Похідні діарилметиліден піперидину, їх отримання та застосування

1. Сполука формули І, її фармацевтичнo прийнятна сіль, діастереомери, енантіомери або їх суміші: 2 (19) 1 3 80012 4-[[3-(ацетиламіно)феніл][1-(3-тієнілметил)-4піперидиніліден]метил]-N,N-діетилбензамід; 4-[[3-(ацетиламіно)феніл][1-(3-піридилметил)-4піперидиніліден]метил]-N,N-діетилбензамід; 4-[[3-(ацетиламіно)феніл][1-(4-піридинілметил)-4піперидиніліден]метил]-N,N-діетилбензамід; 4-{[3-(ацетиламіно)феніл][1-(піридин-2ілметил)піперидин-4-іліден]метил}-N,Nдіетилбензамід; 4-{[3-(ацетиламіно)феніл][1-(1,3-тіазол-4ілметил)піперидин-4-іліден]метил}-N,Nдіетилбензамід; 4-{[3-(aцeтилaмiнo)фeнiл][1-(1,3-тiaзoл-5iлмeтил)пiпepидин-4-iлiдeн]мeтил}-N,Nдіетилбензамід; та її фармацевтичнo прийнятні солі. 6. Сполука за будь-яким з пп.1-5 для застосування як медикаменту. 7. Застосування сполуки за будь-яким з пп.1-5 у виробництві медикаменту для терапії болю, тривожності або функціональних шлунково-кишкових розладів. 8. Фармацевтична композиція, що містить сполуку за будь-яким з пп.1-5 та фармацевтичнo прийнятний носій. 9. Спосіб терапії болю у теплокровних тварин, що передбачає введення вказаній тварині, що потребує такої терапії, терапевтичнo ефективної кількості сполуки за будь-яким з пп.1-5. 10. Спосіб терапії функціональних шлунковокишкових розладів у теплокровних тварин, що передбачає введення вказаній тварині, що потребує такої терапії, терапевтичнo ефективної кількості сполуки за будь-яким з пп.1-5. 11. Спосіб отримання сполуки формули І O R2 N O R3 N R4 R5 N R1 ,(I) в якому проводять: реакцію сполуки формули II з X-C(=O)-R 4 або R4C(=O)-OC(=O)R4 O R2 N R3 NH R5 4 R2, R3, R4 та R5, незалежно, вибрано з групи: гідроген, С1-6алкіл та С 3-6циклоалкіл, де вказані С 16алкіл та С 3-6циклоалкіл, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: R, -NO2, -OR, -Сl, -Br, -I, -F, -СF3, -C(=O)R, C(=O)OH, -NH 2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, -SO3H, -SO 2R, -S(=O)R, -CN, -ОН, C(=O)OR, -C(=O)NR 2, -NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С16алкіл, а Х є Сl, Вr чи І. 12. Спосіб отримання сполуки формули І O R2 N O R3 N R4 R5 N R1 ,(І) в якому проводять реакцію сполуки формули III з R1-CHO або R1CH2-X: O R2 N O R3 N R4 R5 N H , (III) де R1 вибрано з групи: С6-10арил та С2-6 гетероарил, де вказані С6-10арил та С 2-6гетероарил, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: -R, -NO2, -OR, -Сl, -Br, -I, -F, -СF3, C(=O)R, -С(=O)ОН, -NH2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, SO3H, -SO 2R, -S(=O)R, -CN, -ОН, -C(=O)OR, C(=O)NR 2, -NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С1-6алкіл; а R2, R3, R4 та R5, незалежно, вибрано з групи: гідроген, С1-6алкіл та С 3-6циклоалкіл, де вказані С 16алкіл та С 3-6циклоалкіл, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: R, -NO2, -OR, -Сl, -Br, -І, -F, -СF3, -C(=O)R, С(=O)ОН, -NH2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, -SО3Н, -SO 2R, -S(=O)R, -CN, -ОН, C(=O)OR, -C(=O)NR 2, -NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С16алкіл, а Х є Сl, Br або І. 13. Сполука формули III: O R2 N R1 ,(II) де R1 вибрано з групи: С6-10арил та С2-6 гетероарил, де вказані С6-10арил та C2-6гетероарил, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: -R, -NО2, -OR, -Сl, -Br, -I, -F, -СF3, C(=O)R, -C(=O)OH, -NH 2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, SО3Н, -SO 2R, -S(=O)R, -CN, -ОН, -C(=O)OR, C(=O)NR2, -NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С1-6aлкіл; а N O R3 N R4 R5 N H ,(III) де R2, R3, R4 та R5, незалежно, вибрано з групи: гідроген, С1-6алкіл та С 3-6циклоалкіл, де вказані С 16алкіл та С 3-6циклоалкіл, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: R, -NO2, -OR, -Сl, -Br, -І, -F, -СF3, -C(=O)R, 5 80012 6 С(=O)ОН, -NH2, -SH, -NHR, -NR 2, -SR, -SО3Н, SO2R, -S(=O)R, -CN, -ОН, -C(=O)OR, -C(=O)NR 2, NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С1-6алкіл. Представлений винахід стосується нових сполук, способів їх отримання, їх застосування та фармацевтичних композицій, що містять нові сполуки. Нові сполуки є корисними у терапії, а зокрема для лікування болю, тривожності та функціональних шлунково-кишкових розладів. Рецептор ідентифіковано як такий, що грає роль у багатьох функціях організму, як-то циркуляторна та больова системи. Ліганди для dрецептору можуть тому знайти потенційне застосування як аналгетики, та/або як антигіпертензивні засоби. Ліганди для d-рецептору, як також показано, мають імуномодуляторну активність. Iдентифікація щонайменше трьох відмінних сукупностей опіоїдних рецепторів (m, d та k) зараз добре встановлена, та усі три наявні як у центральній, так і у периферійній нервових системах багатьох видів, залучаючи людину. Аналгезію спостережено у різних тваринних моделях, коли активовано один або більше цих рецепторів. За деякими винятками зараз доступні селективні опіоїдні d-ліганди є пептидами та непридатні для застосування системними шляхами. Одним прикладом непептидного d-агоністу є SNC80 [Bilsky E J. et al., Journal of Pharmacology та Experimental Therapeutics, 273(1), pp.359-366 (1995)]. Багато сполук d-агоністів, що ідентифіковано у рівні техніки, мають багато недоліків у тому, що вони потерпають від поганої фармакокінетики та не є аналгетиками при застосуванні системними шляхами. Також, задокументовано, що багато цих сполук d-агоністів виявляють значну конвульсійну дію при системному застосуванні. [Патент США № 6 130 222, Roberts et al], описує деякі d-агоністи. Однак, все ще є необхідність у поліпшених d-агоністах. Якщо не визначено інше у цьому описі, застосована у цьому описі номенклатура взагалі відповідає прикладам та правилам Nomenclature of Organic Chemistry, Sections A, B, C, D, E, F, та Н, Pergamon Press, Oxford, 1979, котру тут наведено як посилання стосовно ілюстрування хімічної структури. Як варіант, сполуки можна називати, застосовуючи програму хімічного найменування: ACD/ChemSketch, Version 5,09/September 2001, Ad vanced Chemistry Development, Inc., Toronto, Canada. Термін "Cm-n" або "Сm-n груп", застосований поодинці або як префікс, стосується будь-якої групи, що має m-n атомів карбону. Термін "вугле водень", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується будь-якої структури, що містить тільки атоми карбону та гідрогену аж до 14 атоми карбону. Термін "вуглеводневий радикал" або "гідрокарбіл", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується будь-якої структури, що є результатом видалення одного або більше гідрогенів від вуглеводню. Термін "алкіл", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується одновалентних лінійних або розгалужених вугле водневих радикалів, що містять приблизно 1-12 атомів карбону. "Алкіл" може, як варіант, містити один або більше ненасичених зв'язків карбон-карбон. Термін "алкілен", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується двовалентних лінійних або розгалужених вуглеводневи х радикалів, що містять приблизно 1-12 атомів карбону, котрий слугує для зв'язування двох структур разом. Термін "алкеніл", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується одновалентних лінійних або розгалужених вуглеводневи х радикалів, що мають щонайменше один подвійний зв'язок карбон-карбон та містять щонайменше приблизно 2-12 атомів карбону. Термін "алкініл", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується одновалентних лінійних або розгалужених вугле водневих радикалів, що мають щонайменше один потрійний зв'язок карбон-карбон та містять щонайменше приблизно 2-12 атомів карбону. Термін "циклоалкіл,", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується моновалентного кільце-вмісного вуглеводневого радикалу, що містить щонайменше приблизно 3-12 атомів карбону. Термін "циклоалкеніл", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується моновалентного кільце-вмісного вуглеводневого радикалу, що має щонайменше один подвійний зв'язок карбонкарбон та містить щонайменше приблизно 3-12 атомів карбону. Термін "циклоалкініл", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується моновалентного кільце-вмісного вуглеводневого радикалу, що має щонайменше один потрійний зв'язок карбонкарбон та містить приблизно 7-12 атомів карбону. Термін "арил", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується мо-новалентного вуглеводневого радикалу, що має одне або більше поліненасичених карбонових кілець та має ароматичний характер, (наприклад, 4n+2 делокалізованих електронів) та містить приблизно 5-14 атомів карбону. Термін "арилен", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується двовалентного вуглеводневого радикалу, що має одне або більше полі ненасичених карбонових кілець та має ароматичний характер, (наприклад, 4n+2 делокалізо 7 80012 ваних електронів) та містить приблизно 5-14 атомів карбону, котрий слугує для зв'язування двох структур разом. Термін "гетероцикл", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується кільце-вмісної структури або молекули, що має один або більше мультивалентних гетероатомів, незалежно вибраних з N, О, Р та S, як частину кільцевої структури, та залучаючи щонайменше приблизно 3-20 атомів у кільці(ях). Гетероцикл може бути насиченим або ненасиченим, містити один або більше подвійних зв'язків, та гетероцикл може містити більше одного кільця. Коли гетероцикл містить більше одного кільця, кільця можуть бути конденсованими або неконденсованими. Конденсовані кільця загалом стосуються щонайменше двох кілець, що мають два спільних атоми. Гетероцикл може мати чи не мати ароматичний характер. Термін "гетероалкіл" застосований поодинці або як суфікс або префікс, стосується радикалу, що утворюється в результаті заміщення одного або більше атомів карбону алкілу з одним або більше гетероатомами, вибраними з N, О та S. Термін "гетероароматичний", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується кільце-вмісної структури або молекули, що має один або більше мультивалентних гетероатомів, незалежно вибраних з N, О, Р та S, як частину кільцевої стр уктури, та залучаючи щонайменше приблизно 3-20 атомів у кільці(ях), де кільце-вмісна структура або молекула має ароматичний характер (наприклад, 4n+2 делокалізованих електронів). Термін "гетероциклічна група," "гетероциклічний," або "гетероцикло", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується радикалу, що походить від гетероциклу видаленням з нього одного або більше гідрогенів. Термін "гетероцикліл", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується моновалентного радикалу, що походить від гетероциклу видаленням з нього одного гідрогену. Термін "гетероциклілен", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується двовалентного радикалу, що походить від гетероциклу видаленням з нього двох гідрогенів, котрий слугує для зв'язування двох стр уктур разом. Термін "гетероарил", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується гетероциклілу, що має ароматичний характер. Термін "гетероциклоалкіл", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується гетероциклілу, що не має ароматичного характеру. Термін "гетероарилен", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується гетероцикпілену, що має ароматичний характер. Термін "гетероциклоалкілен", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується гетероциклілену, що не має ароматичного характеру. Термін "шести-членний", застосований як префікс, стосується групи, що має кільце, що містить 6 кільцевих атомів. Термін "п'яти-членний", застосований як префікс, стосується групи, що має кільце, що містить 5 кільцевих атомів. 8 П'яти-членним кільцевим гетероарилом є гетероарил з кільцем, що має 5 кільцевих атомів, де 1, 2 або 3 кільцеві атоми незалежно вибрано з N, О та S. Прикладами п'яти-членних кільцевих гетероарилів є тіеніл, фурил, піроліл, іміда-золіл, тіазоліл, оксазоліл, піразоліл, ізотіазоліл, ізоксазоліл, 1,2,3-триазоліл, тетразоліл, 1,2,3-тіадіазоліл, 1,2,3оксадіазоліл, 1,2,4-триазоліл, 1,2,4-тіадіазоліл, 1,2,4-оксадіазоліл, 1,3,4-триазоліл, 1,3,4тіадіазоліл, та 1,3,4-оксадіазоліл. Шести-членним кільцевим гетероарилом є гетероарил з кільцем, що має 6 кільцевих атомів, де 1, 2 або 3 кільцеві атоми незалежно вибрано з N, О та S. Прикладами шести-членних кільцевих гетероарилів є піридил, піразиніл, піриміді-ніл, триазиніл та піридазиніл. Термін "заміщений", застосований як префікс, стосується структур, молекул або груп, де один або більше гідрогенів заміщено одною або більше (^вуглеводневими групами, або одною або більше хімічними групами, що містять один або більше гетероатомів, вибраних з N, О, S, F, СІ. Вг, І, та Р. Приклади хімічних груп, що містять один або більше гетероатомів, охоплюють -NO2, -OR, -СІ, -Br, -I, -F, -CF3 , -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH 2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, -SO 3H, -SO 2R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR 2, -NRC(=O)R, OKCO (=0), іміно (=NR), тіо (=S), та оксиміно (=N-OR), де кожний "R" представляє С1-6гідрокарбіл. Наприклад, заміщений феніл може стосуватися групи: нітрофеніл, меток-сифеніл, хлорфеніл, амінофеніл, тощо, де