотидна послідовність функціонально зв’язана з другою нуклеотидною послідовністю, якщо перша нуклеотидна послідовність знаходиться в функціональній залежності від другої нуклеотидної послідовності. Наприклад, промотор функціонально зв’язаний з кодуючою послідовністю, якщо промотор може впливати на транскрипцію або експресію кодуючої послідовності. У випадку отримання нуклеїнових кислот рекомбінантними методами функціонально зв’язані нуклеотидні послідовності звичайно є суміжними і, при необхідності, в одній рамці зчитування можна з'єднати дві білок-кодуючі послідовності. Однак функціонально зв’язані нуклеїнові кислоти не обов'язково повинні бути суміжними. Регуляторний елемент: У даному описі термін "регуляторний елемент" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної регулювати функціонування гена; тобто молекули, здатної впливати на транскрипцію або трансляцію функціонально зв’язаної транскрибованої молекули нуклеїнової кислоти. Регуляторні елементи, такі як промотори, лідерні послідовності, інтрони і ділянки термінації транскрипції, є молекулами некодуючих нуклеїнових кислот, здатні регулювати функціонування гена, які є невід'ємною частиною загальної експресії генів в живих клітинах. Отже, виділені регуляторні елементи, здатні функціонувати в рослинах, можна використовувати для зміни фенотипів рослин рекомбінантними методами. Під "регуляторним елементом" йдеться про ряд нуклеотидів, який визначає, чи відбувається експресія конкретного гена, коли вона відбувається і на якому рівні. Регуляторні послідовності ДНК специфічно взаємодіють з регуляторними або іншими білками. У даному описі термін "здатність регулювати функціонування гена" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної впливати на транскрипцію або трансляцію функціонально зв’язаної молекули нуклеїнової кислоти. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, здатна регулювати функціонування гена, може визначати час або місце експресії, або модулювати рівень і швидкість експресії функціонально зв’язаної молекули нуклеїнової кислоти. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, здатна регулювати функціонування гена, може включати в себе промотор, інтрон, лідерну послідовність або 3'-ділянку термінації транскрипції. Промотори: У даному описі термін "промотор" стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка бере участь в розпізнаванні і зв’язуванні РНК-полімерази II або інших білків, таких як фактори транскрипції (транс-діючі білкові фактори, які регулюють транскрипцію), з подальшою ініціацією транскрипції функціонально зв’язаного гена. Самі промотори можуть містити піделементи, такі як цис-елементи або енхансерні домени, які впливають на транскрипцію функціонально зв’язаних генів. "Рослинний промотор" являє собою природний або не природний промотор здатний функціонувати в рослинних клітинах. Рослинний промотор можна використовувати як 5'-регуляторний елемент для модуляції експресії функціонально зв’язаного гена або генів. Рослинні промотори можна класифікувати за часовим, просторовим або пов'язаним з розвитком характером експресії. Описані тут молекули нуклеїнових кислот можуть містити нуклеотидні послідовності, які включають в себе промотори. Ідентичність послідовностей: У даному описі термін "ідентичність послідовностей" або "ідентичність" в застосуванні до двох нуклеотидних або поліпептидних послідовностей може стосуватися залишків двох послідовностей, які є однаковими при вирівнюванні з максимальною відповідністю в певному вікні порівняння. Якщо термін "процент ідентичності послідовностей" використовують в застосуванні до білків, потрібно розуміти, що положення, в яких знаходяться не ідентичні залишки, можуть відрізнятися в результаті консервативних амінокислотних замін, в процесі яких амінокислотні залишки 7 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 замінюють на інші амінокислотні залишки з подібними хімічними властивостями (такими як заряд, гідрофобність або стеричні ефекти), і, отже, такі заміни не змінюють функціональних властивостей молекули. Таким чином, якщо послідовності відрізняються в результаті консервативних замін, процент ідентичності послідовностей можна відкоригувати до більш високого значення, щоб врахувати консервативну природу заміни в положенні, в якому присутні не ідентичні залишки. Послідовності, які відрізняються внаслідок таких консервативних замін, характеризуються "подібністю послідовностей" або "подібністю". Методи такої корекції добре відомі рядовим фахівцям в даній галузі. Як правило, такі методи включають в себе оцінку консервативної заміни як швидше часткового, а не повного незбігу, яка підвищує процент ідентичності послідовностей. Наприклад, якщо ідентичній амінокислоті присвоюють оцінку від 0 до 1, а неконсервативній заміні присвоюють оцінку 0, то консервативній заміні присвоюють оцінку від 0 до 1. Оцінку консервативних замін можна розрахувати, наприклад, при виконанні програми PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, CA). У даному описі термін "процент ідентичності послідовностей" може стосуватися значення, визначеного шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей у вікні порівняння, де частина послідовності у вікні порівняння може містити добавки або делеції (тобто пропуски) стосовно послідовності (яка не містить добавок або делецій), яка порівнюється для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Процент розраховують шляхом визначення числа положень обох послідовностей, в яких зустрічаються ідентичні нуклеотидні або амінокислотні залишки, з отриманням числа співпадаючих положень, розподілу числа співпадаючих положень на загальне число положень у вікні порівняння і множення результату на 100, з отриманням значення процента ідентичності послідовностей. Аналогічне положення в амінокислотній послідовності: Нуклеотидні і амінокислотні послідовності можна вирівнювати за допомогою способів, описаних в нижченаведених параграфах. При вирівнюванні положення в одній послідовності є "аналогічним" положення в послідовності, яка вирівнюється, якщо положення є ідентичними в консенсусній послідовності. Способи вирівнювання послідовностей з метою порівняльного аналізу добре відомі в даній галузі. Різні програми і алгоритми вирівнювання описані в: Smith and Waterman, Adv. Appl. math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene 73:237-44, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al, Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988; Huang, et al, Computer Applications in the Biosciences 8:155-65, 1992; Pearson et al, Methods in Molecular Biology 24:307-31, 1994; Tatiana et al, FEMS Microbiol. Lett., 174:247-50, 1990. Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 (докладний опис методів вирівнювання послідовностей і розрахунку гомології). Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) можна знайти в інтернеті (на сайті blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) для застосування в поєднанні з програмами для аналізу послідовностей, такими як blastp і blastn. Опис визначення ідентичності послідовностей за допомогою даної програми можна знайти в інтернеті через NCBI на сайті blast.ncbi.nlm.nih.gov Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastDocs. Для порівняння амінокислотних послідовностей використовують функцію програми BLAST "Blast 2 sequences" (bl2seq) з параметрами за умовчанням. Конкретні параметри можуть бути відкориговані на розсуд фахівця в даній галузі, наприклад, з отриманням штрафу за незбіг або винагороди за збіг. Трансформований: У даному описі термін "трансформований" стосується клітини, тканини, органу або організму, в які введена чужорідна молекула нуклеїнової кислоти, така як конструкція. Введена молекула нуклеїнової кислоти може інтегруватися в геномну ДНК реципієнтних клітин, тканини, органу або організму, в результаті чого введена полінуклеотидна молекула успадковується подальшим потомством. Термін "трансгенний" або "трансформований" в застосуванні до клітини або організму також включає в себе потомство клітини або організму, а також потомство, отримане внаслідок програми селекції, яка проводиться, наприклад, шляхом схрещування з використанням такої трансгенної рослини як батьківська рослина, і яка має змінений фенотип, зумовлений присутністю чужорідної молекули нуклеїнової кислоти. IV. Концепції метаболічної інженерії з метою зменшення вмісту насичених жирних кислот в клітині-, тканині- або організмі-хазяїні А. Огляд Втілення даного винаходу включає в себе введення дельта-9-десатураз, які мають специфічну вибірковість відносно ацил-СоА (наприклад, відносно пальмітинової або 8 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 стеаринової кислоти), в насіння рослин. Специфічна вибірковість дельта-9-десатурази відносно ацил-СоА забезпечує спрямованість на деякі конкретні пули насичених жирних кислот (такі як пальмітат, для перетворення в мононенасичені продукти). Щоб зменшити вміст насичених жирних кислот, вибирають ацил-СоА дельта-9-десатурази, оскільки вони звичайно не продукуються в рослинних системах в якій-небудь помітній мірі. В. Поліпептиди Стосовно деяких втілень даного винаходу поліпептиди містять амінокислотну послідовність, яка за результатами вирівнювання має високий процент ідентичності з послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 72 і SEQ ID NO: 73. Конкретні амінокислотні послідовності, які використовуються у вказаних і інших втіленнях, можуть містити послідовності, які, наприклад щонайменше приблизно на 70%, приблизно на 75%, приблизно на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% або 100% ідентичні вищезгаданим послідовностям. У багатьох втіленнях амінокислотна послідовність, за результатами вирівнювання, яка має вищезгадану ідентичність відносно згаданих вище послідовностей, кодує пептид з ферментативною активністю дельта-9-18:0-ACP десатурази, або частину такого пептиду. С. Нуклеїнові кислоти Деякі втілення включають в себе молекули нуклеїнової кислоти, які кодують описаний вище поліпептид. Наприклад, нуклеотидні послідовності, які використовуються в деяких втіленнях, за результатами вирівнювання мають високий процент ідентичності відносно послідовності, вибраної з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48 і SEQ ID NO: 49. Конкретні нуклеотидні послідовності, які використовуються у вказаних і інших втіленнях, можуть містити послідовності, які наприклад щонайменше приблизно на 60%, приблизно на 65%, приблизно на 70%, приблизно на 75%, приблизно на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% або 100% ідентичні послідовності, вибраній з групи, яка складається з SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:48 і SEQ ID NO:49. Рядовому фахівцеві в даній галузі відомо, що молекули нуклеїнових кислот можна модифікувати, практично не змінюючи амінокислотну послідовність кодованого поліпептиду, наприклад, шляхом введення допустимих нуклеотидних замін відповідно до виродженості кодонів. У деяких втіленнях молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу включають в себе генний регуляторний елемент (наприклад, промотор). Промотори можна вибирати залежно від типу клітини, в яку вставляють векторну конструкцію. Промотори, здатні функціонувати в бактеріях, дріжджах і рослинах, добре відомі в даній галузі. Промотори також можна вибирати за їх регуляторними властивостями. Приклади таких властивостей включають в себе здатність підвищувати транскрипційну активність, здатність до індукування, тканинну специфічність і специфічність до стадії розвитку. Описані рослинні промотори, здатні до індукування, вірусного або синтетичного походження, які мають конститутивну активність і здатні здійснювати часову або просторову регуляцію. Див., наприклад, Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3:2719; Odell et al. (1985) Nature 313:810; і Chau et al. (1989) Science 244:174-81. Прийнятні індуковані промотори включають в себе, наприклад, промотори, які індукуються саліциловою кислотою або поліакриловими кислотами, які утворюються внаслідок застосування антидотів (гербіциди на основі заміщених бензолсульфонамідів), промотори теплового шоку, промотор нітрат-індукований, отриманий з послідовності молекули нуклеїнової кислоти транскрибованої в нітратредуктазу шпинату, гормон-індуковані промотори і світлоіндуковані промотори, зв'язані з малою субодиницею карбоксилази RuBP і сімействами LHCP. Приклади прийнятних тканиноспецифічних, залежних від стадії розвитку промоторів, включають в себе промотор β-конгліциніну 7Sα і насіннє-специфічні промотори. Рослинні функціональні промотори, які використовуються для переважної експресії в пластидах насіння, включають в себе промотори білків, які беруть участь в біосинтезі жирних кислот в насінні олійних рослин, і промотори запасних рослинних білків. Приклади таких промоторів включають в себе 5'-регуляторні ділянки послідовностей молекул нуклеїнових кислот, траскрибованих в фазеолін, напін, зеїн, соєвий інгібітор трипсину, ACP, стеароїл-АСР десатуразу і олеосин. Іншим прикладом тканиноспецифічного промотору є промотор лектину, специфічний до тканин насіння. 