нітро, метоксил, хлор, та аміногрупи можуть заміщувати будь-який придатний гідроген на фенільному кільці. Термін "заміщений", застосований як суфікс першої структури, молекули або групи, а потім одної або більше назв хімічних груп, стосується другої стр уктури, молекули або групи, котра є результатом заміщення одного або більше гідрогенів першої структури, молекули або групи одною або більше названими хімічними групами. Наприклад, "феніл, заміщений нітро" стосується нітрофенілу. Термін "як варіант, заміщений" стосується груп, структур, або молекул, що є заміщеними та не заміщеними. Гетероцикл охоплює, наприклад, моноциклічні гетероцикли, як-то: азиридин, ок-сиран, тііран, азетидин, оксетан, тіетан, піролідин, піролін, імідазолідин, піразолідин, піразолін, діоксолан, сульфолан 2,3-дигідрофуран, 2,5-дигідрофуран тетрагідрофуран, тіофан, піперидин, 1,2,3,6тетрагідропіридин, піперазин, морфолін, тіоморфолін, піран, тіопіран, 2,3-дигідропіран, тетрагідропіран, 1,4-дигідропіридин, 1,4-діоксан, 1,3діоксан, діоксан, гомопіперидин, 2,3,4,7-тетрагідро1Н-азепін гомопіперазин, 1,3-діоксепан, 4,7дигідро-1,3-діоксепін, та гексаметиленоксид. На додаток, гетероцикл охоплює ароматичні гетероцикли, наприклад, піридин, пі-разин, піримідин, піридазин, тіофен, фуран, фуразан, пірол, імідазол, тіазол, оксазол, піразол, ізотіазол, ізоксазол, 1,2,3-триазол, тетразол, 1,2,3-тіадіазол, 1,2,3оксадіазол, 1,2,4-триазол, 1,2,4-тіадіазол, 1,2,4 9 80012 оксадіазол, 1,3,4-триазол, 1,3,4-тіадіазол, та 1,3,4оксадіазол. На додаток, гетероцикл охоплює поліциклічні гетероцикли, наприклад, індол, ін-долін, ізоіндолін, хінолін, тетрагідрохінолін, ізохінолін, тетрагідроізохінолін, 1,4-бензодіоксап, кумарин, дигі дроку марин, бензофуран, 2,3-дигідробензофуран, ізобен-зофуран, хромен, хроман, ізохроман, ксантен, феноксатіін, тіантрен, індолізин, ізоіндол, індазол, пурин, фталазин, нафтиридин, хіноксалін, хіназолін, цинолін, птеридин, фена-нтридин, перимідин, фенантролін, феназин, фенотіазин, феноксазин, 1,2-бензізоксазол, бензотіофен, бензоксазол, бензтіазол, бензімідазол, бензтриазол, тіо-ксантин, карбазол, карболін, акридин, піролізидин та хінолізидин. На додаток до вищеописаних поліциклічних гетероциклів, гетероцикл охоплює поліциклічні гетероцикли, де конденсація кілець між двома або більше кільцями охоплює більше одного зв'язку, спільного для обох кілець, та більше двох атомів, спільних для обох кілець. Приклади таких шунтованих гетероциклів охоплюють хінуклідин, діазадицикло[2,2,1]гептан та 7оксадицикло[2,2,1]гептан. Гетероцикліл охоплює, наприклад, моноциклічні гетероцикліли, як-то: азиридиніл, оксираніл, тііраніл, азетидиніл, оксетаніл, тієтаніл, піролідиніл, піролініл, імідазолідиніл, піразолідиніл, піразолініл, діоксоланіл, сульфоланіл, 2,3дигідрофураніл, 2,5-дигідрофураніл, тетрагідрофураніл, тіофаніл, піперидиніл, 1,2,3,6-тетрагідропіридиніл, піперазиніл, морфолініл, тіоморфолініл, піраніл, тіопіраніл, 2,3-дигідропіраніл, тетрагідропіраніл, 1,4-дигідропіридініл, 1,4-діоксаніл, 1,3діоксаніл, діоксаніл, гомопіперидиніл, 2,3,4,7тетрагідро-1Н-азепініл, гомопіперазиніл, 1,3діоксепаніл, 4,7-дигідро-1,3-діоксепініл, та гексаметиленоксидил. На додаток, гетероцикліл охоплює ароматичні гетероцикліли або гетероарили, наприклад, піридініл, піразиніл, піримідініл, піридазиніл, тієніл, фурил, фуразаніл, піро-ліл, імідазоліл, тіазоліл, оксазоліл, піразоліл, ізотіазоліл, ізоксазоліл, 1,2,3триазоліл, тетразоліл, 1,2,3-тіадіазоліл, 1,2,3оксадіазоліл, 1,2,4-триазоліл, 1,2,4-тіадіазоліл, 1,2,4-оксадіазоліл, 1,3,4-триазоліл, 1,3,4тіадіазоліл та 1,3,4. оксадіазоліл. На додаток, гетероцикліл охоплює поліциклічні гетероцикліли (залучаючи як ароматичні, так і неароматичні), наприклад, індоліл, індолініл, ізоіндолініл, хінолініл, тетра-гідрохінолініл, ізохінолініл, тетрагідроізохінолініл, 1,4-бензодіоксаніл, кумариніл, дигід-рокумариніл, бензофураніл, 2,3дигідробензофураніл, ізобензофураніл, хроменіл, хро-маніл, ізохроманіл, ксантеніл, феноксатіініл, тіантреніл, індолініл, ізоіндоліл, індазоліл, пуриніл, фталазиніл, нафтиридиніл, хіноксалініл, хіназолініл, цинолініл, птеридиніл, фенантридиніл, перимідініл, фенантролініл, феназиніл, фенотіазиніл, феноксазиніл, 1,2-бензізоксазоліл, бензотіофеніл, бензоксазоліл, бензтіазоліл, бензімідазоліл, бензтриазоліл, тіоксантиніл, карбазоліл, карболініл, акридиніл, піролізидиніл, та хінолізидиніл. 10 На додаток до вищеописаних поліциклічних гетероциклілів, гетероцикліл охоплює поліциклічні гетероцикліли, де конденсація кілець між двома або більше кільцями охоплює більше одного зв'язку, спільного для обох кілець, та більше двох а томів, спільних для обох кілець. Приклади таких шунтованих гетероциклів охоплюють хінуклиніл, діазадицикло[2,2,1]гептил; та 7оксадицикло[2,2,1]гептил. Термін "алкокси", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується радикалів загальної формули -O-R, де R вибрано з вуглеводневого радикалу. Приклади алкокси охоплюють метоксил, етоксил, пропоксил, ізопропоксил, бутоксил, третбутоксил, ізобутоксил, циклопропілметоксил, алілоксил та пропаргілоксил. Термін "амін" або "аміно", застосований поодинці або як суфікс чи префікс, стосується радикалів загальної формули -NRR', де R та R' незалежно вибрано з гідрогену або вуглеводневого радикалу. "Ацил" застосований поодинці, як префікс або суфікс, означає -C(=O)-R, де R як варіант, заміщено гідрокарбіл, гідроген, аміно або алкокси. Ацилгрупи охоплюють, наприклад, ацетил, пропіоніл, бензоіл, фенілацетил, карбоетокси, та диметилкарбамоіл. Галоген охоплює флуор, хлор, бром та йод. "Галогенований," застосований як префікс групи, означає, що один або більше гі-дрогенів на групі заміщено одним або більше галогенами. Перша кільцева група, що "конденсована" з другою кільцевою групою, означає, що перше кільце та друге кільце мають щонайменше два спільні атоми. "Зв'язаний", якщо не встановлено інше, означає ковалентно зв'язаний. За умови, що це стосується сполуки формули І, її фармацевтично прийнятних солей, діастереомерів, енантіомерів, або їх сумішей: де R1 вибрано з групи: С6-10арил та С 2де вказані С 6-10арил та С 26гетероарил, 6гетероарил, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: R, -NO2, -OR, -СІ, -Вг, -І, -F, -CF3 , -C(=O)R, C(=O)OH, -NH 2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, -SO3H, -SO2R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, C(=O)NR 2, -NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С1-6алкіл; а R2, R3, R4 та R5, незалежно, вибрано з групи: гідроген, С1-6алкіл та С3-6циклоалкіл, де вказані С 1 