9 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інші прийнятні промотори включають в себе промотори нопалін-синтази, манопін-синтази і октопін-синтази, які присутні на, пухлино-індукованих плазмідах Agrobacterium tumefaciens; промотори 19S і 35S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV); посилений промотор 35S CaMV; промотор 35S вірусу мозаїки Figwort; світлоіндукований промотор малої субодиниці рибулозо1,5-біфосфат карбоксилази (ssRUBISCO); промотор EIF-4A тютюну (Mandel et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:995-1004); кукурудзяної синтетази сахарози; кукурудзяної алкогольдегідрогенази I; кукурудзяного світлозбирального комплексу; кукурудзяного білка теплового шоку; промотор хітинази Arabidopsis; промотори LTP (ліпід-переносного білка); халькон-ізомерази петунії; соєвого збагаченого гліцином білка 1; пататину картоплі; промотор убіхітину; і промотор актину. Переважно використовують насіннє-селективні, тканиноселективні або індуковані промотори. Насіннє-специфічна регуляція описана, наприклад, в EP 0255378. Щоб досягнути підвищеної експресії гетерологічного гена (генів), можна здійснити реконструкцію гена (генів) з метою більш ефективної експресії в клітині-хазяїні (наприклад, в клітині рослини, такої як канола, рис, тютюн, маїс, бавовник і соєвий біб). Отже, необов'язковою додатковою стадією при конструюванні гена, який кодує дельта-9-десатуразу, з метою експресії в рослині (тобто крім додавання одного або декількох генних регуляторних елементів), є реконструкція ділянки гетерологічного гена, який кодує білок, який забезпечує оптимальну експресію. Конкретні втілення включають в себе реконструйовані гени, оптимізовані з метою підвищення рівня експресії (тобто продукуючі більше білка) в клітині трансгенної рослини каноли, або в клітині рослини Arabidopsis, відмінній від клітини рослини каноли, або в клітині рослини Arabidopsis, трансформованої природною послідовністю гетерологічного гена. Внаслідок пластичності, яка забезпечується надмірністю/виродженістю генетичного коду (це означає, що деякі амінокислоти кодуються декількома кодонами), еволюція геномів в різних організмах або класах організмів призводить до різного застосування синонімічних кодонів. Таке "зміщення кодонів" знаходить відображення в середньому складі основ в ділянках, які кодують білки. Наприклад, організми, геноми яких мають відносно низький вміст G+С, використовують більше кодонів, які містять А або Т в третьому положенні синонімічних кодонів, тоді як організми, геноми яких мають відносно високий вміст G+С, використовують більше кодонів, які містять G або С в третьому положенні. Крім того, вважають, що присутність "мінорних" кодонів в мРНК може знижувати абсолютну швидкість трансляції мРНК, особливо, якщо заряджена тРНК, відповідна мінорному кодону, присутня у відносно невеликому надлишку. Продовження даного міркування полягає в тому, що зменшення швидкості трансляції під дією окремих мінорних кодонів щонайменше підсумовується у випадку присутності декількох мінорних кодонів. Таким чином, мРНК з високим відносним вмістом мінорних кодонів будуть мати відповідно низькі швидкості трансляції в конкретному експресійному хазяїні. Такі швидкості можуть призводити до відповідних низьких рівнів кодованого білка. При конструюванні оптимізованих генів, які кодують дельта-9-десатуразу, для експресії в канолі або Arabidopsis (або в інших рослинах, таких як рис, тютюн, маїс, бавовник або соєві боби), важливо визначати зміщення кодонів в передбачуваній рослині (рослинах) - хазяїні. Існує множина широко доступних баз даних за послідовностями ДНК, в яких можна знайти інформацію про розподіл кодонів в геномах рослин, або про білок-кодуючі ділянки різних рослинних генів. Зміщення кодонів являє собою статистичний розподіл кодонів, які використовують хазяїн експресії (наприклад, рослину, таку як канола або Arabidopsis) для кодування амінокислот, які входять до складу його білків. Зміщення кодонів можна розрахувати як частоту, з якою використовується один кодон в порівнянні з кодонами всіх амінокислот. Альтернативно зміщення кодонів можна розрахувати як частоту, з якою використовується один кодон для кодування конкретної амінокислоти, в порівнянні з іншими кодонами, які використовуються для кодування цієї ж амінокислоти (синонімічні кодони). При конструюванні оптимізованих кодуючих ділянок для експресії в рослині генів дельта-9десатурази, треба визначити кодони, переважні рослиною насамперед ("перший вибір"), а також переважні кодони другого, третього, четвертого і інш. виборів, якщо існує декілька виборів. Потім можна сконструювати нову послідовність ДНК, яка кодує амінокислотну послідовність дельта-9-десатурази, де нова послідовність ДНК відрізняється від нативної послідовності ДНК (яка кодує десатуразу) в результаті заміни кодонів на переважні хазяїном експресії (кодони першої переваги, другої переваги, третьої переваги або четвертої переваги і інш.) для кодування амінокислоти в кожному положенні амінокислотної послідовності. Потім нову послідовність аналізують на наявність ділянок ферментативної рестрикції, які можуть створюватися в процесі модифікацій. Ідентифіковані передбачувані ділянки рестрикції модифікують шляхом заміни вказаних кодонів кодонами наступної переваги, щоб видалити 10 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ділянки рестрикції. Інші ділянки послідовності, які можуть впливати на транскрипцію або трансляцію гетерологічної послідовності, включають в себе точки з'єднання екзон:інтрон (5' або 3'), сигнали додавання полі-А і/або сигнали термінації РНК-полімерази. Послідовність можна додатково аналізувати і модифікувати з метою зменшення частоти дублетів TA або CG. Крім вказаних дублетів, блоки послідовності, які містять приблизно більше шести однакових нуклеотидів G або С, також можуть впливати несприятливим чином на транскрипцію або трансляцію послідовності. Отже, такі блоки бажано модифікувати шляхом заміни кодонів першого, другого або інш. вибору на переважний кодон наступного вибору. За допомогою описаного вище способу фахівець в даній галузі може модифікувати чужорідний для конкретної рослини ген (гени) таким чином, щоб забезпечити його оптимальну експресію в рослині. Цей спосіб також описаний в заявці PCT WO 97/13402. Таким чином, для трансформації хазяїнів, які включають в себе рослини, можна використовувати оптимізовані синтетичні гени, функціонально еквівалентні генам десатурази деяких втілень. Додатковий посібник по отриманню синтетичних генів можна знайти, наприклад, в патенті США № 5380831. Після конструювання оптимізованої для рослини послідовності ДНК на папері або in silico, можна синтезувати в лабораторії реальну молекулу ДНК, послідовність якої точно відповідає конструйованій послідовності. Такі синтетичні молекули ДНК можна клонувати або піддавати їх іншим маніпуляціям, так якби вони були отримані з природних або нативних джерел. D. Способи генетичної трансформації рослинного матеріалу Деякі втілення направлені на спосіб отримання трансформованої клітини, яка містить одну або декілька молекул нуклеїнової кислоти (нуклеїнових кислот), яка містить нуклеотидну послідовність щонайменше на 60% ідентичну послідовності, вибраної з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48 і SEQ ID NO: 49. Вказані молекули нуклеїнової кислоти також можуть містити, наприклад, некодуючі регуляторні елементи, такі як промотори. Нарівні з некодуючими регуляторними елементами і транскрибованими послідовностями нуклеотидних молекул в клітину можна вводити інші послідовності. Вказані інші послідовності можуть включати в себе 3'термінатори транскрипції, сигнали 3'-поліаденілування, інші послідовності, які не транслюються, транзитні або напрямні послідовності, селектовані маркери, енхансери і оператори. Спосіб трансформації звичайно включає в себе стадії вибору прийнятної клітини-хазяїна, трансформації клітини-хазяїна рекомбінантним вектором і отримання трансформованої клітинихазяїна. Методи введення ДНК в клітини добре відомі фахівцям в даній галузі. Як правило, ці методи можна поділити на п'ять груп: (1) хімічні методи (Graham and Van der Eb (1973) Virology 54(2):536-9; Zatloukal et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:136-53); (2) фізичні методи, такі як мікроін’єкція (Capechi (1980) Cell 22(2):479-88), електропорація (Wong and Neumann (1982) Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-7; Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(17):5824-8; патент США 5384253), і прискорення частинок (Johnston and Tang (1994) Methods Cell Biol. 43(А):353-65; Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24): 11478-82; (3) застосування вірусних векторів (Clapp (1993) Clin. Perinatol. 20(l):155-68; Lu et al. (1993) J. Exp. Med. 178(6):2089-96; Eglitis and Anderson (1988) Biotechniques 6(7):608-14); (4) застосування рецептор-опосередкованих механізмів (Curiel et al. (1992) Hum. Gen. Ther. 3(2): 147-54; Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(13):6099-103); і (5) застосування механізмів опосередкованих бактеріями, такими як Agrobacterium. Альтернативно нуклеїнові кислоти можна безпосередньо вводити до репродуктивних органів рослини, таких як пилок. Zhou et al. (1983) Methods in Enzymology 101:433; Hess (1987) Intern. Rev. Cytol. 107:367; Luo et al. (1988) Plant Mol. Biol. Reporter 6:165; Pena et al. (1987) Nature 325:274. Інші методи трансформації включають в себе, наприклад, трансформацію протопластів, описану в патенті США 5508184. Молекули нуклеїнової кислоти також можна вводити в незрілі ембріони. Neuhaus et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30. Для трансформації рослинних клітин частіше за все використовують наступні методи: опосередковане Agrobacterium перенесення ДНК (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803) (описане в патенті США 5824877; патент США 5591616; патент США 5981840; і патент США 6384301) і біолістика або бомбардування мікрочастинками (тобто метод генної гармати) (як описано в патенті США 5550318; патент США 5538880; патент США 6160208; патент США 6399861; і патент США 6403865). Як правило, проводять ядерну трансформацію, однак, якщо бажано специфічно трансформувати пластиди, такі як хлоропласти або амілопласти, трансформацію проводять шляхом опосередкованої мікрочастинками доставки цільових молекул нуклеїнової кислоти в пластиди рослин конкретних видів, таких як, наприклад, Arabidopsis, тютюн, картопля і різновиди Brassica. 