11 6алкіл 80012 та С3-6циклоалкіл, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: R, -NO2, -OR, -СІ, -Br, -I, -F, -CF3 , -C(=O)R, C(=O)OH, -NH 2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, -SO3H, -SO2R, -S(=O)R, -CN, -OH, C(=O)OR, -C(=O)NR 2, -NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С16алкіл. В одному втіленні сполуки представленого винаходу є сполуками формули І, де R1 вибрано з групи: феніл; піридил; тієніл; фурил; імідазоліл; триазоліл; піроліл; тіазо-ліл; та N-оксидо-піридил, де R1, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: С1-6алкіл, галогенований С1-6алкіл, -NO2, -CF3, С1- 6алкоксил, хлор, флуор, бром, та йод; R2, R3 та R4, незалежно, представляють С 13алкіл або галогенований С 1-3алкіл; R5 вибрано з групи: гідроген, С1-6алкіл та С36циклоалкіл, де вказані С 1-6алкіл та С 3-6Циклоалкіл, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: С1-6алкіл, галогенований С1-6алкіл, -NO2, -CF3, С1-6алкоксил, хлор, флуор, бром, та йод. У ще одному втіленні сполуки представленого винаходу є сполуками формули І, де R1 вибрано з групи: феніл; піридил; тієніл; фурил; імідазоліл; піроліл; та тіазоліл, де R1, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: С1-6алкіл, галогенований С1-6алкіл, -NO2, -CF3, С1-6алкоксил, хлор, флуор, бром, та йод; R2, R3, та R4, незалежно, представляють С1алкіл або галогенований С1-3алкіл; 3 а R5 - гідроген. У наступному втіленні сполуки представленого винаходу є сполуками формули І, де R1 вибрано з групи: феніл, піридил, тієніл, фурил, імідазоліл, піроліл, та тіазоліл; R2 та R3 - етил; R4 - С1-3алкіл; а R5 - гідроген. Слід розуміти, що, коли сполуки представленого винаходу містять один або більше хіральних центрів, сполуки винаходу можуть існувати та бути виділеним, як енанті-омерні або діастереомерні форми, або як рацемічна суміш. Представлений винахід охоплює будь-які можливі енантіомери, діастереомери, рацемати або їх суміші, сполуки формули І. Оптично активні форми сполуки винаходу можна отримувати, наприклад, хіральним хроматографічним відокремленням рацемату, синтезом з оптично активних вихідних матеріалів або асиметричним синтезом способами, описаними тут далі. Слід також розуміти, що певні сполуки представленого винаходу можуть існувати як геометричні ізомери, наприклад Е та Z ізомери алкенів. Представлений винахід охоплює будь-який геометричний ізомер сполуки формули І. Слід розуміти також, що представлений винахід охоплює таутомери сполук формули І. Слід розуміти також, що певні сполуки представленого винаходу можуть існувати у сольватованих, наприклад гідратованих, а також несольватованих формах. Слід розуміти також, що 12 представлений винахід охоплює усі так сольватовані форми сполук формули І. У рамках винаходу є також солі сполук формули І. Загалом, фармацевтично прийнятні солі сполук представленого винаходу можна отримувати застосуванням стандартних способів, добре відомих у рівні техніки, наприклад реакцією достатньо основної сполуки, наприклад алкіламіну з придатною кислотою, наприклад, хлоридною кислотою або оцтовою кислотою, отримуючи фізіологічно прийнятний аніон. Також можливо виробляти відповідну сіль лужного металу (як-то натрій, калій, або літій) або лужноземельного металу (як-то кальцій) обробкою сполуки представленого винаходу, що має придатно кислотний протон, як-то карбонової кислоти або фенолу одним еквівалентом гідроксиду або алкоксиду лужного металу або лужно-земельного металу (як-то етоксид або метоксид), або придатно основним органічним аміном (як-то холін або меглумін) у водному середовищі, а потім звичайними способами очистки. В одному втіленні сполуку формули І ви ще можна перетворити у її фармацевтично прийнятну сіль або сольват, особливо, кислотно-адитивну сіль, як-то хлорид, бромід, фосфа т, ацетат, фумарат, малеат, тартрат, цитрат, метансульфонат чи n-толуєнсульфонат. Нові сполуки представленого винаходу корисні у терапії, особливо для лікування різних больових станів, як-то хронічний біль, невропатичний біль, гострий біль, біль при раку, біль, викликаний ревматоїдним артритом, мігрень, вісцеральний біль тощо Цей перелік, однак, не слід вважати повним. Сполуки винаходу корисні як імуномодулятори, особливо для автоімунних хвороб, як-то артрит, для пересадки шкіри, трансплантації органів та подібних хірургічних потреб, для дифузних хвороб з'єднувальних тканин, різних алергій, для застосування як анти-пухлиних засобів та антивірусних засобів. Сполуки винаходу корисні у лікуванні станів, де дегенерація або дисфункція опіої-дних рецепторів представлені або залучені у цю парадигму. Це може охоплювати застосування мічених ізотопами сполук винаходу у способах діагностики та застосуваннях з формуванням відображень, як-то позитронна емісійна томографія (ПЕТ). Сполуки винаходу корисні для лікування діареї, депресії, тривожності та пов'язаних зі стресом розладів, як-то пов'язаних зі стресом посттравматичних розладів, розладу панічного типу, розладу з генералізованою тривожністю, соціальних фобій, та примусово-нав'язливого розладу, неутримання сечі, передчасної еяколяції, різних психічних захворювань, кашлю, набряку легенів, різних шлунково-кишкових розладів, наприклад, обстипації, функціональних шлунково-кишкових розладів, як-то синдрому підвищеної подразнюваності кишечнику та функціональної диспепсії, хвороби Паркінсона та інших моторних розладів, травматичного поранення мозку, інсульту, кардіопротекції після інфаркту міокарду, поранення спинного мозку та фізичної залежності від ліків, залучаючи лікування алкогольного зловживання, зловживання нікотином, опіоїдами та іншими ліка 13 80012 ми та для розладів симпатическої нервової системи, наприклад гіпертензії. Сполуки винаходу корисні як аналгетики для застосування протягом загальної анестезії та контролю анестезії. Комбінації засобів з відмінними властивостями часто застосованими для досягнення балансу ефектів, необхідного для підтримування анестезійного стану (наприклад амнезії, аналгезії, релаксації м'язів та заспокоєння). Залучені у цю комбінацію анестезійні інгаляції, снодійні засоби, транквілізатори, ней-ром'язові блокатори та опіоїди. Також у рамках винаходу є застосування будьякої сполуки згідно з формулою для виробництва медикаменту для лікування будь-якого з обговорених вище станів. Згідно з ще одним аспектом винаходу є спосіб лікування суб'єкту, що потерпає від будь-якого з обговорених ви ще станів, за яким до пацієнта, що потребує такого лікування, застосовують ефективну кількість сполуки згідно з формулою І. Відтак, представлений винахід стосується