11 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Agrobacterium-опосередковану трансформацію проводять шляхом застосування рекомбінантної ґрунтової бактерії, яка належить до роду Agrobacterium. Деякі види Agrobacterium опосередковують перенесення специфічної ДНК, відомої як "Т-ДНК", яка після генетичної трансформації може переносити будь-який бажаний фрагмент ДНК в рослини багатьох видів. Основні події, які характеризують процес Т-ДНК-опосередкованого патогенезу, включають в себе: індукцію генів вірулентності, а також процесинг і перенесення Т-ДНК. Даний процес є предметом численних оглядів. Див., наприклад, Ream (1989) Ann. Rev. Phytopathol. 27:583- 618; Howard and Citovsky (1990) Bioassays 12:103-8; Kado (1991) Crit. Rev. Plant Sci. 10:132; Zambryski (1992) Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:465- 90; Gelvin (1993) in Transgenic Plants, Kung and Wu eds., Academic Press, San Diego, CA, pp. 49-87; Binns and Howitz (1994) In Bacterical Pathogenesis of Plants and Animals, Dang, ed., Berlin: Springer Verlag., pp. 11938; Hooykaas and Beijersbergen (1994) Ann. Rev. Phytopathol. 32:157-79; Lessl and Lanka (1994) Cell 77:321-4; and Zupan and Zambryski (1995) Annual Rev. Phytopathol. 27:583-618. Щоб полегшити вибір, або відмітити трансформовані рослинні клітини, незалежно від методу трансформації, ДНК, яка вводиться в клітину, може містити ген, здатний функціонувати в регенерованій рослинній тканині, продукуючи сполуку, яке додає рослинній тканині стійкості до сполуки, яка в інших випадках є токсичною. Гени, які представляють інтерес, для застосування як маркера селекції, маркера скринінгу або маркера відмітки, включають в себе, без обмеження, β-глюкуронідазу (GUS), зелений флуоресцентний білок (GFP), люциферазу і гени стійкості до антибіотиків або гербіцидів. Приклади генів стійкості до антибіотиків включають в себе гени, які додають стійкості до пеніциліну, канаміцину (а також неоміцину, G418, блеоміцину); метотрексату (і триметоприму); хлорамфеніколу; і тетрацикліну. Наприклад, стійкість до гліфосату може додавати ген стійкості до гербіциду. Della-Cioppa et al. (1987) Bio/Technology 5:579-84. Крім того, можна використовувати і інші засоби селекції, наприклад, які включають в себе, без обмеження, стійкість до фосфінотрицину і біалафосу, а також механізми позитивної селекції (Joersbro et al. (1998) Mol. Breed. 4:111-7), які входять в об'єм втілень даного винаходу. Трансформовані клітини ідентифікують шляхом селекції або скринінгу і культивують у відповідному середовищі, яке забезпечує регенерацію, після чого їм дають розвиватися до цілих рослин. Способи, які розкриваються в даному винаході, можна використовувати в поєднанні з будьякою трансформованою рослинною клітиною або тканиною. Трансформовані клітини і тканини стосовно даного опису включають в себе, без обмеження, клітини або тканини, здатні до подальшого розвитку з утворенням рослини. Фахівцям в даній галузі відомо, що ряд рослинних клітин або тканин після трансформації шляхом вставки екзогенної ДНК і подальшого культивування у відповідних умовах можуть розвиватися до диференційованої рослини. Відповідні для таких цілей тканини можуть включати в себе, без обмеження, незрілі зародки, тканину щитка зародка, суспензійні клітинні культури, незрілі суцвіття, меристему паростків, експлантати вузликів, тканину калюса, тканину гіпокотилю, сім’ядолі, коріння і листя. Методи регенерації, розвитку і культивування рослин з трансформованих протопластів або експлантатів рослин відомі в даній галузі. Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.) Academic Press, Inc., San Diego, CA; Horsch et al. (1985) Science 227:1229-31. Як правило, вказаний процес регенерації і росту включає в себе стадії відбору трансформованих клітин і культивування вказаних клітин протягом звичайних стадій ембріонального розвитку до утворення проростка з коренем. Подібним чином регенерують трансгенні зародки і насіння. У даному способі трансформанти звичайно культивують в присутності селекційного середовища, яке дозволяє відбирати трансформовані клітини і забезпечує регенерацію паростків рослини. Fraley et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803. Вказані паростки звичайно отримують протягом двох-чотири місяців. Потім отримані трансгенні паростки з корінням вирощують в середовищі, відповідному для вирощування рослин, такому як ґрунт. Клітини, які вижили після впливу селективного засобу, або клітини, охарактеризовані як позитивні за результатами скринінгу, можна культивувати в середовищі, яке забезпечує регенерацію рослин. Потім паростки можна перенести в середовище, прийнятне для стимуляції росту кореневої системи, яке містить селективний засіб і антибіотик для запобігання росту бактерій. У багатьох паростків розвивається коріння. Такі паростки пересаджують в ґрунт або інше середовище, яке забезпечує подальший розвиток кореневої системи. Як вказано вище, даний спосіб може варіювати залежно від конкретного використовуваного штаму рослини і, отже, його деталі можуть змінюватися на розсуд фахівця в даній галузі. 12 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Регенеровані трансгенні рослини можна піддати самозапиленню з отриманням гомозиготних трансгенних рослин. Альтернативно пилок, отриманий з регенерованих трансгенних рослин, можна використовувати для перехресного схрещування з нетрансгенними рослинами, переважно інбредних ліній агрономічно важливих видів. І навпаки, пилок нетрансгенних рослин можна використовувати для запилення регенерованих трансгенних рослин. Трансгенна рослина може передавати трансформовану послідовність нуклеїнової кислоти своєму потомству. Трансгенна рослина переважно є гомозиготню по трансформованій послідовності нуклеїнової кислоти і передає цю послідовність всім своїм нащадкам при статевому розмноженні, або в результаті статевого розмноження. Потомство можна вирощувати з насіння, продукованого трансгенною рослиною. Потім отримані рослини можна піддати самозапиленню з отриманням даної селекційної лінії рослин. Потомство вказаних рослин можна аналізувати, в числі інших ознак, на експресію гена. Експресію гена можна детектувати за допомогою ряду традиційних методів, таких як вестернблотинг, нозерн-блотинг, імунопреципітація і ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз). Трансформовані рослини також можна аналізувати на присутність введеної ДНК і рівень експресії і/або профіль жирних кислот, який забезпечується молекулами нуклеїнових кислот і пептидними молекулами даного винаходу. Фахівцям в даній галузі відомі численні методи, відповідні для аналізу трансформованих рослин. Наприклад, методи аналізу рослин включають в себе, без обмеження, саузерн-блотинг або нозерн-блотинг, методи на основі ПЛР, біохімічні аналізи, методи фенотипового скринінгу, польові аналізи і імунодіагностичні аналізи. Способи специфічної трансформації дводольних добре відомі в даній галузі. Трансформація і регенерація рослин з використанням вказаних способів описані для ряду зернових, які включають в себе, без обмеження, члени роду Arabidopsis, бавовник (Gossypium hirsutum), соєві боби (Glycine max), арахіс (Arachis hypogaea) і члени роду Brassica. Способи трансформації дводольних, насамперед, із застосуванням Agrobacterium tumefaciens, і отримання трансгенних рослин описані для бавовнику (патент США 5004863; патент США 5159135; патент США 5518908); соєвих бобів (патент США 5569834; патент США 5416011; McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-4); Brassica (патент США 5463174); арахісу (Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-7; McKently et al. (1995) Plant Cell Rep. 14:699-703); папайя; і гороху (Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-8). Способи трансформації однодольних добре відомі в даній галузі. Трансформація і регенерація рослин з використанням вказаних способів описані для ряду зернових, які включають в себе, без обмеження, ячмінь (Hordeum vulgarae); маїс (Zea mays); овес (Avena sativa); грястицю звичайну (Dactylis glomerata); рис (Oryza sativa, включаючи різновиди indica і japonica); сорго (Sorghum bicolor); цукрову тростину (Saccharum sp); високу кострицю (Festuca arundinacea); газонні трави (наприклад, Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum); пшеницю (Triticum aestivum); і люцерну (Medicago sativa). Для фахівців в даній галузі очевидно, що існує ряд способів трансформації, які можна використовувати і модифікувати з отриманням стабільних трансгенних рослин ряду цільових культур, які представляють інтерес. У способах даного винаходу можна використовувати будь-які рослини. Переважні для модифікаціїстосовно даного винаходу рослини включають в себе, як приклад і без обмеження, олійні рослини, Arabidopsis thaliana, огірочник (Borago spp.), канолу (Brassica spp.), рицину (Ricinus communis), боби какао (Theobroma cacao), кукурудзу (Zea mays), бавовник (Gossypium spp.), Crambe spp., Cuphea spp., льон (Linum spp.), Lesquerella і Limnanthes spp., Linola, красолю (Tropaeolum spp.), Oenothera spp., оливкове дерево (Olea spp.), пальмове дерево (Elaeis spp.), арахіс (Arachis spp.), ріпак, сафлор (Carthamus spp.), соєві боби (Glycine і Soja spp.), соняшник (Helianthus spp.), тютюн (Nicotiana spp.), Vernonia spp., пшеницю (Triticum spp.), ячмінь (Hordeum spp.), рис (Oryza spp.), овес (Avena spp.), сорго (Sorghum spp.) і жито (Secale spp.), а також інші члени Gramineae. Для фахівців в даній галузі очевидно, що існує ряд способів трансформації, які можна використовувати і модифікувати з отриманням стабільних трансгенних рослин ряду цільових культур, які представляють інтерес. Е. Трансгенне насіння У деяких втіленнях трансгенне насіння може містити поліпептид дельта-9-десатурази, який включає в себе амінокислотну послідовність щонайменше на 80% ідентичну послідовності, вибраної з групи, яка складається з SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 72 і SEQ ID NO: 73. У вказаних і інших втіленнях трансгенне насіння може містити нуклеотидну послідовність щонайменше на 60% ідентичну послідовності, вибраної з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, 13 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48 і SEQ ID NO: 49. У деяких втіленнях трансгенне насіння може містити знижені рівні насичених жирних кислот (таких як пальмітинова жирна кислота і/або стеаринова жирна кислота). Насіння можна зібрати з фертильної трансгенної рослини і використати його для вирощування потомственних поколінь трансформованих рослин, які включають в себе лінії гібридних рослин, які містять щонайменше одну нуклеотидну послідовність з описаних вище і, необов'язково, один додатковий ген або нуклеотидну конструкцію, яка представляє інтерес. Нижченаведені приклади приведені для ілюстрації деяких конкретних ознак і/або втілень. Вказані приклади не треба тлумачити як обмеження винаходу конкретними описаними ознаками або втіленнями. ПРИКЛАДИ Приклад I: Клонування ацил-СоА дельта-9-десатураз і функціональна характеризація olelдефіцитних дріжджів Клонування ацил-СоА дельта-9-десатураз Magnaporthe grisea Ген ацил-СоА дельта-9-десатурази Magnaporthe grisea (MgD9DS) виділяють з геномної ДНК з використанням праймерів на основі послідовності, опублікованої NCBI/Broad Institute, початково відміченої як "гіпотетичний білок" і на 55,4% ідентичної на нуклеотидному рівні ацилСоА дельта-9-десатуразі S. cerevisiae (тобто OLE1). Конструюють прямий і зворотний праймери, кожен з яких містить 41 пару основ в довжину. Прямий праймер, MgΔ9F (SEQ ID NO: 1), містить ділянку EcoRI на 5'-кінці. Зворотний праймер, Mg9AR (SEQ ID NO:2), містить стоп-кодони в кожній з три рамок зчитування і кінцеву ділянку XhoI. Ген MgD9DS ампліфікують методом ПЛР, використовуючи набір для ПЛР Takara EZ Taq™ (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan) стосовно інструкції виробника. Умови ампліфікації включають в себе 94ºС протягом 1 хвилини, потім 30 циклів по 94°С протягом 30 сек, 60°С протягом 60 секунд і подовження при 72°С протягом 90 секунд. Стадію кінцевого подовження проводять при 72°С протягом 10 хвилин. Передбачуваний продукт ПЛР розміром 1425 пар основ вирізають з агарозного гелю і очищають, використовуючи обертові колонки Montage стосовно рекомендацій виробника (Millipore, Billerica, MA). Очищений фрагмент клонують у векторі клонування pCR®2.1 TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Продукт реакції TOPO вводять в хімічно компетентні клітини Е. coli Top 10 в умовах, які рекомендуються постачальником. Виділяють бактеріальні колонії, які містять передбачуваний клон. За допомогою набору для виділення ДНК Macherey-Nagel Nucleospin (Machery-Nagel, Neumann-Neander-Strasse, Diiren, Germany) отримують міні-плазміди, після чого ДНК розщеплюють рестрикційними ферментами EcoRI і XhoI. Ідентифікують позитивні клони, які містять очікуваний фрагмент гена MgD9DS розміром 1425 п.о. Нуклеотидну послідовність отримують шляхом реакцій секвенування. Послідовність ПЛР-ампліфікованого фрагмента приведена в SEQ ID NO: 3. Аналіз послідовності показує наявність невеликого (90 п.о.) інтрону, розташованого на 5'кінці гена MgD9DS. Інтрон видаляють методом сплайсинг-ПЛР з подовженням і перекриттям. Отриманий методом ПЛР амплікон очищають в гелі, клонують у векторі клонування pCR®2.1 TOPO® і використовують для трансформації клітин Е. coli Top 10. Деякі клони ідентифікують шляхом аналізу з розщепленням очищеної ДНК з окремих трансформантних колоній ферментами рестрикції. Вказані клони секвенують, щоб підтвердити присутність клону MgD9DS, який не містить інтрон. Отримана послідовність приведена в SEQ ID NO: 4. Кожен з генів MgD9DS, який містить, так і не містить інтрон, субклонують у вигляді фрагмента EcoRIIXhoI в дріжджовому векторі експресії. Вказаний дріжджовий вектор експресії містить ген дельта-9-десатурази Aspergillus nidulans (AnD9DS), фланкований промотором дельта-9-десатурази S. cerevisiae і 3'UTR/термінатором дельта-9-десатурази. З гена дельта-9десатурази Aspergillus nidulans вирізають фрагмент EcoRI/XhoI, який замінюють фрагментом, який містить ген MgD9DS, або ген MgD9DS, який не містить інтрон. Два клони, які містять ген MgD9DS (один з інтроном, інший без інтрону), використовують для трансформації S. cerevisiae. Дефіцитний по дельта-9-десатуразі штам S. cerevisiae (OFY093), який підтримують на дріжджовому екстракт-пептон-декстрозному (YPD) середовищі, яке містить Tween® 80, трансформують, використовуючи набір для трансформації дріжджів Alkali-Cation (Qbiogene, Montreal, Canada). Доповнені штами ідентифікують по зростанню в середовищі, яке не містить Tween® 80 (мононенасичена жирна кислота як доповнення) або урацил (випадання основи в присутності агару, який містить SC-URA). Доповнені штами очищають до окремих колоній на селективному середовищі три рази. Потім доповнені штами перевіряють шляхом ПЛРампліфікації гена дельта-9-десатурази і секвенування продукту ПЛР. Крім того, штами, які містять клон MgD9DS, повертаються до жирнокислотної і урацильної залежності щонайменше 14 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 після три пасажів на середовищі YPD + Tween® 80, з подальшим приведенням штамів в контакт з середовищем DOBA SC-URA мінус Tween® 80. Експресія інтронвмісної MgD9DS-кодуючої послідовності відсутня, це свідчить про те, що інтрон не піддається сплайсингу по дріжджовому механізму. Потім шляхом аналізу FAME характеризують субстратну специфічність дріжджового штаму, який містить MgD9DS-кодуючу послідовність, в якій відсутній інтрон. Клонування ацил-СоА дельта-9-десатураз Leptosphaeria nodorum За допомогою програми пошуку BlastN з колекції EST L. nodorum вибирають дві послідовності EST Leptosphaeria nodorum (1246 і 429 пар основ, відповідно), які мають високий рівень ідентичності (54,0% і 54,2%, відповідно) відносно ацил-СоА дельта-9-десатурази S. cerevisiae (OLE1). Результати вирівнювання показують, що ці послідовності є на 64,6% ідентичними одна одній, дозволяючи передбачити присутність двох різних ацил-СоА дельта-9десатураз Leptosphaeria nodorum. Ген LnD9DS-1 (SEQ ID NO:5) виділяють шляхом скринінгу бібліотеки кДНК L. nodorum з використанням генного зонда розміром 1246 п.о. Визначають послідовність даного гена і виділяють кодуючу послідовність. Пвнорозмірну послідовність гена LnD9DS-2 спочатку вибирають з геномних послідовностей Leptosphaeria nodorum, опублікованих Broad Institute, шляхом пошуку BLAST з використанням послідовності EST розміром 429 п.о. Продукт пошуку, ідентифікований Supercontig Ln 1.4 як такий, що містить ген, який має 100% гомологію відносно фрагмента розміром 429 п.о., де вказаний ген позначають як кодуючий "гіпотетичний білок". Потім ген LnD9DS-2 клонують з бібліотеки кДНК Leptosphaeria nodorum, використовуючи ПЛР-праймери на основі послідовності Ln 1.4 supercontig. Використовують праймери з послідовностями Lnd9FAD2F (SEQ ID NО: 6) і Lnd9FAD2R (SEQ ID NO: 7). Прямий праймер конструюють з використанням ділянки 5'-BamHI, а зворотний праймер містить стоп-кодони в три рамках зчитування і кінцеву ділянку NcoI. Аліквоту бібліотеки кДНК Leptosphaeria nodorum розбавляють 1/10 з отриманням 400 нг матриці ДНК для реакції ПЛР. ПЛР-ампліфікацію проводять, використовуючи набір для ПЛР Takara EZ Taq™ і рекомендовані умови ампліфікації, які включають в себе 94°С протягом 1 хвилини, потім 30 циклів по 94°С протягом 30 сек, 60°С протягом 60 секунд і подовження при 72°С протягом 90 секунд. Стадію кінцевого подовження проводять при 72°С протягом 10 хвилин. Передбачуваний продукт ПЛР розміром 1370 пар основ вирізають з агарозного гелю і очищають, використовуючи обертові колонки Montage стосовно рекомендацій виробника. Очищений фрагмент клонують у векторі клонування pCR®2.1 TOPO®. Продукт лігування вводять в хімічно компетентні клітини Е. coli Top 10 стосовно інструкцій виробника. Виділяють колонії, які містять передбачуваний клон. За допомогою колонок Macherey-Nagel Nucleospin отримують міні-плазміди, після чого ДНК розщеплюють рестрикційними ферментами BamHI і NcoI. Передбачувані клони LnD9DS-2 ідентифікують і секвенують. Секвенуванням підтверджують послідовність клону LnD9DS-2 (SEQ ID NO:8) шляхом порівняння з послідовністю "гіпотетичного білка". Ідентифікують консервативну зміну в послідовності LnD9DS-2. Кодон TGC (цистеїн) змінюють на AGC (серин) шляхом заміни тимідину аденіном в положенні 271, вказаний кодон транслюється в амінокислоту 89 опублікованої послідовності. Ця консервативна зміна, а цистеїн не є висококонсервативною амінокислотою серед множини нитчастих грибів, тому спроби внести таку зміну не роблять. Гени LnD9DS-1 і LnD9DS-2, SEQ ID NO:5 і 8 відповідно, клонують в дріжджовом векторі експресії. Вміст однієї з кодуючих послідовностей LnD9DS-1 і LnD9DS-2 в клонах підтверджують рестрикційним аналізом і секвенуванням ДНК. Дефіцитний по дельта-9-десатуразі штам S. cerevisiae (OFY093), який підтримують на середовищі YPD, яке містить Tween® 80, трансформують, використовуючи набір для трансформації дріжджів Alkali-Cation, Qbiogene. Доповнені штами ідентифікують по зростанню в середовищі, яке не містить Tween® 80 (мононенасичена жирна кислота як доповнення) або урацил (DOBA sc-ura). Доповнені штами очищають до окремих колоній на селективному середовищі три рази. Потім доповнені штами перевіряють шляхом ПЛР-ампліфікації гена дельта-9-десатурази і секвенування продукту ПЛР. Крім того, штами, які містять клон LnD9DS-2, повертаються до жирнокислотної і урацильної залежності щонайменше після три пасажів на середовищі YPD + Tween® 80, з подальшим приведенням штамів в контакт зі середовищем DOBA SC-URA мінус Tween® 80. Потім за допомогою аналізу FAME характеризують субстратну специфічність дріжджових штамів, які містять кодуючу послідовність LnD9DS-1 або LnD9DS-2. Клонування дефіцитного по дельта-9-десатуразі штаму S. cerevisiae і трансформація його геном HzD9DS Оптимізований для рослини синтетичний ген, який кодує ацил-СоА дельта-9-десатуразу Helicoverpa zea (HzD9DS) (ідентифікований як HzPGDS2 в Rosenfield et al. (2001) Insect 15 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Biochem. Mol. Biol. 31(10):949-64), вирізають з DASPIC089 (описаний нижче) у вигляді фрагмента BamHI/XhoI і очищають в гелі, використовуючи обертові колонки Montage. Отриманий фрагмент лігують у відповідні ділянки рестрикції описаного раніше дріжджового вектора експресії і використовують для трансформації штаму Е. coli DH5a за допомогою стандартних методів молекулярної біології і стосовно інструкцій постачальників (Invitrogen, Carlsbad, CA). Використовуючи рестрикціний аналіз і ДНК-секвенування, вибирають клон, який містить ген HzD9DS, і здійснюють його трансформацію в дефіцитний по дельта-9-десатуразі штам S. cerevisiae, OFY093. Штам OFY093, який підтримують на середовищі YPD, яке містить Tween® 80, трансформують за допомогою набору для трансформації дріжджів Alkali-Cation, Qbiogene. Доповнені штами ідентифікують по зростанню в середовищі, яке не містить Tween® 80 (жирна кислота як доповнення) і урацил (DOBA SC-URA). Передбачувані доповнені штами очищають до окремих колоній на селективному середовищі три рази. Потім доповнені штами перевіряють шляхом: i) екстракції плазмідної ДНК за допомогою набору для виділення плазмід Qbiogene Yeast і подальшої ПЛР-ампліфікації з використанням праймерів, специфічних до гена HzD9DS; ii) секвенування генів HzD9DS-специфічного продукту ПЛР; і iii) повернення штаму до жирнокислотної і URA-3-залежності шляхом пасажів штаму щонайменше три рази на середовищі YPD + Tween® 80, з подальшим приведенням штамів в контакт зі середовищем DOBA SC-URA мінус Tween® 80. Потім за допомогою аналізу FAME характеризують субстратну специфічність перевіреного доповненого дріжджового штаму HzD9DS. Аналіз LnD9DS-1, LnD9DS-2, MgD9DS і HzD9DS, експресованих в OLE 1-дефіцитному дріжджовому штамі Як описано вище, три типових гени ацил-СоА дельта-9-десатурази (D9DS) клонують з фітопатогенних грибів, Magnaporthe grisea (MgD9DS) і Leptosphaeria nodorum (LnD9DS-1 і LnD9DS-2). Вказані гени і білки, які кодуються ними раніше не були охарактеризовані. Ацил-СоА дельта-9-десатурази каталізують утворення цис-подвійного зв'язку між 9 і 10 атомами вуглецю тіоефірів насичених жирних кислот, які містять 14, 16 і 18 атомів вуглецю, і коферменту А, з отриманням тетрадеценової (14:1), гексадеценової (16:1) або олеїнової кислоти (18:1), відповідно. Ефекти, пов'язані з організм-специфічною біологією, усуваються шляхом експресії генів різних грибкових ацил-СоА дельта-9-десатураз в одному біологічному середовищі. Так, експресія генів грибкових ацил-СоА дельта-9-десатураз здійснюється з використанням промотору ендогенного гена olel в пальмітоїл-стеароїл-СоА-десатуразу (OLE1)-дефіцитному дріжджовому штамі OFY093. Таким чином, відмінності, які спостерігаються в даній системі в специфічності до субстрат-жирних кислот пов'язані з конкретними грибковими дельта-9десатуразами, експресованими в доповненому штамі S. cerevisiae. Визначають субстратні специфічності CoA-десатураз MgD9DS, LnD9DS-1 і LnD9DS-2, експресованих в доповнених штамах OYF093, в порівнянні з штамом OFY093, доповненим AnD9DS (sdeA), описаним в WO/1999/050430. Дріжджову експресійну конструкцію, яка містить ген AnD9DS, експресія якого керована промотором гена olel, використовують для трансформації штаму S. cerevisiae OFY093 і експресують за описаним вище способом. Доповнені штами S. cerevisiae вирощують в мінімальному середовищі, яке не містить жирні кислоти, при 30°С протягом 24 годин. Промиті і ліофілізовані клітинні осади піддають кількісному аналізу FAME. Результати даного аналізу показані в таблиці 1 LnD9DS-2 гарантують утворення C14:1 і C16:1, тоді як LnD9DS-1 і MgD9DS віддають перевагу C18:0, на що вказує співвідношення жирних кислот C16:1/18:1, отримане внаслідок аналізу жирнокислотного складу дріжджів. 