сполуки формули І, або її фармацевтично прийнятної солі або сольвату, що вищенаведено, для застосування у терапії. Згідно з наступним аспектом представлений винахід стосується застосування сполуки формули І, або її фармацевтично прийнятної солі або сольвату, що ви щенаведено, у виробництві медикаменту для застосування у терапії. У контексті представленого опису, термін "терапія" також охоплює "профілактику" якщо конкретно не визначено інше. Термін "терапевтичний" та "терапевтично" слід застосовувати відповідно. Термін "терапія" у контексті представленого винаходу крім того охоплює застосування ефективної кількості сполуки представленого винаходу, для пом'якшення вже існуючого хворобливого стану, гострого або хронічного, або повторюваного стану. Це визначення також охоплює профілактичні терапії для попередження повторюваних станів та безперервної терапії для хронічних розладів. Сполуки представленого винаходу корисні у терапії, особливо для терапії різних больових станів, залучаючи, але без обмеження: хронічний біль, невропатичний біль, гострий біль, біль у спині, біль при раку, вісцеральний біль тощо. У застосуванні для терапії у теплокровних тварин, як-то людини, сполуку винаходу можна вживати у формі звичайної фармацевтичної композиції будь-яким шляхом, зокрема перорально, внутрішньом'язово, підшкірно, місцево, інтаназально, інтрапери-тонально, внутрішньогрудинно, внутрішньовенно, епідурально, інтратекально, інтраце-ребровентрикулярно та ін'єкціями у суглоби. В одному втіленні винаходу, шлях застосування може бути пероральним, внутрішньовенним або внутрішньом'язовим. Дозування залежатиме від шляху застосування, суворості хвороби, віку та маси пацієнта та інших факторів, на які звичайно зважає лікар при визначенні індивідуального режиму та рівня дозування, найприйнятнішого для окремого пацієнта. 14 Для отримання фармацевтичних композицій зі сполук цього винаходу інертні фармацевтично прийнятні носії можуть бути твердими або рідкими. Тверді форми препаратів охоплюють порошки, таблетки, здатні до диспергування гранули, капсули, облатки та супозиторії. Твердим носієм може бути одна чи більше речовин, котрі можуть також діяти як розріджувачі, ароматизатори, солюбілізатори, змащувачі, суспендувальні засоби, зв'язуючі, або дезинтегратори таблеток; ним може також бути капсулювальний матеріал. У порошках носієм є мілко подрібнений твердий матеріал у суміші з мілко подрібненою сполукою винаходу, або активним компонентом. У таблетках активний компонент змішано з носієм, що має потрібні властивості щодо зв'язування, у підхожій пропорції, та компактування у бажану форму та розмір. Для отримання композиції супозиторію низькоплавкий віск, як-то суміш гліцеридів жирних кислот та масло какао, плавлять та активний інгредієнт диспергують, наприклад, перемішуванням. Розплавлену гомогенну суміш тоді виливають у форму зручного розміру та дають охолонути та затвердіти. Підхожими носіями є магній карбонат, магній стеарат, тальк, лактоза, цукор, пектин, декстрин, крохмаль, камедь трагаканту, метилцелюлоза, натрій карбоксиметилцелюлоза, низькоплавкий віск, масло какао, тощо. Термін композиція також охоплює композицію активного компоненту з капсулюва-льним матеріалом як носієм, що представляє капсулу, у котрій активний компонент (з або без інших носіїв) оточено носієм котрий є відтак в асоціації з ним. Подібним чином охоплено облатки. Таблетки, порошки, облатки, та капсули можна застосовувати як тверді форми дозування, підхожі для перорального застосування. Рідкі форми композиції охоплюють розчини, суспензії, та емульсії. Наприклад, стерильні водні або водно-пропіленгліколеві розчини активних сполук можуть бути рідкими препаратами, підхожими для парентерального застосування. Рідкі композиції можна також формувати у розчині у водному поліетиленгліколі. Водні розчини для перорального застосування можна отримати розчиненням активного компоненту у воді та додаванням підхожих барвників, ароматизаторів, стабілізаторів та загусників, за потребою. Водні суспензії для перорального застосування можна отримувати диспергуванням мілко подрібненого активного компоненту у воді разом з в'язким матеріал, як-то природні синтетичні камеді, смоли, метилцелюлоза, натрій карбоксиметилцелюлоза та інші суспендувальні засоби, відомі у рівні техніки для фармацевтичних композицій Залежно від режиму застосуванні фармацевтичні композиції переважно містять 0,05%99мас.% (процент за масою), краще 0,10-50мас.%, сполуки винаходу, усі проценти за масою надано стосовно загальної композиції. 15 80012 Терапевтично ефективну кількість для застосування представленого винаходу на практиці можна визначити застосуванням відомих критеріїв, що охоплюють вік, масу та сприйнятливість індивідуального пацієнта, та інтерпретуються у контексті хвороби, яку лікують чи попереджують, звичайним фа хівцем. Охоплено рамками винаходу застосуванні будь-якої сполуки формули І як визначено вище для виробництва медикаменту. Також охопленими рамками представленого винаходу є застосування будь-якої сполуки формули І для виробництва медикаменту для терапії болю. Додатково запропоновано застосування будьякої сполуки формули І для виробництва медикаменту для терапії різних больових станів, охоплюючи, але без обмеження: гострий біль, хронічний біль, невропатичний біль, гострий біль, біль у спині, раковий біль, та вісцеральний біль. Наступним аспектом винаходу є спосіб терапії особи, що страждає від будь-якого з оговорених вище станів, в якому до пацієнта, що потребує такої терапії застосовують ефективну кількість сполуки формули І,. Додатково, запропоновано фармацевтичну композицію, що містить сполуку формули І або її фармацевтично прийнятну сіль в асоціації з фармацевтично прийнятним носієм. Особливо, запропоновано фармацевтичну композицію, що містить сполуку формули І або її фармацевтично прийнятну сіль в асоціації з фармацевтично прийнятним носієм для терапії, конкретніше для терапії болю. Далі, запропоновано фармацевтичну композицію, що містить сполуку формули І або її фармацевтично прийнятну сіль, в асоціації з фармацевтично прийнятним носієм для застосування у будьякому з обговорених ви ще станів. Також запропоновано спосіб отримання сполуки формули І. Згідно з наступним аспектом представлений винахід стосується способу отримання сполуки формули І, що залучає: реакцію сполук формули II з X-C(=O)-R 4 або R4C(=O)-OC(=O)R4: ДЄ 16 R1 вибрано з групи: С6-10алкіл та С2де вказані С 6-10алкіл та С26гетероарил, 6гетероарил, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: -R, -NO2, -OR, -СІ, -Вг, -І, -F, -CF3 , -C(=O)R, C(=O)OH, -NH 2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, -SO3H, -SO 2R, -S(=O)R; -CN, -OH, -C(=O)OR, C(=O)NR 2, -NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С1-6алкіл; а R2, R3, R4 та R5, незалежно, вибрано з групи: гідроген, С1-6алкіл та С3-6циклоалкіл, де вказані С 16алкіл та С 3-6циклоалкіл, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: R, -NO2, -OR, -СІ, -Br, -I, -F, -CF3, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH 2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, -SO3H, -SO2R, -S(=O)R, -CN, -OH, C(=O)OR, -C(=O)NR 2, -NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або Сі_еалкіл. Х-СІ, Вr чи І; У ще одному втіленні винахід стосується способу отримання сполук формули І, що залучає: реакцію сполуки формули III з R1-CHO або R CH2-X: 1 де R1 вибрано з групи: С6-10алкіл та С2де вказані С 6-10алкіл та С26гетероарил, 6гетероарил, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: -R, -NO2, OR, -СІ, -Br, -I, -F, -CF 3, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH 2, SH, -NHR, -NR2, -SR, -SO3H, -SO2R, -S(=O)R; -CN, OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR 2, -NRC(=O)R та NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С1-6алкіл; а R2, R3, R4 та R5, незалежно, вибрано з групи: гідроген, С1-6алкіл та С3-6циклоалкіл, де вказані С 16алкіл та С 3-6цикпоалкіл, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: R, -NO2, -OR, -СІ, -Br, -I, -F, -CF3 , -C(=O)R, C(=O)OH, -NH 2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, -SO3H, -SO2R, -S(=O)R, -CN, -OH, C(=O)OR, -C(=O)NR 2, -NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або Сі_балкіл. Х-СІ, Вr або І; 17 Зокрема, сполуки представленого винаходу та інтермедіати, застосовані для їх отримання можна Схема 1 Схема 2 80012 18 отримувати шляхами синтезу, як представлено у схемах 1-3. 19 80012 Відповідно, згідно з наступним аспектом, представлений винахід стосується проміжної сполук формули III: де R2, R3, R4 та R5, незалежно, вибрано з групи: гідроген, С1-6алкіл та С3-6циклоалкіл, де вказані С 16алкіл та С 3-6циклоалкіл, як варіант, заміщено одним або більше замісниками, вибраними з групи: R, -NO2, -OR, -СІ, -Br, -I, -F, -CF3 , -C(=O)R, C(=O)OH, -NH 2, -SH, -NHR, -NR2, -SR, -SO3H, SO2R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR 2, 20 NRC(=O)R та -NRC(=O)-OR, де R, незалежно, представляє гідроген або С^алкіл. БІОЛОГІЧНА ОЦІНКА Сполуки винаходу виявлені, як активні стосовно б-рецепторів у теплокровних тварин, наприклад, людини. Особливо сполуки винаходу виявлені, як ефективні ліганди б-рецептору. Дослідження in vitro, дивись нижче, демонструють ці неочікувані активності, особливо з огляду на потужність агоністів та ефективність, як продемонстровано у функціональних дослідженнях мозку щурів та/або функціональних дослідженнях брецептору людини (низька). Ця особливість може бути пов'язаною з активністю in vivo та може не бути лінійно пов'язаною з афінністю стосовно зв'язування. У цих дослідженнях in vitro, сполуки досліджено на їх активності стосовно б-рецепторів та отримано ІК50 для визначення селективної активності для конкретних сполук стосовно б 21 80012 рецепторів. У цьому контексті, ІК50 загалом стосується концентрації сполуки, при котрій спостережено 50% заміщення стандартного радіоактивного ліганду d-рецептору. Активності сполуки стосовно k- та mрецепторів також вимірюють у подібних дослідженнях. Модель in vitro Культура клітин Клітини 293S людини, що експресують клоновані (m-, d- та k-рецептори людини та резистентні до неоміцину, вирощують у суспензії при 37°С та 5% СО2 у стр ушуваних колбах, що містять вільний від кальцію DMEM10% сироватки зародка теляти, 5% BCS, 0,1% Pluronic F-68, та 600мкг/мл генетицин. Мозки щурів зважують та промивають охолодженим льодом буферованим фосфатом фізіологічним розчином (з вмістом 2,5мМ EDTA, рН 7,4). Мозки гомогенізують політроном протягом 30с (щурів) в охолодженому льодом лізисному буфері (50мМ Трис, рН 7,0, 2,5мМ EDTA, з фенілметилсульфонілфлуоридом, доданим якраз перед застосуванням до 0,5М мМ з 0,5М ви хідного розчину у ДМСО-етанолі). Отримання мембран Клітини гранулюють та знов суспендують у лізисному буфері (50мМ Трис, рН 7,0, 2,5мМ EDTA, з фенілметилсульфонілфлуоридом, доданим якраз перед застосуванням до 0,1мМ з 0,1М вихідного розчину в етанолі), інкубують на льоді протягом 15 хвилин, тоді гомогенізують політроном протягом 30с Суспензію центрифугують при 1000g (макс) протягом 10 хвилин при 4°С. Надосадковий шар зберігають на льоді та гранули знов суспендують та центрифугують як перед тим. Надосадкові шари з обох обертань комбінують та центрифугують при 46000g (макс) протягом 30 хвилин. Гранули знов суспендують у холодному Трисбуфері (50мМ Трис/СІ, рН 7,0) та центрифугують знов. Кінцеві гранули знов суспендують у мембранному буфері (50мМ Трис, 0,32М са харози, рН 7,0). Аліквоти (1мл) у поліпропіленових тубах заморожують у суміші сухий лід-етанол та зберігають при -70°С до застосування. Концентрації білку визначено модифікованим способом Лоурі з натрій додецилсульфатом. Дослідження зв'язування Мембрани розморожують при 37°С, охолоджують на льоді, пропускають тричі через голку калібру 25 та розбавляють буфером для зв'язування (50мМ Трис, 3мМ МgСІ2, 1мг/мл бичачого сироваточного альбуміну (Sigma A-7888), рН 7,4, котрий зберігають при 4°С після фільтрування через фільтр 0,22m, до котрого тільки що додано 5мкг/мл апротиніну, 10мкМ бестатину, 10мкМ дипротину А, без DTT). Аліквоти по 100мкл додають до охолоджених льодом поліпропіленових туб 12×75мм, що містять 100мкл підхожого радіоліганду та 100мкл тест-сполуки при різних концентраціях. Загальне (ТВ) та неспецифічне (НЗ) зв'язування визначено при відсутності чи присутності 10мкМ налоксону відповідно. Туби стр ушують та інкубують при 25°С протягом 60-75 хвилин, після чого 22 вміст фільтрують швидко під вакуумом та промивають приблизно 12мл/туб охолодженого льодом промивочного буферу (50мМ Трис, рН 7,0, 3мМ МдСІ2) через фільтри GF/B (Whatman), попередньо просочені протягом щонайменше 2 годин у 0,1% поліетиленіміні. Радіоактивність (розпад/хвил) на фільтри вимірюють бета-лічильником після просочення фільтрів протягом щонайменше 12 годин у мінісклянках, що містять 6-7мл сцинтиляційної рідини. Якщо дослідження проводять у 96-коміркових планшетах з глибокими комірками, фільтрування проводять через 96-місцеві попередньо просочені поліетиленіміном уніфільтри, котрі промивають 3×1мл промивочним буфером, та сушать у шафі при 55°С протягом 2 годин. Фільтрпланшети підраховують у TopCount (Packard) після додавання 50мкл сцинтиляційної рідини МС-20 на комірку. У випадку дослідження, проведеного у 96коміркових планшетах з глибокими комірками, ІК50 сполук оцінюють за 10-точковими кривими заміщення у випадку дельта, та 5-точковими кривими заміщення у випадку мю та каппа. Дослідження проводять у 300 мкл з підхожою кількістю мембранного білку (2мкг, 35мкг та 1мкг у випадку дельта, мю та каппа, відповідно) та 50000-80000 розпад/хвил/комірк підхожої радіомітки (125Ідельторфін II, 125 I-FK33824, та 125I-DPD YN для дельта, мю, та капа, відповідно). Загальне зв'язування та неспецифічне зв'язування визначають у присутності та відсутності 10мкМ налоксону. Функціональні дослідження Агоністичну активність сполук вимірюють визначенням ступеню, до котрого комплекс сполукирецептор активує зв'язування GTP з G-білками, з котрими рецептори сполучаються. У дослідженні зв'язування GTP, GTP[y]35S комбінують з тестсполуками та мембранами від клітин HEK-293S, що експресують клоновані опіоїдні рецептори людини або від гомогенізованого мозку щурів та мишей. Агоністи стимулюють зв'язування GTP[g] 35S у цих мембранах. Значення ЕК50 та Емакс сполук визначено за кривими доза-реакція. Праві зсуви кривої доза-реакція дельта-антагоністом налтриндол проводять для перевірки, що агоністична активність опосередковано через дельта-рецептори. Для функціональних досліджень б-рецептору людини ЕК50 (низьке) вимірюють, коли б-рецептори людини, застосовані у дослідженні, експресовано при нижчих рівнях у порівнянні із застосованими у визначенні ЕК50 (високе). Значення Емакс визначено стосовно стандартного d-агоністу SNC80, тобто, більше 100% відповідає сполукам, що мають кращу е фективність, ніж SNC80. Спосіб для GTP мозку щурів Мембрани мозку щурів розморожують при 37°С, пропускають тричі через голку калібру 25 з тупим кінцем та розбавляють GTPgS зв'язуванням (50мМ Гепес, 20мМ гідроксиду натрію, 100мМ хлориду натрію, 1мМ EDTA, 5мМ МдСІ2 , рН 7,4, Додають свіжі: 1мМ DTT, 0,1% BSA). 120мкМ GDP кінцевих додають розбавлення мембран. ЕК50 та Емакс сполук оцінюють за 10-точковими кривими доза-реакція отриманими у 300 мкл з підхожою кількістю білку мембран (20мкг/комірку) та 100000130000 розпад/хвил GTPg35S на комірку (0,11 23 80012 0,14нМ). Базове та максимальне стимульоване зв'язування визначено при відсутності чи присутності 3мкМ SNC-80. Дослідження, проведене на клітинах НЕК 293s, що стабільно експресують клоновані дельта-рецептори, проводять у трохи відмінному буфері (50мМ Гепес, 20мМ NaOH, 200мМ NaCI, 1мМ EDTA, 5мМ МgСІ2 , рН 7,4, додають свіжі: 0,5% бичачого сироваточного альбуміну, без DTT) та 3мкМ кінцевої концентрації GDP. Аналіз результатів Специфічне зв'язування (СЗ) розраховують як 33-Н3, а СЗ у присутності різних тест-сполук вира 24 жено як процент від контролю СЗ. Значення ІК50 та коефіцієнту Хілла (nн) для лігандів у заміщенні специфічно зв'язаного радіоліганду розраховують за логарифмічним графіком або програмами підгонки кривих, як-то Ligand, GraphPad Prism, SigmaPlot, або ReceptorFit Значення К, розраховують за рівнянням Ченга-Пруссофа. Значення ± стандартне відхилення ІК50, Ki та nн представлено для досліджень лігандів щонайменше у трьох кривих заміщення. Біологічну активність сполук представленого показано у таблицях 1 та 2. Таблиця 1 Експерименти з насичення рецепторів Значення Kd радіолігандів визначено за допомогою аналізів зв'язування на мембранах клітин із підхожими радіолігандами при концентраціях, що складають 0,2-5 від визначених Kd (упритул до 10 разів, якщо можлива кількість потрібних радіолігандів). Зв'язування специфічного радіоліганду виражено як пмоль/мг білку мембрани. Значення Кd та Bmakc з окремих експериментів отримують нелінійною підгонкою залежності специфічно зв'язаного (В) від нМ вільного радіоліганду (F) із індивідуалу згідно з одно-ділянковою моделлю. ВИЗНАЧЕННЯ МЕХАНО-АЛОДИНІЇ. ЗАСТОСОВУЮЧИ ТЕСТУВАННЯ ВАН ФРЕЯ Тестування виконують між 08:00 та 16:00год. способом, описаним Капланом та інш. (1994). Щурів поміщали у клітку з плексигласу на поверхню дна із дротової сітки, котра дозволяє доступ до лапи, та залишали звикнути протягом 10-15 хвилин. Місце тестування є серединою підошви лівої задньої лапи, уникаючи менш чутливи х подушечок підошви. Лап торкалися комплектом із 8 ворсин Ван Фрея з логарифмічно зростаючою жорсткістю (0,41, 0,69,1,20, 2,04, 3,63, 5,50, 8,51, та 15,14 грам; Stoelting, 111, USA). Ворсини Ван Фрея застосовували з-під поверхні сітки перпендикулярно поверхні підошви з достатньою силою, щоб викликати легкий вигин лапи та утримати його приблизно 6-8 с Позитивну реакцію відзначають, якщо лапу різко відсмикують. Відсмикування негайно після видалення ворсин також вважається позитивною реакцією. Ходіння вважають неоднозначною реакцією, та у таких випадках стимулювання повторюють. ПРОТОКОЛ ТЕСТУВАННЯ Тварин групи, обробленої FCA, тестовано у 1 післяопераційний день. 50% поріг видалення визначено застосуванням реверсивного способу Диксона (1980). Тестування розпочато з ворсин 2,04г у середині серії. Стимулювання завжди надається послідовним шляхом - висхідним, або спадним. При відсутності реакції відсмикування лап від спочатку вибраних ворсин надають сильніший стимул; у наявності відсмикування лап вибирають наступний слабший стимул. Розрахунок оптимального порога цим способом потребує 6 реакцій у безпосередній близькості до 50% порога, та підрахунок цих б реакцій починають, коли відбувається перша зміна реакції, наприклад, коли поріг пересічено уперше . У випадках, де пороги знижуються зовні діапазону стимулів, відповідно прийнятними є значення 15,14 (нормальна чутливість) або 0,41 (максима 25 80012 льно алодинічна). Утворену картину позитивних та негативних реакцій зведено до таблиці із застосуванням умови, X = немає відсмикування; О = відсмикування, та 50% поріг відсмикування інтерполюють із застосуванням формули: 50% г поріг = 10(xf+kd)/10000 де Xf= останнє значення застосованих ворсин Ван Фрея (log-одиниць); k = табличні значення (від Каплана та інш. (1994)) для системи позитивні/негативні реакції; а d = середня відмінність між стимулами (logодиниці). Тут d=0,224. Пороги Ван Фрея перетворюють у відсоток максимального можливого ефекту (% ММЕ), згідно з Капланом та ін. 1994. Наступне рівняння застосовано для розрахунку % ММЕ: %ММЕ = Поріг при обробціліками(г ) - поріг алодинії(г ) ´ 100 Поріг для контролю(г ) - Поріг алодинії( г ) ЗАСТОСУВАННЯ ТЕСТ-РЕЧОВИНИ Щурів ін'єктують (підшкірно, інтраперитонально, внутрішньовенно або перорально) тестречовиною