16 UA 115302 C2 Таблиця 1 Порівняння жирнокислотного складу olel-дефіцитних дріжджів, експресуючих чотири різні грибкові десатурази Десатураза LnD9DS-l LnD9DS-2 AnD9DS MgD9DS дріжджі дикого типу olel-null + Tween® 80 Пустий вектор + Tween® 80 5 10 15 20 25 30 35 C14:0 C14:1 С16:0 С16:1 С18:0 С18:1 1,5 1,0 0,5 0,5 0,0 0,1 0,0 0,0 36,5 26,6 26,3 22,7 8,7 38,1 7,8 9,1 1,8 6,3 2,0 1,8 51,5 27,9 63,4 65,9 0,6 0,0 9,6 38,6 6,9 0,4 38,0 10,9 7,8 0,3 40,3 8,7 8,7 С16:1/ 18:1 0,17 1,37 0,12 0,14 40,4 2,2 С18:1/ 18:0 28,2 4,4 31,7 37,0 44,3 2,6 С16:1/ 16:0 0,2 1,4 0,3 0,4 39,8 Потім нові десатурази порівнюють з нативною стеароїл-СоА дельта-9-десатуразою S. cerevisiae (olel), перенесеної в середовище, яке використовується для рекомбінантної експресії. Конструюють дріжджовий вектор експресії, який містить нуклеотидну послідовність S. Cerevisiae, описану в WO/2000/011012. Дріжджову експресійну конструкцію, яка містить нативну стеароїл-СоА дельта-9-десатуразу S. Cerevisiae, використовують для трансформації штаму S. cerevisiae OFY093 і експресують за описаним вище способом. У даних експериментах також аналізують іншу, не грибкову ацил-СоА дельта-9-десатуразу, отриману з комах, які належать до різновидів Helicoverpa zea (HzD9DS). Доповнені штами S. cerevisiae, які містять один з генів MgD9DS, LnD9DS-2 і HzD9DS, вирощують у виснаженому бульйоні SC-URA. Контрольний штам pDAB467EV-1 (OFY093, трансформований pDAB467B/N за описаним раніше способом трансформації дріжджів) вирощують в DOB SC-URA + Tween® 80, а висхідний, дефіцитний по дельта-9-десатуразі штам S. cerevisiae, OFY093, вирощують в середовищі DOB scAA + Tween® 80. У культури вносять смужки клітин, свіжоотримані з планшета, який містить таке ж середовище і 1,5% агар. Штами вирощують при 30°С протягом 24 годин. Культури центрифугують при 6000 об/хв протягом 10 хвилин. Осади промивають водою, знов центрифугують при 6000 об/хв протягом 10 хвилин і потім заморожують при -20°С до проведення аналізу FAME. Аналізують три ряди експресійних культур. Висушені із замороженого стану дріжджові осадки омилюють в метанолі, який містить 10% (мас/об) NaOH. Неомилені ліпідні домішки (стероли) видаляють гексаном. Метанольну фракцію підкислюють додаванням H2S04 і протоновані жирні кислоти екстрагують гексаном. Виділену гексанову фракцію висушують, жирні кислоти метилують 0,5 N MeOHCl при 80°С протягом 30 хвилин. Отримані FAME екстрагують гексаном, який містить метиловий ефір ундеканової кислоти як внутрішній стандарт. Екстракти FAME аналізують за допомогою газового хроматографа з полум'яно-іонізаційним детектором FIP6890 (Santa Clara, CA), обладнаним капілярною колонкою BPX 70 (15 м × 0,25 мм × 0,25 мкм), SGE (Austin, TX). FAME розділяють в температурному градієнті, використовуючи гелій як газ-носій. Кожен зразок FAME ідентифікують за часом втримання і кількісно визначають шляхом введення стандартної суміші FAME ріпакової олії Matreya, LLC (Pleasant Gap, PA) як калібрувального стандарту. Таблиця 2 описує жирнокислотний склад (у вигляді %FAME) olel-дефіцитних дріжджових клітин OFY093, експресуючих різні типові ацил Co-A дельта-9-десатурази. Всі штами добре ростуть, є доповненими введеними десатуразами і не вимагають ендогенних MUFA (мононенасичені жирні кислоти). 17 UA 115302 C2 Таблиця 2 Жирнокислотний склад (у вигляді % від загального вмісту FAME) olel-дефіцитного дріжджового штаму OFY093, експресуючого ацил-Со-А дельта-9-десатурази (в дужках приведене стандартне відхилення) Десатураза n C14:0 C14:l C16:0 С16:1 С18:0 С18:1 LnD9DS-2 7 1,4 (0,7) 1,4 (1,0) 26,6 (4,5) 38,8 (2,8) 6,0 (1,3) 25,4 (4,4) HzD9DS 6 2,6 (1,3) 0,9 (0,5) 34,7 (6,8) 37,5 (4,2) 6,0 (1,1) 18,4 (4,1) olel 6 1,1 (0,4) 0,6 (0,4) 14,4 (2,6) 49,2 (1,6) 5,6 (1,1) 24,0 (1,1) AnD9DS 8 0,5 (0,3) 0,2 (0,2) 23,5 (2,2) 9,3 (3,0) 2,1 (0,5) 64,6 (3,2) MgD9DS 2 0,9 (0,0) 0,1 (0,0) 21,2 (0,2) 12,1 (0,1) 1,6 (0,1) 64,2 (0,3) 5 10 Приведені дані показують, що жирнокислотний склад доповнених дріжджових штамів варіює залежно від введеного гена. LnD9DS-2 продукує відносно високі кількості C16:1, як і HzD9DS і olel, тоді як AnD9DS і MgD9DS продукують відносно високі кількості C18:1. Різний рівень перетворення залежно від довжини ланцюга можна додатково продемонструвати шляхом розрахунку частки MUFA для кожної жирної кислоти з довжиною ланцюга C14, C16 або C18, відносно загального вмісту жирних кислот. Отримані дані демонструють відносно високий рівень перетворення в C16:1 під дією LnD9DS-2 і HzD9DS, і в C18:1 під дією AnD9DS і MgD9DS. Таблиця 3. У чотири нижніх рядах приведені результати для контрольних зразків, доповнених тергітолом, ненасиченими жирними кислотами або Tween®. Зразки з різними буквами відрізняються значною мірою за результатами тесту Tukey-Kramer, який проводиться в комплекті статистичного програмного забезпечення JMP (SAS Institute Inc., Cary, NC). 15 Таблиця 3 Частина MUFA в загальному вмісті жирних кислот кожної довжини ланцюга (Cxx:1/(Cxx:0+Cxx:1) Десатураза LnD9DS-2 HzD9DS olel AnD9DS MgD9DS Пустий зразок + тергітол Пустий зразок + тергітол + рицинолеїнова кислота Пустий зразок + тергітол + лінолева кислота Пустий зразок + твін C14 0,49 0,30 0,34 0,25 0,07 0,06 0,07 0 0,65 C16* 0,60 (b) 0,52 (b) 0,79 (a) 0,28 (з) 0,36 (з) 0 0 0 0,23 C18 0,81 (b) 0,75 (з) 0,81 (b) 0,97 (a) 0,98 (a) 0 0,01 0,04 0,87 * C16 MUFA включають в себе цис-вакценову кислоту (C18:1Δ11), отриману в результаті подовження пальмітолеїнової кислоти (C16:1Δ9) 20 25 30 Філогенез грибкових ацил-СоА десатураз Філогенетичний аналіз декількох амінокислотних послідовностей грибкових ацил-СоА дельта-9-десатураз дозволяє передбачити, що LnD9DS-2 відрізняється від дельта-9-десатураз, які віддають перевагу 18:0. Таким чином, автори висунули гіпотезу, що характеристика інших грибкових дельта-9-десатураз, тісно пов'язаних або з дельта-9-десатуразами, які віддають перевагу 18:0, або з LnD9DS-2, може призвести до ідентифікації десатураз з діапазоном активності відносно 18:0 або 16:0. Дана гіпотеза дозволяє передбачити, що грибкова дельта-9десатураза, більш тісно пов'язана з LnD9DS-2, буде мати підвищену активність відносно 16:0. Пошук в загальнодоступних базах даних за послідовностями ДНК (Broad Institute, NCBI, etc.) не виявив ніяких генних послідовностей, які спеціально позначаються як дельта-9-десатурази Magnaporthe grisea або Leptosphaeria nodorum. Pfam аналіз послідовностей Broad Institute, ідентифікованих в даному описі, свідчить про те, що вказані білки містять цитохром B5 і мотиви десатурази, які також виявлені в інших грибкових ацил-СоА дельта-9-десатуразах. Однак вказані білки не були раніше ідентифіковані як ацил-СоА дельта-9-десатурази. Автори продемонстрували наявність даної функції у вказаних білків шляхом доповнення в дріжджах, зворотних досліджень і аналізу послідовностей ДНК. 18 UA 115302 C2 5 10 15 Взаємовідносини деяких генних послідовностей грибкових десатураз аналізують філогенетично, використовуючи метод з'єднання сусідніх послідовностей за допомогою програмного забезпечення MEGA. Tamura et al. (2007) Mol. Biol. and Evolution 24:1596-9. На фіг. 1 показані результати філогенетичного аналізу послідовностей грибкових десатураз. Вказані послідовності ідентифікують шляхом BlastN-пошуку в базі даних NCBI з використанням амінокислотної послідовності AnD9DS (sdeA). LnD9DS-1 і MgD9DS мають більш високий рівень ідентичності послідовностей, ніж LnD9DS-2. Крім того, вирівнювання LnD9DS-1, LnD9DS-2 і MgD9DS з використанням ClustalW показує відмінність LnD9DS-2 від LnD9DS-1 і MgD9DS. Фіг. 2. Нуклеотидні послідовності LnD9DS-1 і MgD9DS містять більш високе число однакових пар основ. Таблиця 4 і фіг. 3 додатково ілюструють філогенетичний взаємозв'язок ідентифікованих білків, LnD9DS-1, LnD9DS-2 і MgD9DS, а також AnD9DS і дріжджової десатурази ScOLE1. Амінокислотні послідовності LnD9DS-1, MgD9DS і AnD9DS (sdeA) мають більш високий процент ідентичності відносно один до одного, ніж LnD9DS-2. Консервація амінокислотної ідентичності дозволяє передбачити, що субстратна специфічність відносно 18:0 ацил-СоА залежить від консервативної послідовності, загальної для LnD9DS-1, MgD9DS і AnD9DS (sdeA). І навпаки, ацил-СоА-субстратна специфічність LnD9DS-2 переважно направлена на 16:0 внаслідок дивергенції її амінокислотної послідовності. Таблиця 4 Амінокислотна ідентичність різних послідовностей грибкових десатураз, вирівняних з використанням ClustalW AnD9DS (sdeA) LnD9DS-l LnD9DS-2 MgD9DS LnD9DS-l 81% -61% 75% LnD9DS-2 61% 61% -62% MgD9DS 75% 75% 62% - Дріжджова OLE1 49% 47% 49% 49% 20 25 30 35 40 45 Приклад 2: Конструювання і синтез оптимізованих генів дельта-9-десатурази Magnaporthe grisea, Helicoverpa zea і Leptosphaeria nodorum Щоб досягнути підвищеної експресії генів грибкової дельта-9-десатурази в канолі, автори конструюють вказані гени так, щоб вони більш ефективно експресувались в клітинах трансгенної каноли, які містять гетерологічний ген. Екстенсивний аналіз послідовностей ділянок ДНК, які кодують нативну дельта-9-десатуразу Magnaporthe grisea, Helicoverpa zea і Leptosphaeria nodorum, розкритих в даному документі як SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 11, відповідно, свідчить про присутність декількох мотивів послідовності, які ймовірно перешкоджають оптимальній експресії в рослині, а також неоптимального складу кодонів для такої експресії в рослині. Щоб сконструювати оптимізовані гени, які кодують білок дельта-9десатуразу, автори отримують послідовності ДНК in silico, які є більш "подібні рослинним" (а саме, більш "канолу-подібними") за природою, де модифікації послідовності не перешкоджають трансляції, або не призводять до утворення нестабільних мРНК. Щоб сконструювати оптимізовані для рослини гени, які кодують дельта-9-десатуразу, отримують послідовності ДНК, які кодують амінокислотні послідовності білків десатураз, з використанням надмірного генетичного коду, визначеного за допомогою таблиці зміщень кодонів, складеної на основі послідовностей, які кодують білки конкретних рослин-хазяїнів (тобто каноли). Кодони, які переважно використовуються в канолі, показані в таблиці 5. В колонках С і G таблиці 5 показано розподіл (у % від застосування всіх кодонів для конкретної амінокислоти) синонімічних кодонів для кожної амінокислоти, виявлений в кодуючих ділянках Brassica napus. Відомо, що деякі синонімічні кодони, які кодують деякі амінокислоти, рідко зустрічаються в генах рослин (наприклад, CGG в канолі). Вважається, що кодон рідко використовується, якщо його трапляння в генах рослини будь-якого типу становить приблизно 10% або менше від діапазону кодування відповідної амінокислоти (означають "DNU" в колонках D і Н таблиці 5). Щоб оцінити розподіл кодонів інших виборів, які кодують амінокислоту, для кожного кодону розраховують середньозважене значення за формулою: Середньозважене значення %C1 = 1/(%C1+%C2+%C3+інш.)×%C1×100, 19 UA 115302 C2 де C1 означає кодон, який аналізується, а %C2, %C3, і інш. означає середні значення % інших синонімічних кодонів в Brassica napus (середні значення % відповідних кодонів беруть з колонок С і G таблиці 5). Середньозважене значення % для кожного кодону беруть в колонках D і Н таблиці 5. 5 Таблиця 5 Трапляння синонімічних кодонів в кодуючих ділянках генів каноли (B. napus) (колонки C і G). Значння трапляння збалансованих-зміщених кодонів, визначення для конструкції оптимізованого для рослини синтетичного гена, приведені у колонках D і H С D E F G H Канола Середньозважене Канола Середньозважене Амінокислота Кодон Амінокислота Кодон % значення % значення GCA 23,3 23,3 СТА 10,1 DNU GCC 21,2 21,2 CTC 22,8 28,5 ALA (A) GCG 14,2 14,2 CTG 11,6 14,6 LEU (L) GCT 41,3 41,3 CTT 25,2 31,6 AGA 31,8 43,8 TTA 10,1 DNU AGG 22,1 30,5 TTG 20,2 25,3 CGA 9,9 DNU AAA 44,6 44,6 LYS(K) ARG (R) CGC 8,9 DNU AAG 55,4 55,4 MET CGG 8,6 DNU ATG 100,0 100,0 (M) CGT 18,6 25,7 ITC 58,6 58,6 PHE (F) AAC 62,6 62,6 ТТТ 41,4 41,4 ASN (N) AAT 37,4 37,4 CCA 29,6 29,6 GAC 42,5 42,5 CCC 14,6 14,6 ASP (D) PRO (P) GAT 57,5 57,5 CCG 18,4 18,4 TGC 49,2 49,2 CCT 37,3 37,3 CYS (C) TGT 50,8 50,8 AGC 16,0 17,9 TAA 38,5 DNU AGT 14,1 15,8 END TAG 22,1 DNU TCA 18,2 20,4 SER (S) TGA 39,4 100,0 TCC 16,7 18,7 CAA 50,0 50,0 TCG 10,7 DNU GLN (Q) CAG 50,0 50,0 TCT 24,3 27,2 GAA 43,6 43,6 АСА 26,3 26,3 GLU (E) GAG 56,4 56,4 ACC 26,9 26,9 THR(T) GGA 36,4 36,4 ACG 16,9 16,9 GGC 16,2 16,2 ACT 30,0 30,0 GLY (G) GGG 15,2 15,2 TRP (W) TGG 100,0 100,0 GGT 32,1 32,1 TAC 59,4 59,4 TYR (Y) CAC 49,6 49,6 TAT 40,6 40,6 HIS(H) CAT 50,4 50,4 GTA 10,8 DNU ATA 21,1 21,1 GTC 24,1 27,0 VAL (V) ILE(I) АТС 42,7 42,7 GTG 28,3 31,7 ATT 36,2 36,2 GTT 36,8 41,3 A В **NA = Не застосовується ***DNU = Не застосовується 10 Нові послідовності ДНК, які головним чином кодують амінокислотні послідовності дельта-9десатураз Magnaporthe grisea, Helicoverpa zea і Leptosphaeria nodorum, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 14 відповідно, конструюють для оптимальної експресії в канолі, використовуючи розподіл кодонів першого і другого виборів як кодони, які часто використовуються в генах каноли. Нові послідовності ДНК відрізняються від нативних послідовностей ДНК, які кодують білки дельта-9-десатурази, присутністю кодонів, переважних рослиною (тобто, кодонів першої переваги, другої переваги, третьої переваги або четвертої 20 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 переваги) для кодування відповідної амінокислоти в кожному положенні амінокислотної послідовності білка. Конструювання оптимізованих для рослини послідовностей ДНК ініціюють шляхом зворотної трансляції білкових послідовностей SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 14, використовуючи таблицю зміщення кодонів в канолі, складену з колонок D і Н таблиці 5. Потім початкові послідовності модифікують шляхом компенсуючих змін кодонів (при збереженні загального середньозваженого трапляння кодону), щоб видалити ділянки розпізнавання ферментами рестрикції, високостабільні внутрішньоланцюжкові повторні структури і інші послідовності, які можуть впливати шкідливий чином на маніпуляції по клонуванню або експресію рекомбінантнго гена в рослинах. Потім послідовності ДНК повторно аналізують на ділянки розпізнавання ферментами рестрикції, які можуть виникати в процесі введення модифікацій. Потім ідентифіковані ділянки додатково модифікують шляхом заміни відповідних кодонів переважними кодонами першого, другого, третього або четвертого вибору. Модифіковані послідовності додатково аналізують і додатково модифікують, щоб зменшити трапляння дублетів TA і CG і збільшити трапляння дублетів TG і CT. Крім вказаних дублетів, ділянки послідовності, які містять більш ніж приблизно шість послідовних залишків [G+С] або [А+Т], модифікують шляхом заміни кодонів першого або другого і інш. вибору на переважні кодони іншого вибору. При конструюванні гена рідко використовувані кодони не включають в його склад в істотній мірі, їх використовують тільки при необхідності застосування критерію конструювання, відмінного від складу кодонів як такого (такого як додавання або делеція ділянок розпізнавання ферментами рестрикції). Приклади сконструйованих за допомогою описаного способу синтетичних оптимізованих для каноли послідовностей ДНК, які кодують десатурази, описані в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 і SEQ ID NO: 17. Отримані послідовності ДНК, описані в SEQ ID NO: 15-17, мають підвищену міру різноманітності кодонів і бажаний склад основ. Крім того, вказані послідовності містять стратегічно розміщені ділянки розпізнавання ферментами рестрикції і не містять послідовності, які можуть перешкоджати транскрипції гена або трансляціям продукту мРНК. У таблицях 6-8 порівнюють вміст кодонів в ділянках, які кодують білки дельта-9-десатурази, які присутні в нативному гені і в його оптимізованих для рослин версіях, і потім ті і інші порівнюють з рекомендаціями за вмістом кодонів для рослинно-оптимізованої послідовності, розрахованими з використанням даних, приведених в колонках D і Н таблиці 5. Таблиця 6 Вміст кодонів в ділянках, які кодують білок MgD9DS Нативну ділянку, яка кодує десатуразу M grisa порівнюють з оптимізованою для рослини версією Аміноки- Кодон слота ALA (A) ARG (R) GCA GCC GCG GCT AGA AGG CGA CGC CGG ASN (N) ASP (D) CYS (C) END CGT AAC AAT GAC GAT TGC TGT TAA TAG РекомендоЧисло у %у ваний оптиміЧисло % у оптимізо- склад зоваАміноу нати- нативваному оптиміному кисвному ному для зованої для лота гені гені рослини для рослигені рослини ни гені послідовності 4 10,5 10 26,3 23,3 18 47,4 8 21,1 21,2 3 7,9 4 10,5 14,2 LEU 13 34,2 16 42,1 41,3 (L) 2 9,5 10 47,6 43,8 1 4,8 6 28,6 30,5 2 9,5 0 0,0 0,0 LYS (K) 12 57,1 0 0,0 0,0 MET 0 0,0 0 0,0 0,0 (M) 4 19,0 5 23,8 25,7 PHE 23 100.0 14 60,9 62,6 (F) 0 0,0 9 39,1 37,4 17 68,0 11 44,0 42,5 PRO 8 32,0 14 56,0 57,5 (Р) 2 66,7 1 33,3 49,2 1 33,3 2 66,7 50,8 SER 0 0,0 0 0,0 0,0 (S) 0 0,0 0 0,0 0,0 21 Рекомендов Число у %у аний склад оптимі- оптиміЧисло у %у оптимізозованому зованому Кодон натино- нативваної для для для му гені ному гені рослини рослини рослини послідогені гені вності СТА CTC CTG CTT TTA TTG AAA AAG 0 11 11 12 0 4 1 28 0,0 28,9 28,9 31,6 0,0 10,5 3,4 96,6 0 11 5 12 0 10 13 16 0,0 28,9 13,2 31,6 0,0 26,3 44,8 55,2 0,0 28,5 14,6 31,6 0,0 25,3 44,6 55,4 ATG 7 100 7 100 100,0 TTC TTT CCA CCC CCG CCT AGC AGT TCA 17 2 0 9 5 7 3 0 5 89,5 10,5 0,0 42,9 23,8 33,3 10,7 0,0 17,9 11 8 6 3 4 8 5 4 7 57,9 42,1 28,6 14,3 19,0 38,1 17,9 14,3 25,0 58,6 41,4 29,6 14,6 18,4 37,3 17,9 15,8 20,4 UA 115302 C2 Таблиця 6 Вміст кодонів в ділянках, які кодують білок MgD9DS Нативну ділянку, яка кодує десатуразу M grisa порівнюють з оптимізованою для рослини версією Аміноки- Кодон слота GLN (Q) GLU (E) 16 GLY (G) TGA CAA CAG GAA GAG GGA GGC GGG GGT CAC CAT ATA ILE (I) АТС ATT Всього HIS (H) РекомендоЧисло у %у ваний оптиміЧисло % у оптимізо- склад зоваАміноу нати- нативваному оптиміному кисвному ному для зованої для лота гені гені рослини для рослигені рослини ни гені послідовності 1 100,0 1 100,0 100,0 2 9,5 11 52,4 50,0 19 90,5 10 47,6 50,0 1 6,7 7 46,7 43,6 14 93,3 8 53,3 56,4 THR 8 19,5 15 36,6 36,4 (T) 13 31,7 7 17,1 16,2 TRP 1 2,4 6 14,6 15,2 (W) 19 46,3 13 31,7 32,1 TYR 19 95,0 10 50,0 49,6 (Y) 1 5,0 10 50,0 50,4 1 4,2 5 20,8 21,1 VAL 15 62,5 10 41,7 42,7 (V) 8 33,3 9 37,5 36,2 232 232 Рекомендов Число у %у аний склад оптимі- оптиміЧисло у %у оптимізозованому зованому Кодон натино- нативваної для для для му гені ному гені рослини рослини рослини послідогені гені вності TCC TCG TCT АСА ACC ACG ACT 9 9 2 4 15 1 4 32,1 32,1 7,1 16,7 62,5 4,2 16,7 4 0 8 6 7 4 7 14,3 0,0 28,6 25,0 29,2 16,7 29,2 18,7 0,0 27,2 26,3 26,9 16,9 30,0 TGG 21 100 21 100 100,0 TAC TAT GTA GTC GTG GTT Всього 16 1 1 21 4 14 94,1 5,9 2,5 52,5 10,0 35,0 10 7 0 11 13 16 58,8 41,2 0,0 27,5 32,5 40,0 59,4 40,6 0,0 27,0 31,7 41,3 244 244 Таблиця 7 Вміст кодонів у ділянках, які кодують білок HzD9DS Нативну ділянку, яка кодує десатуразу H zea, порівнюють з оптимізованою для рослини версією Число у %у Число оптимі%у оптиміАміноу зованативзованому кис- Кодон нативному ному для лота ному для гені рослини гені рослини гені гені GCA GCC GCG GCT AGA AGG ARG CGA (R) CGC CGG CGT ASN AAC (N) AAT ASP GAC (D) GAT CYS TGC (C) TGT TAA END TAG TGA GLN CAA (Q) CAG GLU GAA (E) 16 GAG GGA GLY GGC (G) GGG GGT ALA (A) 4 7 8 16 1 5 2 5 0 0 13 5 16 9 1 0 1 0 0 2 4 7 4 8 6 2 4 11,4 20,0 22,9 45,7 7,7 38,5 15,4 38,5 0,0 0,0 72,2 27,8 64,0 36,0 100,0 0,0 100,0 0,0 0,0 33,3 66,7 63,6 36,4 40,0 30,0 10,0 20,0 9 7 4 15 6 4 0 0 0 3 11 7 12 13 0 1 0 0 1 3 3 5 6 9 4 3 4 25,7 20,0 11,4 42,9 46,2 30,8 0,0 0,0 0,0 23,1 61,1 38,9 48,0 52,0 0,0 100,0 0,0 0,0 100,0 50,0 50,0 45,5 54,5 45,0 20,0 15,0 20,0 Рекомендований склад оптимізованої для рослини послідовності 23,3 21,2 14,2 41,3 43,8 30,5 0,0 0,0 0,0 25,7 62,6 37,4 42,5 57,5 49,2 50,8 0,0 0,0 100,0 50,0 50,0 43,6 56,4 36,4 16,2 15,2 32,1 Число у Число %у % у оптиміу оптимізова Амінокинати- зованом Кодон нативному для слота вному у для ному рослини гені рослини гені гені гені LEU (L) LYS (K) MET (M) PHE (F) PRO (Р) SER (S) THR (T) TRP (W) TYR (Y) 22 СТА CTC CTG CTT TTA TTG AAA AAG ATG TTC TTT CCA CCC CCG CCT AGC AGT TCA TCC TCG TCT АСА ACC ACG ACT TGG TAC 2 8 14 6 2 2 11 14 8 20 4 1 5 2 8 2 1 1 6 3 3 3 7 4 4 14 12 5,9 23,5 41,2 17,6 5,9 5,9 44,0 56,0 100 83,3 16,7 6,3 31,3 12,5 50,0 12,5 6,3 6,3 37,5 18,8 18,8 16,7 38,9 22,2 22,2 100 80,0 0 10 6 10 0 8 10 15 8 14 10 5 3 2 6 3 3 3 3 0 4 5 5 3 5 14 9 0,0 29,4 17,6 29,4 0,0 23,5 40,0 60,0 100 58,3 41,7 31,3 18,8 12,5 37,5 18,8 18,8 18,8 18,8 0,0 25,0 27,8 27,8 16,7 27,8 100 60,0 Рекомендований склад оптимізованої для рослини послідовності 0,0 28,5 14,6 31,6 0,0 25,3 44,6 55,4 100,0 58,6 41,4 2,.6 14,6 18,4 37,3 17,9 15,8 20,4 18,7 0,0 27,2 26,3 26,9 16,9 30,0 100,0 59,4 UA 115302 C2 Таблиця 7 Вміст кодонів у ділянках, які кодують білок HzD9DS Нативну ділянку, яка кодує десатуразу H zea, порівнюють з оптимізованою для рослини версією Число у %у Число оптимі%у оптиміАміноу зованативзованому кис- Кодон нативному ному для лота ному для гені рослини гені рослини гені гені CAC 11 CAT 4 ATA 3 ILE (I) АТС 10 ATT 7 Всьо165 го HIS(H) 73,3 26,7 15,0 50,0 35,0 8 7 4 9 7 53,3 46,7 20,0 45,0 35,0 165 Рекомендований Число склад у оптимізо- АмінокиКодон нативваної для слота ному рослини гені послідовності 49,6 TAT 3 50,4 GTA 0 21,1 GTC 5 VAL (V) 42,7 GTG 13 36,2 GTT 1 Всьо189 го Число у %у % у оптиміоптимізова нати- зованом ному для вному у для рослини гені рослини гені гені 20,0 0,0 26,3 68,4 5,3 6 0 5 6 8 40,0 0,0 26,3 31,6 42,1 Рекомендований склад оптимізованої для рослини послідовності 40,6 0,0 27,0 31,7 41,3 189 Таблиця 8 Вміст кодонів у ділянках, які кодують білок LnD9DS-2 Нативну ділянку, яка кодує десатуразу L nodorum порівнюють з оптимізованою для рослини версією. Амінокислота Число у %у Число оптимі%у оптимізму зоваКонативаному нативн ному дон вному для ому для гені рослини гені рослини гені гені GCA GCC GCG GCT AGA AGG CGA CGC 3 9 12 8 4 3 7 8 9,4 28,1 37,5 25,0 13,8 10,3 24,1 27,6 7 7 5 13 13 9 0 0 CGG 5 17,2 0 0,0 0,0 CGT ASN AAC (N) AAT ASP GAC (D) GAT CYS TGC (C) TGT TAA END TAG TGA GLN CAA (Q) CAG GLU GAA (E) 16 GAG GGA GGC GLY (G) GGG 2 6 6 16 8 4 1 0 1 0 10 8 5 10 13 16 6,9 50,0 50,0 66,7 33,3 80,0 20,0 0,0 100,0 0,0 55,6 44,4 33,3 66,7 34,2 42,1 7 8 4 10 14 2 3 0 0 1 10 8 7 8 14 6 24,1 66,7 33,3 41,7 58,3 40,0 60,0 0,0 0,0 100,0 55,6 44,4 46,7 53,3 36,8 15,8 25,7 62,6 37,4 42,5 57,5 49,2 50,8 0,0 0,0 100,0 50,0 50,0 43,6 56,4 36,4 16,2 6 15,8 6 15,8 15,2 7,9 66,7 33,3 18,2 40,9 40,9 12 9 9 5 10 7 31,6 50,0 50,0 22,7 45,5 31,8 32,1 49,6 50,4 21,1 42,7 36,2 ALA (A) ARG (R) GGT 3 CAC 12 CAT 6 ATA 4 ILE (I) АТС 9 ATT 9 Всьо214 го HIS (H) 21,9 21,9 15,6 40,6 44,8 31,0 0,0 0,0 Рекомендований склад оптимізмваної для рослини послідовності 23,3 21,2 14,2 41,3 43,8 30,5 0,0 0,0 Число Аміноу кис- Кодон нативлота ному гені LEU (L) LYS (K) MET (M) PHE (F) PRO (Р) SER (S) THR (T) TRP (W) TYR (Y) VAL (V) 214 23 СТА CTC CTG CTT TTA TTG AAA AAG 7 14 7 5 3 9 9 11 Число у оптимі%у зованатиному вному для гені рослини гені 15,6 31,1 15,6 11,1 6,7 20,0 45,0 55,0 0 13 7 14 0 11 9 11 %у оптимізованому для рослини гені Рекомендований склад оптимізованої для рослини послідовності 0,0 28,9 15,6 31,1 0,0 24,4 45,0 55,0 0,0 28,5 14,6 31,6 0,0 25,3 44,6 55,4 ATG 9 100 9 100 100,0 TTC TTT CCA CCC CCG CCT AGC AGT TCA TCC TCG TCT АСА ACC ACG ACT 16 4 3 8 2 5 8 6 1 6 7 1 11 5 7 2 80,0 20,0 16,7 44,4 11,1 27,8 27,6 20,7 3,4 20,7 24,1 3,4 44,0 20,0 28,0 8,0 12 8 5 3 3 7 5 5 6 5 0 8 7 7 4 7 60,0 40,0 27,8 16,7 16,7 38,9 17,2 17,2 20,7 17,2 0,0 27,6 28,0 28,0 16,0 28,0 58,6 41,4 29,6 14,6 18,4 37,3 17,9 15,8 20,4 18,7 0,0 27,2 26,3 26,9 16,9 30,0 TGG 19 100 19 100 100,0 TAC TAT GTA GTC GTG GTT Всього 11 6 6 10 12 6 64,7 35,3 17,6 29,4 35,3 17,6 10 7 0 9 11 14 58,8 41,2 0,0 26,5 32,4 41,2 59,4 40,6 0,0 27,0 31,7 41,3 236 236 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Синтез фрагментів ДНК, які містять SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 і SEQ ID NO: 17, проводять комерційні постачальники (PicoScript, Houston, TX і Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). Вказані канолу-оптимізовані послідовності означають як версія 2 (v2). Потім синтетичні фрагменти ДНК клонують у векторах експресії і використовують для трансформації Agrobacterium і каноли, як описано