перед тестуванням Ван Фрея, час між застосуванням тест-сполуки та тестом Ван Фрея змінюється залежно від природи тест-сполуки корчення Тест на корчення Оцтова кислота викликає абдомінальну контракцію, при інтраперитональному застосуванні мишам. Це тоді витягує їх тіло у типовій картині. При застосуванні аналгетиків цей описаний рух спостерігають рідше, і вибрані ліки вважають гарним потенційним кандидатом. Повний типовий рефлекс корчення розглядають тільки тоді, коли представлені наступні елементи: тварина не є у русі; нижче спини злегка депресовано; підошовний частина обох лап доступна для огляду. У цьому аналізі, сполуки представленого винаходу демонструють значне інгібування реакцій корчення після перорального дозування 1-100мкмоль/кг. (і) Отримання розчинів Оцтова кислота (АсОН): 120мкл оцтової кислоти додають до 19,88мл дистильованої води для отримання 20мл кінцевого об'єму АсОН із кінцевою концентрацією 0,6%. Тоді розчин змішують (струшують) і він гото вий для ін'єкції. Сполука (ліки): Кожну сполуку отримують та розчиняють у найбільш придатному носії стандартними способами. (іі) Застосування розчинів Сполуку (ліки) застосовують перорально, інтраперитонально (і.п.), підшкірно (п.ш.) або внутрішньовенно (в.в.)) по 10мл/кг (з огляду на середню вагу тіла мишей) за 20, 30 або 40 хвилин (згідно з категорією сполуки та її характеристиками) перед тестуванням. Коли сполуку уводять центрально: інтравентрикулярно (і.в.) або інтратекально (і.т.) застосовують об'єм 5мкл. АсОН застосовують інтраперитонально (і.п.) 10мл/кг (з огляду на середню вагу тіла миші) у дві ділянки негайно перед тестуванням. (ііі) Тестування Тварину (мишу) спостерігають протягом 20 хвилин і число випадків (рефлекс корчен-ня) занотовують та компілюють наприкінці експерименту. 26 Мишей розподіляють в окремі "бокси"-клітки з контактними підстилками. Усіх 4 мишей звичайно обстежують одночасно: один контроль та три дози ліків. Ефективність стосовно тривожності та тривожноподібних симптомів визначають конфліктним тестом geller-seifter у щура. Ефективність стосовно симптому функціонального шлунково-кишкового розладу у щура можна визначити пробою, описаною Coutinho SV et al, у American Journal of Physiology - Gastrointestinal & Liver Physiology. 282(2):G307-16,2002 Feb. ДОДАТКОВІ ПРОТОКОЛИ ТЕСТУВАННЯ IN VIVO Суб'єкти та розміщення Звичайних самців щурів Sprague Dawley (175200g) розміщено групами по 5 у помешкання з контрольованою температурою (22°С, 40-70% вологість, 12-годин світло/темрява). Експерименти виконують протягом світлої фази циклу. Тварини мають їжу та воду досхочу, і х умертвляють негайно після отримання даних. Зразок Тестування сполук (ліки) охоплює групи щурів, що не отримують будь-якої обробки та інших, яких обробляють ліпополісахаридом (ЛПС) Е.соїі. Для експерименту із обробкою ЛПС, чотири групи ін'єктують ЛПС, тоді одну із чотирьох груп обробляють носієм, в той час як інші три групи ін'єктують ліками та їх носієм. Другу серію експериментів проводять із п'ятьма групами щурів; усі які не отримують обробки ЛПС. Не піддана обробці група не отримує сполуки (ліки) або носія; інші чотири групи лікують носієм з ліками або без них. Це виконують для визначення анксіолітичної або седативної дії аналгетиків, котрі можуть сприяти зменшенню USV. Застосування ЛПС Щурам дають звикнути до експериментальної лабораторії протягом 15-20 хвилин перед обробкою. Запалення індукують застосуванням ЛПС (ендотоксин грам-негативної бактерії Е. соїі серотипу 0111:В4, Sigma). ЛПС (2,4мкг) ін'єктують інтрацеребровентрикулярно (і.ц.в.) в об'ємі 10мкл, застосуванням стандартної стереотаксичної хірургічної техніки під анестезією ізофлураном. Шкіру між вух розтягують рострально та роблять подовжній розріз близько 1см, що розкриває поверхню черепа. Ділянку пункції визначають координатами: 0,8мм позаду (наступно за брегмою), 1,5мм збоку (зліва) від місця з'єднання ламбдовидного и стріловидного швів черепа (сагітальний шов), та 5мм нижче поверхні черепу (вертикальний) у боковому шлуночку. ЛПС ін'єктують стерильною голкою з нержавіючої сталі (26-G 3/8) d мм довжини, закріпленій на 100-мкл шприці Hamilton з поліетиленовим тюбінгом (РЕ20; 10-15см). 4мм стопор, виготовлений з обрізаної голки (20-G) поміщено над голкою та закріплено на ній силіконовим клеєм 26G що створює потрібну глибину 5мм. Після ін'єкції ЛПС, голку залишають на місці ще 10с, що дозволяє сполуці дифундувати, тоді її видаляють. Розріз закривають і щура повертають 27 80012 до його вихідної клітки та дають відпочити мінімум 3,5 години перед тестуванням Експериментальна установка для стимуляції ударом повітря Щурів залишають в експериментальній лабораторії після наступної ін'єкції ЛПС та застосування сполуки (ліків). Під час тестування усі х щурів видаляють та поміщають зовні лабораторії. Одного щура у цей час переносять у лабораторію для тестування та поміщають у чистий бокс (9×9×18см), котрий тоді поміщають у кабіну з вентиляцією та ослабленим звуком розміром 62(ш)×35(д)×46(в)см (BRS/LVE, Div. Tech-Serv Inc). Удар повітря через форсунку повітряного отвору у 0,32см регулюють системою (AirStim, San Diego Intruments), здатною встановлювати тривалість повітряного удару (0,2с) та фіксувати інтенсивність із частотою 1 удар у 10с. Застосовують максимально 10 ударів або до появи звуку, котрий інколи з'являється першим. Перший удар повітря означає початок реєстрації. Експериментальна установка для ультразвукової реєстрації. Появу звуку реєструють протягом 10 хвилин застосуванням мікрофонів (G.R.A.S. sound та vibrations, Vedbaek, Denmark), поміщених усередині кожної кабіни та контрольованих програмним забезпеченням LMS (LMS CAD A-X 3,5В, Data Acquisition Monitor, Troy, Michigan). Частоти між 0 та 32000Гц реєструють, акумулюють та аналізують ідентичним програмним забезпеченням (LMS CADA-X 3,5В, Time Data Processing Monitor та UPA (User Programming та Analysis)). Сполуки (ліки). Усі сполуки (ліки) доведено до рН між 6,5 та 7,5, їх застосовують в об'ємі 4мл/кг. Після застосування сполуки (ліків) тварин повертають до їх вихідних кліток до часу тестування. Аналіз Реєстрацію проводять серіями статистичного та Фур'є аналізів для фільтрування (між 20-24кГц) та розрахунку потрібних параметрів. Дані виражено як середнє ± СВ. Статистична значимість оцінюється застосуванням Т-тесту для порівняння між необробленими та обробленими ЛПС щурами, та одношляховою ANOVA, а потім тестом Дунетта (після цього) множинного порівняння стосовно ефективності ліків. Відмінність між групами вважають значущоюою при мінімальному значенні р