в приведених нижче прикладах. Приклад 3: Конструювання плазміди Вказані нижче плазміди конструюють за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Конструюють полінуклеотидні фрагменти, які містять елементи, регулюючі транскрипцію в рослинах (які включають в себе промотор, зв'язаний з геном, який представляє інтерес, який закінчується 3'UTR), або "PTU", і об'єднують їх з іншими елементами, регулюючими транскрипцію в рослинах, в Т-ланцюжковій ділянці бінарного вектору. Опис pDAB7318: pDAB7318 (фіг. 6; SEQ ID NO: 58) конструюють за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Вказана плазміда містить дві послідовності PTU десатурази. Перша послідовність PTU десатурази містить промотор фазеоліну Phaseolus vulgaris (промотор PvPhas v2 (SEQ ID NO: 67); Genbank: J01263), 5'-нетрансльована ділянка Phaseolus vulgaris (5'UTR PvPhas (SEQ ID NO: 68); Genbank: J01263), ген AnD9DS v3 (SEQ ID NO: 49), 3'нетрансльована ділянка Phaseolus vulgaris (3'-UTR PvPhas v1 (SEQ ID NO: 69); Genbank: J01263) і ділянка приєднання матриксу Phaseolus vulgaris (3'-MAR PvPhas v2 (SEQ ID NO: 70); Genbank: J01263). Друга послідовність PTU десатурази містить промотор PvPhas v2, 5'-UTR PvPhas, LnD9DS-2 v2 (SEQ ID NO: 17) і 3'-нетрансльована ділянка ORF23 Agrobacterium tumefaciens (3'-UTR AtuORF23 (SEQ ID NO: 71); Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22). Елементи PTU десатурази з’єднуються за допомогою додаткових коротких вбудованих послідовностей. Дві послідовності PTU десатурази фланкуються ділянками рекомбінації Gateway®, Invitrogen, які забезпечують перенесення вказаних експресійних касет PTU в плазміду, яка використовується для трансформації Agrobacterium. Крім того, плазміда містить точку початку реплікації і маркер селекції по канаміцину. Опис pDAB7319: pDAB7319 (фіг. 7; SEQ ID NO: 60) конструюють шляхом Gateway®рекомбінації між pDAB7318 і pDAB7309 (фіг. 5; SEQ ID NO: 53). Вказана плазміда містить дві послідовності PTU десатурази, описані в попередньому розділі "Опис pDAB7318". Вказані PTU розташовуються в орієнтації голова-хвіст в Т-ланцюжкових бордюрних ділянках ДНК бінарного вектору pDAB7309, який використовується для трансформації рослин. Цей бінарний вектор містить PTU фосфінотрицин-ацетилтрансферази, який включає в себе промотор вірусу мозаїки жилок маніоки (промотор CsVMV v2; Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-39); фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (PAT v5; Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37); і 3'нетрансльована ділянка ORF1 Agrobacterium tumefaciens (3'UTR AtuORFl v4; Huang et al. (1990), вище), в додавання до інших регуляторних елементів, таких як ділянка приєднання матриксу RB7 Nicotiana tabacum (RB7 MARv2; Genbank: U67919), овердрайв Overdrive (Toro et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(22):8558-62) і Т-ланцюжкові бордюрні послідовності (Т-ДНКбордюр А і Т-ДНК-бордюр В; Gardner et al. (1986) Science 231:725-7, і міжнародна патентна публікація PCT No. WO2001/025459A1). Плазміди, які містять описані вище PTU, виділяють і перевіряють шляхом розщеплення рестрикційними ферментами і секвенування ДНК. Опис pDAB7320: pDAB7320 (фіг. 8; SEQ ID NO:55) конструюють за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Вказана плазміда містить одну послідовність PTU десатурази. PTU десатурази містить промотор PvPhas v2, 5'-UTR PvPhas, LnD9DS-2 v2 (SEQ ID NO: 17) і 3'UTR AtuORF23. Елементи PTU десатурази з’єднуються за допомогою додаткових коротких вбудованих послідовностей. Послідовність PTU десатурази також фланкується ділянками рекомбінації Gateway®, Invitrogen, які забезпечують її перенесення в плазміду, які використовується для трансформації Agrobacterium. Крім того, плазміда містить точку початку реплікації і маркер селекції по канаміцину. Опис pDAB7321: pDAB7321 (фіг. 9; SEQ ID NO: 61) конструюють шляхом Gateway®рекомбінації між pDAB7320 і pDAB7309. Вказана плазміда містить послідовність PTU десатурази, описану в попередньому розділі "Опис pDAB7319". Вказаний PTU розташовується в орієнтації голова-хвіст в Т-ланцюжкових бордюрних ділянках ДНК бінарного вектору pDAB7309, який використовується для трансформації рослин. Цей бінарний вектор містить PTU фосфінотрицин-ацетилтрансферази: промотор CsVMV v2; PAT v5; і 3'-UTR AtuORF1 v4, в додавання до інших регуляторних елементів, таких як овердрайв і Т-ланцюжкові бордюрні послідовності (Т-ДНК-бордюр А і Т-ДНК-бордюр В). Плазміди, які містять описаний вище PTU, виділяють і перевіряють шляхом розщеплення рестрикційними ферментами і секвенування ДНК. 24 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис pDAB7323: pDAB7323 (фіг. 10; SEQ ID NO: 56) конструюють за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Вказана плазміда містить дві послідовності PTU десатурази. Перший PTU десатурази містить промотор PvPhas v2, 5'-UTR PvPhas, AnD9DS v3 (SEQ ID NO: 47), 3'-UTR PvPhas і 3'-MAR PvPhas v2. Другий PTU десатурази містить промотор PvPhas v2, 5'UTR PvPhas, HzD9DS v2 (SEQ ID NO: 16) і 3'-UTR AtuORF23. Елементи PTU десатурази з’єднуються за допомогою додаткових коротких вбудованих послідовностей. Дві послідовності PTU десатурази фланкуються ділянками рекомбінації Gateway®, Invitrogen, які забезпечують перенесення вказаних експресійних касет PTU в плазміду, яка використовується для трансформації Agrobacterium. Крім того, плазміда містить точку початку реплікації і маркер селекції по канаміцину. Опис pDAB7324: pDAB7324 (фіг. 11; SEQ ID NO: 62) конструюють шляхом Gateway®рекомбінації між pDAB7323 і pDAB7309. Вказана плазміда містить дві послідовності PTU десатурази, описані в попередньому розділі "Опис pDAB7323". Вказані PTU розташовуються в орієнтації голова-хвіст в Т-ланцюжкових бордюрних ділянках ДНК бінарного вектору pDAB7309, який використовується для трансформації рослин. Цей бінарний вектор містить PTU фосфінотрицин-ацетилтрансферази: промотор CsVMV v2; PAT v5; і 3'UTR AtuORF1 v4, в додавання до інших регуляторних елементів, таких як овердрайв і Т-ланцюжкові бордюрні послідовності (Т-ДНК-бордюр А і Т-ДНК-бордюр В). Плазміди, які містять описані вище PTU, виділяють і перевіряють шляхом розщеплення рестрикційними ферментами і секвенування ДНК. Опис pDAB7325: pDAB7325 (фіг. 12; SEQ ID NO:57) конструюють за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Вказана плазміда містить одну послідовність PTU десатурази. Даний PTU десатурази містить промотор PvPhas v2, 5'-UTR PvPhas, HzD9DS v2 (SEQ ID NO: 16) і 3'-UTR AtuORF23. Елементи PTU десатурази з’єднуються за допомогою додаткових коротких вбудованих послідовностей, а послідовність PTU десатурази фланкується ділянками рекомбінації Gateway®, Invitrogen, які забезпечують її перенесення в плазміду, яка використовується для трансформації Agrobacterium. Крім того, плазміда містить точку початку реплікації і маркер селекції по канаміцину. Опис pDAB7326: pDAB7326 (фіг. 13; SEQ ID NO: 63) конструюють шляхом Gateway®рекомбінації між pDAB7325 і pDAB7309. Вказана плазміда містить послідовність десатурази PTU, описану в попередньому розділі "Опис pDAB7325." Вказані PTU розташовуються в орієнтації голова-хвіст в Т-ланцюжкових бордюрних ділянках ДНК бінарного вектору pDAB7309, який використовується для трансформації рослин. Цей бінарний вектор містить PTU фосфінотрицин-ацетилтрансферази: промотор CsVMV v2; PAT v5; і 3-' UTR AtuORF1 v4, в додавання до інших регуляторних елементів, таких як овердрайв і Т-ланцюжкові бордюрні послідовності (Т-ДНК-бордюр А і Т-ДНК-бордюр В). Плазміди, які містять описані вище PTU, виділяють і перевіряють шляхом розщеплення рестрикційними ферментами і секвенування ДНК. Опис pDAB7327: pDAB7327 (фіг. 14; SEQ ID NO: 58) конструюють за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Вказана плазміда містить одну послідовність PTU десатурази. PTU десатурази містить промотор PvPhas v2, 5'-UTR PvPhas, ген AnD9DS v3 (SEQ ID NO: 49) і 3'-UTR AtuORF23. Елементи PTU десатурази з’єднуються за допомогою додаткових коротких вбудованих послідовностей. Послідовність PTU десатурази також фланкується ділянками рекомбінації Gateway®, Invitrogen, які забезпечують її перенесення в плазміду, яка використовується для трансформації Agrobacterium. Крім того, плазміда містить точку початку реплікації і маркер селекції по канаміцину. Опис pDAB7328: pDAB7328 (фіг. 15; SEQ ID NO: 64) конструюють шляхом Gateway®рекомбінації між pDAB7327 і pDAB7309. Вказана плазміда містить послідовність PTU десатурази, описану в попередньому розділі "Опис pDAB7327". Вказаний PTU розташовується в орієнтації голова-хвіст в Т-ланцюжкових бордюрних ділянках ДНК бінарного вектору pDAB7309, який використовується для трансформації рослин. Цей бінарний вектор містить PTU фосфінотрицин-ацетилтрансферази: промотор CsVMV v2; PAT v5; і 3'UTR AtuORF1 v4, в додавання до інших регуляторних елементів, таких як овердрайв і Т-ланцюжкові бордюрні послідовності (Т-ДНК-бордюр А і Т-ДНК-бордюр В). Плазміди, які містять описаний вище PTU, виділяють і перевіряють шляхом розщеплення рестрикційними ферментами і секвенування ДНК. Опис pDAB7329: pDAB7329 (фіг. 16; SEQ ID NO: 59) конструюють за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Вказана плазміда містить одну послідовність PTU десатурази, яка включає в себе промотор PvPhas v2, 5'-UTR PvPhas, MgD9DS v2 (SEQ ID NO: 15) і 3'-UTR AtuORF23. Елементи PTU десатурази з’єднуються за допомогою додаткових коротких 25 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 вбудованих послідовностей. Послідовність PTU десатурази фланкується ділянками рекомбінації Gateway®, Invitrogen, які забезпечують її перенесення в плазміду, яка використовується для трансформації Agrobacterium. Крім того, плазміда містить точку початку реплікації і маркер селекції по канаміцину. Опис pDAB7330: pDAB7330 (фіг. 17; SEQ ID NO: 65) конструюють шляхом Gateway®рекомбінації між pDAB7329 і pDAB7309. Вказана плазміда містить послідовність PTU десатурази, описану в попередньому розділі "Опис pDAB7325." Вказаний PTU розташовується в орієнтації голова-хвіст в Т-ланцюжкових бордюрних ділянках ДНК бінарного вектору pDAB7309, який використовується для трансформації рослин. Цей бінарний вектор містить PTU фосфінотрицин-ацетилтрансферази: промотор CsVMV v2; PAT v5; і 3'UTR AtuORF1 v4, в додавання до інших регуляторним елементів, таких як овердрайв і Т-ланцюжкові бордюрні послідовності (Т-ДНК-бордюр А і Т-ДНК-бордюр В). Плазміди, які містять описаний вище PTU, виділяють і перевіряють шляхом розщеплення рестрикційними ферментами і секвенування ДНК. Опис pDAB7331: Крім описаних вище, конструюють контрольну плазміду, яка не містить PTU десатурази (SEQ ID NO: 66). Фіг. 18. Крім регуляторних елементів, описаних в pDAB7309, дана конструкція містить тільки PTU фосфінотрицин-ацетилтрансферази. Приклад 4: Трансформація Agrobacterium Електро-компетентні клітини Agrobacterium tumefaciens (таблиця 9) отримують за способом Weigel and Glazebrook (2002) "How to Transform Arabidopsis" Ch. 5, in Arabidopsis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 50 мкл компетентних клітин Agrobacterium відтають на льоду і трансформують, використовуючи від 300 до 400 нг плазмідної ДНК бінарного вектору. Клітинну суміш піддають електропорації в присутності ДНК, використовуючи заздалегідь охолоджені кювети для електропорації (0,2 см) і електропоратор Bio-Rad Gene Pulser® (Hercules, CA), в наступних умовах: напруга: 2,5 кВ, тривалість імпульсу: 5 мсек, конденсаторна місткість на виході 25 мкФ, опір 200 Ω. Після електропорації в кожну кювету додають 1 мл бульйону YEP (дріжджовий екстракт (10 г/л), пептон (10 г/л) і NaCl (5 г/л)), після чого суспензію клітин в середовищі YEP переносять в пробірку для культивування об'ємом 15 мл. Клітини інкубують, обережно струшуючи, при 28ºС протягом 4 годин, і потім культуру вміщують на чашки, які містять YEP+агар і відповідний чинник селекції стосовно таблиці 9. Чашки інкубують протягом 2-4 днів при 28ºС, після чого колонії відбирають, смугами наносять на свіжі чашки, які містять YEP+агар, для селекції по антибіотику і інкубують при 28ºС протягом 1-3 днів. Колонії перевіряють як Agrobacterium, використовуючи кетолактозний тест, і потім виділяють позитивні по кетолактозі колонії шляхом двох пасажів окремих колоній. Кінцеву накладку колоній роблять після завершення виділення окремих колоній. Таблиця 9 Штами Agrobacterium і вибір антибіотику Штам Z707S DA2569 EHA105 DA2552 40 45 50 Геномна селекція Streptomycin Erythromycin Streptomycin Erythromycin Ti-хелперна селекція Kanamycin Kanamycin Немає Немає Селекція по бінарному вектору Spectinomycin Spectinomycin Spectinomycin Spectinomycin Перевірка колоній Agrobacterium: Аналіз на присутність інтактної плазміди проводять методом рестрикційного розщеплення, використовуючи вектор-специфічні рестрикційні ферменти. Для виділення плазмідної ДНК з вибраних трансформованих колоній Agrobacterium використовують набори для виділення плазмідної ДНК Macherey-Nagel NucleoBond® стосовно рекомендацій виробника. Як контроль служить плазмідна ДНК бінарного вектора, яка використовується для трансформації Agrobacterium. Проводять чотири окремі реакції розщеплення, використовуючи 0,75-1 мкг ДНК. Реакцію залишають протікати протягом 1-2 г і потім аналізують методом електрофорезу в агарозному гелі з фарбуванням бромідом етидію. Відбирають колонії, для яких продукти розщеплення під дією всіх ферментів є ідентичними плазмідному контролю і мають очікувані розміри згідно з розташуванням смуг. Штам A. tumefaciens LBA404 (Invitrogen Carlsbad, California) використовують для трансформації Arabidopsis, а штам А. tumefaciens Z707S (Hepburn et al. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-9) для трансформації каноли. 26 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 5: Agrobacterium-опосередкована трансформація Arabidopsis thaliana Трансформація Arabidopsis: Arabidopsis трансформують, використовуючи метод занурення квіткових рослин, заснований на способі Clough and Bent (1998) Plant J. 16:735-743. Вибрану колонію Agrobacterium використовують для інокуляції однієї або декількох пре-культур в 30 мл бульйону YEP, який містить відповідні антибіотики для селекції. Культуру (культури) інкубують протягом ночі при 28ºС, постійно перемішуючи при 220 об/хв. Кожну пре-культуру використовують для інокуляції двох культур в 500 мл бульйону YEP, який містить антибіотики для селекції, після чого культури інкубують протягом ночі при 28ºС, постійно перемішуючи. Потім клітини центрифугують приблизно при 8700 g протягом 10 хвилин при кімнатній температурі і отриманий супернатант відкидають. Клітинний осад обережно ресуспендують в 500 мл інфільтраційного середовища, яке містить: солі 1/2x Murashige and Skoog/вітаміни B5 Gamborg, 10% (мас/об) сахарози, 0,044 мкМ бензиламінопурину (10 мкл/літр початкового розчину в ДМСО з концентрацією 1 мг/мл) і 300 мкл/літр Silwet® L-77. Рослини віком приблизно 1 місяць занурюють в середовище на 15 секунд, стежачи за тим, щоб нові суцвіття були навантажені. Потім рослини викладають на бік, накривають (прозорим або непрозорим покриттям) і залишають на 24 години, після чого промивають водою і ставлять вертикально. Рослини вирощують при 22ºС з періодом чергування світло/темрява 16/8 годин. Приблизно через 4 тижні після занурення від рослин збирають насіння. Умови вирощування Arabidopsis thaliana: Свіжозібране насіння сушать протягом 7 днів при кімнатній температурі в присутності зневоднювального засобу. Після сушіння насіння суспендують в 0,1% розчині агарози (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Суспендоване насіння зберігають при 4ºС протягом 2 днів, щоб досягнути стану спокою і гарантувати одночасне проростання насіння (розшарування). Суміш Sunshine LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) покривають тонким шаром вермікуліту і піддають підповерхневому зрошуванню розчином Hoaglan до зволоження. Ґрунтову суміш дренують протягом 24 годин. Розшароване насіння висівають на вермікуліт, накривають вологозберігальними ковпаками (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) і тримають протягом 7 днів. Після проростання насіння рослини вирощують в автоматичному регуляторі Conviron (моделі CMP4030 і CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) в умовах довгого дня (16 годин світло/8 годин 2 темрява) при інтенсивності світла 120-150 мкмоль/м сек, постійній температурі (22ºС) і вологості (40-50%). Рослини спочатку поливають розчином Hoaglan, а потім деіонізованою водою, тримаючи ґрунт вологим, але не мокрим. Незадовго до збору насіння (за 1-2 тижні до збору) рослини висушують. Селекція трансформованих рослин T 1: Насіння T1 висівають в лотки для пророщування розміром 10,5'×21" (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), як описано вище, і вирощують у вказаних умовах. Ковпаки видаляють через 5-6 днів після висівання. Через 5 днів і потім через 10 днів після висівання паростки кроплять 0,20% розчином гербіциду глуфосинату (Liberty) в об'ємі 10 мл/лоток (703 л/га), використовуючи пневматичний розпилювач DeVilbiss для доставки ефективної кількості, 280 г/га, глуфосинату. 10 мл розчину гербіциду глуфосинату вносять піпеткою в сцинтиляційний флакон об'ємом 20 мл для кожного лотка, який окроплюється. Зрошуючу рідину доставляють шляхом горизонтального і вертикального нанесення. Після кожного зрошування всі селекційні лотки забезпечують бірками, на яких вказані назва гербіциду, частота нанесення і дата нанесення. Через 4-7 днів після другого зрошування ідентифікують стійкі до гербіциду рослини і пересаджують їх в горщики, які містять суміш Sunshine LP5. Пересаджені рослини поміщають в теплицю і вирощують у вказаних вище умовах. Через шістьвісім тижнів після пересадження від кожної рослини збирають насіння і зберігають їх окремо під індивідуальним ідентифікаційним номером. Приклад 7: Agrobacterium-опосередкована трансформація каноли Отримання Agrobacterium: Штами Agrobacterium, які містять одну з плазмід pDAB7319, pDAB7321, pDAB7324, pDAB7326, pDAB7328, pDAB7330 і pDAB7331, висівають штрихом в чашки з середовищем YEP (бактопептон (20,0 г/л) і дріжджовий екстракт (10,0 г/л)), який містить стрептоміцин (100 мг/мл) і спектиноміцин (50 мг/мл), після чого інкубують протягом 2 днів при 28ºС. Петлю дводенної культури із засіяної штрихом чашки інокулюють в 150 мл модифікованого середовища YEP, яке містить стрептоміцин (100 мг/мл) і спектиноміцин (50 мг/мл), яке знаходиться в стерильній перекиненій колбі (колбах) об'ємом 500 мл, і струшують при 200 об/хв і 28ºС. Перед трансформацією гіпокотилів каноли культури ресуспендуюють в Mсередовищі (солі LS; 3% глюкози; модифіковані вітаміни B5; 1 мкМ кінетин; 1 мкМ 2,4-D; pH 5,8) і розбавляють до відповідної щільності (50 ед. Клетта). Трансформація каноли: 27 UA 115302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пророщування насіння: Здійснюють поверхневу стерилізацію насіння каноли (різновид Nexera 710) 10% водним розчином гіпохлориту протягом 10 хвилин, після чого насіння промивають три рази на стальних ситах стерильною дистильованою водою. Насіння пророщують в середовищі для каноли ½ MS (1/2 MS, 2% сахарози, 0,8% агару), яке міститься в фітолотках (25 насінин на фітолоток). Лотки вміщують в кліматичну камеру для пророщування насіння (Percival Scientific, Inc., Perry, IA) з режимом росту, встановленим на 25ºС і фотоперіод 16 годин світла/8 годин темряви, і пророщують протягом 5 днів. Попередня обробка: На 5 день в асептичних умовах вирізають сегменти гіпокотилю розміром ~3 мм, відкидаючи шматочки кореню і паростка (висушування гіпокотилів запобігають, вміщуючи їх в процесі вирізування в 10 мл стерильної води milliQ). Сегменти гіпокотилю вміщують горизонтально на стерильному фільтрувальному папері в калюс-індукуючому середовищі, MSK1D1 (MS; 1 мг/л кінетину; 1 мг/л 2,4-D; 3% сахарози; 0,7% фітагару), і тримають протягом 3 днів стадії попередньої обробки в кліматичній камері для пророщування з режимом зростання, встановленим на 22-23ºС і фотоперіод 16 годин світла/8 годин темряви. Спільне культивування з Agrobacterium: За день до обробки Agrobacterium інокулюють колби зі середовищем YEP, яке містить відповідні антибіотики. Сегменти гіпокотилів переносять з фільтрувального паперу в пусті чашки Петрі розміром 100×25 мм, які містять 10 мл рідкого середовища M для запобігання висушуванню сегментів гіпокотилів. На даній стадії для збору і перенесення сегментів використовують шпатель. Рідке середовище M видаляють піпеткою, після чого в чашки Петрі додають 40 мл суспензії Agrobacterium (на 500 сегментів 40 мл розчину Agrobacterium). Сегменти обробляють протягом 30 хвилин, періодично обертаючи чашки Петрі так, щоб гіпокотилі залишалися завантаженими в розчин Agrobacterium. У кінці періоду обробки розчин Agrobacterium переносять піпеткою в лабораторну склянку для відходів, автоклавують і відкидають (розчин Agrobacterium повністю видаляють, щоб запобігти розростанню Agrobacterium). Оброблені гіпокотилі переносять пінцетом назад у вихідні чашки, які містять MSK1D1 і фільтрувальний папір, стежачи за тим, щоб сегменти не висихали. Сегменти гіпокотилів разом з контрольними сегментами повертають в кліматичну камеру для пророщування із зниженою інтенсивністю світла (яку досягають, накриваючи чашки алюміневою фольгою), і оброблені гіпокотилі культивують спільно з Agrobacterium протягом 3 днів. Індукція калюса на селекційному середовищі: Після 3 днів спільного культивування сегменти гіпокотилів переносять окремо пінцетами на калюс-індукуюче середовище, MSK1D1H1 (MS; 1 мг/л кінетину; 1 мг/л 2,4-D; 0,5 г/л MES; 5 мг/л AgNО3; 300 мг/л тіментину; 200 мг/л карбеніциліну; 1 мг/л Herbiace; 3% сахарози; 0,7% фітагару). Сегменти гіпокотилів фіксують на середовищі, але не занурюють в нього. Селекція і регенерація паростків: Після культивування протягом 7 днів на калюсіндукуючому середовищі, які мають калюс сегменти гіпокотилів переносять в середовище для регенерації паростків 1, яке містить маркер селекції, MSB3Z1H1 (MS; 3 мг/л BAP; 1 мг/л зеатину; 0,5 г/л MES; 5 мг/л AgNО3; 300 мг/л тіментину; 200 мг/л карбеніциліну; 1 мг/л Herbiace; 3% сахарози; 0,7% фітагару). Через 14 днів гіпокотилі з паростками переносять в середовище для регенерації 2 з підвищеним вмістом маркера селекції, MSB3Z1H3 (MS; 3 мг/л BAP; 1 мг/л зеатину; 0,5 г/л MES; 5 мг/л AgNО3; 300 мг/л тіментину; 200 мг/л карбеніциліну; 3 мг/л Herbiace®; 3% сахарози; 0,7% фітагару). Подовження паростків: Через 14 днів сегменти з паростками переносять в середовище для подовження паростків, MSMESH5 (MS; 300 мг/л тіментину; 5 мг/л Herbiace®; 2% сахарози; 0,7% агару TC). Паростки, які видовжилися, виділяють і переносять в MSMESH5. Через 14 днів інші паростки, які не видовжилися, в першому циклі, вміщають на MSMESH5 і переносять в свіже селекційне середовище такого ж складу. На даній стадії всі сегменти гіпокотилів, які залишилися, відкидають. Паростки, які видовжилися, на середовищі MSB3Z1H3, через два тижні виділяють і переносять в середовище MSMESH5. Інші паростки, які не видовжилися, в першому циклі на MSMESH5, виділяють і переносять в свіже селекційне середовище такого ж складу. На даній стадії всі сегменти гіпокотилів, які залишилися, відкидають. Індукція кореневої системи: Через 14 днів паростки переносять в середовище MSMEST (MS; 0,5 г/л MES; 300 мг/л тіментину; 2% сахарози; 0,7% агару TC) для індукції кореневої системи. Паростки, у яких не з'явилося коріння після першого перенесення на середовище MSMEST, піддають перенесенню другого або третього циклу на середовище MSMEST до отримання рослин з корінням. Паростки, які не подовжилися/не пустили коріння після першого перенесення на середовище MSMEST, піддають перенесенню другого або третього циклу на середовище MSMEST до отримання рослин з корінням. Рослини, які пустили коріння на середовищі MSMESH5 або MSMEST, і є ПЛР-позитивними, відправляють для пересадки в ґрунт. Після 28